TY - THES A1 - Helaly, Alaa El-din A. T1 - Molecular studies on plants to enhance their stress tolerance T1 - - N2 - Environmental stresses such as drought, high salt and low temperature affect plant growth and decrease crop productivity extremely. It is important to improve stress tolerance of the crop plant to increase crop yield under stress conditions. The Arabidopsis thaliana salt tolerance 1 gene (AtSTO1) was originally identified by Lippuner et al., (1996). In this study around 27 members of STO-like proteins were identified in Arabidopsis thaliana, rice and other plant species. The STO proteins have two consensus motifs (CCADEAAL and FCV(L)EDRA). The STO family members can be regarded as a distinct class of C2C2 proteins considering their low sequence similarity to other GATA like proteins and poor conservation in the C-terminus. AtSTO1 was found to be induced by salt, cold and drought in leaves and roots of 4-week-old Arabidopsis thaliana wild-type plants. The expression of AtSTO1 under salt and cold stress was more pronounced in roots than in leaves. The data provided here revealed that the AtSTO1 protein is localized in the nucleus. The observation that AtSTO1 localizes in the nucleus is consistent with its proposed function as a transcription factor. AtSTO1-dependent phenotypes were observed when plant were grown at 50 mM NaCl on agar plates. Leaves of AtSTO1 overexpression lines were bigger with dark green coloration, whereas stunted growth and yellowish leaves were observed in wild-type and RNAi plants. Also, the AtSTO1 overexpression plants when exposed to long-term cold stress had a red leaf coloration which was much stronger than in wild-type and RNAi lines. Growth of AtSTO1 overexpression lines in long term under salt and cold stress was always associated with long roots which was more pronounced than in wild-type and RNAi lines. Proline accumulation increased more strongly in leaves and roots of AtSTO1 overexpression lines than in tissues of wild-type and RNAi lines when treated with 200 mM NaCl, exposed to cold stress or when watering was prevented for one day or two weeks. Also, soluble sugar content increased to higher levels under salt, cold and drought stress in AtSTO1 overexpression lines when compared to wild-type and RNAi lines. The increase in soluble sugar content was detected in AtSTO1 overexpression lines after long-term (2 weeks) growth of plants under these stresses. Anthocyanins accumulated in leaves of AtSTO1 overexpression lines when exposed to long term salt stress (200 mM NaCl for 2 weeks) or to 4°C for 6 and 8 weeks. Also, anthocyanin content was increased in flowers of AtSTO1 overexpression plants kept at 4°C for 8 weeks. Taken together these data indicate that overexpression of AtSTO1 enhances abiotic stress toleranc via a more pronounced accumulation of compatible solutes under stress. N2 - Umweltstress wie zum Beispiel Trockenheit, Salz und niedrige Temperaturen beeinflussen in erheblichem Maße das pflanzliche Wachstum und haben einen negativen Einfluss auf Ertragsleistungen. Untersuchungen zur Verbesserung der Stresstoleranz und des Ernteertrages von Kulturpflanzen sind daher von großer Bedeutung. Pflanzen passen sich Umweltveränderungen durch physiologische und entwicklungsabhängige Prozesse an. In den letzten Jahren wurden zahlreiche Gene identifiziert, die als Reaktion von Umweltstress in der Pflanze aktiviert werden. Salzstress bewirkt negative Veränderungen des pflanzlichen Wasserstatus, die auf veränderte K+/Na+-Verhältnisse und Na+- und Cl--Konzentrationen zurückzuführen sind. Neben Veränderungen in der Bewässerungspraxis spielt heute die Züchtung salztoleranter Pflanzen und die biotechnologische Verbesserung von Kulturpflanzen eine zunehmend wichtige Rolle. Im Rahmen der Doktorarbeit wurde ein bisher wenig untersuchtes Gen, welches AtSTO1 genannt wird, anhand der Modellpflanze Ackerschmalwand (lat. Arabidopsis thaliana) analysiert. Das Gen wird durch Umweltstress, insbesondere durch Kälte, aktiviert. Es wurden gentechnisch veränderte Pflanzen hergestellt, die eine verstärkte Aktivität des AtSTO1-Gens aufweisen. Diese Pflanzen zeigten bei Vorliegen von hohen Salzkonzentration ein im Vergleich zu unveränderten Pflanzen verbessertes Wachstum. Diese Stimulation des pflanzlichen Wachstums unter Salzstress-Bedingungen war begleitet von einer vermehrten Bildung bestimmter chemischer Substanzen, die die Pflanzen in die Lage versetzen, mit dem Stress besser fertig zu werden. Dazu gehört beispielsweise die Aminosäure Prolin, deren Konzentration in den gentechnisch veränderten Pflanzen nach Stressbehandlung stärker erhöht ist, als in den unveränderten Kontrollpflanzen oder in Pflanzen, die eine reduzierte AtSTO1-Aktivität besaßen. Auch die Gehalte einiger Zucker waren in den gentechnisch modifizierten Pflanzen unter Stress erhöht. Insgesamt hat sich gezeigt, dass AtSTO1 eine wichtige Aufgabe in der Stressantwort spielt. Weitere Untersuchungen sollten es ermöglichen, auch bei Kulturpflanzen, wie etwa Reis, die Stresstoleranz durch Veränderung verwandter Gene zu erhöhen. ----------- vollständiger Name des Autors: Abdallah Helaly, Alaa El-Din Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-2427 ER - TY - THES A1 - Schwonbeck, Susanne T1 - Analyse von Single Nucleotide Polymorphisms an Glas-Oberflächen N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer SNP-Genotypisierungsmethode mit auf Mikroarrays immobilisierten PCR-Produkten. Für die Analyse wurde ein faseroptischer Affinitätssensor bzw. ein Durchfluss-Biochip-Scanner mit integrierter Fluoreszenzdetektion verwendet. An den immobilisierten Analyten (PCR-Produkten) wurde eine Fluoreszenzoligonukleotidsonde hybridisiert und anschließend die Dissoziation der Sonde im Fluss verfolgt. Die Diskriminierung von Wildtyp- und Mutanten-DNA erfolgte durch die kinetische Auswertung der Dissoziationskurven sowie durch die Analyse der Fluoreszenzintensität. Die Versuche am faseroptischen Affinitätssensor zeigten, dass DNA-DNA-Hybride sowohl von Oligonukleotiden als auch von PCR-Produkten ein typisches Dissoziationsverhalten aufweisen, wobei fehlgepaarte Hybride eine signifikant schnellere Dissoziation zeigen als perfekt passende Hybride. Dieser Geschwindigkeitsunterschied lässt sich durch den Vergleich der jeweiligen kinetischen Geschwindigkeitskonstanten kD quantitativ erfassen. Da die Kopplung des Analyten an der Chipoberfläche sowie die Hybridisierungs- und Dissoziationsparameter essentiell für die Methodenentwicklung war, wurden die Parameter für ein optimales Spotting und die Immobilisierung von PCR-Produkten ermittelt. Getestet wurden die affine Kopplung von biotinylierten PCR-Produkten an Streptavidin-, Avidin- und NeutrAvidin-Oberflächen sowie die kovalente Bindung von phosphorylierten Amplifikaten mit der EDC/Methylimidazol-Methode. Die besten Ergebnisse sowohl in Spotform und -homogenität als auch im Signal/Rausch-Verhältnis wurden an NeutrAvidin-Oberflächen erreicht. Für die Etablierung der Mikroarray-Genotypisierungsmethode durch kinetische Analyse nach einem Hybridisierungsexperiment wurden Sondenlänge, Puffersystem, Spotting-Konzentration des Analyten sowie Temperatur optimiert. Das Analysensystem erlaubte es, PCR-Produkte mit einer Konzentration von 250 ng/µl in einem HEPES-EDTA-NaCl-Puffer auf mit NeutrAvidin beschichtete Glasträger zu spotten. In den anschließenden Hybridisierungs- und Dissoziationsexperimenten bei 30 °C konnte die Diskriminierung von homocygoter Wildtyp- und homocygoter Mutanten- sowie heterocygoter DNA am Beispiel von Oligonukleotid-Hybriden erreicht werden. In einer Gruppe von 24 homocygoten Patienten wurde ein Polymorphismus im SULT1A1-Gen analysiert. Sowohl durch kinetische Auswertung als auch mit der Analyse der Fluoreszenzintensität wurde der Genotyp der Proben identifiziert. Die Ergebnisse wurden mit dem Referenzverfahren, der Restriktionschnittstellenanalyse (PCR-RFLP) validiert. Lediglich ein Genotyp wurde falsch bestimmt, die Genauigkeit lag bei 96%. In einer Gruppe von 44 Patienten wurde der Genotyp eines SNP in der Adiponectin-Promotor-Region untersucht. Nach Vergleich der Analysenergebnisse mit denen eines Referenzverfahrens konnten lediglich 14 der untersuchten Genotypen bestätigt werden. Ursache für die unzureichende Genauigkeit der Methode war vor allem das schlechte Signal/Rausch-Verhältnis. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das in dieser Arbeit entwickelte Analysesystem für die Genotypisierung von Einzelpunktmutationen geeignet ist, homocygote Patientenproben zuverlässig zu analysieren. Prinzipiell ist das auch bei heterocygoter DNA möglich. Da nach aktuellem Kenntnisstand eine SNP-Analysemethode an immobilisierten PCR-Produkten noch nicht veröffentlicht wurde, stellt das hier entwickelte Verfahren eine Alternative zu bisher bekannten Mikroarray-Verfahren dar. Als besonders vorteilhaft erweist sich der reverse Ansatz der Methode. Der hier vorgestellte Ansatz ist eine kostengünstigere und weniger hoch dimensionierte Lösung für Fragestellungen beispielsweise in der Ernährungswissenschaft, bei denen meist eine mittlere Anzahl Patienten auf nur einige wenige SNPs zu untersuchen ist. Wenn es gelingt, durch die Weiterentwicklung der Hardware bzw. weiterer Optimierung, eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses und damit die Diskriminierung von heterocygoter DNA zu erreichen, kann diese Methode zukünftig bei der Analyse von mittelgroßen Patientengruppen alternativ zu anderen Genotypisierungsmethoden verwendet werden. N2 - The aim of this thesis was the development of a SNP genotyping method involving PCR products immobilised on microarrays. For the analysis a fibre optic affinity biosensor and a flow-through biochip scanner were used. Fluorescent probes were hybridized with the immobilised PCR products. In order to start the dissociation process the surface was rinsed with buffer and the fluorescence intensity was measured. Two different cases were studied: First, the full-matched DNA hybrid (wildtyp single strand with complementary wildtype single strand), second the mis-matched hybrid (wildtype single strand and mutant single strand). After determinating the reaction rates (kD) as kinetic parameter the kD values of both cases were compared. The experiments showed a significant difference in the kD value of the full- and the mis-match hybrids. Therefore, mutant and wildtype DNA were discriminated by kinetic analysis of the dissociation process and analysis of the fluorescence intensity. To set up the complete analysis process the reaction parameters like coupling of the PCR products had to be optimised. Both affininty coupled (streptavidin, neutravidin, avidin - biotin) and covalent methods (EDC/methylimidazol) were carried out. Best results in spot homogeinity and spot appearance were obtained with coupling of biotinylated PCR products on neutravidin coated chip surfaces. Additionally, the length of the probe, the spotting concentration, the spotting buffer and the reaction temperature were optimised. In the optimised analysis PCR products (250 µg/µl) were spotted onto neutravidin coated surfaces. The hybridisation and dissociation processes were carried out at 30°C. A HEPES-EDTA-NaCl buffer was used for spotting, diluting of the fluorescent probe and rinsing the microarray surface. A fluorescent probe was used with 13 nucleotides in length. The mis- or full-matching base indicating the polymorphism was located in the center position of the probe. The analysis system was tested with the genomic DNA of a group of 24 homocygote individuals with a SNP in the SULT1A1 gene region. The hybridisation and dissociation processes were carried out and the reaction rates were determinated. Subsequently after the analysis in the flow-through biochip scanner the fluorescence intensity of the spots were measured. The results showed very good comparability with results of a PCR-RFLP analysis (one false genotype). Additionally, a group of 44 heterocygote DNA samples with one SNP in the adiponectin promotor region were also genotyped. Compared to a reference method only 14 genotypes were correctly determined. This was mostly due to a low signal-noise-ratio and needs to be further investigated. Besides the problem in analysing heterocygote DNA samples the developed analysis system is very useful for genotyping SNP in homocygote DNA samples. The successful analysis of heterocygote sample is principally possible and with further investigations/optimisation, a better analysis should be possible. The most important advantage of the developed method is the reverse approach of binding PCR products at the surface instead of oligonucleotides. This allows the parallel genotyping of several individuals. Other advantages include low costs and medium sized dimensions in terms of throughput. KW - Einzelbasenaustausch KW - SNP KW - Mikrochip KW - DNA-Chip KW - SULT1A1 KW - Adiponectin KW - kinetische Analyse KW - Dissoziation KW - Durchfluß-Biochip-Scanner KW - Fließsystem KW - single nucleotide polymorphisms KW - SNP KW - microarray KW - DNA KW - kinetic analysis KW - dissociation KW - SULT1A1 KW - flow-through biochip scanner Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001853 ER - TY - THES A1 - Ringleb, Jennifer T1 - Identifikation antigener Determinanten des ZPB2 Proteins der Hauskatze und Charakterisierung ihrer kontrazeptiven und immunogenen Eigenschaften N2 - Die immunologische Kontrazeption mittels Zona pellucida (ZP) Proteinen gilt als vielversprechender Ansatz für die Reproduktionskontrolle verwilderter Haus- und Wildtierbestände. Da die Applikation von nativer ZP mit Nebenwirkungen verbunden ist, wird die Verwendung einzelner ZP Peptide als Bestandteil kontrazeptiver Vakzine als besonders aussichtsreich erachtet. Das Prinzip dieser nebenwirkungsfreien ZP Immunisierung ist die gezielte Trennung der Entzündungsreaktionen auslösenden T-Zell-Epitope der ZP von den kontrazeptiv wirkenden B-Zell-Epitopen. Niedermolekulare synthetische oder rekombinante Peptide allein sind gering immunogen und können somit keine ausreichende Immunantwort induzieren. Die Verwendung von Peptiden für die immunologische Kontrazeption erfordert daher ein „Vakzin-Design“, d. h. die gezielte Kombination der Peptide mit immunstimulierenden Substanzen (Liposomen, Carrierproteinen, Adjuvantien). Zielstellung der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des Potentials synthetischer Peptide für die Immunokontrazeption von verwilderten Hauskatzen (Felis catus). Dazu wurden zunächst relevante B-Zell-Epitope des felinen Zona pellucida Proteins, ZPB2, identifiziert und synthetisiert. Zwei der synthetischen Peptide (P3, P6) wurden zur Herstellung von Antikörpern an BSA konjugiert und zusammen mit Freundschem Adjuvans in Ratten verimpft. Die kontrazeptive Relevanz beider Peptide sowie der Ratten Anti-Peptid Antiseren wurde im in vitro Befruchtungssystem der Hauskatze geprüft. Zur Untersuchung der Immunogenität der Peptide in der Zielspezies Hauskatze erfolgte die Entwicklung von Vakzin-Prototypen für die einmalige Applikation. Neben der Eruierung der Stärke und Dauer der Immunantwort wurde durch Verpaarung der Tiere auch das kontrazeptive Potential in vivo abgeschätzt. N2 - Immunological contraception based on zona pellucida (ZP) proteins is regarded as a promising approach for the control of reproduction in feral domestic and wild animals. Because application of native ZP caused adverse