TY - THES A1 - Grafe, Marianne Erika T1 - Analysis of supramolecular assemblies of NE81, the first lamin protein in a non-metazoan organism T1 - Analyse von supramolekularen Komplexen von NE81, dem ersten Lamin in einem nicht-metazoischen Organismus N2 - Lamine sind Proteine an der inneren Kernhülle und bilden zusammen mit verbundenen Proteinen die nukleäre Lamina. Dieses Netzwerk sorgt für die Stabilität des Zellkerns und unterstützt die Organisation des Zell-Zytoskeletts. Zusätzlich sind Lamine und ihre verbundenen Proteine in viele Prozesse wie Genregulation und Zelldifferenzierung involviert. Bis 2012 war der Stand der Forschung, dass nur bei mehrzelligen Organismen eine nukleäre Lamina zu finden ist. NE81 ist das erste lamin-ähnliche Protein, das in einem nicht-mehrzelligen Organismus (Dictyostelium discoideum) entdeckt wurde. Es hat viele Eigenschaften und Strukturmerkmale mit Laminen gemeinsam. Dazu zählt der dreiteilige Aufbau des Proteins, eine Phosphorylierungsstelle für ein Zellzyklus-abhängiges Enzym, ein Kernlokalisationssignal, wodurch das Protein in den Kern transportiert wird, sowie eine C-terminale Sequenz zur Verankerung des Proteins in der Kernhülle. In dieser Arbeit wurden verschiedene Methoden zur vereinfachten Untersuchung von Laminstrukturen getestet, um zu zeigen, dass sich NE81 wie bereits bekannte Lamin-Proteine verhält und supramolekulare Netzwerke aus Laminfilamenten bildet. Zur Analyse der Struktur supramolekularer Anordnungen wurde das Protein durch Entfernen des Kernlokalisationssignals auf der äußeren Kernhülle von Dictyostelium gebildet. Die anschließende Untersuchung der Oberfläche der Kerne mit einem Rasterelektronenmikroskop zeigte, dass NE81 Strukturen in der Größe von Laminen bildet, allerdings nicht in regelmäßigen filamentösen Anordnungen. Um die Entstehung der Laminfilamente zu untersuchen, wurde lösliches NE81 aus Dictyostelium aufgereinigt und mit verschiedenen mikroskopischen Methoden untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass NE81 unter Niedrigsalz-Bedingungen dünne, fadenförmige Strukturen und Netzwerke ausbildet, die denen von Säugetier-Laminen sehr ähnlich sind. Die Mutation der Phosphorylierungsstelle von NE81 zu einer imitierenden dauerhaften Phosphorylierung von NE81 in der Zelle, zeigte zunächst ein gelöstes Protein, das überraschenderweise unter Blaulichtbestrahlung der Zelle wieder lamin-ähnliche Anordnungen formte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass NE81 echte Laminstrukturen ausbilden kann und hebt Dictyostelium als Nicht-Säugetier-Modellorganismus mit einer gut charakterisierten Kernhülle, mit allen relevanten, aus tierischen Zellen bekannten Proteinen, hervor. N2 - Nuclear lamins are nucleus-specific intermediate filaments forming a network located at the inner nuclear membrane of the nuclear envelope. They form the nuclear lamina together with proteins of the inner nuclear membrane regulating nuclear shape and gene expression, among others. The amoebozoan Dictyostelium NE81 protein is a suitable candidate for an evolutionary conserved lamin protein in this non-metazoan organism. It shares the domain organization of metazoan lamins and is fulfilling major lamin functions in Dictyostelium. Moreover, field-emission scanning electron microscopy (feSEM) images of NE81 expressed on Xenopus oocytes nuclei revealed filamentous structures with an overall appearance highly reminiscent to that of metazoan Xenopus lamin B2. For the classification as a lamin-like or a bona fide lamin protein, a better understanding of the supramolecular NE81 structure was necessary. Yet, NE81 carrying a large N-terminal GFP-tag turned out as unsuitable source for protein isolation and characterization; GFP-NE81 expressed in Dictyostelium NE81 knock-out cells exhibited an abnormal distribution, which is an indicator for an inaccurate assembly of GFP-tagged NE81. Hence, a shorter 8×HisMyc construct was the tag of choice to investi-gate formation and structure of NE81 assemblies. One strategy was the structural analysis of NE81 in situ at the outer nuclear membrane in Dictyostelium cells; NE81 without a func-tional nuclear localization signal (NLS) forms assemblies at the outer face of the nucleus. Ultrastructural feSEM pictures of NE81ΔNLS nuclei showed a few filaments of the expected size but no repetitive filamentous structures. The former strategy should also be established for metazoan lamins in order to facilitate their structural analysis. However, heterologously expressed Xenopus and C. elegans lamins showed no uniform localization at the outer nucle-ar envelope of Dictyostelium and hence, no further ultrastructural analysis was undertaken. For in vitro assembly experiments a Dictyostelium mutant was generated, expressing NE81 without the NLS and the membrane-anchoring isoprenylation site (HisMyc-NE81ΔNLSΔCLIM). The cytosolic NE81 clusters were soluble at high ionic strength and were purified from Dictyostelium extracts using Ni-NTA Agarose. Widefield immunofluorescence microscopy, super-resolution light microscopy and electron microscopy images of purified NE81 showed its capability to form filamentous structures at low ionic strength, as described previously for metazoan lamins. Introduction of a phosphomimetic point mutation (S122E) into the CDK1-consensus sequence of NE81 led to disassembled NE81 protein in vivo, which could be reversibly stimulated to form supramolecular assemblies by blue light exposure. The results of this work reveal that NE81 has to be considered a bona fide lamin, since it is able to form filamentous assemblies. Furthermore, they highlight Dictyostelium as a non-mammalian model organism with a well-characterized nuclear envelope containing all rele-vant protein components known in animal