TY - JOUR A1 - Schweigert, Florian J. A1 - Gericke, Beate A1 - Wolfram, Wiebke A1 - Kaisers, Udo A1 - Dudenhausen, Joachim W. T1 - Peptide and protein profiles in serum and follicular fluid of women undergoing IVF JF - Human reproduction N2 - BACKGROUND: Proteins and peptides in human follicular fluid originate from plasma or are produced by follicular structures. Compositional changes reflect oocyte maturation and can be used as diagnostic markers. The aim of the study was to determine protein and peptide profiles in paired serum and follicular fluid samples from women undergoing IVF. METHODS: Surface-enhanced laser desorption and ionization-time of flight-mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) was used to obtain characteristic protein pattern. RESULTS: One hundred and eighty-six individual MS signals were obtained from a combination of enrichment on strong anion exchanger (110), weak cation exchanger (52) and normal phase surfaces (24). On the basis of molecular masses, isoelectric points and immunoreactivety, four signals were identified as haptoglobin (alpha(1)- and alpha(2)-chain), haptoglobin 1 and transthyretin (TTR). Immunological and MS characteristics of the TTR : retinol-binding protein (RBP) transport complex revealed no microheterogeneity differences between serum and follicular fluid. Discriminatory patterns arising from decision-tree-based classification and regression analysis distinguished between serum and follicular fluid with a sensitivity and specificity of 100%. CONCLUSIONS: Quantitative and qualitative differences indicate selective transport processes rather than mere filtration across the blood-follicle barrier. Identified proteins as well as characteristic peptide and/or protein signatures might emerge as potential candidates for diagnostic markers of follicle and/or oocyte maturation and thus oocyte quality. KW - human follicular fluid KW - peptide KW - protein KW - proteome KW - serum Y1 - 2006 U6 - https://doi.org/10.1093/humrep/del257 SN - 0268-1161 VL - 21 IS - 11 SP - 2960 EP - 2968 PB - Univ. Press CY - Oxford ER - TY - THES A1 - Rothe, Monique T1 - Response of intestinal Escherichia coli to dietary factors in the mouse intestine T1 - Anpassung von Escherichia coli an Ernährungsfaktoren im Intestinaltrakt der Maus N2 - Diet is a major force influencing the intestinal microbiota. This is obvious from drastic changes in microbiota composition after a dietary alteration. Due to the complexity of the commensal microbiota and the high inter-individual variability, little is known about the bacterial response at the cellular level. The objective of this work was to identify mechanisms that enable gut bacteria to adapt to dietary factors. For this purpose, germ-free mice monoassociated with the commensal Escherichia coli K-12 strain MG1655 were fed three different diets over three weeks: a diet rich in starch, a diet rich in non-digestible lactose and a diet rich in casein. Two dimensional gel electrophoresis and electrospray tandem mass spectrometry were applied to identify differentially expressed proteins of E. coli recovered from small intestine and caecum of mice fed the lactose or casein diets in comparison with those of mice fed the starch diet. Selected differentially expressed bacterial proteins were characterised in vitro for their possible roles in bacterial adaptation to the various diets. Proteins belonging to the oxidative stress regulon oxyR such as alkyl hydroperoxide reductase subunit F (AhpF), DNA protection during starvation protein (Dps) and ferric uptake regulatory protein (Fur), which are required for E. coli’s oxidative stress response, were upregulated in E. coli of mice fed the lactose-rich diet. Reporter gene analysis revealed that not only oxidative stress but also carbohydrate-induced osmotic stress led to the OxyR-dependent expression of ahpCF and dps. Moreover, the growth of E. coli mutants lacking the ahpCF or oxyR genes was impaired in the presence of non-digestible sucrose. This indicates that some OxyR-dependent proteins are crucial for the adaptation of E. coli to osmotic stress conditions. In addition, the function of two so far poorly characterised E. coli proteins was analysed: 2 deoxy-D gluconate 3 dehydrogenase (KduD) was upregulated