TY  - JOUR
A1  - Ud-Din, Aziz
A1  - Rauf, Mamoona
A1  - Ghafoor, S.
A1  - Khattak, M. N. K.
A1  - Hameed, M. W.
A1  - Shah, H.
A1  - Jan, S.
A1  - Muhammad, K.
A1  - Rehman, A.
A1  - Inamullah, 
T1  - Efficient use of artificial micro-RNA to downregulate the expression of genes at the post-transcriptional level in Arabidopsis thaliana
JF  - Genetics and molecular research
N2  - Micro-RNAs are cellular components regulating gene expression at the post-transcription level. In the present study, artificial micro-RNAs were used to decrease the transcript level of two genes, AtExpA8 (encoding an expansin) and AHL25 (encoding an AT-hook motif nuclear localized protein) in Arabidopsis thaliana. The backbone of the Arabidopsis endogenous MIR319a micro-RNA was used in a site-directed mutagenesis approach for the generation of artificial micro-RNAs targeting two genes. The recombinant cassettes were expressed under the control of the CaMV 35S promoter in individual A. thaliana plants. Transgenic lines of the third generation were tested by isolating total RNA and by subsequent cDNA synthesis using oligo-dT18 primers and mRNAs as templates. The expression of the two target genes was checked through quantitative realtime polymerase chain reaction to confirm reduced transcript levels for AtExpA8 and AHL25. Downregulation of AtExpA8 resulted in the formation of short hypocotyls compared with those of the wild-type control in response to low pH and high salt concentration. This technology could be used to prevent the expression of exogenous and invading genes posing a threat to the normal cellular physiology of the host plant.
KW  - Artificial micro-RNA
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - qRT-PCR
KW  - AtExpA8
KW  - AHL25
Y1  - 2016
U6  - https://doi.org/10.4238/gmr.15027439
SN  - 1676-5680
VL  - 15
PB  - FUNPEC
CY  - Ribeirao Preto
ER  - 
TY  - THES
A1  - Nietzsche, Madlen
T1  - Identifizierung und Charakterisierung neuer Komponenten der SnRK1-Signaltransduktion in Arabidopsis thaliana
T1  - Identification and characterization of novel components of SnRK1-Signalling in Arabidopsis thaliana
N2  - Für alle Organismen ist die Aufrechterhaltung ihres energetischen Gleichgewichts unter fluktuierenden Umweltbedingungen lebensnotwendig. In Eukaryoten steuern evolutionär konservierte Proteinkinasen, die in Pflanzen als SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1) bezeichnet werden, die Adaption an Stresssignale aus der Umwelt und an die Limitierung von Nährstoffen und zellulärer Energie. Die Aktivierung von SnRK1 bedingt eine umfangreiche transkriptionelle Umprogrammierung, die allgemein zu einer Repression energiekonsumierender Prozesse wie beispielsweise Zellteilung und Proteinbiosynthese und zu einer Induktion energieerzeugender, katabolischer Stoffwechselwege führt. Wie unterschiedliche Signale zu einer generellen sowie teilweise gewebe- und stressspezifischen SnRK1-vermittelten Antwort führen ist bisher noch nicht ausreichend geklärt, auch weil bislang nur wenige Komponenten der SnRK1-Signaltransduktion identifiziert wurden. In dieser Arbeit konnte ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk um die SnRK1αUntereinheiten aus Arabidopsis AKIN10/AKIN11 etabliert werden. Dadurch wurden zunächst Mitglieder der pflanzenspezifischen DUF581-Proteinfamilie als Interaktionspartner der SnRK1α-Untereinheiten identifiziert. Diese Proteine sind über ihre konservierte DUF581Domäne, in der ein Zinkfinger-Motiv lokalisiert ist, fähig mit AKIN10/AKIN11 zu interagieren. In planta Ko-Expressionsanalysen zeigten, dass die DUF581-Proteine eine Verschiebung der nucleo-cytoplasmatischen Lokalisierung von AKIN10 hin zu einer nahezu ausschließlichen zellkernspezifischen Lokalisierung begünstigen sowie die Ko-Lokalisierung von AKIN10 und DUF581-Proteinen im Nucleus. In Bimolekularen