TY  - THES
A1  - Vosloh, Daniel
T1  - Subcellular compartmentation of primary carbon metabolism in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana
T1  - Subzelluläre Kompartimentierung des primären Kohlenstoffmetabolismus in Mesophyllzellen von Arabidopsis thaliana
N2  - Metabolismus in Pflanzenzellen ist stark kompartimentiert. Viele Stoffwechselwege haben Reaktionen in mehr als einem Kompartiment. Zum Beispiel wird während der Photosynthese in pflanzlichen Mesophyllzellen Kohlenstoff in Form von Stärke in den Chloroplasten synthetisiert, während es im Zytosol in Form von Sacharose gebildet und in der Vakuole gespeichert wird. Diese Reaktionen sind strikt reguliert um ein Gleichgewicht der Kohlenstoffpools der verschiedenen Kompartimente aufrecht zu erhalten und die Energieversorgung aller Teile der Zelle für anabolische Reaktionen sicher zu stellen. Ich wende eine Methode an, bei der die Zellen unter nicht-wässrigen Bedingungen fraktioniert werden und daher der metabolische Status der während der Ernte herrschte über den ganzen Zeitraum der Auftrennung beibehalten wird. Durch die Kombination von nichtwässriger Fraktionierung und verschiedener Massenspektrometrietechniken (Flüssigchromotagraphie- und Gaschromotagraphie basierende Massenspekrometrie) ist es möglich die intrazelluläre Verteilung der meisten Intermediate des photosynthetischen Kohlenstoffstoffwechsels und der Produkte der nachgelagerten metabolischen Reaktionen zu bestimmen. Das Wissen über die in vivo Konzentrationen dieser Metabolite wurde genutzt um die Änderung der freien Gibbs Energie in vivo zu bestimmen. Mit Hilfe dessen kann bestimmt werden, welche Reaktion sich in einem Gleichgewichtszustand befinden und welche davon entfernt sind. Die Konzentration der Enzyme und der Km Werte wurden mit den Konzentrationen der Metabolite in vivo verglichen, um festzustellen, welche Enzyme substratlimitiert sind und somit sensitiv gegenüber Änderungen der Substratkonzentration sind. Verschiedene Intermediate des Calvin-Benson Zyklus sind gleichzeitig Substrate für andere Stoffwechselwege, als da wären Dihyroxyaceton-phosphat (DHAP, Saccharosesynthese), Fructose 6-phosphat (Fru6P, Stärkesynthese), Erythrose 4-phosphat (E4P, Shikimat Stoffwechselweg) und Ribose 5-phosphat (R5P, Nukleotidbiosynthese). Die Enzyme, die diese Intermediate verstoffwechseln, liegen an den Abzweigungspunkten zu diesen Stoffwechselwegen. Diese sind Trisose phosphat isomerase (DHAP), Transketolase (E4P), Sedoheptulose-1,7 biphosphat aldolase (E4P) und Ribose-5-phosphat isomerase (R5P), welche nicht mit ihren Substraten gesättigt sind, da die jeweilige Substratkonzentration geringer als der zugehörige Km Wert ist. Für metabolische Kontrolle bedeutet dies, dass diese Schritte am sensitivsten gegenüber Änderungen der Substratkonzentrationen sind. Im Gegensatz dazu sind die regulierten irreversiblen Schritte von Fructose-1,6.biphosphatase und Sedoheptulose-1,7-biphosphatase relativ insensitiv gegenüber Änderungen der Substratkonzentration. Für den Stoffwechselweg der Saccharosesynthese konnte gezeigt werden, dass die zytosolische Aldolase eine geringer Bindeseitenkonzentration als Substratkonzentration (DHAP) aufweist, und dass die Konzentration von Saccharose-6-phosphat geringer als der Km Wert des synthetisierenden Enzyms Saccharose-phosphatase ist. Sowohl die Saccharose-phosphat-synthase, also auch die Saccharose-phosphatase sind in vivo weit von einem Gleichgewichtszustand entfernt. In Wildtyp Arabidopsis thaliana Columbia-0 Blättern wurde der gesamte Pool von ADPGlc im Chloroplasten gefunden. Das Enzyme ADPGlc pyrophosphorylase ist im Chloroplasten lokalisiert und synthetisiert ADPGlc aus ATP und Glc1P. Dieses Verteilungsmuster spricht eindeutig gegen die Hypothese von Pozueta-Romero und Kollegen, dass ADPGlc im Zytosol durch ADP vermittelte Spaltung von Saccharose durch die Saccharose Synthase erzeugt wird. Basierend auf dieser Beobachtung und anderen veröffentlichten Ergebnissen wurde geschlußfolgert, dass der generell akzeptierte Stoffwechselweg der Stärkesynthese durch ADPGlc Produktion via ADPGlc pyrophosphorylase in den Chloroplasten korrekt ist, und die Hypothese des alternativen Stoffwechselweges unhaltbar ist. Innerhalb des Stoffwechselweges der Saccharosesynthsese wurde festgestellt, dass die Konzentration von ADPGlc geringer als der Km Wert des Stärkesynthase ist, was darauf hindeutet, dass das Enzym substratlimitiert ist. Eine generelle Beobachtung ist, dass viele Enzmye des Calvin-Benson Zyklus ähnliche Bindeseitenkonzentrationen wie Metabolitkonzentrationen aufweisen, wohingegen in den Synthesewegen von Saccharose und Stärke die Bindeseitenkonzentrationen der Enzyme viel geringer als die Metabolitkonzentrationen sind.
