TY - JOUR A1 - Adem, Fozia A. A1 - Mbaveng, Armelle T. A1 - Kuete, Victor A1 - Heydenreich, Matthias A1 - Ndakala, Albert A1 - Irungu, Beatrice A1 - Yenesew, Abiy A1 - Efferth, Thomas T1 - Cytotoxicity of isoflavones and biflavonoids from Ormocarpum kirkii towards multi-factorial drug resistant cancer JF - Phytomedicine : international journal of phytotherapy and phytopharmacology N2 - Background: While incidences of cancer are continuously increasing, drug resistance of malignant cells is observed towards almost all pharmaceuticals. Several isoflavonoids and flavonoids are known for their cytotoxicity towards various cancer cells. Methods: The cytotoxicity of compounds was determined based on the resazurin reduction assay. Caspases activation was evaluated using the caspase-Glo assay. Flow cytometry was used to analyze the cell cycle (propodium iodide (PI) staining), apoptosis (annexin V/PI staining), mitochondrial membrane potential (MMP) (JC-1) and reactive oxygen species (ROS) (H2DCFH-DA). CCRF-CEM leukemia cells were used as model cells for mechanistic studies. Results: Compounds 1, 2 and 4 displayed IC50 values below 20 mu M towards CCRF-CEM and CEM/ADR5000 leukemia cells, and were further tested towards a panel of 7 carcinoma cells. The IC50 values of the compounds against carcinoma cells varied from 16.90 mu M (in resistant U87MG.Delta EGFR glioblastoma cells) to 48.67 mu M (against HepG2 hepatocarcinoma cells) for 1, from 7.85 mu M (in U87MG.Delta EGFR cells) to 14.44 mu M (in resistant MDA-MB231/BCRP breast adenocarcinoma cells) for 2, from 4.96 mu M (towards U87MG.Delta EGFRcells) to 7.76 mu M (against MDA-MB231/BCRP cells) for 4, and from 0.07 mu M (against MDA-MB231 cells) to 2.15 mu M (against HepG2 cells) for doxorubicin. Compounds 2 and 4 induced apoptosis in CCRF-CEM cells mediated by MMP alteration and increased ROS production. Conclusion: The present report indicates that isoflavones and biflavonoids from Ormocarpum kirkii are cytotoxic compounds with the potential of being exploited in cancer chemotherapy. Compounds 2 and 4 deserve further studies to develop new anticancer drugs to fight sensitive and resistant cancer cell lines. KW - Apoptosis KW - Cancer KW - Ormocarpum kirkii KW - Isoflavone KW - Biflavonoid KW - Multi-drug resistance Y1 - 2019 U6 - https://doi.org/10.1016/j.phymed.2019.152853 SN - 0944-7113 SN - 1618-095X VL - 58 PB - Elsevier CY - München ER - TY - JOUR A1 - Marco, Makungu A1 - Deyou, Tsegaye A1 - Gruhonjic, Amra A1 - Holleran, John A1 - Duffy, Sandra A1 - Heydenreich, Matthias A1 - Firtzpatrick, Paul A. A1 - Landberg, Goran A1 - Koch, Andreas A1 - Derese, Solomon A1 - Pelletier, Jerry A1 - Avery, Vicky M. A1 - Erdelyi, Mate A1 - Yenesew, Abiy T1 - Pterocarpans and isoflavones from the root bark of Millettia micans and of Millettia dura JF - Phytochemistry letters KW - Millettia micans KW - Millettia dura KW - Pterocarpan KW - Isoflavone KW - Cytotoxicity KW - Plasmodium falciparum Y1 - 2017 U6 - https://doi.org/10.1016/j.phytol.2017.07.012 SN - 1874-3900 SN - 1876-7486 VL - 21 SP - 216 EP - 220 PB - Elsevier CY - Amsterdam ER - TY - THES A1 - Schröder, Christine T1 - Identifizierung und Charakterisierung der Isoflavon-umsetzenden Enzyme aus dem humanen Darmbakterium Slackia isoflavoniconvertens T1 - Identification and characterization of isoflavone-converting enzymes of the human gut bacterium Slackia isoflavoniconvertens N2 - Aufgrund ihrer potenziell gesundheitsfördernden Wirkung sind die polyphenolischen Isoflavone für die menschliche Ernährung von großem Interesse. Eine Vielzahl an experimentellen und epidemiologischen Studien zeigen für die in Soja enthaltenen Isoflavone Daidzein und Genistein eine präventive Wirkung bezüglich hormon-abhängiger und altersbedingter Erkrankungen, wie Brust- und Prostatakrebs, Osteoporose, Herz-Kreislauf-Erkrankungen sowie des menopausalen Syndroms. Die Metabolisierung und Bioaktivierung dieser sekundären Pflanzenstoffe durch die humane intestinale Darmmikrobiota ist individuell unterschiedlich. Nur in einem geringen Teil der westlichen Bevölkerung wird der Daidzein-Metabolit Equol durch spezifische Darmbakterien gebildet. Ein isoliertes Equol-produzierendes Bakterium des menschlichen Darmtrakts ist Slackia isoflavoniconvertens. Anhand dieser Spezies sollten die