cells. KW - lamin KW - NE81 KW - Dictyostelium KW - nuclear envelope KW - nuclear lamina KW - expansion microscopy KW - Lamin KW - NE81 KW - Dictyostelium KW - Kernhülle KW - nukleäre Lamina KW - Expansions-Mikroskopie Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-441802 ER - TY - THES A1 - Koikkarah Aji, Amit T1 - Quantitative sub cellular characterization of Hantavirus structural proteins T1 - Quantitativ Subzellulär Charakterisierung Von Hantavirus-Strukturproteine. N2 - Hantaviruses (HVs) are a group of zoonotic viruses that infect human beings primarily through aerosol transmission of rodent excreta and urine samplings. HVs are classified geographically into: Old World HVs (OWHVs) that are found in Europe and Asia, and New World HVs (NWHVs) that are observed in the Americas. These different strains can cause severe hantavirus diseases with pronounced renal syndrome or severe cardiopulmonary system distress. HVs can be extremely lethal, with NWHV infections reaching up to 40 % mortality rate. HVs are known to generate epidemic outbreaks in many parts of the world including Germany, which has seen periodic HV infections over the past decade. HV has a trisegmented genome. The small segment (S) encodes the nucleocapsid protein (NP), the middle segment (M) encodes the glycoproteins (GPs) Gn and Gc which forms up to tetramers and primarily monomers \& dimers upon independent expression respectively and large segment (L) encodes RNA dependent RNA polymerase (RdRp). Interactions between these viral proteins are crucial in providing mechanistic insights into HV virion development. Despite best efforts, there continues to be lack of quantification of these associations in living cells. This is required in developing the mechanistic models for HV viral assembly. This dissertation focuses on three key questions pertaining to the initial steps of virion formation that primarily involves the GPs and NP. The research investigations in this work were completed using Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) approaches. FCS is frequently used in assessing the biophysical features of bio-molecules including protein concentration and diffusion dynamics and circumvents the requirement of protein overexpression. FCS was primarily applied in this thesis to evaluate protein multimerization, at single cell resolution. The first question addressed which GP spike formation model proposed by Hepojoki et al.(2010) appropriately describes the evidence in living cells. A novel in cellulo assay was developed to evaluate the amount of fluorescently labelled and unlabeled GPs upon co-expression. The results clearly showed that Gn and Gc initially formed a heterodimeric Gn:Gc subunit. This sub-unit then multimerizes with congruent Gn:Gc subunits to generate the final GP spike. Based on these interactions, models describing the formation of GP complex (with multiple GP spike subunits) were additionally developed. HV GP assembly primarily takes place in the Golgi apparatus (GA) of infected cells. Interestingly, NWHV GPs are hypothesized to assemble at the plasma membrane (PM). This led to the second research question in this thesis, in which a systematic comparison between OWHV and NWHV GPs was conducted to validate this hypothesis. Surprisingly, GP localization at the PM was congruently observed with OWHV and NWHV GPs. Similar results were also discerned with OWHV and NWHV GP localization in the absence of cytoskeletal factors that regulate HV trafficking in cells. The final question focused on quantifying the NP-GP interactions and understanding their influence of NP and GP multimerization. Gc mutlimers were detected in the presence of NP and complimented by the presence of localized regions of high NP-Gc interactions in the perinuclear region of living cells. Gc-CT domain was shown to influence NP-Gc associations. Gn, on the other hand, formed up to tetrameric complexes, independent from the presence of NP. The results in this dissertation sheds light on the initial steps of HV virion formation by quantifying homo and heterotypic interactions involving NP and GPs, which otherwise are very difficult to perform. Finally, the in cellulo methodologies implemented in this work can be potentially extended to understand other key interactions involved in HV virus assembly. N2 - Hantaviren (HVs) gehören zu einer Gruppe von Zoonosenviren, die den Menschen hauptsächlich über Aerosolübertragung von Nagetierausscheidungen und Urinproben infizieren. HVs werden geografisch unterteilt in: Alte Welt-HVs (OWHVs), die in Europa und Asien vorkommen, und Neue Welt-HVs (NWHVs), die auf dem amerikanischen Kontinent beobachtet werden. Diese verschiedenen Stämme können schwere Krankheiten verursachen, wie hämorrhagisches Fieber mit Nierensyndrom oder schwere Herz-Lungen-Störungen. HVs haben eine hohe Sterblichkeitsrate, wobei NWHV-Infektionen eine Sterblichkeitsrate von bis zu 40 % erreichen. Es ist bekannt, dass HVs in vielen Teilen der Welt epidemische Ausbrüche verursachen können, so auch in Deutschland, wo in den letzten zehn Jahren regelmäßig HV-Infektionen vorkamen. HV besitzt ein trisegmentiertes Genom. Das kleine Segment (S) kodiert das Nukleokapsidprotein (NP), das mittlere Segment (M) kodiert die Glykoproteine (GPs) Gn und Gc, die bei unabhängiger Expression Tetramere und Dimere bilden, und das große Segment (L) kodiert die RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp). Die Wechselwirkungen zwischen diesen viralen Proteinen sind von entscheidender Bedeutung für die Aufklärung der Mechanismen der HV-entwicklung. Trotz aller Bemühungen fehlt es nach wie vor an der Quantifizierung dieser Verbindungen in lebenden Zellen. Dies ist für die Entwicklung komplexer Modelle für den Aufbau von HV erforderlich. Diese