TY - THES A1 - Cheng, Feng T1 - Evolution and ontogeny of electric organ discharge in African weakly electric fish genus Campylomormyrus: a genomic and transcriptomic perspective N2 - The African weakly electric fishes (Mormyridae) exhibit a remarkable adaptive radiation possibly due to their species-specific electric organ discharges (EODs). It is produced by a muscle-derived electric organ that is located in the caudal peduncle. Divergence in EODs acts as a pre-zygotic isolation mechanism to drive species radiations. However, the mechanism behind the EOD diversification are only partially understood. The aim of this study is to explore the genetic basis of EOD diversification from the gene expression level across Campylomormyrus species/hybrids and ontogeny. I firstly produced a high quality genome of the species C. compressirostris as a valuable resource to understand the electric fish evolution. The next study compared the gene expression pattern between electric organs and skeletal muscles in Campylomormyrus species/hybrids with different types of EOD duration. I identified several candidate genes with an electric organ-specific expression, e.g. KCNA7a, KLF5, KCNJ2, SCN4aa, NDRG3, MEF2. The overall genes expression pattern exhibited a significant association with EOD duration in all analyzed species/hybrids. The expression of several candidate genes, e.g. KCNJ2, KLF5, KCNK6 and KCNQ5, possibly contribute to the regulation of EOD duration in Campylomormyrus due to their increasing or decreasing expression. Several potassium channel genes showed differential expression during ontogeny in species and hybrid with EOD alteration, e.g. KCNJ2. I next explored allele specific expression of intragenus hybrids by crossing the duration EOD species C. compressirostris with the medium duration EOD species C. tshokwe and the elongated duration EOD species C. rhynchophorus. The hybrids exhibited global expression dominance of the C. compressirostris allele in the adult skeletal muscle and electric organ, as well as in the juvenile electric organ. Only the gene KCNJ2 showed dominant expression of the allele from C. rhynchophorus, and this was increasingly dominant during ontogeny. It hence supported our hypothesis that KCNJ2 is a key gene of regulating EOD duration. Our results help us to understand, from a genetic perspective, how gene expression effect the EOD diversification in the African weakly electric fish. N2 - Die Mormyridae, eine Familie afrikanischer schwach elektrischer Süßwasserfische, zeigen eine außergewöhnliche adaptive Radiation. Eine Erklärung für die Diversifizierung dieser Gruppe stellen die artspezifischen elektrischen Organentladungen (EODs) dar. Diese werden von einem elektrischen Organ muskulären Ursprungs im Ansatz der Schwanzflosse erzeugt. Die verschiedenen EODs könnten als präzygotischer Isolationsmechanismus für die Radiation verantwortlich sein. Dennoch ist der Mechanismus hinter der EOD-Diversifizierung bisher nicht vollständig geklärt. Ziel dieser Studie ist es, die genetische Grundlage der EOD-Diversifizierung auf der Ebene der Genexpression bei verschiedenen Campylomormyrus-Arten bzw. -Hybriden und während der Ontogenese zu ermitteln. Zunächst wurde erstmals das Genom der Art C. compressirostris in hoher Qualität sequenziert. Dies bildet eine bedeutende Grundlage für das Verständnis der Evolution der elektrischen Fische. In der zweiten Studie wurden Genexpressionsmuster von elektrischen Organen und Skelettmuskeln bei Campylomormyrus-Arten bzw. -Hybriden mit unterschiedlicher EOD-Dauer verglichen. Dabei konnten mehrere Kandidatengene identifiziert werden, die potentiell Elektroorgan-spezifisch exprimiert sind, i.a. KCNA7a, KLF5, KCNJ2, SCN4aa, NDRG3, MEF2. Bei allen untersuchten Arten/Hybriden wies das Genexpressionsmuster einen signifikanten Zusammenhang mit der EOD-Dauer auf. Die Expression mehrerer Kandidatengene, wie beispielsweise KCNJ2, KLF5, KCNK6 und KCNQ5, trägt möglicherweise zur Regulierung der EOD-Dauer bei Campylomormyrus bei. Bei Arten und Hybriden mit EOD-Unterschieden zeigten Kaliumkanal-Gene wie KCNJ2 eine unterschiedliche Expression während der Ontogenese. Zudem wurde die Allel-spezifische Expression bei Intragenus-Hybriden unter Verwendung der Arten C. compressirostris, C. tshokwe und C. rhynchophorus, die jeweils eine kurze, intermediäre bzw. lange EOD-Dauer aufweisen, untersucht. Die Hybriden wiesen eine generell dominante Expression