reactions, utilization of single ZP peptides as elements of contraceptive vaccines were considered to bear good prospects. The principle of this ZP immunization is based upon a systematic separation of inflammation triggering T-cell epitopes from the contraceptive B-cell epitopes. The present study evaluates the immunogenicity and contraceptive potential of synthetic feline ZPB2 peptides for immunocontraception in cats (Felis catus). First of all, relevant B-cell epitopes were identified and synthesized. In order to generate antipeptide antibodies two peptides (P3, P6) were chosen and coupled to BSA. Rats were immunized with the conjugation product combined with Freund′s complete adjuvant. The contraceptive efficacy of both peptides and of the anti-peptide antibodies generated were determined using in vitro fertilization of feline oocytes (IVF). To evaluate the peptides immunogenicity in the target species (cat), vaccine-prototypes were developed for a single application protocol. The strength and duration of the immune response was analyzed. Additionally, cats were mated to assess the contraceptive potential of the vaccines in vivo. T2 - Identifikation antigener Determinanten des ZPB2 Proteins der Hauskatze und Charakterisierung ihrer kontrazeptiven und immunogenen Eigenschaften KW - Zona pellucida KW - Peptid KW - Katze KW - Kontraception KW - zona pellucida KW - peptide KW - cat KW - contraception Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001901 ER - TY - THES A1 - Venevskaia, Irina T1 - Modeling of vegetation diversity and a national conservation planning: example of Russia N2 - Die übergreifende Zielsetzung meiner Studie ist eine Ausarbeitung quantitativer Methoden zur nationalen nationale Schutzplanung in Übereinstimmung mit dem internationalen Ansatz. Diese Zielsetzung erfordert eine Lösung der folgenden Probleme: 1) Wie lässt sich Vegetationsvielfalt in grober Auflösung auf Basis abiotischen Faktoren einschätzen? 2) Wie ist der Ansatz 'globaler Hotspots' für die Eingrenzung nationaler Biodiversitäts-Hotspots zu übernehmen? 3) Wie erfolgt die Auswahl von quantitativen Schutzzielen unter Einbezug der Unterschiede nationaler Hotspots bei Umweltbedingungen und durch den Menschen Bedrohung? 4) Wie sieht der Entwurf eines großflächigen nationalen Naturschutzkonzepts aus, das die hierarchische Natur der Artenvielfalt reflektiert? Die Fallstudie für nationale Naturschutzplanung ist Russland. Die nachfolgenden theoretischen Schlüsse wurden gezogen: · Großräumige Vegetationsdiversität ist weitgehend vorhersagbar durch klimabedingte latente Wärme für Verdunstung und topographische Landschaftsstruktur, beschrieben als Höhendifferenz. Das klimabasierte Modell reproduziert die beobachtete Artenanzahl von Gefäßpflanzen für verschiedene Gebiete auf der Welt mit einem durchschnittlichen Fehler von 15% · Nationale Biodiversitäts-Hotspots können auf Grundlage biotischer oder abiotischer Daten kartographiert werden, indem als Korrektur für ein Land die quantitativen Kriterien für Planzenendemismus und Landnutzung des Ansatzes der 'globalen Hotspots' genutzt wird · Quantitative Naturschutzziele, die die Unterschiede zwischen nationalen Biodiversitäts-Hotspots in Bezug auf Umweltbedingungen und der Bedrohung durch den Menschen miteinbeziehen, können mit nationalen Daten über Arten auf der Roten Liste gesetzt werden · Ein großräumiger nationaler Naturschutzplan, der die hierarchische Natur der Artenvielfalt berücksichtigt, kann durch eine Kombination von abiotischer Methode im nationalen Bereich (Identifikation großräumiger Hotspots) und biotischer Methode im regionalen Bereich (Datenanalyse der Arten auf der Roten Liste) entworfen werden N2 - The overall objective of the study is an elaboration of quantitative methods for national conservation planning, coincident with the international approach ('hotspots' approach). This objective requires a solution of following problems: 1) How to estimate large scale vegetation diversity from abiotic factors only? 2) How to adopt 'global hotspots' approach for bordering of national biodiversity hotspots? 3) How to set conservation targets, accounting for difference in environmental conditions and human threats between national biodiversity hotspots? 4) How to design large scale national conservation plan reflecting hierarchical nature of biodiversity? The case study for national conservation planning is Russia. Conclusions: · Large scale vegetation diversity can be predicted to a major extent by climatically determined latent heat for evaporation and geometrical structure of landscape, described as an altitudinal difference. The climate based model reproduces observed species number of vascular plant for different areas of the world with an average error 15% · National biodiversity hotspots can be mapped from biotic or abiotic data using corrected for a country the quantitative criteria for plant endemism and land use from the 'global hotspots' approach · Quantitative conservation targets, accounting for difference in environmental conditions and human threats between national biodiversity hotspots can be set using national data for Red Data book species · Large scale national conservation plan reflecting hierarchical nature of biodiversity can be designed by combination of abiotic method at national scale (identification of large scale hotspots) and biotic method at regional scale (analysis of species data from Red Data book) T2 - Modeling of vegetation diversity and a national conservation planning: example of Russia KW - Vegetationsvielfalt KW - nationaler Biodiversitäts-Hotspots KW - quantitativen Schutzzielen KW - nationalen Naturschutzplanung KW - Russland KW - large scale vegetation diversity KW - national biodiversity hotspots KW - conservation targets KW - large scale national conservation plan KW - Russia Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001863 ER - TY - THES A1 - Junker, Björn H. T1 - Sucrose breakdown in the potato tuber N2 - In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze verfolgt, um das Verständnis des Saccharose-zu-Stärke Stoffwechselweges in sich entwickelnden Kartoffelknollen zu untersuchen. Zunächst wurde ein induzierbares Genexpressions-System aus dem Schimmelpilz Aspergillus nidulans für die Untersuchung des Metabolismus von Kartoffelknollen optimiert. Es wurde herausgefunden, dass dieses sogenannte alc system schneller auf Acetaldehyd reagiert als auf Ethanol, und dass Acetaldehyd weniger Seiteneffekte auf den Metabolismus hat. Die optimalen Induktionsbedingungen wurden dann benutzt um die Effekte einer zeitlich kontrollierten zytosolischen Expression einer Hefe-Invertase auf den Metabolismus der Kartoffelknolle zu untersuchen. Die beobachteten Unterschiede zwischen induzierter und konstitutiver Expression der Invertase führten zu der Feststellung, dass die Glycolyse erst induziert wird nachdem ein ATP-Mangel durch erhöhtes Saccharose-Cycling kreiert wurde. Weiterhin lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass Maltose in der Kartoffelknolle eher ein Produkt der Kondensation zweier Glucose-Einheiten ist statt ein Produkt des Stärke-Abbaus zu sein. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Expression einer Hefe-Invertase in der Vakuole von Kartoffelknollen ähnliche Effekte auf deren Metabolismus hat wie die Expression des gleichen Enzymes im Apoplasten. Diese Beobachtung ist ein weiterer Beleg für die Präsenz eines Mechanismus, bei dem Saccharose mittels Endozytose in die Vakuole aufgenommen wird anstatt über Transporter direkt ins Zytosol aufgenommen zu werden. Zum Schluß wird ein kinetisches Modell des Saccharose-Abbaus vorgestellt, das in der Lage ist diesen Teil des Stoffwechsels der Kartoffelknolle quantitativ zu simulieren. Weiterhin kann dieses Modell die metabolischen Effekte der Einführung einer Hefe-Invertase in das Zytosol von Kartoffelknollen mit erstaunlicher Präzision vorhersagen. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass induzierbare Genexpression sowie Computermodelle von Stoffwechselwegen nützliche Hilfsmittel für eine Verbesserung des Verständnisses des Pflanzenmetabolismus sind. N2 - In this work different approaches are undertaken to improve the understanding of the sucrose-to-starch pathway in developing potato tubers. At first an inducible gene expression system from fungal origin is optimised for the use of studying metabolism in the potato tuber. It is found that the alc system from Aspergillus nidulans responds more rapidly to acetaldehyde than ethanol, and that acetaldehyde has less side-effects on metabolism. The optimal induction conditions then are used to study the effects of temporally controlled cytosolic expression of a yeast invertase on metabolism of potato tubers. The observed differences between induced and constitutive expression of the invertase lead to the conclusion that glycolysis is induced after an ATP demand has been created by an increase in sucrose cycling. Furthermore, the data suggest that in the potato tuber maltose is a product of glucose condensation rather than starch degradation. In the second part of the work it is shown that the expression of a yeast invertase in the vacuole of potato tubers has similar effects on metabolism than the expression of the same enzyme in the apoplast. These observations give further evidence to the presence of a mechanism by which sucrose is taken up via endocytosis to the vacuole rather than via transporters directly to the cytosol. Finally, a kinetic in silico model of sucrose breakdown is presented that is able to simulate this part of potato tuber metabolism on a quantitative level. Furthermore, it can predict the metabolic effects of the introduction of a yeast invertase in the cytosol of potato tubers with an astonishing precision. In summary, these data prove that inducible gene expression and kinetic computer models of metabolic pathways are useful tools to greatly improve the understanding of plant metabolism. T2 - Sucrose breakdown in the potato tuber KW - Saccharose KW - Solanum tuberosum KW - Invertase KW - induzierbare Genexpression KW - Stoffwechselmodellierung KW - sucrose KW - Solanum tuberosum KW - invertase KW - inducible gene expression KW - metabolic modelling Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001673 ER - TY - THES A1 - Scheich, Christoph T1 - High-throughput evaluation of protein folding conditions and expression constructs for structural genomics N2 - Das E. coli Expressionssystem ist das am häufigsten angewandte hinsichtlich der rekombinante Proteinexpression für strukturelle und funktionelle Analysen aufgrund der hohen erzielten Ausbeuten und der einfachen Handhabbarkeit. Allerdings ist insbesondere die Expression eukaryotischer Proteine in E. coli problematisch, z.B. wenn das Protein nicht korrekt gefaltet ist und in unlöslichen Inclusion Bodies anfällt. In manchen Fällen ist die Analyse von Deletionskonstrukten oder einzelnen Proteindomänen der Untersuchung des Vollängeproteins vorzuziehen. Dies umfasst die Herstellung eines Satzes von Expressionskonstrukten, welche charakterisiert werden müssen. In dieser Arbeit werden Methoden optimiert und evaluiert für die in vitro-Faltung von Inclusion Body-Proteinen sowie die Entwicklung einer Hochdurchsatz-Charakterisierung von Expressionskonstrukten. Die Überführung von Inclusion Body-Proteinen in den nativen Zustand beinhaltet zwei Schritte: (a) Auflösen mit einen chaotropen Reagenz oder starkem ionischen Detergenz und (b) Faltung des Proteins durch Beseitigung des Chaotrops begleitet von dem Transfer in einen geeigneten Puffer. Die Ausbeute an nativ gefaltetem Protein ist oft stark eingeschränkt aufgrund von Aggregation und Fehlfaltung; sie kann allerdings durch die Zugabe bestimmter Additive zum Faltungspuffer erhöht werden. Solche Additive müssen empirisch identifiziert werden. In dieser Arbeit wurde eine Testprozedur für Faltungsbedingungen entwickelt. Zur Reduzierung der möglichen Kombinationen der getesteten Additive wurden sowohl empirische Beobachtungen aus der Literatur als auch bekannte Eigenschaften der Additive berücksichtigt. Zur Verminderung der eingesetzten Proteinmenge und des Arbeitsaufwandes wurde der Test automatisiert und miniaturisiert mittels eines Pipettierroboters. 20 Bedingungen zum schnellen Verdünnen von denaturierten Proteinen werden hierbei getestet und zwei Bedingungen zur Faltung von Proteinen mit dem Detergenz/Cyclodextrin Protein-Faltungssystem von Rozema et al. (1996). 100 µg Protein werden pro Bedingung eingesetzt. Zusätzlich werden acht Bedingungen für die Faltung von His-Tag-Fusionsproteinen (ca. 200 µg), welche an eine Metallchelat-Matrix immobilisiert sind, getestet. Die Testprozedur wurde erfolgreich angewendet zur Faltung eines humanen Proteins, der p22 Untereinheit von Dynactin, welche in E. coli in Inclusion Bodies exprimiert wird. So wie es sich bei vielen Proteinen darstellt, war auch für p22 Dynactin kein biologischer Nachweistest vorhanden, um den Erfolg des Faltungsexperimentes zu messen. Die Löslichkeit des Proteins kann nicht als eindeutiges Kriterium dienen, da neben nativ gefaltetem Protein, lösliche fehlgefaltete Spezies und Mikroaggregate auftreten können. Diese Arbeit evaluiert Methoden zur Detektion kleiner Mengen nativen Proteins nach dem automatisierten Faltungstest. Bevor p22 Dynactin gefaltet wurde, wurden zwei Modellenzyme zur Evaluierung eingesetzt, bovine Carboanhydrase II (CAB) und Malat Dehydrogenase aus Schweineherz-Mitochondrien. Die wiedererlangte Aktivität nach der Rückfaltung wurde korreliert mit verschiedenen biophysikalischen Methoden. Bindungsstudien mit 8-Anilino-1-Naphtalenesulfonsäure ergaben keine brauchbaren Informationen bei der Rückfaltung von CAB aufgrund der zu geringen Sensitivität und da fehlgefaltete Proteine nicht eindeutig von nativem Protein unterschieden werden konnten. Tryptophan Fluoreszenzspektren der rückgefalteten CAB wurden zur Einschätzung des Erfolges der Rückfaltung angewandt. Die Verschiebung des Intensitätsmaximum zu einer niedrigeren Wellenlänge im Vergleich zum denaturiert entfalteten Protein sowie die Fluoreszenzintensität korrelierten mit der wiedererlangten enzymatischen Aktivität. Für beide Modellenzyme war analytische hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) brauchbar zur Identifizierung rückgefalteter Proben mit aktivem Enzym. Kompakt gefaltetes, aktives Enzym eluierte in einem distinkten Peak im abnehmenden Ammoniumsulfat-Gradienten. Das Detektionslimit für analytische HIC lag bei 5 µg. Im Falle von CAB konnte gezeigt werden, dass Tryptophan-Fluoreszenz-Spektroskopie und analytische HIC in Kombination geeignet sind um Falsch-Positive oder Falsch-Negative, welche mit einem der Monitore erhalten wurden, auszuschließen. Diese beiden Methoden waren ebenfalls geeignet zur Identifizierung der Faltungsbedingungen von p22 Dynactin. Tryptophan-Fluoreszenz-Spektroskopie kann jedoch zu Falsch-Positiven führen, da in machen Fällen Spektren von löslichen Mikroaggregaten kaum unterscheidbar sind von Spektren des nativ gefalteten Proteins. Dies zusammenfassend wurde eine schnelle und zuverlässige Testprozedur entwickelt, um Inclusion Body-Proteine einer strukturellen und funktionellen Analyse zugänglich zu machen. In einem separaten Projekt wurden 88 verschiedene E. coli-Expressionskonstrukte für 17 humane Proteindomänen, welche durch Sequenzanalyse identifiziert wurden, mit einer Hochdurchsatzreinigung und –faltungsanalytik untersucht, um für die Strukturanalyse geeignete Kandidaten zu erhalten. Nach Expression in einem Milliliter im 96er Mikrotiterplattenformat und automatisierter Proteinreinigung wurden löslich exprimierte Proteindomänen direkt analysiert mittels 1D ¹H-NMR Spektroskopie. Hierbei zeigte sich, dass insbesondere isolierte Methylgruppen-Signale unter 0.5 ppm sensitive und zuverlässige Sonden sind für gefaltetes Protein. Zusätzlich zeigte sich, dass – ähnlich zur Evaluierung des Faltungstests – analytische HIC effizient eingesetzt werden kann zur Identifizierung von Konstrukten, welche kompakt gefaltetes Protein ergeben. Sechs Konstrukte, welche zwei Domänen repräsentieren, konnten schnell als tauglich für die Strukturanalyse gefunden werden. Die Struktur einer dieser Domänen wurde kürzlich von Mitarbeitern gelöst, die andere Struktur wurde im Laufe dieses Projektes von einer anderen Gruppe veröffentlicht. N2 - For recombinant production of proteins for structural and functional analyses, the E. coli expression system is the most widely used due to high yields and straightforward processing. However, particularly the expression of eukaryotic proteins in E. coli is often problematic, e.g. when the protein is not folded correctly and is deposited in insoluble inclusion bodies. In some cases it is favourable to analyse deletion constructs of a protein or an individual protein domain instead of the full-length protein. This implies the generation of a set of expression constructs that need to be characterised. In this work methods to optimise and evaluate in vitro folding of inclusion body proteins as well as high-throughput characterisation of expression constructs were developed. Transferring inclusion body proteins to their native state involves two steps: (a) solubilisation with a chaotropic reagent or a strong ionic detergent and (b) folding of the protein by removal of the chaotrop accompanied by the transfer into an appropriate buffer. The yield of natively folded protein is often substantially reduced due to aggregation or misfolding; it may, however, be improved by certain additives to the folding buffer. These additives need to be identified empirically. In this thesis a screening procedure for folding conditions was developed. To reduce the number of possible combinations of screening additives, empirical observations documented in the literature as well as well known properties of certain screening additives were considered. To decrease the amount of protein and work invested, the screen was miniaturised and automated using a pipetting robot. Twenty rapid dilution conditions for the denatured protein are tested and two conditions for folding of proteins using the detergent/cyclodextrin protein folding system of Rozema et al. (1996). 100 µg protein is used per condition. In addition, eight conditions can be tested for folding of His-tagged proteins (approx. 200 µg) immobilised on metal chelate resins. The screen was successfully applied to fold a human protein, the p22 subunit of dynactin that is expressed in inclusion bodies in E. coli. For p22 dynactin – as is the case for many proteins – there was no biological assay available to assess the success of the folding screen. Protein solubility can not be used as a stringent criterion because beside natively folded protein, soluble misfolded species and microaggregates may occur. This work evaluates methods to detect small amounts of natively folded protein after automated folding screening. Before folding screening with p22 dynactin, two model enzymes, bovine carbonic anhydrase II (CAB) and pig heart mitochondrial malate dehydrogenase, were used for evaluation. Recovered activity after refolding was correlated to different biophysical methods. 8-anilino-1-naphtalenesulfonic acid binding-experiments gave no useful information when refolding CAB, due to low sensitivity and because misfolded protein could not be readily distinguished from native protein. Tryptophan fluorescence spectra of refolded CAB were used to assess the success of refolding. The shift of the intensity maximum to a shorter wavelength, compared to the denaturant unfolded protein, as well as the fluorescence intensity correlated to recovered enzymatic activity. For both model enzymes, analytical hydrophobic interaction chromatography (HIC) was useful to identify refolded samples that contain active enzyme. Compactly folded, active enzyme eluted in a distinct peak in a decreasing ammonium sulfate gradient. The detection limit of analytical HIC was approx. 5 µg. In case of CAB, tryptophan fluorescence spectroscopy and analytical HIC showed that both methods in combination can be useful to rule out false positives or false negatives obtained with one method. These two methods were also useful to identify conditions for folding of p22 dynactin. However, tryptophan fluorescence spectroscopy can lead to false positives because in some cases spectra of soluble microaggregates are not well distinguishable from spectra of natively folded protein. In summary, a fast and reliable screening procedure was developed to make inclusion body proteins accessible to structural or functional analyses. In a separate project, 88 different E. coli expression constructs for 17 human protein domains that had been identified by sequence analysis were analysed using high-throughput purification and folding analysis in order to obtain candidates suitable for structural analysis. After 96 deep-well microplate expression and automated protein purification, solubly expressed protein domains were directly analysed using 1D ¹H-NMR spectroscopy. It was found that isolated methyl group signals below 0.5 ppm are particularly sensitive and reliable probes for folded protein. In addition – similar to the evaluation of a folding screen – analytical HIC proved to be an efficient tool for identifying constructs that yield compactly folded protein. Both methods, 1D ¹H-NMR spectroscopy and analytical HIC, provided complementary results. Six constructs, representing two domains, could be quickly identified as targets that are well suitable for structural analysis. The structure of one of these domains was solved recently by co-workers, the other structure was published by another group during this project. T2 - High-throughput evaluation of protein folding conditions and expression constructs for structural genomics KW - Strukturproteomics KW - Proteinfaltungstest KW - Proteindomänen KW - structural genomics KW - protein folding screen KW - protein domains Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001552 ER - TY - THES A1 - Walter, Monika T1 - Die parallele beta-Helix der Pektat-Lyase aus Bacillus subtilis : Stabilität, Faltungsmechanismus und Faltungsmutanten N2 - Die Pektat-Lyasen gehören zu einer Proteinfamilie, die meistens von pflanzenpathogenen Mikroorganismen sekretiert werden. Die Enzyme katalysieren den Abbau von Polygalakturonsäure, einem Hauptbestandteil in pflanzlichen Mittellamellen und Primärzellwänden. Der Abbau der alpha-1,4-verbrückten Galakturonsäurereste erfogt durch eine beta-Eliminierungsreaktion, dabei entsteht ein Produkt mit einer ungesättigten C4-C5 Bindung am nicht reduzierenden Ende, das durch spektroskopische Messungen beobachtet werden kann. Für die enzymatische Reaktion der Pektat-Lyasen ist Calcium nötig und das pH-Optimum der Reaktion liegt bei pH 8.5. Alle bis jetzt bekannten Strukturen der Pektat- und Pektin-Lyasen haben das gleiche Strukturmotiv - eine rechtsgängige parallele beta-Helix. Die Struktur der Pektat-Lyase aus Bacillus subtilis (BsPel) ist im Komplex mit Calcium gelöst worden. BsPel ist ein monomeres Protein mit einer ungefähren Molekularmasse von 43 kDa, das keine Disulfidbrücken enthält. Dies erlaubte sowohl eine effiziente rekombinante Expression des Wildtypproteins, als auch von destabilisierten Mutanten im Cytoplasma von E. coli. Parallele beta-Helices sind relativ große, jedoch verhältnismäßig einfach aufgebaute Proteine. Um detailliertere Informationen über die kritischen Schritte bei der in vitro-Faltung von parallelen beta-Helices zu erhalten, sollte in der vorliegenden Arbeit versucht werden, den Faltungsmechanismus dieses Proteins näher zu charakterisieren. Dabei sollte vor allem die Frage geklärt werden, welche Wechselwirkungen für die Stabilität dieses Proteins einerseits und für die Stabilität von essentiellen Faltungsintermediaten andererseits besonders wichtig sind.