in intestinal E. coli of mice fed the lactose-rich diet and this enzyme and 5 keto 4 deoxyuronate isomerase (KduI) were downregulated on the casein-rich diet. Reporter gene analysis identified galacturonate and glucuronate as inducers of the kduD and kduI gene expression. Moreover, KduI was shown to facilitate the breakdown of these hexuronates, which are normally degraded by uronate isomerase (UxaC), altronate oxidoreductase (UxaB), altronate dehydratase (UxaA), mannonate oxidoreductase (UxuB) and mannonate dehydratase (UxuA), whose expression was repressed by osmotic stress. The growth of kduID-deficient E. coli on galacturonate or glucuronate was impaired in the presence of osmotic stress, suggesting KduI and KduD to compensate for the function of the regular hexuronate degrading enzymes under such conditions. This indicates a novel function of KduI and KduD in E. coli’s hexuronate metabolism. Promotion of the intracellular formation of hexuronates by lactose connects these in vitro observations with the induction of KduD on the lactose-rich diet. Taken together, this study demonstrates the crucial influence of osmotic stress on the gene expression of E. coli enzymes involved in stress response and metabolic processes. Therefore, the adaptation to diet-induced osmotic stress is a possible key factor for bacterial colonisation of the intestinal environment. N2 - Sowohl Humanstudien als auch Untersuchungen an Tiermodellen haben gezeigt, dass die Ernährung einen entscheidenden Einfluss auf die Zusammensetzung der Darmmikrobiota hat. Aufgrund der Komplexität der Mikrobiota und der inter individuellen Unterschiede sind die zellulären Mechanismen, die dieser Beobachtung zugrunde liegen, jedoch weitgehend unbekannt. Das Ziel dieser Arbeit war deshalb, Anpassungsmechanismen von kommensalen Darmbakterien auf unterschiedliche Ernährungsfaktoren mittels eines simplifizierten Modells zu untersuchen. Dazu wurden keimfreie Mäuse mit Escherichia coli MG1655 besiedelt und drei Wochen mit einer stärkehaltigen, einer laktosehaltigen oder einer kaseinhaltigen Diät gefüttert. Mittels zwei dimensionaler Gelelektrophorese und Elektrospray Ionenfallen-Massenspektrometrie wurde das Proteom der intestinalen E. coli analysiert und differentiell exprimierte bakterielle Proteine in Abhängigkeit der gefütterten Diät identifiziert. Die Funktion einiger ausgewählter Proteine bei der Anpassung von E. coli auf die jeweilige Diät wurde im Folgenden in vitro untersucht. E. coli Proteine wie z.B. die Alkylhydroperoxid Reduktase Untereinheit F (AhpF), das DNA Bindeprotein Dps und der eisenabhängige Regulator Fur, deren Expression unter der Kontrolle des Transkriptionsregulators OxyR steht, wurden stärker exprimiert, wenn die Mäuse mit der laktosehaltigen Diät gefüttert wurden. Reportergenanalysen zeigten, dass nicht nur oxidativer Stress, sondern auch durch Kohlenhydrate ausgelöster osmotischer Stress zu einer OxyR abhängigen Expression der Gene ahpCF and dps führte. Weiterhin wiesen E. coli Mutanten mit einer Deletion der ahpCF oder oxyR Gene ein vermindertes Wachstum in Gegenwart von nicht fermentierbarer Saccharose auf. Das spricht dafür, dass OxyR abhängige Proteine eine wichtige Rolle bei der Anpassung von E. coli an osmotischen Stress spielen. Weiterhin wurde die Funktion von zwei bisher wenig charakterisierten E. coli Proteinen untersucht: die 2 Deoxy D Glukonate 3 Dehydrogenase (KduD) wurde im Darm von Mäusen, die mit der laktosehaltigen Diät gefüttert wurden, induziert, während dieses Protein und die 5 Keto 4 Deoxyuronate Isomerase (KduI) nach Fütterung der kaseinhaltigen Diät herunterreguliert wurden. Mittels Reportergenanalysen wurde gezeigt, dass Galakturonat und Glukuronat die kduD und kduI Expression induzierten. KduI begünstigte die Umsetzung dieser Hexuronate. In E. coli wird die Umsetzung von Galakturonat und Glukuronat typischerweise von den Enzymen Uronate Isomerase (UxaC), Altronate Oxidoreduktase (UxaB), Altronate Dehydratase (UxaA), Mannonate Oxidoreduktase (UxuB) und Mannonate Dehydratase (UxuA) katalysiert. Weitere Experimente verdeutlichten, dass osmotischer Stress die Expression der Gene uxaCA, uxaB und uxuAB verminderte. Darüber hinaus zeigten kduID defiziente E. coli Mutanten in Gegenwart von Galakturonat oder Glukuronat