N2  - Metabolism in plant cells is highly compartmented, with many pathways involving reactions in more than one compartment. For example, during photosynthesis in leaf mesophyll cells, primary carbon fixation and starch synthesis take place in the chloroplast, whereas sucrose is synthesized in the cytosol and stored in the vacuole. These reactions are tightly regulated to keep a fine balance between the carbon pools of the different compartments and to fulfil the energy needs of the organelles. I applied a technique which fractionates the cells under non-aqueous conditions, whereby the metabolic state is frozen at the time of harvest and held in stasis throughout the fractionation procedure. With the combination of non-aqueous fractionation and mass spectrometry based metabolite measurements (LC-MS/MS, GC-MS) it was possible to investigate the intracellular distributions of the intermediates of photosynthetic carbon metabolism and its products in subsequent metabolic reactions. With the knowledge about the in vivo concentrations of these metabolites under steady state photosynthesis conditions it was possible to calculate the mass action ratio and change in Gibbs free energy in vivo for each reaction in the pathway, to determine which reactions are near equilibrium and which are far removed from equilibrium. The Km value and concentration of each enzyme were compared with the concentrations of its substrates in vivo to assess which reactions are substrate limited and so sensitive to changes in substrate concentration. Several intermediates of the Calvin-Benson cycle are substrates for other pathways, including dihydroxyacetone-phosphate (DHAP,sucrose synthesis), fructose 6-phosphate (Fru6P, starch synthesis), erythrose 4-phosphate (E4P,shikimate pathway) and ribose 5-phosphate (R5P, nucleotide synthesis). Several of the enzymes that metabolise these intermediates, and so lie at branch points in the pathway, are triose-phosphate isomerase (DHAP), transketolase (E4P, Fru6P), sedoheptulose-1,7-bisphosphate aldolase (E4P) and ribose-5-phosphate isomerase (R5P) are not saturated with their respective substrate as the metabolite concentration is lower than the respective Km value. In terms of metabolic control these are the steps that are most sensitive to changes in substrate availability, while the regulated irreversible reactions of fructose-1,6-bisphosphatase and sedoheptulose-1,7-bisphosphatase are relatively insensitive to changes in the concentrations of their substrates. In the pathway of sucrose synthesis it was shown that the concentration of the catalytic binding site of the cytosolic aldolase is lower than the substrate concentration of DHAP, and that the concentration of Suc6P is lower than the Km of sucrose-phosphatase for this substrate. Both the sucrose-phosphate synthase and sucrose-phosphatase reactions are far removed from equilibrium in vivo. In wild type A. thaliana Columbia-0 leaves, all of the ADPGlc was found to be localised in the chloroplasts. ADPglucose pyrophosphorylase is localised to the chloroplast and synthesises ADPGlc from ATP and Glc1P. This distribution argues strongly against the hypothesis proposed by Pozueta-Romero and colleagues that ADPGlc for starch synthesis is produced in the cytosol via ADP-mediated cleavage of sucrose by sucrose synthase. Based on this observation and other published data it was concluded that the generally accepted pathway of starch synthesis from ADPGlc produced by ADPglucose pyrophosphorylase in the chloroplasts is correct, and that the alternative pathway is untenable. Within the pathway of starch synthesis the concentration of ADPGlc was found to be well below the Km value of starch synthase for ADPGlc, indicating that the enzyme is substrate limited. A general finding in the comparison of the Calvin-Benson cycle with the synthesis pathways of sucrose and starch is that many enzymes in the Calvin Benson cycle have active binding site concentrations that are close to the metabolite concentrations, while for nearly all enzymes in the synthesis pathways the active binding site concentrations are much lower than the metabolite concentrations.
