TY - THES A1 - Hintsche, Marius T1 - Locomotion of a bacterium with a polar bundle of flagella T1 - Fortbewegung eines Bakteriums mit einem polaren Flagellenbündel BT - insights into movement and navigation by fluorescence high speed microscopy BT - Erkentnisse über Bewegung und Navigation mittels Hochgeschwindigkeitsfluoreszenzmikroskopie N2 - Movement and navigation are essential for many organisms during some parts of their lives. This is also true for bacteria, which can move along surfaces and swim though liquid environments. They are able to sense their environment, and move towards environmental cues in a directed fashion. These abilities enable microbial lifecyles in biofilms, improved food uptake, host infection, and many more. In this thesis we study aspects of the swimming movement - or motility - of the soil bacterium (P. putida). Like most bacteria, P. putida swims by rotating its helical flagella, but their arrangement differs from the main model organism in bacterial motility research: (E. coli). P. putida is known for its intriguing motility strategy, where fast and slow episodes can occur after each other. Up until now, it was not known how these two speeds can be produced, and what advantages they might confer to this bacterium. Normally the flagella, the main component of thrust generation in bacteria, are not observable by ordinary light microscopy. In order to elucidate this behavior, we therefore used a fluorescent staining technique on a mutant strain of this species to specifically label the flagella, while leaving the cell body only faintly stained. This allowed us to image the flagella of the swimming bacteria with high spacial and temporal resolution with a customized high speed fluorescence microscopy setup. Our observations show that P. putida can swim in three different modes. First, It can swim with the flagella pushing the cell body, which is the main mode of swimming motility previously known from other bacteria. Second, it can swim with the flagella pulling the cell body, which was thought not to be possible in situations with multiple flagella. Lastly, it can wrap its flagellar bundle around the cell body, which results in a speed wich is slower by a factor of two. In this mode, the flagella are in a different physical conformation with a larger radius so the cell body can fit inside. These three swimming modes explain the previous observation of two speeds, as well as the non strict alternation of the different speeds. Because most bacterial swimming in nature does not occur in smoothly walled glass enclosures under a microscope, we used an artificial, microfluidic, structured system of obstacles to study the motion of our model organism in a structured environment. Bacteria were observed in microchannels with cylindrical obstacles of different sizes and with different distances with video microscopy and cell tracking. We analyzed turning angles, run times, and run length, which we compared to a minimal model for movement in structured geometries. Our findings show that hydrodynamic interactions with the walls lead to a guiding of the bacteria along obstacles. When comparing the observed behavior with the statics of a particle that is deflected with every obstacle contact, we find that cells run for longer distances than that model. Navigation in chemical gradients is one of the main applications of motility in bacteria. We studied the swimming response of P. putida cells to chemical stimuli (chemotaxis) of the common food preservative sodium benzoate. Using a microfluidic gradient generation device, we created gradients of varying strength, and observed the motion of cells with a video microscope and subsequent cell tracking. Analysis of different motility parameters like run lengths and times, shows that P. putida employs the classical chemotaxis strategy of E. coli: runs up the gradient are biased to be longer than those down the gradient. Using the two different run speeds we observed due to the different swimming modes, we classify runs into `fast' and `slow' modes with a Gaussian mixture model (GMM). We find no evidence that P. putida's uses its swimming modes to perform chemotaxis. In most studies of bacterial motility, cell tracking is used to gather trajectories of individual swimming cells. These trajectories then have to be decomposed into run sections and tumble sections. Several algorithms have been developed to this end, but most require manual tuning of a number of parameters, or extensive measurements with chemotaxis mutant strains. Together with our collaborators, we developed a novel motility analysis scheme, based on generalized Kramers-Moyal-coefficients. From