und durch Saccharose ausgelösten osmotischen Stress eine Verlangsamung des Wachstums. Das deutet darauf hin, dass KduI und KduD die durch osmotischen Stress bedingten Funktionseinschränkungen der regulären hexuronatabbauenden Enzyme kompensieren. Die beobachtete Bildung von intrazellulären Hexuronaten während des Laktosekatabolismus in vitro stellt eine Verbindung zu dem ursprünglichen Tierexperiment her und deutet darauf hin, dass der Ernährungsfaktor Laktose die Verfügbarkeit von Hexuronat für intestinale E. coli beeinflusst. Diese Studie weist somit den Einfluss von osmotischem Stress auf die Expression von OxyR abhängigen Genen, die für Stressantwortproteine sowie für metabolische Enzymen kodieren, in E. coli nach. Durch Nahrungsfaktoren entstandener osmotischer Stress stellt demnach einen entscheidenden Faktor für die bakterielle Kolonisation des Darmes dar. KW - Mikrobiota KW - Escherichia coli KW - Proteom KW - Ernährungsfaktoren KW - OxyR KW - microbiota KW - Escherichia coli KW - proteome KW - dietary factors KW - OxyR Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-66387 ER - TY - THES A1 - Mörbt, Nora T1 - Differential proteome analysis of human lung epithelial cells following exposure to aromatic volatile organic compounds T1 - Differentielle Proteomeanalyse humaner Lungenepithelzellen nach Exposition mit aromatischen flüchtigen Substanzen N2 - The widespread usage of products containing volatile organic compounds (VOC) has lead to a general human exposure to these chemicals in work places or homes being suspected to contribute to the growing incidence of environmental diseases. Since the causal molecular mechanisms for the development of these disorders are not completely understood, the overall objective of this thesis was to investigate VOC-mediated molecular effects on human lung cells in vitro at VOC concentrations comparable to exposure scenarios below current occupational limits. Although differential expression of single proteins in response to VOCs has been reported, effects on complex protein networks (proteome) have not been investigated. However, this information is indispensable when trying to ascertain a mechanism for VOC action on the cellular level and establishing preventive strategies. For this study, the alveolar epithelial cell line A549 has been used. This cell line, cultured in a two-phase (air/liquid) model allows the most direct exposure and had been successfully applied for the analysis of inflammatory effects in response to VOCs. Mass spectrometric identification of 266 protein spots provided the first proteomic map of A549 cell line to this extent that may foster future work with this frequently used cellular model. The distribution of three typical air contaminants, monochlorobenzene (CB), styrene and 1,2 dichlorobenzene (1,2-DCB), between gas and liquid phase of the exposure model has been analyzed by gas chromatography. The obtained VOC partitioning was in agreement with available literature data. Subsequently the adapted in vitro system has been successfully employed to characterize the effects of the aromatic compound styrene on the proteome of A549 cells (Chapter 4). Initially, the cell toxicity has been assessed in order to ensure that most of the concentrations used in the following proteomic approach were not cytotoxic. Significant changes in abundance and phosphorylation in the total soluble protein fraction of A549 cells have been detected following styrene exposure. All proteins have been identified using mass spectrometry and the main cellular functions have been assigned. Validation experiments on protein and transcript level confirmed the results of the 2-DE experiments. From the results, two main cellular pathways have been identified that were induced by styrene: the cellular oxidative stress response combined with moderate pro-apoptotic signaling. Measurement of cellular reactive oxygen species (ROS) as well as the styrene-mediated induction of oxidative stress marker proteins confirmed the hypothesis of oxidative stress as the main molecular response mechanism. Finally, adducts of cellular proteins with the reactive styrene metabolite styrene 7,8 oxide (SO) have been identified. Especially the SO-adducts observed at both the reactive centers of thioredoxin