der Allele von C. compressirostris in der adulten Skelettmuskulatur und im elektrischen Organ sowie im juvenilen elektrischen Organ auf. Einzig im Gen KCNJ2 dominierte das Allel von C. rhynchophorus, mit zunehmender Dominanz mit fortschreitender Ontogenese. Dies stützt unsere Hypothese einer Beteiligung des KCNJ2-Gens an der Regulation der EOD-Dauer. Unsere Ergebnisse stellen einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis des Einflusses der Genexpression auf die EOD-Diversifizierung bei afrikanischen schwach elektrischen Fischen dar. KW - tropical freshwater fish KW - weakly electric fish KW - genomics KW - transcriptomics KW - Genomik KW - Transkriptomik KW - tropische Süßwasserfische KW - schwach elektrischer Fisch Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-630172 ER - TY - THES A1 - Kersting, Katerina T1 - Development of a CRISPR/Cas gene editing technique for the coccolithophore Chrysotila carterae Y1 - 2024 ER - TY - THES A1 - Stange, Maike T1 - A study on Coronin-A and Aip1 function in motility of Dictyostelium discoideum and on Aip1 interchangeability between Dictyostelium discoideum and Arabidopsis thaliana T1 - Studie über die Funktion von Coronin-A und Aip1 bei der Motilität von Dictyostelium discoideum und zur Aip1-Austauschbarkeit zwischen Dictyostelium discoideum und Arabidopsis thaliana N2 - Actin is one of the most highly conserved proteins in eukaryotes and distinct actin-related proteins with filament-forming properties are even found in prokaryotes. Due to these commonalities, actin-modulating proteins of many species share similar structural properties and proposed functions. The polymerization and depolymerization of actin are critical processes for a cell as they can contribute to shape changes to adapt to its environment and to move and distribute nutrients and cellular components within the cell. However, to what extent functions of actin-binding proteins are conserved between distantly related species, has only been addressed in a few cases. In this work, functions of Coronin-A (CorA) and Actin-interacting protein 1 (Aip1), two proteins involved in actin dynamics, were characterized. In addition, the interchangeability and function of Aip1 were investigated in two phylogenetically distant model organisms. The flowering plant Arabidopsis thaliana (encoding two homologs, AIP1-1 and AIP1-2) and in the amoeba Dictyostelium discoideum (encoding one homolog, DdAip1) were chosen because the functions of their actin cytoskeletons may differ in many aspects. Functional analyses between species were conducted for AIP1 homologs as flowering plants do not harbor a CorA gene. In the first part of the study, the effect of four different mutation methods on the function of Coronin-A protein and the resulting phenotype in D. discoideum was revealed in two genetic knockouts, one RNAi knockdown and a sudden loss-of-function mutant created by chemical-induced dislocation (CID). The advantages and disadvantages of the different mutation methods on the motility, appearance and development of the amoebae were investigated, and the results showed that not all observed properties were affected with the same intensity. Remarkably, a new combination of Selection-Linked Integration and CID could be established. In the second and third parts of the thesis, the exchange of Aip1 between plant and amoeba was carried out. For A. thaliana, the two homologs (AIP1-1 and AIP1-2) were analyzed for functionality as well as in D. discoideum. In the Aip1-deficient amoeba, rescue with AIP1-1 was more effective than with AIP1-2. The main results in the plant showed that in the aip1-2 mutant background, reintroduced AIP1-2 displayed the most efficient rescue and A. thaliana AIP1-1 rescued better than DdAip1. The choice of the tagging site was important for the function of Aip1 as steric hindrance is a problem. The DdAip1 was less effective when tagged at the C-terminus, while the plant AIP1s showed mixed results depending on the tag position. In conclusion, the foreign proteins partially rescued phenotypes of mutant plants and mutant amoebae, despite the organisms only being very distantly related in evolutionary terms. N2 - Actin ist eines der am stärksten konservierten Proteine in Eukaryoten und sogar Prokaryoten weisen Aktin-ähnliche Proteine mit filamentbildenden Eigenschaften auf. Aufgrund dieser Gemeinsamkeiten teilen Aktin-modulierte Proteine vieler Arten