Rückfaltung von BsPel, ausgehend vom guanidiniumchlorid-denaturierten Zustand, war bei kleinen Proteinkonzentrationen und niedrigen Temperaturen vollständig möglich. GdmCl-induzierte Faltungsübergänge waren aber nicht reversibel und zeigten eine apparente Hysterese. Kinetische Messungen des Fluoreszenz- und CD-Signals im fernen UV ergaben eine extreme Denaturierungsmittelabhängigkeit der Rückfaltungsrate im Bereich des Übergangmittelpunktes. Der extreme Abfall der Rückfaltungsraten mit steigender Denaturierungsmittelkonzentration kann als kooperative Entfaltung eines essentiellen Faltungsintermediats verstanden werden. Dieses Faltungsintermediat ist temperaturlabil und kann durch den Zusatz Glycerin im Renaturierungspuffer stabilisiert werden, wobei sich die Hysterese verringert, jedoch nicht vollständig aufgehoben wird. Durch reverse Doppelsprungexperimente konnten zwei transiente Faltungsintermediate nachgewiesen werden, die auf zwei parallelen Faltungswegen liegen und beide zum nativen Zustand weiterreagieren können. Fluoreszenzemissionsspektren der beiden Intermediate zeigten, daß beide schon nativähnliche Struktur aufweisen. Kinetische Daten von Prolin-Doppelsprungexperimenten zeigten, daß Prolinisomerisierung den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Reaktivierung des denaturierten Enzyms darstellt. Desweiteren konnte durch Prolin-Doppelsprungexperimenten an Mutanten mit Substitutionen im Prolinrest 281 gezeigt werden, daß die langsame Renaturierung von BsPel nicht durch die Isomerisierung der einzigen cis-Peptidbindung an Prolin 281 verursacht wird, sondern durch die Isomerisierung mehrerer trans-Proline. Die beiden beobachteten transienten Faltungsintermediate sind somit wahrscheinlich zwei Populationen von Faltungsintermediaten mit nicht-nativen X-Pro-Peptidbindungen, wobei sich die Populationen durch mindestens eine nicht-native X-Pro-Peptidbindung unterscheiden.
Der Austausch des Prolinrestes 281 gegen verschiedene Aminosäuren (Ala, Ile, Leu, Phe, Gly) führte zu einer starken Destabilisierung des nativen Proteins und daneben auch zu einer Reduktion in der Aktivität, da die Mutationsstelle in der Nähe der putativen Substratbindetasche liegt. Die Rückfaltungskinetiken der Prolinmutanten war bei 10°C annähernd gleich zum Wildtyp und die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der Faltung waren durch die Mutation nicht verändert. Die durch die Mutation verursachte drastische Destabilisierung des nativen Zustands führte zu einem reversiblen Entfaltungsgleichgewicht bei pH 7 und 10°C. GdmCl-induzierte Faltungsübergänge der Mutante P281A zeigten bei Messungen der Tryptophanfluoreszenzemission und der Aktivität einen kooperativen Phasenübergang mit einem Übergangsmittelpunkt bei 1.1 M GdmCl. Durch die Übereinstimmung der Faltungsübergänge bei beiden Messparametern konnten die Faltungsübergänge nach dem Zwei-Zustandsmodell ausgewertet werden. Dabei wurde eine freie Sabilisierungsenthalpie der Faltung für die Mutante von - 64.2 ± 0.4 kJ/mol und eine Kooperativität des Übergangs von - 58.2 ± 0.3 kJ/(mol·M) bestimmt.
BsPel enthält, wie die meisten monomeren rechtsgängigen parallelen beta-Helix-Proteine, einen internen Stapel wasserstoffverbrückter Asparagin-Seitenketten. Die Mehrheit der erzeugten Mutanten mit Substitutionen im Zentrum der Asn-Leiter (N271X) waren als enzymatisch aktives Protein zugänglich. Die Auswirkung der Mutation auf die Stabilität und Rückfaltung wurde an den Proteinen BsPel-N271T und BsPel-N271A näher analysiert. Dabei führte die Unterbrechung des Asparaginstapels im Inneren der beta-Helix zu keiner drastischen Destabilisierung des nativen Proteins. Allerdings führten diese Mutationen zu einem temperatur-sensitiven Faltungsphänotyp und die Hysterese im Denaturierungsübergang wurde verstärkt. Offenbar wird durch die Unterbrechung des Asparaginstapel ein essentielles, thermolabiles Faltungsintermediat destabilisiert. Der Asparaginstapel wird somit bei der Faltung sehr früh ausgebildet und ist wahrscheinlich schon im Übergangszustand vorhanden. N2 - Pectate lyases belong to a family of proteins secreted by plant pathogenic microbes. The enzymes cleave alpha-1,4 linked galacturonic acid by a beta-elimination that results in an unsaturated product, which can be quantified spectrophotometrically. Calcium is essential for the activity and the pH-optimum is near 8.5. All known structures of pectate and pectin lyases have the same structural motif - a right handed parallel beta-helix. The structure of pectate lyase from Bacillus subtilis (BsPel) has been solved in complex with calcium. It is a monomeric protein, with a molecular mass of about 43 kDa and without disulfide bonds. This allows its high-yield recombinant expression in the cytoplasm of Escherichia coli. Parallel beta-helices are relative large proteins, however with a simple folding topology. The objective of this work was to characterize the folding mechanism of BsPel. In particular we investigated the role of the interactions of certain residues in the parallel beta-helix for the stability of the native protein and the stability of essential folding intermediates. Refolding of BsPel was possible at low protein concentrations and low temperature. However, denaturation of BsPel was not freely reversible. De- and renaturation curves showed a large apparent hysteresis. Furthermore, the folding rate constant deduced from fluorescence and circulardichroism measurements showed a very strong dependence on denaturant concentrations near the midpoint of the renaturation transition. This can be explained with a cooperative unfolding of an essential folding intermediate. Upon stabilisation of the temperature-sensitive intermediate by addition of glycerol in the renaturation buffer, the hysteresis is reduced, but does not disappear. Reverse double mixing kinetic experiments have shown that two transient folding intermediates are on the folding pathway. These intermediates are on parallel pathways and both can fold to the native state. Fluorescence emission spectra have shown the native-like structure of both intermediates. Furthermore, data from proline double mixing kinetic experiments revealed that isomerization of peptidyl-prolyl bonds was responsible for the slow kinetics in the reactivation of the enzyme. However, the isomerization of the single cis-peptidyl-prolyl bond at Pro281 was not responsible for the slowest folding phase observed, but rather the isomerization of other trans-peptidyl-prolyl bonds. Thus, both transient folding intermediates observed probably represent two populations of folding intermediates with non-native X-Pro-peptide bonds. The difference of the two populations is at least one non-native X-Pro-peptide bond. Mutations of the proline 281 against various residues (Ala, Ile, Leu, Phe, Gly) resulted in a strong destabilization of the native protein. Also, the activity of the mutant proteins was strong reduced due to the position of the mutation site near the putative