Arbeit konzentriert sich auf drei Schlüsselfragen im Zusammenhang mit den ersten Phasen der Virionenbildung, an denen hauptsächlich die GPs und NP beteiligt sind. Die Forschungsaufgaben in dieser Arbeit wurden mit Hilfe der Fluoreszenzkorrelationspektroskopie (FCS) untersucht. Die FCS wird häufig zur Bewertung der biophysikalischen Eigenschaften von Biomolekülen, einschließlich der Proteinkonzentration und Diffusionsdynamik, eingesetzt und macht eine Überexpression von Proteinen überflüssig. In dieser Arbeit wurde FFS in erster Linie eingesetzt, um die Multimerisierung von Proteinen bei Einzelzellauflösung zu untersuchen. Die erste Frage lautete, welches das von Hepojoki et al. (2010) vorgeschlagene Modell der GP-Spike-Bildung den Vorgang in lebenden Zellen adäquat beschreibt. Es wurde ein neuartiger in cellulo-Assay entwickelt, um die Konzentration von fluoreszenzmarkierten und unmarkierten GPs bei der Ko-expression zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass Gn und Gc zunächst eine heterodimere Gn:Gc-Untereinheit bilden. Diese Untereinheit multimerisiert dann mit kongruenten Gn:Gc-Untereinheiten, um den finalen GP-Spike zu erzeugen. Auf der Grundlage dieser Interaktionen wurden zusätzlich Modelle entwickelt, die die Bildung des GP-Komplexes (mit mehreren GP-Spike-Untereinheiten) beschreiben. Die HV-GP-Assemblierung findet hauptsächlich im Golgi-Apparat (GA) von infizierten Zellen statt. Interessanterweise wird angenommen, dass NWHV GPs an der Plasmamembran (PM) assembliert werden. Dies führte zur zweiten Frage dieser Arbeit, bei der ein systematischer Vergleich zwischen OWHV- und NWHV-GP durchgeführt wurde, um diese Hypothese zu bestätigen. Überraschenderweise wurde die GP-Lokalisierung an der PM bei OWHV- und NWHV-GPs gleichermaßen beobachtet. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei der Lokalisierung von OWHV- und NWHV-GP in Abwesenheit von zytoskelettalen Faktoren festgestellt, die die HV-Infektion regulieren. Die letzte Frage dieser Arbeit konzentrierte sich auf die Quantifizierung der NP-GP-Wechselwirkungen und das Verständnis ihres Einflusses auf die Multimerisierung von NP und GPs. Gc-Multimere, die in Gegenwart von NP nachgewiesen wurden, wurden durch das Vorhandensein von perinukleär lokalisierten Regionen mit starken NP-Gc-Wechselwirkungen in lebenden Zellen komplettiert. Es wurde gezeigt, dass die Gc-CT-Domäne die NP-Gc-Assoziationen beeinflusst. Gn hingegen bildete unabhängig von der Anwesenheit von NP tetramerische Komplexe. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben Aufschluss über die ersten Phasen der HV-Assemblierung, indem sie die Homo- und Hetero-Interaktionen zwischen NP und GPs quantifizieren, was sonst nur sehr schwer möglich ist. Schließlich können die in dieser Arbeit implementierten in cellulo-Methoden potenziell erweitert werden, um andere Schlüsselinteraktionen zu verstehen, die an der HV-Assemblierung beteiligt sind. KW - Hantavirus KW - fluorescence microscopy KW - fluorescence correlation spectroscopy KW - protein multimerization KW - virus assembly KW - single cell imaging KW - Hantaviren KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Fluoreszenzkorrelationspektroskopie KW - Virionenbildung KW - Proteinmultimerisierung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-586612 ER - TY - THES A1 - Dunsing, Valentin T1 - Fluorescence fluctuation spectroscopy techniques to quantify molecular interactions and dynamics in complex biological systems N2 - Living cells rely on transport and interaction of biomolecules to perform their diverse functions. A powerful toolbox to study these highly dynamic processes in the native environment is provided by fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) techniques. In more detail, FFS takes advantage of the inherent dynamics present in biological systems, such as diffusion, to infer molecular parameters from fluctuations of the signal emitted by an ensemble of fluorescently tagged molecules. In particular, two parameters are accessible: the concentration of molecules and their transit times through the observation volume. In addition, molecular interactions can be measured by analyzing the average signal emitted per molecule - the molecular brightness - and the cross-correlation of signals detected from differently tagged species. In the present work, several FFS techniques were implemented and applied in different biological contexts. In particular, scanning fluorescence correlation spectroscopy (sFCS) was performed to measure protein dynamics and interactions at the plasma membrane (PM) of cells, and number and brightness (N&B) analysis to spatially map molecular aggregation. To account for technical limitations and sample related artifacts, e.g. detector noise, photobleaching, or background signal, several correction schemes were explored. In addition, sFCS was combined with spectral detection and higher moment analysis of the photon count distribution to resolve multiple species at the PM. Using scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy and cross-correlation N&B, the interactions of amyloid precursor-like protein 1 (APLP1), a synaptic membrane protein, were investigated. It is shown for the first time directly in living cells, that APLP1 undergoes specific interactions at cell-cell contacts. It is further demonstrated that zinc ions induce formation of large APLP1 clusters that enrich at contact sites and bind to clusters on the opposing cell. Altogether, these results provide direct evidence that APLP1 is a zinc ion dependent neuronal adhesion protein. In the context of APLP1, discrepancies of oligomeric state estimates were observed, which were attributed to non-fluorescent states of the chosen red fluorescent protein (FP) tag mCardinal (mCard). Therefore, multiple FPs and their performance in FFS based measurements of protein interactions were systematically evaluated. The study revealed superior properties of monomeric enhanced green fluorescent protein (mEGFP) and mCherry2. Furthermore, a simple correction scheme allowed unbiased in situ measurements of protein oligomerization by quantifying non-fluorescent state fractions of FP tags. The procedure was experimentally confirmed for biologically relevant protein complexes consisting of up to 12 monomers. In the last part of this work, fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and single particle tracking (SPT) were used to characterize diffusive transport dynamics in a bacterial biofilm model. Biofilms are surface adherent bacterial communities, whose structural organization is provided by extracellular polymeric substances (EPS) that form a viscous polymer hydrogel. The presented study revealed a probe size and polymer concentration dependent (anomalous) diffusion hindrance in a reconstituted EPS matrix system caused by polymer chain entanglement at physiological concentrations. This result indicates a meshwork-like organization of the biofilm matrix that allows free diffusion of small particles, but strongly hinders diffusion of larger particles such as bacteriophages. Finally, it is shown that depolymerization of the matrix by phage derived enzymes rapidly facilitated free diffusion. In the context of phage infections, such enzymes may provide a key to evade trapping in the biofilm matrix and promote efficient infection of bacteria. In combination with phage application, matrix depolymerizing enzymes may open up novel antimicrobial strategies against multiresistant bacterial strains, as a promising, more specific alternative to conventional antibiotics. N2 - Die Funktion lebender Zellen basiert auf Transport und Interaktion von Biomolekülen. Zur genauen Untersuchung dieser dynamischen Prozesse in lebenden Zellen eignen sich Fluoreszenzfluktuationsspektroskopieverfahren (FFS). Diese nutzen durch Diffusion oder andere Prozesse auftretende Fluktuationen, um Größen auf molekularer Skala durch statistische Analyse des Signals fluoreszenzmarkierter Moleküle zu ermitteln. Insbesondere können die Konzentration der Moleküle und ihre mittlere Verweildauer im Beobachtungsvolumen quantifiziert werden. Außerdem lassen sich molekulare Interaktionen anhand des mittleren Signals pro Molekül, der sogenannten molekularen Helligkeit, und der Kreuzkorrelation der Signale verschieden markierter Moleküle untersuchen. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene FFS Methoden etabliert und zur Erforschung biologischer Prozesse genutzt. Um Dynamiken und Bindungsvorgänge an der Zellmembran zu untersuchen, wurde Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) unter Nutzung eines linearen Scanwegs (sFCS) verwendet. Außerdem wurde die Oligomerisierung von Proteinen mittels Number&Brightness (N&B) Analyse räumlich aufgelöst. Verschiedene Korrekturverfahren wurden validiert und angewandt, um die erhobenen Daten von Störquellen wie Bleichen der Fluorophore oder Hintergrundsignalen zu bereinigen sowie instrumentelle Größen wie Detektionsrauschen zu kalibrieren. Darüber hinaus konnten durch spektral aufgelöste Aufnahme des Fluoreszenzsignals sowie Analyse höherer statistischer Momente mehrere Molekülpopulationen gleichzeitig detektiert werden. Mittels Zweifarben-sFCS und -N&B wurde anschließend das Amyloidvorläuferprotein APLP1 untersucht, welches an Synapsen, den Kontaktstellen von Neuronen, lokalisiert. Mit dem verwendeten Ansatz konnte zum ersten Mal direkt in lebenden Zellen nachgewiesen werden, dass APLP1 spezifische Bindungen an Zellkontaktstellen eingeht. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Zinkionen eine Anreicherung und verstärkte Interaktion von APLP1 induzieren. Diese Beobachtungen unterstützen die Hypothese, dass APLP1 die Adhäsion benachbarter Zellen vermittelt und diese Funktion konzentrationsabhängig durch Zinkionen reguliert wird. Zur Untersuchung von APLP1 wurde es genetisch mit Fluoreszenzproteinen wie dem rot fluoreszierenden Protein mCardinal fusioniert. Bei der Bestimmung des Oligomerisierungszustands von APLP1 ergaben sich unter Verwendung verschiedener Fluorophore unterschiedliche Ergebnisse. Diese deuteten darauf hin, dass ein Teil der mCardinal Proteine nicht fluoreszierte. Um zu einem tieferen Verständnis dieses Phänomens und dessen Einfluss auf Interaktionsmessungen zu gelangen, wurden häufig verwendete Fluoreszenzproteine systematisch evaluiert. Auf diese Weise konnten zwei Proteine identifiziert werden, grün fluoreszierendes mEGFP und rot fluoreszierendes mCherry2, die den geringsten Anteil an nicht fluoreszierenden Zuständen aufweisen und sich deshalb am besten für Interaktionsmessungen eignen. Mittels eines einfachen Korrekturschemas basierend auf der experimentellen Bestimmung des nicht fluoreszierenden Anteils konnten genaue Messungen des Oligomerisierungszustandes von Proteinen in lebenden Zellen vorgenommen werden, was für biologisch relevante Proteine mit bis zu 12 Untereinheiten erfolgreich gezeigt werden konnte. Im letzten Teil der Arbeit wurden Diffusionsvorgänge in bakteriellen Biofilmen untersucht. Biofilme werden von Bakterienkolonien gebildet, die auf Oberflächen wachsen und beispielsweise zur Verbreitung multiresistenter Keime in Krankenhäusern beitragen. Bei der Bildung von Biofilmen spielen Polymere, die von Bakterien produziert werden, eine entscheidende Rolle. Diese füllen die Zwischenräume im Biofilm mit einer Art Gel, der sogenannten Biofilmmatrix. Anhand von FCS und Einzelpartikelverfolgung konnte gezeigt werden, dass Diffusion von Partikeln in einem rekonstituierten Gel stark von deren Größe sowie der