reductase 1, which is a key element in the control of the cellular redox state, may be involved in styrene-induced ROS formation and apoptosis. A similar proteomic approach has been carried out with the halobenzenes CB and 1,2-DCB (Chapter 5). In accordance with previous findings, cell toxicity assessment showed enhanced toxicity compared to the one caused by styrene. Significant changes in abundance and phosphorylation of total soluble proteins of A549 cells have been detected following exposure to subtoxic concentrations of CB and 1,2-DCB. All proteins have been identified using mass spectrometry and the main cellular functions have been assigned. As for the styrene experiment, the results indicated two main pathways to be affected in the presence of chlorinated benzenes, cell death signaling and oxidative stress response. The strong induction of pro-apoptotic signaling has been confirmed for both treatments by detection of the cleavage of caspase 3. Likewise, the induction of redox-sensitive protein species could be correlated to an increased cellular level of ROS observed following CB treatment. Finally, common mechanisms in the cellular response to aromatic VOCs have been investigated (Chapter 6). A similar number (4.6-6.9%) of all quantified protein spots showed differential expression (p<0.05) following cell exposure to styrene, CB or 1,2-DCB. However, not more than three protein spots showed significant regulation in the same direction for all three volatile compounds: voltage-dependent anion-selective channel protein 2, peroxiredoxin 1 and elongation factor 2. However, all of these proteins are important molecular targets in stress- and cell death-related signaling pathways. N2 - Die vermehrte Verwendung von Produkten, welche flüchtige organische Substanzen (VOC - volatile organic compound) enthalten, hat eine generelle Exposition der Bevölkerung mit diesen Substanzen an Arbeitsplätzen aber auch in Wohnräumen bedingt. VOCs stehen im Verdacht, zur zunehmenden Inzidenz umweltbedingter Erkrankungen beizutragen. Da die molekularen Ursachen dieser Erkrankungen bisher noch unverstanden sind, war es ein übergeordnetes Ziel dieser Arbeit, VOC-vermittelte molekulare Effekte in menschlichen Lungenepithelzellen anhand eines in vitro Modells zu untersuchen. Dabei sollten vor allem Konzentrationen unterhalb der gültigen Arbeitsplatzgrenzwerte untersucht werden. Obwohl Effekte auf einzelne Proteine bekannt sind, wurden bisher keine Effekte der VOC-Exposition auf das komplexe Netzwerk der zellulären Proteine (Proteom) untersucht. Dieses Wissen ist essentiell, um induzierte zelluläre Mechanismen zu verstehen und Strategien zu deren Vermeidung zu entwickeln. Für die hier durchgeführten Untersuchungen wurde die Lungenepithelzelllinie A549 in einem Zweiphasenexpositionsmodell eingesetzt. Dieses ermöglichte eine möglichst direkte zelluläre Exposition und wurde bereits erfolgreich verwendet, um durch VOC hervorgerufene Entzündungseffekte zu identifizieren. Die massen-spektrometrische Identifikation von 266 Proteinflecken lieferte die erste umfassende Proteomkarte der A549 Zelllinie, welche nachfolgende Untersuchungen mit diesem häufig verwendeten Zelltyp erleichtern wird. Zusätzlich wurde die Verteilung der drei gängigen Luftkontaminanten Chlorbenzol (CB), Styrol and 1,2-Dichlorobenzol (1,2-DCB) zwischen den beiden Phasen (gas/flüssig) des Expositionsmodells gaschromatographisch bestimmt. Die Verteilung entsprach den verfügbaren Literaturdaten. Anschließend wurde das modifizierte Expositionsmodell erfolgreich eingesetzt, um styrol-vermittelte Effekte auf das Proteom der A549 Zellen zu charakterisieren (Kapitel 4). Zu Beginn erfolgte die Erfassung der Zelltoxizität der Substanz, um sicher zu stellen, daß der überwiegende Teil der späteren Expositionsexperimente mit subtoxischen Konzentrationen durchgeführt wird. Es konnte eine signifikant veränderte Expression und Phosphorylierung der löslichen Proteinfraktion der A549 Zellen als Reaktion auf die Styrolexposition festgestellt werden. Die regulierten Proteine wurden massenspektrometrisch identifiziert und ihre wichtigsten Funktionen wurden zugewiesen. Validierungsexperimente auf Protein- und auf Transkriptebene bestätigten die 2-DE Ergebnisse. Insgesamt konnte die zelluläre