ähnliche strukturelle Eigenschaften und vermutlich auch Funktionen. Die Polymerisierung und Depolymerisation von Aktin sind kritische Prozesse für eine Zelle, da sie zu Zellformänderungen beitragen können, um sich an die Umgebung anzupassen und Nährstoffe sowie zelluläre Komponenten innerhalb der Zelle zu bewegen und zu verteilen. Inwieweit die Funktionen von Aktin-bindenden Proteinen zwischen entfernt verwandten Arten funktionell konserviert sind, wurde jedoch nur in wenigen Fällen untersucht. In dieser Arbeit wurden Funktionen von Coronin-A (CorA) und Actin-interagierendem Protein 1 (AIP1), zweier an der Aktindynamik beteiligter Proteine, charakterisiert. Darüber hinaus wurde die Austauschbarkeit und Funktion von AIP1 in zwei phylogenetisch entfernten Modellorganismen untersucht. Die Blütenpflanze Arabidopsis thaliana (kodiert für zwei Homologe: AIP1-1 und AIP1-2) und die Amöbe Dictyostelium discoideum (kodiert für ein Homolog: DdAip1) wurden ausgewählt, weil die Funktionen ihrer Aktin-Zytoskelette in mehreren Aspekten verschieden sein könnten. Funktionelle Analysen zwischen Arten wurden für AIP1-Homologe durchgeführt, da Blütenpflanzen kein CorA Gen tragen. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Wirkung von vier verschiedenen Mutationsmethoden auf die Funktion des CorA-Proteins und des resultierenden Phänotyps in D. discoideum in zwei genetischen Knockouts, einem RNAi Knockdown und einem durch chemisch induzierte Delokalisierung (CID) erzeugten Mutanten geprüft. Die Vor- und Nachteile der Methoden zur Motilität, des Aussehens und der Entwicklung der Amöben wurden untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass nicht alle beobachteten Eigenschaften mit der gleichen Intensität beeinflusst wurden. Hierbei wurde eine neue Methodenkombination aus selektionsgebundener Integration und CID etabliert. Im zweiten und im dritten Teil der Arbeit wurde der Austausch von AIP1 zwischen Pflanze und Amöben durchgeführt. Die zwei A. thaliana-Homologe AIP1-1 und AIP1-2 wurden auf Funktionalität in D. discoideum geprüft. In Aip1-defizienten Amöben war die Rettung mit AIP1-1 effektiver als bei AIP1-2. Die Hauptergebnisse der Arbeit wiesen darauf hin, dass AIP1-2 im aip1.2-1 act7 Mutantenhintergrund die effizienteste Rettung zeigte, während A. thaliana AIP1-1 effizienter rettete als DdAip1. Die Auswahl der Tagging-Site war für die AIP1-Funktion bedeutend, da sterische Hinderung eine Rolle spielen könnte. DdAip1 war weniger effektiv, wenn es am C-Terminus fusioniert war, während die Proteinfusionen der A. thaliana AIP1s je nach Position der „tags“ unterschiedliche Ergebnisse zeigten. Zusammenfassend retteten die fremden Proteine teilweise Phänotypen von mutierten Pflanzen und mutierten Amöben, obwohl die Organismen evolutionär weit entfernt verwandt sind. KW - actin KW - cell motility KW - plant growth KW - selection-linked integration KW - chemically induced dislocation KW - interspecies interchange KW - Aktin KW - Zellmotilität KW - Pflanzenwachstum KW - Selection-Linked Integration KW - chemisch-induzierte Dislokation KW - Austausch zwischen zwei Spezies Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-628569 ER - TY - THES A1 - You, Lili T1 - Chloroplast engineering for recombinant protein production and stress protection Y1 - 2024 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Marjänn Helena T1 - Untersuchungen zur Evolution der 15-Lipoxygenase (ALOX15) bei Säugetieren und funktionelle Charakterisierung von Knock-in-Mäusen mit humanisierter Reaktionsspezifität der 15-Lipoxygenase-2 (Alox15b) T1 - Studies on the evolution of 15-lipoxygenase (ALOX15) in mammals and functional characterization of Knock-in mice with humanized reaction specificity of 15-lipoxygenase-2 (Alox15b) N2 - Arachidonsäurelipoxygenasen (ALOX-Isoformen) sind Lipid-peroxidierenden Enzyme, die bei der Zelldifferenzierung und bei der Pathogenese verschiedener Erkrankungen bedeutsam sind. Im menschlichen Genom gibt es sechs funktionelle ALOX-Gene, die als Einzelkopiegene vorliegen. Für jedes humane ALOX-Gen gibt es ein orthologes Mausgen. Obwohl sich die sechs humanen ALOX-Isoformen strukturell sehr ähnlich sind, unterscheiden sich ihre funktionellen Eigenschaften deutlich voneinander. In der vorliegenden Arbeit wurden vier unterschiedliche Fragestellungen zum Vorkommen, zur biologischen Rolle und zur Evolutionsabhängigkeit der enzymatischen Eigenschaften von Säugetier-ALOX-Isoformen untersucht: 