KW  - Pflanze
KW  - Kohlenstoffmetabolismus
KW  - Mesophyll
KW  - Zelle
KW  - plant
KW  - carbon metabolism
KW  - mesophyll
KW  - cell
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-55534
ER  - 
TY  - THES
A1  - Uflewski, Michal
T1  - Characterizing the regulation of proton antiport across the thylakoid membrane
N2  - Die Energie, die zum Antrieb photochemischer Reaktionen benötigt wird, stammt aus der Ladungstrennung an der Thylakoidmembran. Aufrgrund des Unterschieds in der Protonenkonzentration zwischen dem Stroma der Chloroplasten und dem Thylakoidlumen wird eine Protonenmotorische Kraft (pmf) erzeugt. Die pmf setzt sich aus dem Protonengradienten (ΔpH) und dem Membranpotential (ΔΨ) zusammen, die gemeinsam die ATP-Synthese antreiben. In der Natur schwankt die Energiemenge, die die Photosynthese antreibt, aufgrund häufiger Änderungen der Lichtintensität. Der Thylakoid-Ionentransport kann den Energiefluss durch einen Photosyntheseapparat an die Lichtverfügbarkeit anpassen, indem er die pmf-Zusammensetzung verändert. Die Dissipation von ΔΨ verringert die Ladungsrekombination am Photosystem II, so dass ein Anstieg der ΔpH-Komponente eine Rückkopplung zur Herabregulierung der Photosynthese auslösen kann. Der durch den K+-Austausch-Antiporter 3 (KEA3) gesteuerte K+/H+-Antiport reduziert den ΔpH-Anteil von pmf und dämpft dadurch das nicht-photochemische Quenching (NPQ). Infolgedessen erhöht sich die Photosyntheseeffizienz beim Übergang zu geringerer Lichtintensität. Ziel dieser Arbeit war es, Antworten auf Fragen zur Regulierung der KEA3-Aktivität und ihrer Rolle in der Pflanzenentwicklung zu finden. Die vorgestellten Daten zeigen, dass KEA3 in Pflanzen, denen der Chloroplasten-ATP-Synthase-Assembly-Faktor CGL160 fehlt und die eine verminderte ATP-Synthase-Aktivität aufweisen, eine zentrale Rolle bei der Regulierung der Photosynthese und des Pflanzenwachstums unter stationären Bedingungen spielt. Das Fehlen von KEA3 in der cgl160-Mutante führt zu einer starken Beeinträchtigung des Wachstums, da die Photosynthese aufgrund des erhöhten pH-abhängigen NPQs und des verringerten Elektronenflusses durch den Cytochrom b6f-Komplex eingeschränkt ist. Die Überexpression von KEA3 in der cgl160-Mutante erhöht die Ladungsrekombination im Photosystem II und fördert die Photosynthese. In Zeiten geringer ATP-Synthase-Aktivität profitieren die Pflanzen also von der KEA3-Aktivität. KEA3 unterliegt einer Dimerisierung über seinen regulatorischen C-Terminus (RCT). Der RCT reagiert auf Veränderungen der Lichtintensität, da die Pflanzen, die KEA3 ohne diese Domäne exprimieren, einen reduzierten Lichtschutzmechanismus bei Lichtintensitätsschwankungen aufweisen. Allerdings fixieren diese Pflanzen während der Photosynthese-Induktionsphase mehr Kohlenstoff als Gegenleistung für einen langfristigen Photoprotektor, was die regulierende Rolle von KEA3 in der Pflanzenentwicklung zeigt. Der KEA3-RCT ist dem Thylakoidstroma zugewandt, so dass seine Regulierung von lichtinduzierten Veränderungen in der Stroma-Umgebung abhängt. Die Regulierung der KEA3-Aktivität überschneidet sich mit den pH-Änderungen im Stroma, die bei Lichtschwankungen auftreten. Es hat sich gezeigt, dass ATP und ADP eine Affinität zum heterolog exprimierten KEA3 RCT haben. Eine solche Wechselwirkung verursacht Konformationsänderungen in der RCT-Struktur. Die Faltung der RCT-Liganden-Interaktion hängt vom pH-Wert der Umgebung ab. Mit einer Kombination aus Bioinformatik und In-vitro-Ansatz wurde die ATP-Bindungsstelle am RCT lokalisiert. Das Einfügen einer Punktmutation in der KEA3-RCT Bindungsstelle in planta führte zu einer Deregulierung der Antiporteraktivität beim Übergang zu wenig Licht. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten ermöglichten es uns, die Rolle von KEA3 bei der Anpassung der Photosynthese umfassender zu bewerten und Modelle zur Regulierung der KEA3-Aktivität während des Übergangs zwischen verschiedenen Lichtintensitäten vorzuschlagen.
