The search result changed since you submitted your search request. Documents might be displayed in a different sort order.
  • search hit 7 of 5333
Back to Result List

Direkte und indirekte Hapten-selektive Immunfluoreszenzmarkierung von Hybridomzellen zur Generierung monoklonaler Antikörper

Direct and indirect hapten-specific immunofluorescence labeling of hybridoma cells for the generation of monoclonal antibodies

  • Die Hybridomtechnik zur Produktion von monoklonalen Antikörpern ermöglichte einen großen Schritt in der Entwicklung von Immunoassays für die biochemische Forschung und klinische Diagnostik. Auch die Produktion von Antikörpern gegen niedermolekulare Analyten, Haptene, typische Targets in der Lebensmittel- und Umweltanalytik, erlangte in den letzten Jahren eine immer größere Bedeutung. Im Zuge der Durchführung der Hybridomtechnik werden tausende Antikörper-sezernierende und nicht-sezernierende Zellen generiert. Die Selektion der wenigen antigenselektiven Hybridomzellen zählt dabei zu den herausforderndsten Schritten für die Antikörpergewinnung. Bisherige Selektionsverfahren, wie die Limiting-Dilution-Klonierung in Verbindung mit Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs), garantieren keine Monoklonalität und erlauben nur das Screening von einigen wenigen Zellklonen. Hingegen ermöglichen Hochdurchsatz-Selektionsmethoden, wie die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS), einen sehr hohen Probendurchsatz. Eine EinzelzellablageDie Hybridomtechnik zur Produktion von monoklonalen Antikörpern ermöglichte einen großen Schritt in der Entwicklung von Immunoassays für die biochemische Forschung und klinische Diagnostik. Auch die Produktion von Antikörpern gegen niedermolekulare Analyten, Haptene, typische Targets in der Lebensmittel- und Umweltanalytik, erlangte in den letzten Jahren eine immer größere Bedeutung. Im Zuge der Durchführung der Hybridomtechnik werden tausende Antikörper-sezernierende und nicht-sezernierende Zellen generiert. Die Selektion der wenigen antigenselektiven Hybridomzellen zählt dabei zu den herausforderndsten Schritten für die Antikörpergewinnung. Bisherige Selektionsverfahren, wie die Limiting-Dilution-Klonierung in Verbindung mit Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs), garantieren keine Monoklonalität und erlauben nur das Screening von einigen wenigen Zellklonen. Hingegen ermöglichen Hochdurchsatz-Selektionsmethoden, wie die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS), einen sehr hohen Probendurchsatz. Eine Einzelzellablage garantiert hierbei Monoklonalität. Jedoch sind die dafür erforderlichen Zellmarkierungen oftmals zellschädigend oder aufwendig zu generieren. Auch ist bisher noch keine Markierungsmethode bekannt, die es ermöglicht, Hapten-selektive Hybridomzellen durchflusszytometrisch zu analysieren und eine FACS-Selektion durchzuführen. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit zwei Zellmarkierungsmethoden entwickelt, die dies ermöglichen sollten. Die membranständigen Antikörper von Hybridomzellen sollten entweder direkt oder indirekt immunfluoreszenz-markiert und dadurch für die Durchflusszytometrie und FACS-Selektion zugänglich gemacht werden. Die direkte Markierung wurde mittels eines Hapten-Fluorophor-Konjugats durchgeführt. Sie ermöglichte erstmalig den Anteil an Haptenselektiven Hybridomzellen in einer Hybridomzelllinie zu überprüfen. Dies konnte für zwei Hapten-selektive Hybridomzelllinien, die Antikörper gegen das Hormon 17β-Estradiol und das Cardenolid Digoxigenin bilden, gezeigt werden. Durchflusszytometrie und ELISAs lieferten vergleichbare Ergebnisse. Zellen, die Hapten-selektiv markiert werden konnten, sezernierten ebenfalls Hapten-selektive Antikörper. Des Weiteren konnte die direkte Markierung dazu genutzt werden, zwei Mykotoxin-selektive Hybridomzelllinien, welche Antikörper gegen Aflatoxin und Zearalenon bilden, auf Monoklonalität zu testen. Dies ist mittels ELISA nicht möglich. Die Markierungsmethode eignete sich jedoch nur für fixierte Hybridomzellen. Eine Markierung von lebenden Zellen konnte weder durchflusszytometrisch noch mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie gezeigt werden. Dies gelang erst mit einer neu entwickelten indirekten Immunfluoreszenzmarkierung. Dabei wurden die Zellen zunächst mit einem Hapten-Peroxidase-Konjugat inkubiert, gefolgt von einem Fluorophor-markierten anti-HRP-Antikörper-Konjugat. Dies wurde für zwei Analyten, das Hormon Estron und das Antiepileptikum Carbamazepin, gezeigt. Die indirekte Markierung wurde erfolgreich dazu verwendet, Carbamazepin-selektive Hybridomzellen aus einem Fusionsansatz für die monoklonale Antikörperproduktion auszusortieren. Damit wurde erstmalig eine Zellmarkierungsmethode entwickelt, die eine Hochdurchsatz-Selektion lebender Hybridomzellen aus einem Fusionsansatz ermöglicht. Sie ist nicht zellschädigend und kann zusätzlich zur Selektion Hapten-selektiver Plasmazellen verwendet werden.show moreshow less