1) Spitzhörnchen (Tupaiidae) sind evolutionär näher mit dem Menschen verwandt als Nagetiere und wurden deshalb als Alternativmodelle für die Untersuchung menschlicher Erkrankungen vorgeschlagen. In dieser Arbeit wurde erstmals der Arachidonsäurestoffwechsel von Spitzhörnchen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass im Genom von Tupaia belangeri vier unterschiedliche ALOX15-Gene vorkommen und die Enzyme sich hinsichtlich ihrer katalytischen Eigenschaften ähneln. Diese genomische Vielfalt, die weder beim Menschen noch bei Mäusen vorhanden ist, erschwert die funktionellen Untersuchungen zur biologischen Rolle des ALOX15-Weges. Damit scheint Tupaia belangeri kein geeigneteres Tiermodel für die Untersuchung des ALOX15-Weges des Menschen zu sein. 2) Entsprechend der Evolutionshypothese können Säugetier-ALOX15-Orthologe in Arachidonsäure-12-lipoxygenierende- und Arachidonsäure-15-lipoxygenierende Enzyme eingeteilt werden. Dabei exprimieren Säugetierspezies, die einen höheren Evolutionsgrad als Gibbons aufweisen, Arachidonsäure-15-lipoxygenierende ALOX15-Orthologe, während evolutionär weniger weit entwickelte Säugetiere Arachidonsäure-12 lipoxygenierende Enzyme besitzen. In dieser Arbeit wurden elf neue ALOX15-Orthologe als rekombinante Proteine exprimiert und funktionell charakterisiert. Die erhaltenen Ergebnisse fügen sich widerspruchsfrei in die Evolutionshypothese ein und verbreitern deren experimentelle Basis. Die experimentellen Daten bestätigen auch das Triadenkonzept. 3) Da humane und murine ALOX15B-Orthologe unterschiedliche funktionelle Eigenschaften aufweisen, können Ergebnisse aus murinen Krankheitsmodellen zur biologischen Rolle der ALOX15B nicht direkt auf den Menschen übertragen werden. Um die ALOX15B-Orthologen von Maus und Mensch funktionell einander anzugleichen, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Knock-in Mäuse durch die In vivo Mutagenese mittels CRISPR/Cas9-Technik hergestellt. Diese exprimieren eine humanisierte Mutante (Doppelmutation von Tyrosin603Asparaginsäure+Histidin604Valin) der murinen Alox15b. Diese Mäuse waren lebens- und fortpflanzungsfähig, zeigten aber geschlechtsspezifische Unterschiede zu ausgekreuzten Wildtyp-Kontrolltieren im Rahmen ihre Individualentwicklung. 4) In vorhergehenden Untersuchungen zur Rolle der ALOX15B in Rahmen der Entzündungsreaktion wurde eine antiinflammatorische Wirkung des Enzyms postuliert. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine Humanisierung der murinen Alox15b die Entzündungsreaktion in zwei verschiedenen murinen Entzündungsmodellen beeinflusst. Eine Humanisierung der murinen Alox15b führte zu einer verstärkten Ausbildung von Entzündungssymptomen im induzierten Dextran-Natrium-Sulfat-Kolitismodell. Im Gegensatz dazu bewirkte die Humanisierung der Alox15b eine Abschwächung der Entzündungssymptome im Freund‘schen Adjuvans Pfotenödemmodell. Diese Daten deuten darauf hin, dass sich die Rolle der ALOX15B in verschiedenen Entzündungsmodellen unterscheidet. N2 - Arachidonic acid lipoxygenases (ALOX-isoforms) are lipid peroxidizing enzymes that have been implicated in cell differentiation and in the pathogenesis of different diseases. In the human genome six different ALOX genes have been identified and all of them occur as single copy genes. For each human ALOX gene an ortholog exists in the mouse genome. Although human and mouse ALOX orthologs share a high degree of structural similarity ALOX15 and ALOX15B orthologs exhibit distinct functional characteristics. In the present study addressed four different questions on the occurrence, the biological role and enzyme evolution of mammalian ALOX15 and ALOX15B orthologs. 1) Tupaiidae are more closely related to humans than rodents and therefore these mammals have frequently been suggested as better animal models than mice for investigations into patho-physiological basis of human diseases. This work explored for the first time the arachidonic acid metabolism of a Tupaiidae representative (Tupaia belangeri) and found that this mammal carries four distinct ALOX15 genes in its genome. The enzymes encoded by these four genes share a high degree of functional similarity but the observed genomic multiplicity, which is neither present in mice nor in humans, makes studies into the biological role of ALOX15 orthologs more complex. Thus, Tupaia belangeri is not more suitable than mice for investigations into the biological role of