Konzentration der Polymere abhängt. Das untersuchte System bestand hierbei aus langkettigen Zuckermolekülen, die von Biofilmen aufgereinigt wurden und als Modellsystem für die Biofilmmatrix dienten. Im physiologischen Konzentrationsbereich bildete sich ein Polymernetzwerk aus, durch das sich kleine Teilchen frei bewegen konnten, größere Partikel wie z.B. Bakteriophagen jedoch stark verlangsamt wurden. Dies lässt vermuten, dass die Biofilmmatrix die Funktion eines größenabhängigen Filters aufweist. Zersetzung der Polymere mittels Enzymen, die natürlich in Bakteriophagen vorkommen, führte zu freier Diffusion auch größerer Partikel. Die gewonnen Ergebnisse deuten darauf hin, dass solche Enzyme für Phagen eine Schlüsselfunktion besitzen, um Biofilme besser durchdringen und somit Bakterien effizienter infizieren zu können. In Kombination mit Bakteriophagen könnten (zielgerichtet optimierte) Enzyme dieser Art eine vielversprechende, spezifischere Alternative zu konventionellen Antibiotika bei der Bekämpfung multiresistenter Keime darstellen. T2 - Fluoreszenzfluktuationsspektroskopieverfahren zur Bestimmung molekularer Interaktionen und Dynamiken in komplexen biologischen Systemen KW - Fluorescence fluctuation spectroscopy KW - Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie KW - Cell-cell adhesion KW - Zell-zell Adhäsion KW - fluorescent proteins KW - Fluoreszenzproteine KW - biofilms KW - Biofilme Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-478494 ER - TY - THES A1 - Petrich, Annett T1 - Quantitative fluorescence microscopy methods to investigate molecular interactions and dynamics in living cells T1 - Quantitative Fluoreszenzmikroskopiemethoden zur Untersuchung molekularer Interaktionen und Dynamik in lebenden Zellen N2 - Biomolecules such as proteins and lipids have vital roles in numerous cellular functions, including biomolecule transport, protein functions, cellular homeostasis and biomembrane integrity. Traditional biochemistry methods do not provide precise information about cellular biomolecule distribution and behavior under native environmental conditions since they are not transferable to live cell samples. Consequently, this can lead to inaccuracies in quantifying biomolecule interactions due to potential complexities arising from the heterogeneity of native biomembranes. To overcome these limitations, minimal invasive microscopic techniques, such as fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) in combination with fluorescence proteins (FPs) and fluorescence lipid analogs, have been developed. FFS techniques and membrane property sensors enable the quantification of various parameters, including concentration, dynamics, oligomerization, and interaction of biomolecules in live cell samples. In this work, several FFS approaches and membrane property sensors were implemented and employed to examine biological processes of diverse context. Multi-color scanning fluorescence fluctuation spectroscopy (sFCS) was used the examine protein oligomerization, protein-protein interactions (PPIs) and protein dynamics at the cellular plasma membrane (PM). Additionally, two-color number and brightness (N&B) analysis was extended with the cross-correlation analysis in order to quantify hetero-interactions of proteins in the PM with very slow motion, which would not accessible with sFCS due strong initial photobleaching. Furthermore, two semi-automatic analysis pipelines were designed: spectral Förster resonance energy transfer (FRET) analysis to study changes in membrane charge at the inner leaflet of the PM, and spectral generalized polarization (GP) imaging and spectral phasor analysis to monitor changes in membrane fluidity and order. An important parameter for studying PPIs is molecular brightness, which directly determines oligomerization and can be extracted from FFS data. However, FPs often display complex photophysical transitions, including dark states. Therefore, it is crucial to characterize FPs for their dark-states to ensure reliable oligomerization measurements. In this study, N&B and sFCS analysis were applied to determine photophysical properties of novel green FPs under different conditions (i.e., excitation power and pH) in living cells. The results showed that the new FPs, mGreenLantern (mGL) and Gamillus, exhibited the highest molecular brightness at the cost of lower photostability. The well-established monomeric enhanced green fluorescent protein (mEGFP) remained the best option to investigate PPIs at lower pH, while mGL was best suited for neutral pH, and Gamillus for high pH. These findings provide guidance for selecting an appropriate FP to quantify PPIs via FFS under different environmental conditions. Next, several biophysical fluorescence microscopy approaches (i.e., sFCS, GP imaging, membrane charge FRET) were employed to monitor changes in lipid-lipid-packing in biomembranes in different biological context. Lipid metabolism in cancer cells is known to support rapid proliferation and metastasis. Therefore, targeting lipid synthesis or membrane integrity holds immense promise as an anticancer strategy. However, the mechanism of action of the novel agent erufosine (EPC3) on membrane stability is not fully under stood. The present work revealed that EPC3 reduces lipid packing and composition as well as increased membrane fluidity and dynamic, hence, modifies lipid-lipid-interaction. These effects on membrane integrity were likely triggered by modulations in lipid metabolism and membrane organization. In the case of influenza A virus (IAV) infection, regulation of lipid metabolism is crucial for multiple steps in IAV replication and is related to the pathogenicity of IAV. Here, it is shown for the first time that IAV infection triggers a local