bislang unbekannten, an der Umsetzung von Daidzein und Genistein beteiligten Enzyme identifiziert und charakterisiert werden. Fermentationsexperimente mit S. isoflavoniconvertens zeigten, dass die Gene der Daidzein und Genistein-umsetzenden Enzyme nicht konstitutiv exprimiert werden, sondern induziert werden müssen. Mit Hilfe der zweidimensionalen differentiellen Gelelektrophorese wurden sechs Proteine detektiert, welche in einer S. isoflavoniconvertens-Kultur in Anwesenheit von Daidzein induziert wurden. Auf Grundlage einzelner Peptidsequenzen erfolgte die Sequenzierung eines Genkomplexes mit den in gleicher Orientierung angeordneten Genen der durch Daidzein induzierten Proteine. Sequenzvergleiche identifizierten zudem äquivalente Genprodukte zu den Proteinen von S. isoflavoniconvertens in anderen Equolproduzierenden Bakterien. Nach der heterologen Expression in Escherichia coli wurden drei dieser Gene durch enzymatische Aktivitätstests als Daidzein-Reduktase (DZNR), Dihydrodaidzein-Reduktase (DHDR) und Tetrahydrodaidzein-Reduktase (THDR) identifiziert. Die Kombination der E. coli-Zellextrakte führte zur vollständigen Umsetzung von Daidzein über Dihydrodaidzein zu Equol. Neben Daidzein setzte die DZNR auch Genistein zu Dihydrogenistein um. Dies erfolgte mit einer größeren Umsatzgeschwindigkeit im Vergleich zur Reduktion von Daidzein zu Dihydrodaidzein. Enzymatische Aktivitätstests mit dem Zellextrakt von S. isoflavoniconvertens zeigten ebenfalls eine schnellere Umsetzung von Genistein. Die Kombination der rekombinanten DHDR und THDR führte zur Umsetzung von Dihydrodaidzein zu Equol. Der korrespondierende Metabolit 5-Hydroxyequol konnte als Endprodukt des Genistein-Metabolismus nicht detektiert werden. Zur Reinigung der drei identifizierten Reduktasen wurden diese genetisch an ein Strep-tag fusioniert und mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Die übrigen durch Daidzein induzierten Proteine IfcA, IfcBC und IfcE wurden ebenfalls in E. coli exprimiert und als Strep-Fusionsproteine gereinigt. Vergleichende Aktivitätstests identifizierten das induzierte Protein IfcA als Dihydrodaidzein-Racemase. Diese katalysierte die Umsetzung des (R)- und (S)-Enantiomers von Dihydrodaidzein und Dihydrogenistein zum korrespondierenden Racemat. Neben dem Elektronentransfer-Flavoprotein IfcBC wurden auch die THDR, DZNR und IfcE als FAD-haltige Flavoproteine identifiziert. Zudem handelte es sich bei IfcE um ein Eisen-Schwefel-Protein. Nach Induktion der für die Daidzein-Umsetzung kodierenden Gene wurden mehrere verschieden lange mRNA-Transkripte gebildet. Dies zeigte, dass die Transkription des durch Daidzein induzierten Genkomplexes in S. isoflavoniconvertens nicht in Form eines einzelnen Operonsystems erfolgte. Auf Grundlage der identifizierten Daidzein-umsetzenden Enzyme kann der Mechanismus der bakteriellen Umsetzung von Isoflavonen durch S. isoflavoniconvertens eingehend erforscht werden. Die ermittelten Gensequenzen der durch Daidzein induzierten Proteine sowie die korrespondierenden Gene weiterer Equol-produzierender Bakterien bieten zudem die Möglichkeit der mikrobiellen Metagenomanalyse im humanen Darmtrakt. N2 - Gut bacteria play a crucial role in the metabolism of dietary isoflavones which have been implicated in the prevention of hormone-dependent and age-related diseases. Only the intestinal bacteria are able to catalyze the bioactivation of the main soybean isoflavones daidzein and genistein to equol and 5-hydroxy-equol, respectively. Although several equolforming gut bacteria have been isolated in recent years, the knowledge on the involved enzymes is still scarce. Slackia isoflavoniconvertens represents one of the few equol-forming gut bacteria isolated from humans. Growth experiments with S. isoflavoniconvertens indicated that the enzymes catalyzing the conversion of daidzein and genistein were inducible by these isoflavones. Using two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE), several proteins were found to be upregulated in S. isoflavoniconvertens cells grown in the presence of daidzein. Based on selected protein sequences, a cluster of eight genes was identified encoding the daidzeininduced proteins. Sequence analysis revealed also similarities of daidzein-induced proteins to corresponding enzymes from other equol-forming