mammalian ALOX15 orthologs since loss-of-function studies on one ALOX15 ortholog may easily be compensated by upregulation of an orthologous gene. 2) According to the Evolutionary Hypothesis mammalian ALOX15 orthologs can be subdivided into arachidonic acid 12-lipoxygenating and arachidonic acid 15-lipoxygenating enzymes. Mammalian species, which are ranked above gibbons express arachidonic acid 15 lipoxygenating ALOX15 orthologs. In contrast mammals ranked below gibbons express arachidonic acid 12-lipoxygenating enzymes. In this study the ALOX15 orthologs of eleven different mammals expressed as recombinant proteins and characterized their functional properties. The results of these experiments were consistent with the Evolutionary Hypothesis and put this theory on a broader experimental basis. Moreover, the obtained in vitro mutagenesis data indicate that the novel enzymes follow Triad Concept. 3) Since human and mouse ALOX15B orthologs exhibit different functional properties, conclusion drawn in mouse models of human diseases may be misleading. To make human and mouse ALOX15B orthologs more like each other were generated Alox15b knock-in mice, which express the humanized Tyr603Asp+His604Val double mutant of mouse Alox15b instead of the endogenous wildtype enzyme employing the CRISPR/Cas9 in vivo mutagenesis strategy. These Alox15b-KI mice are viable, reproduce normally but exhibit gender-specific differences to outbred wildtype control animals when the bodyweight kinetics during adolescence and early adulthood were followed. 4) In previous studies an anti-inflammatory role of ALOX15B in the pathogenesis of inflammation has been suggested. Here we explored whether functional humanization of mouse Alox15b impacts the severity of inflammatory symptoms in two mouse inflammation models. In the dextran-sodium sulfate colitis model humanization of mouse Alox15b induced more severe inflammatory symptoms. In contrast, humanization of this enzyme protected mice in the Freund’s complete adjuvants induced paw edema model. Taken together, these data suggest that the patho-physiological roles of Alox15b may vary depending on the type of the animal inflammation model used. KW - Lipoxygenase KW - ALOX15B KW - Knock in Mäuse KW - enzymatische Reaktionsspezifität KW - Tupaia belangeri KW - DSS-Colitis KW - Pfotenödem Mausmodell KW - mammalian ALOX15 orthologs Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-620340 ER - TY - THES A1 - Székely, András Csaba T1 - Long-distance circadian coordination via a phloem-delivered mobile transcript Y1 - 2024 ER - TY - THES A1 - Hammel, Alexander T1 - Establishing the red microalga Porphyridium purpureum as a novel platform for the production of recombinant proteins T1 - Die Etablierung der roten Mikroalge Porphyridium purpureum als neue Platform für die Herstellung rekombinanter Proteine N2 - Microalgae have been recognized as a promising green production platform for recombinant proteins. The majority of studies on recombinant protein expression have been conducted in the green microalga C. reinhardtii. While promising improvement regarding nuclear transgene expression in this alga has been made, it is still inefficient due to epigenetic silencing, often resulting in low yields that are not competitive with other expressor organisms. Other microalgal species might be better suited for high-level protein expression, but are limited in their availability of molecular tools. The red microalga Porphyridium purpureum recently emerged as candidate for the production of recombinant proteins. It is promising in that transformation vectors are episomally maintained as autonomously replicating plasmids in the nucleus at a high copy number, thus leading to high expression values in this red alga. In this work, we expand the genetic tools for P. purpureum and investigate parameters that govern efficient transgene expression. We provide an improved transformation protocol to streamline the generation of transgenic lines in this organism. After being able to efficiently generate transgenic lines, we showed that codon usage is a main determinant of high-level transgene expression, not only at the protein level but also at the level of mRNA accumulation. The optimized expression constructs resulted in YFP accumulation up to an unprecedented 5% of the total soluble protein. Furthermore, we designed new constructs conferring efficient transgene expression into the