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Meerrettich Peroxidase : Modifikationen und Anwendungen in Biosensoren

Horseradish Peroxidase : modifications and applications in biosensors

  • Biosensoren werden oft für die Messung einzelner Substanzen in komplexen Medien verwendet, wie z.B. bei der Blutzuckerbestimmung. Sie bestehen aus einem physikochemischen Sensor, dem Transduktionselement, und einer darauf immobilisierten biologischen Komponente, dem Erkennungselement. In dieser Arbeit wurde als Transduktionselement eine Elektrode und als Biokomponente das Enzym „Meerrettich Peroxidase“ (engl. horseradish peroxidase, HRP) verwendet. Solche HRP-Elektroden werden für die Messung von Wasserstoffperoxid (H2O2) eingesetzt. H2O2 wird im Körper von weißen Blutkörperchen produziert, um Bakterien abzutöten, wird teilweise ausgeatmet und kann in kondensierter Atemluft nachgewiesen werden. Da viele weiße Blutkörperchen bei einer Chemotherapie abgetötet und dadurch die Patienten anfälliger für Infektionen werden, muss ihre Anzahl regelmäßig überwacht werden. Dazu wird zurzeit Blut abgenommen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, ob eine Überwachung der Anzahl an weißen Blutkörperchen ohne Blutabnahme durch eineBiosensoren werden oft für die Messung einzelner Substanzen in komplexen Medien verwendet, wie z.B. bei der Blutzuckerbestimmung. Sie bestehen aus einem physikochemischen Sensor, dem Transduktionselement, und einer darauf immobilisierten biologischen Komponente, dem Erkennungselement. In dieser Arbeit wurde als Transduktionselement eine Elektrode und als Biokomponente das Enzym „Meerrettich Peroxidase“ (engl. horseradish peroxidase, HRP) verwendet. Solche HRP-Elektroden werden für die Messung von Wasserstoffperoxid (H2O2) eingesetzt. H2O2 wird im Körper von weißen Blutkörperchen produziert, um Bakterien abzutöten, wird teilweise ausgeatmet und kann in kondensierter Atemluft nachgewiesen werden. Da viele weiße Blutkörperchen bei einer Chemotherapie abgetötet und dadurch die Patienten anfälliger für Infektionen werden, muss ihre Anzahl regelmäßig überwacht werden. Dazu wird zurzeit Blut abgenommen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, ob eine Überwachung der Anzahl an weißen Blutkörperchen ohne Blutabnahme durch eine H2O2-Messung erfolgen kann. Ein direkter Zusammenhang zwischen der ausgeatmeten H2O2-Menge und der Zahl der weißen Blutkörperchen konnte dabei nicht festgestellt werden. Für empfindliche H2O2-Messungen mit einer HRP-Elektrode ist ein schneller Austausch von Elektronen zwischen der Elektrode und dem Enzym notwendig. Eine Vorraussetzung dafür ist eine kurze Distanz zwischen dem aktiven Zentrum des Enzyms und der Elektrodenoberfläche. Um einen kurzen Abstand zu erreichen wurden im zweiten Teil dieser Arbeit verschiedene poröse graphitähnliche Materialien aus pyrolysierten Kobalt-Porphyrinen für die Elektrodenherstellung verwendet. Dabei stellte sich heraus, dass eines der untersuchten Materialien, welches Poren von etwa der Größe eines Enzyms hat, Elektronen etwa 200mal schneller mit dem Enzym austauscht als festes Graphit. Die HRP selbst enthält in seinem aktiven Zentrum ein Eisen-Protoporphyrin, also ein aus vier Ringen bestehendes flaches Molekül mit einem Eisenatom im Zentrum. Reagiert die HRP mit H2O2, so entzieht es dem Peroxid zwei Elektronen. Eines dieser Elektronen wird am Eisen, das andere im Ringsystem zwischengespeichert, bevor sie an ein anderes Molekül oder an die Elektrode weitergegeben werden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde das Eisen durch Osmium ausgetauscht. Das so veränderte Enzym entzieht Peroxiden nur noch ein Elektron. Dadurch reagiert es zwar langsamer mit Wasserstoffperoxid, dafür aber schneller mit tert-Butylhydroperoxid, einem organischen Vertreter der Peroxid-Familie.show moreshow less
  • Biosensors are often used for the measurement of specific substances in complex media, e.g. glucose in blood. They consist of a physicochemical sensor, the transducer, onto which a biological component, the recognition element, is immobilised. In this work, an electrode was used as transducer and the enzyme “horseradish peroxidase” (HRP) as biological component. Such HRP electrodes are used for the measurement of hydrogen peroxide (H2O2). H2O2 is produced in the body by white blood cells to destroy bacteria, is partially exhaled and can be measured in breath condensate. Since a lot of white blood cells are destroyed during chemotherapy and patients get more prone to infections, their amount must be checked regularly. Currently blood samples are taken for this purpose. In the first part of this work it was investigated, if the amount of white blood cells can be checked without taking blood by measuring H2O2. A correlation between the amount of exhaled H2O2 and the number of white blood cells could not be found. For a sensitive H2O2Biosensors are often used for the measurement of specific substances in complex media, e.g. glucose in blood. They consist of a physicochemical sensor, the transducer, onto which a biological component, the recognition element, is immobilised. In this work, an electrode was used as transducer and the enzyme “horseradish peroxidase” (HRP) as biological component. Such HRP electrodes are used for the measurement of hydrogen peroxide (H2O2). H2O2 is produced in the body by white blood cells to destroy bacteria, is partially exhaled and can be measured in breath condensate. Since a lot of white blood cells are destroyed during chemotherapy and patients get more prone to infections, their amount must be checked regularly. Currently blood samples are taken for this purpose. In the first part of this work it was investigated, if the amount of white blood cells can be checked without taking blood by measuring H2O2. A correlation between the amount of exhaled H2O2 and the number of white blood cells could not be found. For a sensitive H2O2 measurement with an HRP electrode a quick exchange of electrons between electrode and enzyme is needed. One condition for this is a short distance between the active centre of the enzyme and the electrode surface. In order to achieve a short distance, several porous graphite-like materials made of pyrolysed cobalt porphyrins where used in the second part of this work for the electrode production. It turned out that one of the tested materials, which had pores about the same size as the enzyme, did exchange electrons with the enzyme about 200 times faster than solid graphite. HRP itself contains an iron protoporphyrin, i.e. a planar molecule consisting of four rings with an iron atom in the middle, its active centre. When HRP reacts with H2O2, it takes two electrons from the peroxide. One of these electrons is stored at the iron, the other in the ring system, until they are passed on to another molecule or the electrode. In the last part of this work, the iron was exchanged with osmium. The modified enzyme takes only one electron from peroxides. Thus it reacts slower with hydrogen peroxide, but faster with tert-butylhydroperoxide, an organic member of the peroxide family.show moreshow less

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Metadaten
Author:Noya Loew
URN:urn:nbn:de:kobv:517-opus-18430
Advisor:Frieder W. Scheller
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2008
Publishing Institution:Universität Potsdam
Granting Institution:Universität Potsdam
Date of final exam:2008/04/21
Release Date:2008/05/14
Tag:Biosensor; Elektrochemie; Peroxid; Peroxidase; Porphyrin
Biosensor; Electrochemistry; Peroxidase; Peroxide; Porphyrin
RVK - Regensburg Classification:VG 6867
Organizational units:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Biochemie und Biologie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
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