active center of the protein. At 10°C the kinetic folding behavior of the proline mutants was not significant changed. However, the strong destabilization of the native state in the proline mutants resulted in a reversible folding equilibrium at pH 7 and 10°C. The unfolding of the P281A mutant was reversible as determined by fluorescence emission and enzyme activity measurements. The coincidence of these detected transitions is consistent with a two-state equilibrium transition. At pH 7 and 10°C the delta G°(H2O) for folding of P281A was - 64.2 ± 0.4 kJ/mol, with a midpoint of the transition at 1.1 M GdmCl and a cooperativity of - 58.2 ± 0.3 kJ/(mol·M). BsPel has an asparagine ladder in turn 2 of the parallel beta-helix with extensive network of side-chain hydrogen bonds between the Asn residues. Such an Asn-ladder is a conserved feature of many monomeric beta-helices crystallized so far. The middle Asn residue (271) was selected and exchanged for various residues. Most of the mutants were expressed at 25°C as soluble and active proteins but with a significant reduction in yield. Mutants N271T and N271A were selected to study the stability and refolding of these proteins in comparison with the wild-type protein. The substitution in the Asn-ladder did not drastically destabilize the native protein, but caused a temperature-sensitive-folding (tsf) phenotype with an increased hysteresis in the de- and renaturation transition curves. In addition, the disruption of the Asn-ladder resulted in destabilization of an essential, thermosensitive folding intermediate. Thus, the Asn-ladder is formed very early during the folding, probably well before the transition state of folding. KW - Heubacillus ; Pectat-Lyase ; Helix KW - apparente Hysterese KW - parallele rechtsgängige beta-Helix KW - Pektat-Lyase KW - Peptidyl-Prolyl-cis-trans Isomerisierung KW - Proteinfaltung KW - temperatur-sensitive KW - apparent hysteresis KW - cis-trans isomerisation of prolyl-peptide bonds KW - parallel beta-helix KW - pectate lyase KW - protein folding KW - temperature sensitive foldi Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000588 ER - TY - THES A1 - Trippo, Ulrike T1 - Körperbau, Körperzusammensetzung und Ernährungsgewohnheiten bei Erwachsenen in Abhängigkeit von Alter und Geschlecht N2 - Die vorliegende Arbeit ist eine aktuelle Dokumentation von Körperbau, Körperzusammensetzung und Ernährungsgewohnheiten an 708 jüngeren und älteren Männern und Frauen aus dem Bundesland Brandenburg. Der Körperbau wurde über ein 42 Längen-, Breiten-, Tiefen- und Umfangsmaße umfassendes anthropometrisches Untersuchungsprogramm bestimmt. Die Einschätzung von Gesamtkörperfettanteil und Magermasse erfolgte mit zwei Feldmethoden, der Hautfaltendickenmessung und der bioelektrischen Impedanzanalyse. Mit Hilfe eines semiquantitativen Fragebogens zu den Ernährungsgewohnheiten wurde der Lebensmittelverzehr erfasst und daraus die Energie- und Nährstoffaufnahme berechnet. Die Ergebnisse zum Körperbau zeigen im Mittel eine Abnahme der Längenmaße, jedoch eine Zunahme der Breiten-, Tiefen- und Umfangsmaße mit steigendem Erwachsenenalter. Einfache Parameter zur Beurteilung des Ernährungszustandes, wie Körpermasse und Body-Mass-Index (BMI) nehmen im Alter geschlechtsspezifisch zu. Nach den Richtlinien der WHO für den BMI gelten 55,3% der untersuchten Männern als übergewichtig, davon 10% als adipös. Von allen untersuchten Frauen sind 41,6% übergewichtig, davon sind 14,3% adipös. Der Anteil der Übergewichtigen ist zwar beim weiblichen Geschlecht geringer, aber dafür haben mehr Frauen die Grenze zur Adipositas überschritten. Für eine wissenschaftlich exakte Beurteilung des Ernährungszustandes reichen Körpermasse und BMI nicht aus, da sie die Körperzusammensetzung nicht bzw. nicht genügend berücksichtigen. Die subkutane Fettschichtdicke nimmt insbesondere am Rumpf zu, was als zusätzliches Gesundheitsrisiko gilt. Der Gesamtkörperfettanteil steigt im Erwachsenenalter abhängig von der Berechnungsmethode an. Die untersuchten Frauen sind gegenüber den Männern in allen Altersgruppen durch einen etwa ein Drittel höheren Körperfettanteil gekennzeichnet. Die tägliche Nahrungsenergieaufnahme der untersuchten Personen lässt eine abnehmende Tendenz bis zum 65. Lebensjahr erkennen. Trotz einer sinkenden Nahrungsenergieaufnahme im Alter, nimmt der BMI zu. Mögliche Ursachen hierfür werden in der Arbeit diskutiert. Der Anteil der Grundnährstoffe an der Energiebereitstellung entspricht in keiner der untersuchten Gruppen den Empfehlungen der Deutschen Gesellschaft für Ernährung. Allgemein ist der Fettkonsum zu hoch und der Kohlenhydratanteil zu gering. Das zeigt sich besonders in den beiden mittleren untersuchten Altersgruppen und bei den Männern stärker als bei den Frauen. N2 - The objective of the present study was an analysis of body build, body composition and nutritional habits. 708 young and elderly men and women of Germany (Brandenburg) have been examined. The test persons underwent a detailed anthropometric examination encompassing 42 length, breadth, depth and circumference measurements. The total body fat and lean body mass were determined by means of two field methods - skinfold thickness measurements and bioelectrical impedance analysis. Dietary intake was assessed by a semiquantitative food frequency questionnaire. The results concerning body build show on average a decrease of length measurements, however, an increase of breadths, depths and circumferences during adult age. Simple parameters for estimation of nutritional status like Body mass and Body-Mass-Index (BMI) rise during adulthood clearly depending on sex. Following the BMI-recommendations of the WHO 55.3% of men investigated are overweight out of this 10% are adipose. From all women investigated 41.6% are overweight out of this 14.6% are obese or adipose. The portion of overweight persons is certainly lower in women but on the other hand women exceed more often the limit of adiposity. For a scientifically correct assessment of the nutritional status body mass and BMI are not sufficient because body composition is not included. Subcutaneous fat layer increases in particular at the trunk. This abdominal fat distribution is an additional health risk. Total body fat increases during adult age depending on the method used. Women show in all investigated age groups a significantly higher total body fat content compared with men (about one third more). During adulthood the energy intake in men and women tends to decrease more and more. Energy intake and BMI show an inverse trend: While energy intake decreases by age, the BMI rises. Possible reasons for that were discussed. Intake of basic nutrients does not meet the recommendations of the German Association of Nutrition. In general the intake of fat is too high and the intake of carbohydrates is too low. This can be especially seen in the two middle-aged groups investigated. In men this unhealthy trend is higher than in women. KW - Körperzusammensetzung KW - BMI KW - BIA KW - Anthropometrie KW - Ernährungsgewohnheiten KW - Ernährungszustand Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000306 ER - TY - THES A1 - Daub, Carsten Oliver T1 - Analysis of integrated transcriptomics and metabolomics data : a systems biology approach N2 - Moderne Hochdurchsatzmethoden erlauben die Messung einer Vielzahl von komplementären Daten und implizieren die Existenz von regulativen Netzwerken auf einem systembiologischen Niveau. Ein üblicher Ansatz zur Rekonstruktion solcher Netzwerke stellt die Clusteranalyse dar, die auf einem Ähnlichkeitsmaß beruht. Wir verwenden das informationstheoretische Konzept der wechselseitigen Information, das ursprünglich für diskrete Daten