enrichment of negatively charged lipids at the inner leaflet of the PM, which decreases membrane fluidity and dynamic, as well as increases lipid packing at the assembly site in living cells. This suggests that IAV alters lipid-lipid interactions and organization at the PM. Overall, this work highlights the potential of biophysical techniques as a screening platform for studying membrane properties in living cells at the single-cell level. Finally, this study addressed remaining questions about the early stage of IAV assembly. The recruitment of matrix protein 1 (M1) and its interaction with other viral surface proteins, hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), and matrix protein 2 (M2), has been a subject of debate due to conflicting results. In this study, different FFS approaches were performed in transfected cells to investigate interactions between IAV proteins themselves and host factors at the PM. FFS measurements revealed that M2 interacts strongly with M1, leading to the translocation of M1 to the PM. This interaction likely took place along the non-canonical pathway, as evidenced by the detection of an interaction between M2 and the host factor LC3-II, leading to the recruitment of LC3-II to the PM. Moreover, weaker interaction was observed between HA and membrane-bound M1, and no interaction between NA and M1. Interestingly, higher oligomeric states of M1 were only detectable in infected cells. These results indicate that M2 initiates virion assembly by recruiting M1 to the PM, which may serve as a platform for further interactions with viral proteins and host factors. N2 - Biomoleküle wie Proteine und Lipide spielen eine wichtige Rolle bei zahlreichen Zellfunktionen, darunter Biomolekültransport, Proteinfunktionen, zelluläre Homöostase und Biomembranintegrität. Traditionelle biochemische Methoden liefern keine Informationen über die Verteilung und das Verhalten zellulärer Biomolekülen unter natürlichen Bedingungen, da sie nicht auf lebende Zellproben übertragbar sind. Folglich kann dies zu Ungenauigkeiten bei der Quantifizierung von Biomolekülinteraktionen führen und potenzielle Komplexitäten der Heterogenität nativer Biomembranen übersehen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden minimalinvasive mikroskopische Techniken wie die Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie (FFS) in Kombination mit Fluoreszenzproteinen (FPs) und Fluoreszenzlipidanaloga entwickelt. FFS-Techniken und Membraneigenschaftssensoren ermöglichen die Quantifizierung verschiedener Parameter, einschließlich Konzentration, Dynamik, Oligomerisierung und Wechselwirkung von Biomolekülen in lebenden Zellproben. In dieser Arbeit wurden mehrere FFS-Ansätze und Sensoren für Membraneigenschaften implementiert und eingesetzt, um biologische Prozesse in verschiedenen Zusammenhängen zu untersuchen. Die Mehrfarben-Scanning-Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie (sFCS) wurde zur Untersuchung von Protein-Oligomerisierung, Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) und Proteindynamik an der zellulären Plasmamembran (PM) eingesetzt. Zusätzlich wurde die Zweifarben-Analyse von Anzahl und Helligkeit (N&B) mit der Kreuzkorrelationsanalyse erweitert, um Hetero-Interaktionen von Proteinen in der PM mit sehr langsamer Dynamik zu quantifizieren, die mit sFCS aufgrund starker anfänglicher Bleiche der Fluorophore nicht zugänglich wären. Darüber hinaus wurden zwei halbautomatische Analysepipelines entwickelt: die spektrale Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Analyse zur Untersuchung von Änderungen der Membranladung auf der Innenseite der PM und die spektrale generalisierte Polarisation (GP)-Bildgebung sowie die spektrale Phasor-Analyse zur Überwachung von Änderungen der Membranfluidität und -ordnung. Ein wichtiger Parameter zur Untersuchung von PPIs ist die molekulare Helligkeit, die die Oligomerisierung direkt bestimmt und aus FFS daten extrahiert werden kann. Allerdings weisen FPs häufig komplexe photophysikalische Übergänge auf, einschließlich nichtfluoreszierender Zustände. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, FPs hinsichtlich ihrer dunklen Zustände zu charakterisieren, um zuverlässige Oligomerisierungsmessungen sicherzustellen. In dieser Studie wurden N&B- und sFCS-Analysen angewendet, um die photophysikalischen Eigenschaften neuartiger grüner FPs unter verschiedenen Bedingungen (d. h. Anregungsleistung und pH-Wert) in lebenden Zellen zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten, dass die neuen FPs mGreenLantern (mGL) und Gamillus die höchste molekulare Helligkeit aufwiesen, allerdings auf Kosten einer geringeren Photostabilität. Das etablierte mEGFP blieb die beste Option, um PPIs bei niedrigerem pH-Wert zu untersuchen, während mGL am besten für neutralen pH-Wert und Gamillus für hohen pH-Wert geeignet war. Diese Ergebnisse bieten Orientierung für die Auswahl eines geeigneten FP zur Quantifizierung von PPIs über FFS unter verschiedenen Umgebungsbedingungen. Als nächstes wurden mehrere biophysikalische Fluoreszenzmikroskopie-Ansätze (z. B. sFCS, GP-Bildgebung, Membranladung-FRET) eingesetzt, um Veränderungen in der Lipid-Lipid-Packung in Biomembranen in verschiedenen biologischen Kontexten zu überwachen. Es ist bekannt, dass der Lipidstoffwechsel in Krebszellen die schnelle Vermehrung und Metastasierung fördert. Daher ist die gezielte Beeinflussung der Lipidsynthese oder der Membranintegrität eine vielversprechende Strategie zur Krebsbekämpfung. Der Wirkungsmechanismus des neuartigen Wirkstoffs Erufosin (EPC3) auf die Membranstabilität ist nicht vollständig geklärt. Die vorliegende Arbeit ergab, dass EPC3 die Lipidpackung und -zusammensetzung reduziert sowie die Fluidität und Dynamik der Membran erhöht und somit die