Fluoreszenzkomplementations-Analysen konnte die zellkernspezifische Interaktion von DUF581-Proteinen mit SnRK1α-Untereinheiten in planta bestätigt werden. Außerhalb der DUF581-Domäne weisen die Proteine einander keine große Sequenzähnlichkeit auf. Aufgrund ihrer Fähigkeit mit SnRK1 zu interagieren, dem Fehlen von SnRK1Phosphorylierungsmotiven sowie ihrer untereinander sehr variabler gewebs-, entwicklungs- und stimulusspezifischer Expression wurde für DUF581-Proteine eine Funktion als Adaptoren postuliert, die unter bestimmten physiologischen Bedingungen spezifische Substratproteine in den SnRK1-Komplex rekrutieren. Auf diese Weise könnten DUF581Proteine die Interaktion von SnRK1 mit deren Zielproteinen modifizieren und eine Feinjustierung der SnRK1-Signalweiterleitung ermöglichen. Durch weiterführende Interaktionsstudien konnten DUF581-interagierende Proteine darunter Transkriptionsfaktoren, Proteinkinasen sowie regulatorische Proteine gefunden werden, die teilweise ebenfalls Wechselwirkungen mit SnRK1α-Untereinheiten aufzeigten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eines dieser Proteine für das eine Beteiligung an der SnRK1Signalweiterleitung als Transkriptionsregulator vermutet wurde näher charakterisiert. STKR1 (STOREKEEPER RELATED 1), ein spezifischer Interaktionspartner von DUF581-18, gehört zu einer pflanzenspezifischen Leucin-Zipper-Transkriptionsfaktorfamilie und interagiert in Hefe sowie in planta mit SnRK1. Die zellkernspezifische Interaktion von STKR1 und AKIN10 in Pflanzen unterstützt die Vermutung der kooperativen Regulation von Zielgenen. Weiterhin stabilisierte die Anwesenheit von AKIN10 die Proteingehalte von STKR1, das wahrscheinlich über das 26S Proteasom abgebaut wird. Da es sich bei STKR1 um ein Phosphoprotein mit SnRK1-Phosphorylierungsmotiv handelt, stellt es sehr wahrscheinlich ein SnRK1-Substrat dar. Allerdings konnte eine SnRK1-vermittelte Phosphorylierung von STKR1 in dieser Arbeit nicht gezeigt werden. Der Verlust von einer Phosphorylierungsstelle beeinflusste die Homo- und Heterodimerisierungsfähigkeit von STKR1 in Hefeinteraktionsstudien, wodurch eine erhöhte Spezifität der Zielgenregulation ermöglicht werden könnte. Außerdem wurden Arabidopsis-Pflanzen mit einer veränderten STKR1-Expression phänotypisch, physiologisch und molekularbiologisch charakterisiert. Während der Verlust der STKR1-Expression zu Pflanzen führte, die sich kaum von Wildtyp-Pflanzen unterschieden, bedingte die konstitutive Überexpression von STKR1 ein stark vermindertes Pflanzenwachstum sowie Entwicklungsverzögerungen hinsichtlich der Blühinduktion und Seneszenz ähnlich wie sie auch bei SnRK1α-Überexpression beschrieben wurden. Pflanzen dieser Linien waren nicht in der Lage Anthocyane zu akkumulieren und enthielten geringere Gehalte an Chlorophyll und Carotinoiden. Neben einem erhöhten nächtlichen Stärkeumsatz waren die Pflanzen durch geringere Saccharosegehalte im Vergleich zum Wildtyp gekennzeichnet. Eine Transkriptomanalyse ergab, dass in den STKR1-überexprimierenden Pflanzen unter Energiemangelbedingungen, hervorgerufen durch eine verlängerte Dunkelphase, eine größere Anzahl an Genen im Vergleich zum Wildtyp differentiell reguliert war als während der Lichtphase. Dies spricht für eine Beteiligung von STKR1 an Prozessen, die während der verlängerten Dunkelphase aktiv sind. Ein solcher ist beispielsweise die SnRK1-Signaltransduktion, die unter energetischem Stress aktiviert wird. Die STKR1Überexpression führte zudem zu einer verstärkten transkriptionellen Induktion von Abwehrassoziierten Genen sowie NAC- und WRKY-Transkriptionsfaktoren nach verlängerter Dunkelphase. Die Transkriptomdaten deuteten auf eine stimulusunabhängige Induktion von Abwehrprozessen hin und konnten eine Erklärung für die phänotypischen und physiologischen Auffälligkeiten der STKR1-Überexprimierer liefern.