culture medium, simplifying purification and harvests of recombinant proteins. To further improve transgene expression, we tested endogenous promoters driving the most highly transcribed genes in P. purpureum and found minor increase of YFP accumulation. We employed the previous findings to express complex viral antigens from the hepatitis B virus and the hepatitis C virus in P. purpureum to demonstrate its feasibility as producer of biopharmaceuticals. The viral glycoproteins were successfully produced to high levels and could reach their native confirmation, indicating a functional glycosylation machinery and an appropriate folding environment in this red alga. We could successfully upscale the biomass production of transgenic lines and with that provide enough material for immunization trials in mice that were performed in collaboration. These trials showed no toxicity of neither the biomass nor the purified antigens, and, additionally, the algal-produced antigens were able to elicit a strong and specific immune response. The results presented in this work pave the way for P. purpureum as a new promising producer organism for biopharmaceuticals in the microalgal field. N2 - Biotechnologisch hergestellte Proteine (rekombinante Proteine), wie zum Beispiel monoklonale Antikörper, Insulin oder diverse Impfstoffe, spielen heutzutage eine immer wichtigere Rolle bei der Bekämpfung von Krankheiten. Diese werden hauptsächlich aus genetisch veränderten humanen Zelllinien hergestellt. Die Produktion ist allerdings sehr teuer, anfällig für Kontaminationen und nicht nachhaltig. Als Alternative dazu können Mikroalgen benutzt werden, die viel günstiger kultiviert werden können und viele Vorteile bezüglich des ökologischen Aspekts bieten. Die bisherige Forschung an Mikroalgen als Plattform für die Herstellung rekombinanter Proteine konzentriert sich vor allem auf die grüne Mikroalge Chlamydomonas reinhardtii. Doch vor allem die geringe Proteinausbeute macht diese Alge nicht zum idealen Expressionsorganismus. Kürzlich wurde die rote Mikroalge Porphyridium purpureum als vielversprechende Kandidatin für die Produktion rekombinanter Proteine identifiziert. Besonders interessant ist, dass diese Alge rekombinante Proteine in einem hohen Maß exprimiert. Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem Potenzial von Porphyridium purpureum als relativ unerforschte Alge. Es wurden neue genetische Werkzeuge entwickelt und verschiedene Faktoren untersucht, die die Expression von eingebrachten Genen beeinflussen. Durch Optimierung dieser Parameter konnten wir die Proteinausbeute eines gelb fluoreszierenden Proteins auf 5% des löslichen Gesamtproteins steigern. Wir haben das gewonnene Wissen genutzt, um jeweils ein Oberflächenprotein vom Hepatitis B Virus und vom Hepatitis C Virus in dieser roten Mikroalge herzustellen. Diese können als möglicher zukünftiger Impfstoff benutzt werden. Wir konnten zeigen, dass beide Proteine korrekt und in hoher Menge in Porphyridium purpureum hergestellt werden. Anschließend wurden die hergestellten Proteine auf ihre Wirksamkeit und Verträglichkeit an Mäusen getestet. Dabei wurde gezeigt, dass (i) Porphyridium purpureum nicht giftig ist und auch keine giftigen Produkte produziert und (ii) die produzierten Proteine eine effektive Immunantwort gegen die Viren induzieren. Mit dieser Arbeit wurde das Fundament für die biotechnologische Anwendung dieser roten Mikroalge gelegt. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass P. purpureum eine vielversprechende Mikroalgenart für die Produktion von biopharmazeutischen Proteinen ist. KW - microalgae KW - biotechnology KW - subunit vaccine KW - Biotechnologie KW - Mikroalgen KW - Untereinheitenimpfstoff Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-632709 ER - TY - THES A1 - Siebler, Lara T1 - Identifying novel regulators of heat stress memory in Arabidopsis thaliana T1 - Identifikation neuer Regulatoren des Hitzestressgedächtnisses in Arabidopsis thaliana N2 - Heat stress (HS) is a major abiotic stress that negatively affects plant growth and productivity. However, plants have developed various adaptive mechanisms to cope with HS, including the acquisition and maintenance of thermotolerance, which allows them to respond more effectively to subsequent stress episodes. HS memory includes type II transcriptional memory which is characterized by enhanced re-induction of a subset of HS memory genes upon recurrent