Lipid-Lipid-Wechselwirkung verändert. Diese Auswirkungen auf die Membranintegrität wurden wahrscheinlich durch Modulationen des Lipidstoffwechsels und der Membranorganisation ausgelöst. Im Falle einer Infektion mit dem Influenza-A-Virus (IAV) ist die Regulierung des Lipidstoffwechsels für mehrere Schritte der IAV-Replikation von entscheidender Bedeutung und hängt mit der Pathogenität von IAV zusammen. Hier wird zum ersten Mal gezeigt, dass eine IAV-Infektion eine lokale Anreicherung negativ geladener Lipide an der Innenseite der PM auslöst, die Fluidität und Dynamik der Membran verringert und die Lipidpackung an der Assemblierungsstelle in lebenden Zellen erhöht. Dies legt nahe, dass IAV die Lipid-Lipid-Wechselwirkungen und die Organisation am PM verändert. Insgesamt unterstreicht diese Arbeit das Potenzial biophysikalischer Techniken als Screening-Plattform zur Untersuchung von Membraneigenschaften in lebenden Zellen auf Einzelzellebene. Abschließend ging diese Studie auf verbleibende Fragen zur frühen Phase der IAV-Assemblierung ein. Die Rekrutierung von Matrixprotein 1 (M1) und seine Wechselwirkung mit anderen viralen Oberflächenproteinen, Hämagglutinin (HA), Neuraminidase (NA) und Matrixprotein 2 (M2), war aufgrund widersprüchlicher Ergebnisse Gegenstand von Debatten. In dieser Studie wurden verschiedene FFS-Ansätze in transfizierten Zellen durchgeführt, um Wechselwirkungen zwischen IAV-Proteinen untereinander und Wirtsfaktoren an der PM zu untersuchen. FFS-Messungen ergaben, dass M2 stark mit M1 interagiert, was zur Translokation von M1 zur PM führt. Diese Interaktion fand wahrscheinlich entlang des nichtkanonischen Weges statt, was durch den Nachweis einer Interaktion zwischen M2 und dem Wirtsfaktor LC3-II belegt wurde, die zur Rekrutierung von LC3-II zur PM führte. Darüber hinaus wurde eine schwächere Wechselwirkung zwischen HA und membrangebundenem M1 beobachtet und keine Wechselwirkung zwischen NA und M1. Interessanterweise waren höhere oligomere Zustände von M1 nur in infizierten Zellen nachweisbar. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass M2 den Zusammenbau von Virionen initiiert, indem es M1 zur PM rekrutiert, welches als Plattform für weitere Interaktionen mit viralen Proteinen und Wirtsfaktoren dienen könnte. KW - influenza A virus KW - virus-host interaction KW - cancer KW - biomolecule interactions KW - membrane fluidity KW - fluorescence fluctuation spectroscopy KW - fluorescent proteins KW - biosensors KW - Biomolekülinteraktionen KW - Biosensoren KW - Krebs KW - Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie KW - fluoreszierende Proteine KW - Influenza A Virus KW - Membranfluidität KW - Virus-Wirt-Interaktion Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-611800 ER - TY - THES A1 - Sarlet, Adrien T1 - Tuning the viscoelasticity of Escherichia coli biofilms T1 - Abstimmung der Viskoelastizität von Escherichia coli-Biofilmen BT - interplay between extrinsic and intrinsic factors BT - Wechselspiel zwischen extrinsischen und intrinsischen Faktoren N2 - Biofilms are heterogeneous structures made of microorganisms embedded in a self-secreted extracellular matrix. Recently, biofilms have been studied as sustainable living materials with a focus on the tuning of their mechanical properties. One way of doing so is to use metal ions. In particular biofilms have been shown to stiffen in presence of some metal cations and to soften in presence of others. However, the specificity and the determinants of those interactions vary between species. While Escherichia coli is a widely studied model organism, little is known concerning the response of its biofilms to metal ions. In this work, we aimed at tuning the mechanics of E. coli biofilms by acting on the interplay between matrix composition and metal cations. To do so, we worked with E. coli strains producing a matrix composed of curli amyloid fibres or phosphoethanolamine-cellulose (pEtN-cellulose) fibres or both. The viscoelastic behaviour of the resulting biofilms was investigated with rheology after incubation with one of the following metal ion solutions: FeCl3, AlCl3, ZnCl2 and CaCl2 or ultrapure water. We observed that the strain producing both fibres stiffen by a factor of two when exposed to the trivalent metal cations Al(III) and Fe(III) while no such response is observed for the bivalent cations Zn(II) and Ca(II). Strains producing only one matrix component did not show any stiffening in response to either cation, but even a small softening. In order to investigate further the contribution of each matrix component to the mechanical properties, we introduced additional bacterial strains producing curli fibres in combination with non-modified cellulose, non-modified cellulose only or neither component. We measured biofilms produced by those different strains with rheology and without any solution. Since rheology does not preserve the architecture of the matrix, we compared those results to the mechanical properties of biofilms probed with the non-destructive microindentation. The microindentation results showed that biofilm stiffness is mainly determined by the presence of curli amyloid fibres in the matrix. However, this clear distinction between biofilm matrices containing or not containing curli is absent from the rheology results, i.e. following partial destruction of the matrix architecture. In addition, rheology also indicated a negative impact of curli on biofilm yield stress and flow stress. This suggests that curli fibres are more brittle and therefore more affected by the mechanical treatments. Finally, to examine the molecular interactions between the biofilms and the metal cations, we used Attenuated total reflectance - Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to study