N2  - For all living organism maintenance of energy homeostasis under changing environmental conditions is indispensable. In eukaryotes, evolutionary conserved protein kinases, such as the SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1) in plants, integrate environmental stress signals, nutrient availability and energy depletion during adaptational responses. Activation of SnRK1 triggers a broad transcriptional reprogramming, which in general represses energy consuming processes such as proliferation and protein biosynthesis and induces energy producing catabolic pathways. Although SnRK1 acts as a convergent point for many different environmental and metabolic signals to control growth and development, it is currently unknown how these many different signals could be translated into a cell-type or stimulusspecific response. This is also due to the fact that only a few proteins participating in SnRK1 signal transduction have yet been identified. In this work, a protein-protein interaction network of the Arabidopsis SnRK1α-subunits AKIN10/AKIN11 was established. Thereby, members of the plant specific DUF581 protein family were identified as SnRK1α interacting proteins. The highly conserved DUF581 domain possesses a zinc finger motif and mediates the interaction with AKIN10/AKIN11. In planta co-expression of AKIN10 with DUF581 proteins leads to a shift of subcellular localization from a nucleo-cytoplasmic distribution of both proteins to a nearly exclusive nuclear localization and show that AKIN10 and DUF581 proteins co-localize in nuclei of plant cells. Bimolecular fluorescence complementation analysis revealed that SnRK1α-subunits interact with DUF581 proteins in plants. Apart from their DUF581 domain there is no strong sequence similarity between DUF581 proteins. Because of their ability to interact with SnRK1, the absence of SnRK1-target motifs and their highly variable transcriptional regulation in a tissue-, development- or stimuli-specific manner, it is possible that DUF581 proteins act as adaptor proteins recruiting substrate proteins into the SnRK1 complex under defined physiological conditions. That said, DUF581 could modify the interaction of SnRK1 with its target proteins and facilitate fine-tuning of SnRK1 signal transduction. Additional interaction studies revealed further DUF581 interacting proteins such as transcription factors, protein kinases and regulatory proteins that in part were also able to interact with SnRK1α. One of these proteins which is supposed to be involved in SnRK1 signaling as a transcriptional regulator was characterized in more detail: Arabidopsis STKR1 (STOREKEPPER RELATED 1) a DUF581-18 interaction partner belongs to a plant specific leucine zipper transcription factor family and is able to interact with SnRK1 in yeast and in planta. Co-operative regulation of target genes by STKR1 and AKIN10 is supported by the specific interaction of these proteins inside the plant nucleus. Furthermore, AKIN10 seems to stabilize protein levels of STKR1 in that it attenuates its proteasomal turnover. Due to the fact that STKR1 is a phosphoprotein with putative SnRK1 target motives it is likely a SnRK1 substrate. However, SnRK1 mediated phosphorylation of STKR1 could not be shown in this work. Though, interaction studies in yeast revealed that a loss of putative phosphorylation sites influences the ability of homo- and hetero-dimerization of STKR1, possibly allowing a higher specificity during target gene regulation. Another part of this work was the phenotypic, physiological and molecular characterization of Arabidopsis plants with altered expression of STKR1. Whereas the absence of STKR1 expression results in plants without strong phenotypic abnormality compared to wildtype the overexpression leads to a strong decrease in plant growth as well as developmental retardations regarding to the