the underlying stochastic model, many parameters like run length etc., can be inferred by an optimization procedure without the need for explicit run and tumble classification. The method can, however, be extended to a fully fledged tumble classifier. Using this method, we analyze E. coli chemotaxis measurements in an aspartate analog, and find evidence for a chemotactic bias in the tumble angles. N2 - Bewegung und Navigation sind für viele Organismen in einigen Bereichen ihres Lebens unerlässlich. Dies gilt auch für Bakterien, die sich entlang von Oberflächen bewegen und durch Flüssigkeiten schwimmen können. Sie sind in der Lage, ihre Umgebung wahr zu nehmen und sich gezielt auf Signale in der Umwelt zuzubewegen. Diese Fähigkeiten ermöglichen mikrobielle Lebenszyklen in Biofilmen, verbesserte Nahrungsaufnahme, Wirtsinfektion und vieles mehr. In dieser Arbeit untersuchen wir Aspekte der Schwimmbewegung - oder Motilität - des Bodenbakteriums Pseudomonas putida (P. putida). Wie die meisten Bakterien schwimmt P. putida durch Rotation seiner schraubenförmigen Flagellen, aber ihre Anordnung unterscheidet sich vom Hauptmodellorganismus in der bakteriellen Motilitätsforschung: Escherichia coli (E. coli). P. putida ist bekannt für seine faszinierende Motilitätsstrategie, bei der schnelle und langsame Episoden hintereinander auftreten können. Bislang war nicht bekannt, wie diese beiden Geschwindigkeiten erzeugt werden können und welche Vorteile sie diesem Bakterium bringen können. Normalerweise sind die Flagellen, die Hauptkomponente der Schuberzeugung bei Bakterien, mit herkömmlicher Lichtmikroskopie nicht zu beobachten. Um dieses Verhalten zu verdeutlichen, haben wir daher eine Fluoreszenzfärbetechnik an einem Mutantenstamm dieser Spezies eingesetzt, um die Flagellen spezifisch zu markieren und gleichzeitig den Zellkörper nur schwach gefärbt zu lassen. Dies ermöglichte es uns, die Geißeln der schwimmenden Bakterien mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung mit einem maßgeschneiderten Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzmikroskopie-Setup darzustellen. Unsere Beobachtungen zeigen, dass P. putida in drei verschiedenen Modi schwimmen kann. Erstens kann es mit den Flagellen den Zellkörper vorwärts drücken, was der wichtigste Modus der Schwimmmotilität ist, der zuvor von anderen Bakterien bekannt war. Zweitens kann es mit den Flagellen den Zellkörper hinter sich her ziehen, was in Situationen mit mehreren Flagellen für nicht möglich gehalten wurde. Schließlich kann es sein Flagellenbündel um den Zellkörper wickeln, was zu einer um den Faktor zwei verlangsamten Geschwindigkeit führt. In diesem Modus befinden sich die Flagellen in einer anderen physikalischen Konformation mit einem größeren Radius, so dass der Zellkörper hineinpassen kann. Diese drei Schwimmmodi erklären die vorherige Beobachtung von zwei Geschwindigkeiten sowie das nicht strenge Abwechseln der verschiedenen Geschwindigkeiten. Da das Schwimmen von Bakterien in der Natur nicht in glattwandigen Glaskammern unter dem Mikroskop stattfindet, haben wir ein künstliches, mikrofluidisches, strukturiertes System von Hindernissen verwendet, um die Bewegung unseres Modellorganismus in einer strukturierten Umgebung zu untersuchen. Bakterien wurden in Mikrokanälen mit zylindrischen Hindernissen unterschiedlicher Größe und mit unterschiedlichen Abständen mit Videomikroskopie und Zelltracking beobachtet. Wir analysierten Turn-Winkel, Run-Zeiten und Run-Längen, die wir mit einem Minimalmodell für die Bewegung in strukturierten Geometrien verglichen haben. Unsere Ergebnisse zeigen, dass hydrodynamische Wechselwirkungen mit den Wänden zu einer Leitung der Bakterien entlang von Hindernissen führen. Vergleicht man das beobachtete Verhalten mit der Statik eines Partikels, das bei jedem Hinderniskontakt umgelenkt wird, so stellt man fest, dass Zellen über längere Strecken Laufen als in dieses Modell. Die Navigation in chemischen Gradienten ist eine der Hauptapplikation der Motilität bei Bakterien. Wir untersuchten die Schwimmreaktion von P. putida Zellen auf chemische Reize (Chemotaxis) des gängigen Lebensmittelkonservierungsmittels Natriumbenzoat. Mit einem mikrofluidischen Gradientengenerator erzeugten wir Gradienten unterschiedlicher Stärke und beobachteten die Bewegung der Zellen mit einem Videomikroskop und anschließendem Zelltracking. Die Analyse verschiedener Motilitätsparameter wie Lauflängen und -zeiten zeigt, dass P. putida die klassische Chemotaxiestrategie von E. coli anwendet: Läufe gradientenaufwärts sind im Mittel länger sein als solche gradientenabwärts. Mit den beiden verschiedenen Laufgeschwindigkeiten, die