the three E.coli strains producing a matrix composed of curli amyloid fibres, pEtN-cellulose fibres or both. We measured biofilms produced by those strains in presence of each of the aforementioned metal cation solutions or ultrapure water. We showed that the three strains cannot be distinguished based on their FTIR spectra and that metal cations seem to have a non-specific effect on bacterial membranes in absence of pEtN-cellulose. We subsequently conducted similar experiments on purified curli or pEtN-cellulose fibres. The spectra of the pEtN-cellulose fibres revealed a non-valence-specific interaction between metal cations and the phosphate of the pEtN-modification. Altogether, these results demonstrate that the mechanical properties of E. coli biofilms can be tuned via incubation with metal ions. While the mechanism involving curli fibres remains to be determined, metal cations seem to adsorb onto pEtN-cellulose and this is not valence-specific. This work also underlines the importance of matrix architecture to biofilm mechanics and emphasises the specificity of each matrix composition. N2 - Biofilme sind heterogene Strukturen aus Mikroorganismen, die in eine selbst-abgesonderte extrazelluläre Matrix eingebettet sind. In letzter Zeit wurden Biofilme als nachhaltige lebende Materialien untersucht, mit dem Ziel ihre mechanischen Eigenschaften zu modifizieren. Eine Möglichkeit, dies zu tun, ist die Verwendung von Metallionen. Es hat sich gezeigt, dass Biofilme in Gegenwart einiger Metallkationen steifer und in Gegenwart anderer weicher werden. Die Spezifität und die Bestimmungsfaktoren dieser Wechselwirkungen sind jedoch je nach Spezies unterschiedlich. Obwohl Escherichia coli ein weithin untersuchter Modellorganismus ist, ist wenig über den Einfluss von Metallionen auf die Eigenschaften von E. coli-Biofilmen bekannt. Ziel dieser Arbeit war, die mechanischen Eigenschaften von E. coli-Biofilmen durch Beeinflussung des Zusammenspiels von Matrixzusammensetzung und Metallkationen zu untersuchen und zu verändern. Zu diesem Zweck wurden E. coli-Stämme verwendet, die eine Matrix aus Curli-Fasern oder Phosphoethanolamin-modifizierter Zellulose (pEtN-Zellulose) oder aus beiden produzieren. Das viskoelastische Verhalten der resultierenden Biofilme wurde nach Inkubation mit einer der folgenden Metallsalzlösungen (oder Reinstwasser) rheologisch untersucht: FeCl3, AlCl3, ZnCl2 und CaCl2. Es zeigte sich, dass die Steifigkeit von Biofilmen des Stammes, der beide Fasern produziert, um das Doppelte höher ist, wenn sie den dreiwertigen Metallkationen Al(III) und Fe(III) ausgesetzt werden. Im Gegensatz dazu konnte keine derartige Veränderung der Steifigkeit beobachtet werden, wenn stattdessen die zweiwertigen Kationen Zn(II) und Ca(II) zugesetzt wurden. Stämme, die nur eine Matrixkomponente produzieren, zeigten keine Versteifung in Gegenwart von Kationen, sondern sogar eine geringe Erweichung. Um den Beitrag der einzelnen Matrixkomponenten zu den mechanischen Eigenschaften weiter zu untersuchen, wurden weitere Bakterienstämme mit den bereits genannten verglichen. Diese Stämme produzieren entweder Curli-Fasern in Kombination mit nicht modifizierter Zellulose, ausschließlich nicht modifizierte Zellulose oder keine der beiden Komponenten. Die resultierenden Biofilme wurden ohne den Zusatz von Salzlösung rheologisch charakterisiert. Da die Matrixarchitektur bei Rheologiemessungen zerstört wird, wurden die Biofilme ebenfalls mit Mikroindentation untersucht, welche mit intakten Biofilmen durchgeführt werden kann. Die Ergebnisse der Mikroindentation zeigen, dass die Steifigkeit der Biofilme hauptsächlich durch das Vorhandensein von Curli-Fasern bestimmt wird. Diese klare Unterscheidung der mechanischen Eigenschaften zwischen Biofilmmatrices mit und ohne Curli ist jedoch in den rheologischen Ergebnissen nicht erkennbar, d. h. nach teilweiser Zerstörung der Matrixarchitektur. Darüber hinaus zeigte die Rheologie eine niedrigere Fließspannung für Biofilme, die Curli enthalten. In der Kombination deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Curli-Fasern spröder und daher stärker von der mechanischen Behandlung betroffen sind. Um die molekularen Wechselwirkungen zwischen der Biofilm-Matrix und Metallkationen zu untersuchen, wurden die drei E. coli-Stämme, die eine Matrix aus Curli-Fasern, pEtN-Zellulose oder beidem bilden, mit abgeschwächter Totalreflexions-Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie (ATR-FTIR) charakterisiert. Die von diesen Stämmen produzierten Biofilme wurden in Gegenwart jeder der oben genannten Metallsalzlösungen und in Reinstwasser untersucht. Es wurde gezeigt, dass die drei Stämme anhand ihrer FTIR-Spektren nicht unterschieden werden können und dass in Abwesenheit von pEtN-Zellulose eine mögliche unspezifische Wirkung auf bakterielle Membranen besteht. Ähnliche Experimente mit gereinigten Curli-Fasern oder pEtN-Zellulose deuten darauf hin, dass Metallkationen in erster Linie eine nicht-valenzspezifische Wechselwirkung mit der Phosphatgruppe der pEtN-Modifikation eingehen. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die mechanischen Eigenschaften von E. coli-Biofilmen durch Inkubation mit Metallkationen modifiziert werden können. Während die Mechanismen, an denen Curli-Fasern beteiligt sind, noch nicht aufgeklärt sind, scheinen Metallkationen an pEtN-Zellulose zu adsorbieren. Diese Arbeit unterstreicht auch die Bedeutung der Matrixarchitektur für die Mechanik von Biofilmen und verdeutlicht die Wichtigkeit der jeweiligen Matrixzusammensetzung für die Spezifität und das Ausmaß der beobachteten Effekte. KW - E. coli KW - biofilm KW - metal cation KW - matrix KW - viscoelasticity KW - E. coli KW - Biofilm KW - Metallkation KW - Matrix KW - Viskoelastizität Y1 - 2023 ER -