HS. In this study, new regulators of HS memory in A. thaliana were identified through the characterization of rein mutants. The rein1 mutant carries a premature stop in CYCLIN-DEPENDENT-KINASE 8 (CDK8) which is part of the cyclin kinase module of the Mediator complex. Rein1 seedlings show impaired type II transcriptional memory in multiple heat-responsive genes upon re-exposure to HS. Additionally, the mutants exhibit a significant deficiency in HS memory at the physiological level. Interaction studies conducted in this work indicate that CDK8 associates with the memory HEAT SHOCK FACTORs HSAF2 and HSFA3. The results suggest that CDK8 plays a crucial role in HS memory in plants together with other memory HSFs, which may be potential targets of the CDK8 kinase function. Understanding the role and interaction network of the Mediator complex during HS-induced transcriptional memory will be an exciting aspect of future HS memory research. The second characterized mutant, rein2, was selected based on its strongly impaired pAPX2::LUC re-induction phenotype. In gene expression analysis, the mutant revealed additional defects in the initial induction of HS memory genes. Along with this observation, basal thermotolerance was impaired similarly as HS memory at the physiological level in rein2. Sequencing of backcrossed bulk segregants with subsequent fine mapping narrowed the location of REIN2 to a 1 Mb region on chromosome 1. This interval contains the At1g65440 gene, which encodes the histone chaperone SPT6L. SPT6L interacts with chromatin remodelers and bridges them to the transcription machinery to regulate nucleosome and Pol II occupancy around the transcriptional start site. The EMS-induced missense mutation in SPT6L may cause altered HS-induced gene expression in rein2, possibly triggered by changes in the chromatin environment resulting from altered histone chaperone function. Expanding research on screen-derived factors that modify type II transcriptional memory has the potential to enhance our understanding of HS memory in plants. Discovering connections between previously identified memory factors will help to elucidate the underlying network of HS memory. This knowledge can initiate new approaches to improve heat resilience in crops. N2 - Hitzestress ist ein abiotischer Stressfaktor, der Pflanzenwachstum und Ertragsfähigkeit negativ beeinflusst. Pflanzen haben Anpassungsmechanismen entwickelt, einschließlich des Erwerbs und der Aufrechterhaltung von Thermotoleranz, die es ihnen ermöglichen auf wiederholte Stressereignisse effektiver zu reagieren. Das Hitzestress-Gedächtnis umfasst unter anderem verstärkte Re-Induktion von Gedächtnisgenen nach wiederholter Exposition (Typ II). In dieser Arbeit wurden anhand der Charakterisierung von Re-Induktionsmutanten (rein Mutanten) neue Regulatoren des Typ II Hitzestress-Gedächtnisses in A. thaliana identifiziert. Die rein1 Mutante weist ein vorzeitiges Stoppcodon in CDK8 auf, einer Untereinheit im Kinasemodul des Mediator Komplexes. Rein1 Keimlinge zeigen ein beeinträchtigtes Hitzstress-Transkriptionsgedächtnis, sowie Defekte in der Aufrechterhaltung der Thermotoleranz auf physiologischer Ebene. Mittels Interaktionsstudien konnte gezeigt werden, dass CDK8 mit den im Hitzestress-Gedächtnis fungierenden Hitzeschockfaktoren HSAF2 und HSFA3 interagiert. Die Ergebnisse legen nahe, dass CDK8 zusammen mit HSFs eine Rolle bei der Aufrechterhaltung des Hitzestress-Gedächtnisses spielt, wobei letztere potenzielle Ziele der Kinasefunktion von CDK8 darstellen. Die Rolle und das Interaktionsnetzwerk des Mediatorkomplexes während der durch Hitzstress-induzierten transkriptionellen Gedächtnis-bildung und Aufrechterhaltung ist ein aufregender Aspekt zukünftiger Forschung. Die zweite rein Mutante (rein2) wurde aufgrund einer stark beeinträchtigten transkriptionellen Re-Induktion nach wiederholtem Hitzestress für weitere Charakterisierungen ausgewählt. Dabei wurden zusätzliche Defekte in der initialen Induktion von Hitzestress-Gedächtnisgenen festgestellt. Die basale Thermotoleranz in rein2 war in ähnlicher Weise beeinträchtigt wie das Hitzestress-Gedächtnis. Die Position von REIN2 wurde mithilfe von Sequenzierung und Feinkartierung auf eine 1 Mb große Region auf Chromosom 1 eingegrenzt. Dieses Intervall enthält das Gen At1g65440, das für Histon-Chaperon SPT6L kodiert. Die Missense-Mutation in SPT6L könnte die Ursache für das veränderte