wir aufgrund der unterschiedlichen Schwimmmodi beobachtet haben, klassifizieren wir Läufe in schnelle und langsame Modi mit einem "Gaussian Mixture Model" (GMM). Wir finden keinen Beweis dafür, dass P. putida seine Schwimmmodi nutzt, um Chemotaxis durchzuführen. In den meisten Studien zur bakteriellen Motilität wird das Zelltracking verwendet, um die Trajektorien einzelner schwimmender Zellen zu erfassen. Diese Trajektorien müssen dann in Lauf- und Wendeabschnitte (Runs und Turns) zerlegt werden. Mehrere Algorithmen wurden zu diesem Zweck entwickelt, aber die meisten erfordern eine manuelle Abstimmung einer Reihe von Parametern oder umfangreiche Messungen mit chemotaktischen Mutantenstämmen. Zusammen mit unseren Mitarbeitern haben wir ein neuartiges Motilitätsanalyseschema entwickelt, das auf verallgemeinerten Kramers-Moyal-Koeffizienten basiert. Aus dem zugrunde liegenden stochastischen Modell können viele Parameter wie Lauflänge etc. durch ein Optimierungsverfahren abgeleitet werden, ohne dass eine explizite Run und Turn Klassifizierung erforderlich ist. Das Verfahren kann jedoch zu einem vollwertigen Klassifizierer ausgebaut werden. Mit dieser Methode analysieren wir E. coli Chemotaxis Messungen in einem Gradienten eines Aspartat analogen Chemoattractors und finden Beweise für eine chemotaktische Variation der Tumble-Winkeln. KW - bacteria KW - motility KW - chemotaxis KW - Bakterien KW - Motilität KW - Chemotaxis Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-426972 ER - TY - THES A1 - Schindler, Daniel T1 - Mathematical modeling and simulation of protrusion-driven cell dynamics T1 - Mathematische Modellierung und Simulation von amöboiden Zelldynamiken N2 - Amoeboid cell motility takes place in a variety of biomedical processes such as cancer metastasis, embryonic morphogenesis, and wound healing. In contrast to other forms of cell motility, it is mainly driven by substantial cell shape changes. Based on the interplay of explorative membrane protrusions at the front and a slower-acting membrane retraction at the rear, the cell moves in a crawling kind of way. Underlying these protrusions and retractions are multiple physiological processes resulting in changes of the cytoskeleton, a meshwork of different multi-functional proteins. The complexity and versatility of amoeboid cell motility raise the need for novel computational models based on a profound theoretical framework to analyze and simulate the dynamics of the cell shape. The objective of this thesis is the development of (i) a mathematical framework to describe contour dynamics in time and space, (ii) a computational model to infer expansion and retraction characteristics of individual cell tracks and to produce realistic contour dynamics, (iii) and a complementing Open Science approach to make the above methods fully accessible and easy to use. In this work, we mainly used single-cell recordings of the model organism Dictyostelium discoideum. Based on stacks of segmented microscopy images, we apply a Bayesian approach to obtain smooth representations of the cell membrane, so-called cell contours. We introduce a one-parameter family of regularized contour flows to track reference points on the contour (virtual markers) in time and space. This way, we define a coordinate system to visualize local geometric and dynamic quantities of individual contour dynamics in so-called kymograph plots. In particular, we introduce the local marker dispersion as a measure to identify membrane protrusions and retractions in a fully automated way. This mathematical framework is the basis of a novel contour dynamics model, which consists of three biophysiologically motivated components: one stochastic term, accounting for membrane protrusions, and two deterministic terms to control the shape and area of the contour, which account for membrane retractions. Our model provides a fully automated approach to infer protrusion and retraction characteristics from experimental cell tracks while being also capable of simulating realistic and qualitatively different contour dynamics. Furthermore, the model is used to classify two different locomotion types: the amoeboid and a so-called fan-shaped type. With the complementing Open Science approach, we ensure a high standard regarding the usability of our methods and the reproducibility of our research. In this context, we introduce our software publication named AmoePy, an open-source Python package to segment, analyze, and simulate amoeboid cell motility. Furthermore, we describe measures to improve its usability and extensibility, e.g., by detailed run instructions and an automatically generated source code