human gut bacteria. The heterologous expression of three of those proteins in Escherichia coli and enzyme activity tests identified them as a daidzein reductase (DZNR), a dihydrodaidzein reductase (DHDR) and a tetrahydrodaidzein reductase (THDR). The combined cell extracts catalyzed the complete conversion of daidzein to equol. The recombinant DZNR also converted genistein to the intermediate dihydrogenistein at higher rates than observed for the conversion of daidzein to dihydrodaidzein. Higher rates were also observed with S. isoflavoniconvertens cell extracts. In combination, the recombinant DHDR and THDR catalyzed the reduction of dihydrodaidzein to equol, while the corresponding formation product 5-hydroxy-equol was not observed. The three reductases were functionally expressed as Strep-tag fusion proteins and purified by a one-step affinity chromatography. In addition, the remaining daidzein-induced proteins IfcA, IfcBC and IfcE were successfully expressed in E. coli and purified. In a comparative enzyme activity test, IfcA was identified as a dihydrodaidzein racemase, which converts the (R)- and (S)-enantiomers of dihydrodaidzein and dihydrogenistein to the corresponding racemate. Flavin analysis revealed flavin adenine dinucleotide (FAD) as the cofactor of THDR, DZNR, IfcE and also of the putative heterodimeric electron tansfer flavoprotein IfcBC. In addition, IfcE was identified as iron-sulfur enzyme. The analysis of intergenic regions and gene expression indicated a non-operon genetic structure of daidzein-induced proteins, because mRNA expression occurs at different transcriptional units. Furthermore, the transcription start site was determined for ifcA as the first gene of daidzein-induced gene cluster. In summary, the identification and incipient characterization of the daidzein-induced enzymes provides the basis for detection corresponding genes in other equol-forming gut bacteria within the microbial metagenome of the human gut. The results enable also further studies to elucidate the catalytic mechanism underlying the isoflavone bioactivation by S. isoflavoniconvertens and to clarify the regulation of enzyme induction. KW - Isoflavone KW - Darmbakterium KW - Equol KW - Proteine KW - Reduktase KW - isoflavones KW - gut microbiota KW - equol KW - protein KW - reductase Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-80065 ER - TY - THES A1 - Reimann, Manja T1 - Der Einfluss von diätetisch verabreichten Sojaisoflavonen auf den Homocysteinmetabolismus und die Endothelfunktion bei gesunden, postmenopausalen Frauen T1 - The impact of soy isoflavones on homocysteine metabolism and endothelial function in healthy postmenopausal women N2 - Homocystein (tHcy) gilt als unabhängiger kardiovaskulärer Risikofaktor und korreliert eng mit einer endothelialen Dysfunktion, welche nichtinvasiv mittels der flussinduzierten Vasodilatation (FMD) messbar ist. Experimentelle Hyperhomocysteinämie ist mit einer reduzierten Bioverfügbarkeit von endothelialen Stickstoffmonoxid (NO) bei gleichzeitig erhöhten Spiegeln des kompetetiven Inhibitors der NO-Biosynthese asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA) assoziiert. In-vivo senkt eine Östrogenbehandlung neben tHcy auch die ADMA-Spiegel und verbessert signifikant die Endothelfunktion. Hinsichtlich ihrer Wirkung als selektive Östrogenrezeptormodulatoren wird angenommen, dass Phytoöstrogene, speziell Sojaisoflavone, ähnliche Effekte hervorrufen. Innerhalb einer europäischen, multizentrischen, doppelblinden Interventionsstudie an 89 gesunden, postmenopausalen Frauen wurde der Einfluss von Sojaisoflavonen auf den Homocysteinmetabolismus, den Blutdruck und die in-vivo Endothelfunktion untersucht. Die cross-over Studie umfasste zwei achtwöchige Interventionsperioden, die von einer gleichlangen Wash-out-Phase unterbrochen waren. Die Zuteilung zum Isoflavon- (50 mg/d) oder Plazeboregime für die erste Interventionsphase erfolgte randomisiert. Endpunkterhebungen fanden jeweils in den Wochen 0 und 8 der Interventionsperioden statt. Die renale Ausscheidung von Genistein, Daidzein und Equol war während der Isoflavonintervention signifikant erhöht (P>0,001). Die Phyoöstrogene hatten weder einen Effekt auf die tHcy-Konzentration (P=0,286), noch auf ADMA, Erythrozytenfolat und Vitamin B-12 (P>0,05) im