N2  - The energy required to drive photochemical reactions is derived from charge separation across the thylakoid membrane. As the consequence of difference in proton concentration between chloroplasts stroma and thylakoid lumen, a proton motive force (pmf) is generated. The pmf is composed out of the proton gradient (ΔpH) and membrane potential (ΔΨ), and together they drive the ATP synthesis. In nature, the amount of energy fueling photosynthesis varies due to frequent changes in the light intensity. Thylakoid ion transport can adapt the energy flow through a photosynthetic apparatus to the light availability by adjusting the pmf composition. Dissipation of ΔΨ reduces the charge recombination at the photosystem II, allowing for an increase in ΔpH component to trigger a feedback downregulation of photosynthesis. K+ Exchange Antiporter 3 (KEA3) driven K+/H+ antiport reduces the ΔpH fraction of pmf, thereby dampening a non-photochemical quenching (NPQ). As a result, it increases the photosynthesis efficiency during the transition to lower light intensity. This thesis aimed to find the answers for questions concerning KEA3 activity regulation and its role in plant development. Presented data shows that in plants lacking chloroplast ATP synthase assembly factor CGL160 with decreased ATP synthase activity, KEA3 has a pivotal role in photosynthesis regulation and plant growth during steady-state conditions. Lack of KEA3 in cgl160 mutant results in a strong growth impairment, as photosynthesis is limited due to increased pH-dependent NPQ and decreased electron flow through cytochrome b6f complex. Overexpression of KEA3 in cgl160 mutant increases charge recombination at photosystem II, promoting photosynthesis. Thus, during periods of low ATP synthase activity, plants benefit from KEA3 activity. The KEA3 undergoes dimerization via its regulatory C-terminus (RCT). The RCT responds to changes in light intensity as the plants expressing KEA3 without this domain show reduced photo-protective mechanism in light intensity transients. However, those plants fix more carbon during the photosynthesis induction phase as a trade-off for a long-term photoprotection, showing KEA3 regulatory role in plant development. The KEA3 RCT is facing thylakoid stroma, thus its regulation depends on light-induced changes in the stromal environment. KEA3 activity regulation overlaps with the stromal pH changes occurring during light fluctuations. The ATP and ADP has shown to have an affinity towards heterologously expressed KEA3 RCT. Such interaction causes conformational changes in RCT structure. The fold change of RCT-ligand interaction depends on the environmental pH value. With a combination of bioinformatics and in vitro approach, the ATP binding site at RCT was located. Introduction of binding site point mutation in planta KEA3 RCT resulted in antiporter activity deregulation during transition to low light. Together, the data presented in this thesis allowed us to assess more broadly a KEA3 role in photosynthesis adjustment and propose the models of KEA3 activity regulation throughout transition in light intensity.
KW  - plant
KW  - photosynthesis
KW  - thylakoid
KW  - ion transport
KW  - fluctuating light
KW  - Pflanze
KW  - Photosynthese
KW  - Thylakoid
KW  - Ionentransport
KW  - schwankendes Licht
Y1  - 2021
ER  -