documentation, and to ensure its functionality and stability, e.g., by automatic software tests, data validation, and a hierarchical package structure. The mathematical approaches of this work provide substantial improvements regarding the modeling and analysis of amoeboid cell motility. We deem the above methods, due to their generalized nature, to be of greater value for other scientific applications, e.g., varying organisms and experimental setups or the transition from unicellular to multicellular movement. Furthermore, we enable other researchers from different fields, i.e., mathematics, biophysics, and medicine, to apply our mathematical methods. By following Open Science standards, this work is of greater value for the cell migration community and a potential role model for other Open Science contributions. N2 - Amöboide Zellmotilität findet bei einer Vielzahl biomedizinischer Prozesse wie Krebsmetastasierung, embryonaler Morphogenese und Wundheilung statt. Im Gegensatz zu anderen Formen der Zellmotilität wird sie hauptsächlich durch erhebliche Formveränderungen der Zelle angetrieben. Sie beruht auf dem Zusammenspiel von explorativen Membranausstülpungen an der Vorderseite und einem langsamer wirkenden Membraneinzug an der Rückseite. Die Komplexität amöboider Zellmotilität machen neue Berechnungsmodelle erforderlich, um die Dynamik der Zellform mathematisch fundiert zu analysieren und zu simulieren. Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung (i) eines mathematischen Frameworks zur Beschreibung der Konturendynamik in Zeit und Raum, (ii) eines Computermodells, um Eigenschaften der Membranveränderungen von einzelnen Zellen zu inferieren und gleichzeitig realistische Konturdynamiken zu simulieren, (iii) und eines ergänzenden Open-Science-Ansatzes, um die oben genannten Methoden vollständig zugänglich und leicht anwendbar zu machen. Auf der Grundlage von aufeinander folgenden Mikroskopiebildern vom Modellorganismus Dictyostelium discoideum, wenden wir einen Bayesschen Ansatz an, um glatte Darstellungen der Zellmembran, sogenannte Zellkonturen, zu erhalten. Wir führen eine einparametrige Familie von regularisierten Konturflüssen ein, um Referenzpunkte auf der Kontur (virtuelle Marker) in Zeit und Raum zu verfolgen. Auf diese Weise definieren wir ein Koordinatensystem zur Visualisierung lokaler geometrischer und dynamischer Größen der individuellen Konturdynamiken in sogenannten Kymographen-Plots. Insbesondere führen wir die lokale Marker-Dispersion ein, mit der signifikante Membranveränderungen identifiziert werden können. Dieses mathematische Framework bildet die Grundlage für unser neues Modell zur Beschreibung von Konturendynamiken. Es besteht aus drei biophysiologisch motivierten Komponenten: einem stochastischen Term, der die Membranausstülpungen steuert, und zwei deterministischen Termen, die das Membraneinziehen, unter Berücksichtigung der Konturform und -fläche, steuern. Unser Modell bietet einen vollautomatisierten Ansatz zur Inferrenz der Charakteristiken von Membranveränderungen für experimentelle Zelldaten. Außerdem ermöglicht es die Simulation von realistischen und qualitativ unterschiedlichen Konturendynamiken. Mit dem ergänzenden Open-Science-Ansatz setzen wir einen hohen Standard hinsichtlich der Nutzbarkeit unserer Methoden und der Reproduzierbarkeit unserer Forschung. In diesem Kontext stellen wir die Softwarepublikation AmoePy vor, ein Open-Source-Pythonpaket zur Segmentierung, Analyse und Simulation von amöboider Zellmotilität. Darüber hinaus beschreiben wir Maßnahmen zur Verbesserung der Benutzerfreundlichkeit und Erweiterbarkeit, z. B. durch detaillierte Ausführanweisungen und eine automatisch generierte Quellcodedokumentation, und zur Gewährleistung der Funktionalität und Stabilität, z. B. durch automatische Softwaretests, Datenvalidierung und eine hierarchische Paketstruktur. Die mathematischen Methoden dieser Arbeit stellen wesentliche Verbesserungen in der Modellierung und Analyse der amöboiden Zellmotilität dar. Wir sind der Ansicht, dass die oben genannten Methoden aufgrund ihrer Verallgemeinerbarkeit von größerem Wert für andere wissenschaftliche Anwendungen sind und potentiell einsetzbar in verschiedenen Wissenschaftsfeldern sind, u. a. Mathematik, Biophysik und Medizin. Durch die Einhaltung von Open-Science-Standards ist diese Arbeit von größerem Wert und ein potenzielles Vorbild für andere Open-Science-Beiträge. KW - amöboide Bewegung KW - Zellmotilität KW - mathematische Modellierung KW - offene Wissenschaft KW - amoeboid motion KW - cell motility KW - mathematical modeling KW - open science Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-613275 ER -