Plasma. Während die Summe aus Nitrat und Nitrit (NOx), welche die NO-Bioverfügbarkeit reflektiert, im Verlaufe der Plazebobehandlung abfiel, wurde ein leichter Anstieg bei der Isoflavonsupplementation beobachtet (Delta Wo8-Wo0: -2,60 [-8,75; 2,25] vs. 1,00 [-6,65; 7,85] µmol/L P<0,001), was zu einem signifikanten Behandlungseffekt führte. Weiterhin wurde eine positive Korrelation zwischen ADMA und Vitamin B-12 gefunden (R=0,252; P=0,018). Die flussinduzierte Vasodilatation (P=0,716), ein Maß für die Endothelfunktion, blieb durch die Isoflavonbehandlung unbeeinflusst, obwohl sich diese über die Zeit insgesamt verbesserte (P>0,001). Bis auf einen marginalen Anstieg des systolischen Wertes (P=0,032) im Vergleich zur Plazebobehandlung blieb der Blutdruck während der Isoflavonintervention unverändert. Im Gegensatz zu Östrogen übten Sojaisoflavone weder einen Einfluss auf die in-vivo Endothelfunktion noch auf die traditionellen und neuen kardiovaskulären Risikofaktoren den Blutdruck, tHcy und ADMA aus. Demzufolge ist der gesundheitliche Nutzen isolierter Isoflavone hinsichtlich einer Prävention hormonmangelbedingter Erkrankungen in gesunden postmenopausalen Frauen fraglich. N2 - Homocysteine (tHcy) is a strong and independent risk factor for cardiovascular disease. Hyperhomocysteinemia contributes to endothelial dysfunction as assessed by flow-mediated vasodilation (FMD). The mechanisms by which homocysteine generates endothelial dysfunction remain incompletely understood although a growing body of data suggests that the bioavailability of nitric oxide (NO) is reduced. The principal competitive inhibitor of endothelial NO-synthase asymmetric dimethylarginine (ADMA) may play a central role in homocysteine related dysfunction as it is derived from homocysteine metabolism. Cardiovascular risk factor modification has suggested beneficial effects of estrogen on endothelial function by lowering homocysteine and ADMA levels. We hypothesize that phytoestrogens particular isoflavones act in a similar manner. The effects of soy isoflavones on homocysteine metabolism and endothelial function were investigated within a multi-centre, double blind, cross-over intervention trial in 89 European postmenopausal women. Subjects consumed either fruit cereal bars with or without soy isoflavones (50 mg/d) for 8 weeks each with a 8 weeks washout period in between. Endpoint measurements were during both treatment phases at baseline and weeks 8, respectively. Urinary phytoestrogens increased significantly after isoflavone intervention (P<0.001). Isoflavone supplementation did affect neither plasma total homocysteine (P=0.286) nor ADMA, vitamin B-12 or folate (P<0.05). Isoflavones had a favorable effect on NO-metabolism assessed by analysis of NO-metabolites (NOx) nitrite and nitrate. While NOx concentration significantly decreased during placebo there was a slight increase after isoflavone supplementation leading to a significant treatment difference (delta wk8-wk0: -2.60 [-8.75; 2.25] vs. 1.00 [-6.65; 7.85] µmol/L P<0.001). There was no association between total homocysteine and ADMA whereas a positive correlation was found for ADMA and vitamin B-12 (R=0.252; P=0.018). The endothelial function model did not demonstrate any difference between either treatment regime (P=0.716), although endothelial function assessed by flow-mediated vasodilation improved in general (P<0.001). A potential adverse effect was noted, with an elevation in systolic blood pressure (P=0.032) whereas diastolic blood pressure and mean arterial pressure remained unaffected. Soy isoflavones did not have beneficial effects on endothelial function as well as on traditional and novel cardiovascular risk factors like plasma homocysteine, blood pressure and ADMA as observed for estrogen treatment. The health benefit of isolated isoflavones in healthy postmenopausal women is questionable. KW - Isoflavone KW - Homocystein KW - Stickstoffmonoxid KW - Sojabohne KW - Östrogene KW - Hormonersatztherapie KW - postmenopausal KW - asymmetrisches Dimethylarginin KW - Endothelfunktion KW - endothelabhängige flussinduzierte Vasodilatation KW - soy isoflavones KW - homocysteine KW - asymmetric dimethylarginine KW - nitric oxide KW - endothelial function Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-6233 ER -