  • The ability to create monoclonal antibodies has allowed great strides to be made in immunoassay development for biochemical research and clinical diagnostics. Particularly for small molecular weight analytes, haptens, the need of selective antibodies has increased. The hybridoma technique generates thousands of fused antibody-secreting and non-secreting cells, with the majority being irrelevant. The subsequent screening and subcloning process in order to identify and isolate the very few hybrids that are secreting antibodies of the desired selectivity is a major concern. The traditional limiting dilution technique followed by enzymelinked immunosorbent assays (ELISAs) is inefficient and monoclonality is not guaranteed. Often the number of clones that can be screened is limited. High-throughput techniques such as fluorescence-activated cell sorting (FACS) provide an efficient tool to increase the number of cells to be screened. Furthermore, a single-cell deposition of cells would ensure monoclonality. However, antigen-selective cellThe ability to create monoclonal antibodies has allowed great strides to be made in immunoassay development for biochemical research and clinical diagnostics. Particularly for small molecular weight analytes, haptens, the need of selective antibodies has increased. The hybridoma technique generates thousands of fused antibody-secreting and non-secreting cells, with the majority being irrelevant. The subsequent screening and subcloning process in order to identify and isolate the very few hybrids that are secreting antibodies of the desired selectivity is a major concern. The traditional limiting dilution technique followed by enzymelinked immunosorbent assays (ELISAs) is inefficient and monoclonality is not guaranteed. Often the number of clones that can be screened is limited. High-throughput techniques such as fluorescence-activated cell sorting (FACS) provide an efficient tool to increase the number of cells to be screened. Furthermore, a single-cell deposition of cells would ensure monoclonality. However, antigen-selective cell labeling techniques are often cell damaging or laborious. The purpose of this study was to explore a cell labeling technique enabling the hapten-selective analysis and isolation of hybridoma cells via FACS. This would reduce much of the effort that has currently to be employed in hybridoma generation. For this reason, a direct and indirect hapten-selective labeling technique was developed. For the direct labeling, a haptenfluorophore conjugate was generated. The conjugate was used to tag membrane-bound immunoglobulin G of hybridoma cells and thereby enabling flow cytometric analysis. Using this kind of conjugate, it was possible to examine the selective antibody expression of hybridoma cell lines producing antibodies against the hormone estradiol and the steroid digoxigenin. Flow cytometric analysis and ELISAs showed comparable results: Cells, which were tagged with the corresponding hapten-fluorophore conjugate also secreted hapten-selective antibodies. Furthermore, it was possible to check hybridoma cell lines producing antibodies against the mycotoxins aflatoxin and zearalenone for monoclonality, which is not possible with ELISA. However, the direct labeling technique was only applicable to fixed cells. Successful labeling of living cells could neither be detected by flow cytometry nor by confocal laser scanning microscopy. On the contrary, using the newly developed indirect labeling technique, flow cytometric analysis and selection of living cells by FACS was possible. Here, the cells were first incubated with a hapten-peroxidase conjugate followed by a fluorophore-conjugated anti-peroxidase antibody. The technique was established on a hybridoma cell line selective for the hormone estrone. Furthermore, this labeling technique enabled for the first time the sorting of hybridoma cells producing selective antibodies against the medication carbamazepine out of a fusion mixture with high efficiency. The selected clones were used for monoclonal antibody production. The indirect labeling is harmless for cells and could also be applied on haptenselective plasma cells.show moreshow less

Export metadata

Additional Services

Search Google Scholar Statistics
Metadaten
Author details:Martin DippongGND
Supervisor(s):Frank Fabian Bier, Rudolf J. Schneider, Roland Lauster
Publication type:Doctoral Thesis
Language:German
Publication year:2017
Publishing institution:Universität Potsdam
Granting institution:Universität Potsdam
Date of final exam:2017/12/18
Release date:2018/01/30
Tag:Durchflusszytometrie; Haptene; Hybridom; Immunfluoreszenz; monoklonale Antikörper
flow cytometry; hapten; hybridoma; immunofluorescence; monoclonal antibodies
Number of pages:VII, 103
Organizational units:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Biochemie und Biologie
DDC classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
License (German):License LogoKeine öffentliche Lizenz: Unter Urheberrechtsschutz
Accept ✔
This website uses technically necessary session cookies. By continuing to use the website, you agree to this. You can find our privacy policy here.