definiert ist, als Ähnlichkeitsmaß und schlagen eine Erweiterung eines für gewöhnlich für die Anwendung auf kontinuierliche biologische Daten verwendeten Algorithmus vor. Wir vergleichen unseren Ansatz mit bereits existierenden Algorithmen. Wir entwickeln ein geschwindigkeitsoptimiertes Computerprogramm für die Anwendung der wechselseitigen Information auf große Datensätze. Weiterhin konstruieren und implementieren wir einen web-basierten Dienst fuer die Analyse von integrierten Daten, die durch unterschiedliche Messmethoden gemessen wurden. Die Anwendung auf biologische Daten zeigt biologisch relevante Gruppierungen, und rekonstruierte Signalnetzwerke zeigen Übereinstimmungen mit physiologischen Erkenntnissen. N2 - Recent high-throughput technologies enable the acquisition of a variety of complementary data and imply regulatory networks on the systems biology level. A common approach to the reconstruction of such networks is the cluster analysis which is based on a similarity measure. We use the information theoretic concept of the mutual information, that has been originally defined for discrete data, as a measure of similarity and propose an extension to a commonly applied algorithm for its calculation from continuous biological data. We compare our approach to previously existing algorithms. We develop a performance optimised software package for the application of the mutual information to large-scale datasets. Furthermore, we design and implement a web-based service for the analysis of integrated data measured with different technologies. Application to biological data reveals biologically relevant groupings and reconstructed signalling networks show agreements with physiological findings. KW - Transinformation KW - wechselseitige Information KW - Ähnlichkeitsmaß KW - Genexpression KW - mutual information KW - distance measure KW - gene expression Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001251 ER - TY - THES A1 - Lehmann, Cathleen T1 - Untersuchungen zum Aufnahmemechanismus und intrazellulärem Transport von fusogenen und kationischen Liposomen-DNA-Komplexen für den Gentransfer N2 - Mit der vorliegenden Arbeit sollten mit Hilfe elektronenmikroskopischer Methoden verschiedene Liposomen-DNA-Komplexe zum Gentransfer charakterisiert sowie die Aufnahme und Verteilung in der Zellkultur untersucht werden. Dabei waren vor allem solche Präparationen von besonderem Interesse, die in unserer Arbeitsgruppe 'Drug Targeting' getestet oder entwickelt und verwendet wurden, wie Sendai-Virus Liposomen (HVJ-Liposomen), Virosomen sowie DAC-Chol und DOCSPER-Liposomen als Vertreter der kationischen Lipide. Im ersten Teil der Arbeit wurden fusogene Liposomen und Virosomen charakterisiert. Bei diesen Untersuchungen wurden folgende Ergebnisse erzielt: ·Sendai-Viren fusionieren mit Liposomen unterschiedlicher Lipidzusammensetzung. ·Die daraus resultierenden HVJ-Liposomen sind mit elektronenmikroskopischen Methoden identifizierbar. ·Die Spikes auf den HVJ-Liposomen besitzen fusogene Eigenschaften. ·HVJ-Liposomen eignen sich auf Grund der geringen Ausbeute sowie der geringen Transfektionseffizienz nicht zum in vitro Gentransfer. ·Virosomen stellen einen weiteren Typ fusogener Gentransfervesikel dar. ·Ihre Größe und fusogenen Eigenschaften sind abhängig von der externen Zugabe einer optimierten Lipidmischung. ·Im Innenraum der Virosomen kann mit Poly-L-Lysin vorkomplexierte DNA verkapselt werden. ·Die fusogenen Eigenschaften der Virosomen wurden mit Hilfe immunelektronenmikroskopischer Techniken und monoklonaler Antikörper gegen Hämagglutinin/Neuraminidase und das Fusionsprotein sowie mit polyklonalen Antiseren gezeigt. ·An Hand goldmarkierter DNA sind Virosomen nach der Transfektion in der Zelle nachweisbar. Da in unserer Arbeitsgruppe bevorzugt kationische Liposomen zum Gentransfer verwendet werden, wurde auch die Struktur der Liposomen untersucht und folgende Ergebnisse dokumentiert: ·Die Struktur und die Größe kationischer Liposomen werden hauptsächlich durch die Lipidzusammensetzung bestimmt. ·Die Bildung von Liposomen-DNA-Komplexen ist mit einer Größenzunahme der Komplexe gekoppelt. ·Die Anzahl gebundener Plasmide steigt mit der Größe der Lipoplexe. ·Gentransferaktive Lipopolyplexe (mit Protaminsulfat komplexierte DNA und DAC-Chol- Liposomen) sind kleiner als Lipoplexe. Ihre Struktur wird von der Zusammensetzung bestimmt. Eine weitere wichtige Frage betrifft den Weg der Gencarrier in der Zelle. Kenntnisse über diese Vorgänge sind vorteilhaft, um die einzelnen Schritte zu verstehen und möglichst gezielt zu verbessern. Bei der Untersuchung der Partikel im Hinblick auf zelluläre Barrieren beim Gentransfer konnten folgende Ergebnisse erzielt werden: ·Die Bindung der Partikel an die Zellmembran und Aufnahme sind abhängig von den eingesetzten Zellen und Komplexen sowie derInkubationszeit. ·Die Aufnahme erfolgt über endozytotische Mechanismen, wobei Lipopolyplexe schneller als Lipoplexe in die Zellen gelangen. Nicht alle gebundenen Komplexe werden aufgenommen. ·Die aufgenommenen Partikel befinden sich in Endosomen und werden ins Innere der Zelle transportiert. ·Freisetzung der DNA und Eintritt in den Zellkern über Kernporen konnte nicht beobachtet werden. ·DNA-haltige Vesikel in Kernnähe deuten auf einen weiteren Mechanismus hin (Vesikeltransfer zum Zellkern). N2 - The aim of this work is the characterisation of several liposome DNA complexes for in vitro gene transfer and uptake as well as their distribution in cultured cell lines using electron microscopy. The particles used were fusogenic liposomes made from Sendai virus, virosomes and cationic liposomes. At first fusogenic liposomes and virosomes were characterised. The results obtained are summarised below: ·Sendai virus can fuse with liposomes made from different lipid composition. ·HVJ-liposomes are detectable using electron microscopy techniques. ·The spikes from HVJ-liposomes have fusogenic properties. ·HVJ-liposomes are not suitable for in vitro gene transfer due to the low amount of fusogenic liposomes leading to low transfection efficiency. ·Virosomes, reconstituted virus envelopes, are another type of fusogenic vesicles. ·Size and morphology of virosomes depends on the addition of an optimised lipid mixture. ·PLL treated DNA is entrapped into virosomes. ·Monoclonal and polyclonal antibodies and protein A gold technique can be used for the detection of viral glycoproteins on virosomes. ·Gold labelled DNA was used to show the distribution in cultured cells. In order to characterise the structure of cationic liposomes following results were obtained: ·Size and structure depends on the lipid composition. ·The formation of liposomes leads to an increase of the size. ·Larger lipoplexes contain more DNA. ·Lipopolyplexes composed of DNA complexed with protamine sulphate and DAC- Chol liposomes are smaller than lipoplexes. Their structure depends on the composition. To improve transfection ability examination of the cellular barriers is useful. With regard to the fate of lipoplexes following results were obtained. ·Binding depends on the cell line, kind of particles and incubation time. ·Uptake occurs through endocytosis. Lipopolyplexes enter the cells faster than larger lipoplexes. ·Lipoplexes are enclosed in endosomes and were carried into the centre of the cell. ·Escape of DNA from endosomes and entry into nucleus were not visible. ·Vesicles with DNA were observed near the nucleus. There is an opportunity for another pathway to the nucleus. KW - Gentherapie KW - kationische Liposomen KW - Virosomen KW - Elektronenmikroskopie KW - gene therapy KW - cationic liposome KW - virosome KW - electron microscopy Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001196 ER -