Reaktion durch die styrol-vermittelte Induktion zweier zentraler Mechanismen erklärt werden: oxidativer zellulärer Stress und beginnende Apoptose. Folgeexperimente wie die Messung der Menge der zellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und die Induktion von redox-sensitiven Markerproteinen konnte die Hypothese eines styrol-induzierten oxidativen Milieus bestätigen. Schließlich wurden Proteinaddukte des reaktiven Styrolmetaboliten Styrol 7,8 epoxide (SO) identifiziert. Besonders die SO-Addukte, welche and den beiden aktiven Zentren der Thioredoxin Reduktase 1 gefunden wurden könnten eine wichtige Rolle bei der styrol-induzierten ROS-Bildung sowie der beginnenden Apoptose spielen. In Analogie zum Styrolexperiment wurden die Effekte der halogenierten Benzole CB und 1,2-DCB untersucht (Kapitel 5). Es konnten ebenfalls sämtliche Proteine identifiziert und die wichtigsten zellulären Funktionen zugewiesen werden. Diese Substanzen modulierten ebenfalls apoptotische Signalwege und die zelluläre Antwort auf oxidativen Streß. Der beobachtete starke pro-apoptotische Effekt konnte für beide Substanzen mit der Spaltung der Caspase 3 nachgewiesen werden. Weiterhin konnte für CB die Induktion redox-sensitiver Proteinspezies mit einem beobachteten höherem Gehalt an ROS erklärt werden. Schließlich wurden ähnliche Mechanismen der zellulären Antwort auf die Exposition mit den drei untersuchten aromatischen VOCs diskutiert (Kapitel 6). Alle getesteten VOCs verursachten eine vergleichbare differentielle Expression (p<0,05) von 4,6-6,9% aller quantifizierten Proteinspezies. Nur drei Proteinspots wurden dabei gemeinsam für alle VOCs reguliert: voltage-dependent anion-selective channel protein 2, peroxiredoxin 1 and elongation factor 2. Allerdings gehören diese drei Proteine zu wichtigen zellulären Zielstrukturen der Signalwege für Stressantwort und Zelltod. KW - VOC KW - Proteom KW - Styrol KW - chlorbenzol KW - dichlorbenzol KW - VOC KW - proteome KW - styrene KW - monochlorobenzene KW - dichlorobenzene Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-49257 ER - TY - GEN A1 - Henze, Andrea A1 - Aumer, Franziska A1 - Grabner, Arthur A1 - Raila, Jens A1 - Schweigert, Florian J. T1 - Genetic differences in the serum proteome of horses, donkeys and mules are detectable by protein profiling T2 - Postprints der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe N2 - Although horses and donkeys belong to the same genus, their genetic characteristics probably result in specific proteomes and post-translational modifications (PTM) of proteins. Since PTM can alter protein properties, specific PTM may contribute to species-specific characteristics. Therefore, the aim of the present study was to analyse differences in serum protein profiles of horses and donkeys as well as mules, which combine the genetic backgrounds of both species. Additionally, changes in PTM of the protein transthyretin (TTR) were analysed. Serum protein profiles of each species (five animals per species) were determined using strong anion exchanger ProteinChips (R) (Bio-Rad, Munich, Germany) in combination with surface-enhanced laser desorption ionisation-time of flight MS. The PTM of TTR were analysed subsequently by immunoprecipitation in combination with matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight MS. Protein profiling revealed species-specific differences in the proteome, with some protein peaks present in all three species as well as protein peaks that were unique for donkeys and mules, horses and mules or for horses alone. The molecular weight of TTR of horses and donkeys differed by 30Da, and both species revealed several modified forms of TTR besides the native form. The mass spectra of mules represented a merging of TTR spectra of horses and donkeys. In summary, the present study indicated that there are substantial differences in the proteome of horses and donkeys. Additionally, the results probably indicate that the proteome of mules reveal a higher similarity to donkeys than to horses. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 567 KW - mass spectrometry KW - post-translational modifications KW - proteome KW - species differences Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-412886 SN - 1866-8372 IS - 567 ER -