induction of flowering and senescence reminiscent of SnRK1overexpressing plants. Plants of these lines were not able to accumulate anthocyanins and also contain reduced levels of chlorophyll and carotenoids. Besides a higher starch turnover in dark, these plants displayed lower sucrose contents. Microarray analysis revealed that under energy deficit stress, induced by extended darkness, a higher number of genes were differentially regulated in plants overexpressing STKR1 compared to wildtype than during the light period. This observation argues for a participation of STKR1 in processes, which are active under extended darkness, being the case for SnRK1 signaling which is strongly activated under energy deficient stress. Overexpression of STKR1 also leads to transcriptional induction of genes associated with defense like NAC and WRKY transcription factors after an extended dark. Results of transcriptome data analysis indicate a stimulus independent induction of defense associated processes and are suitable to explain phenotypical and physiological abnormality of the STKR1 overexpressing lines.
KW  - SnRK1
KW  - Proteinkinase
KW  - Phosphorylierung
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - Energiemangel
KW  - phosphorylation
KW  - energy starvation
KW  - protein kinase
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-98678
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Czesnick, Hjördis
A1  - Lenhard, Michael
T1  - Antagonistic control of flowering time by functionally specialized poly(A) polymerases in Arabidopsis thaliana
JF  - The plant journal
N2  - Polyadenylation is a critical 3-end processing step during maturation of pre-mRNAs, and the length of the poly(A) tail affects mRNA stability, nuclear export and translation efficiency. The Arabidopsis thaliana genome encodes three canonical nuclear poly(A) polymerase (PAPS) isoforms fulfilling specialized functions, as reflected by their different mutant phenotypes. While PAPS1 affects several processes, such as the immune response, organ growth and male gametophyte development, the roles of PAPS2 and PAPS4 are largely unknown. Here we demonstrate that PAPS2 and PAPS4 promote flowering in a partially redundant manner. The enzymes act antagonistically to PAPS1, which delays the transition to flowering. The opposite flowering-time phenotypes in paps1 and paps2 paps4 mutants are at least partly due to decreased or increased FLC activity, respectively. In contrast to paps2 paps4 mutants, plants with increased PAPS4 activity flower earlier than the wild-type, concomitant with reduced FLC expression. Double mutant analyses suggest that PAPS2 and PAPS4 act independently of the autonomous pathway components FCA, FY and CstF64. The direct polyadenylation targets of the three PAPS isoforms that mediate their effects on flowering time do not include FLC sense mRNA and remain to be identified. Thus, our results uncover a role for canonical PAPS isoforms in flowering-time control, raising the possibility that modulating the balance of the isoform activities could be used to fine tune the transition to flowering. Significance Statement The length of the poly(A) tail affects mRNA stability, nuclear export and translation efficiency. Arabidopsis has three isoforms of nuclear poly(A) polymerase (PAPS): PAPS1 plays a major role in organ growth and plant defence. Here we show that PAPS2 and PAPS4 redundantly promote flowering and act antagonistically to PAPS1, which delays flowering. We suggest that modulating the activity of these isoforms fine-tunes the transition to flowering.
KW  - polyadenylation
KW  - 3-end processing
KW  - poly(A) polymerase
KW  - flowering time
KW  - autonomous pathway
KW  - Arabidopsis thaliana
Y1  - 2016
U6  - https://doi.org/10.1111/tpj.13280
SN  - 0960-7412
SN  - 1365-313X
VL  - 88
SP  - 570
EP  - 583
PB  - Wiley-Blackwell
CY  - Hoboken
ER  -