Hitzestress-induzierte Transkriptionsmuster in rein2 sein, möglicherweise aufgrund von einer abweichenden Chaperonfunktion und folglich Veränderung in der Chromatinumgebung. Die Ausweitung der Forschung zu den in diesem Screening ermittelten Faktoren, die das Typ II Transkriptionsgedächtnis beeinflussen, hat das Potenzial, unser derzeitiges Verständnis des Hitzestress-Gedächtnisses in Pflanzen zu verbessern und Verbindungen zwischen zuvor entdeckten Gedächtnisregulatoren herzustellen. Dieses Wissen kann dazu beitragen neue Ansätze zur Verbesserung der Hitzeresilienz bei Nutzpflanzen anzustoßen. KW - epigenetics KW - heat stress KW - molecular biology KW - genetic screen KW - Epigenetik KW - Hitzestress KW - Molekularbiologie KW - genetischer Screen Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-634477 ER - TY - THES A1 - Freimuth, Nina T1 - Elucidating the suppression of root hair formation by a member of a novel, short ENTH protein family in Arabidopsis thaliana T1 - Untersuchungen der Unterdrückung der Wurzelhaarbildung durch ein Mitglied einer neuen, kurzen ENTH-Proteinfamilie in Arabidopsis thaliana N2 - This work analyzed functional and regulatory aspects of the so far little characterized EPSIN N-terminal Homology (ENTH) domain-containing protein EPSINOID2 in Arabidopsis thaliana. ENTH domain proteins play accessory roles in the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) (Zouhar and Sauer 2014). Their ENTH domain interacts with membranes and their typically long, unstructured C-terminus contains binding motifs for adaptor protein complexes and clathrin itself. There are seven ENTH domain proteins in Arabidopsis. Four of them possess the canonical long C-terminus and participate in various, presumably CCV-related intracellular transport processes (Song et al. 2006; Lee et al. 2007; Sauer et al. 2013; Collins et al. 2020; Heinze et al. 2020; Mason et al. 2023). The remaining three ENTH domain proteins, however, have severely truncated C-termini and were termed EPSINOIDs (Zouhar and Sauer 2014; Freimuth 2015). Their functions are currently unclear. Preceding studies focusing on EPSINOID2 indicated a role in root hair formation: epsinoid2 T DNA mutants exhibited an increased root hair density and EPSINOID2-GFP was specifically located in non-hair cell files in the Arabidopsis root epidermis (Freimuth 2015, 2019). In this work, it was clearly shown that loss of EPSINOID2 leads to an increase in root hair density through analyses of three independent mutant alleles, including a newly generated CRISPR/Cas9 full deletion mutant. The ectopic root hairs emerging from non-hair positions in all epsinoid2 mutant alleles are most likely not a consequence of altered cell fate, because extensive genetic analyses placed EPSINOID2 downstream of the established epidermal patterning network. Thus, EPSINOID2 seems to act as a cell autonomous inhibitor of root hair formation. Attempts to confirm this hypothesis by ectopically overexpressing EPSINOID2 led to the discovery of post-transcriptional and -translational regulation through different mechanisms. One involves the little characterized miRNA844-3p. Interference with this pathway resulted in ectopic EPSINOID2 overexpression and decreased root hair density, confirming it as negative factor in root hair formation. A second mechanism likely involves proteasomal degradation. Treatment with proteasomal inhibitor MG132 led to EPSINOID2-GFP accumulation, and a KEN box degron motif was identified in the EPSINOID2 sequence associated with degradation through a ubiquitin/proteasome-dependent pathway. In line with a tight dose regulation, genetic analyses of all three mutant alleles indicate that EPSINOID2 is haploinsufficient. Lastly, it was revealed that, although EPSINOID2 promoter activity was found in all epidermal cells, protein accumulation was observed in N-cells only, hinting at yet another layer of regulation. N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden funktionelle und regulatorische Aspekte des bisher wenig charakterisierten EPSIN N-Terminal Homology (ENTH)-Domäne-enthaltenden Proteins EPSINOID2 in Arabidopsis thaliana untersucht. ENTH-Domänen Proteine spielen akzessorische Rollen in der Bildung von Clathrin-umhüllten Vesikeln (CCVs) (Zouhar and Sauer 2014). Ihre ENTH-Domäne interagiert mit Membranen und ihr typischerweise langer, unstrukturierter C-Terminus enthält Bindungsmotive für Adapterproteinkomplexe und Clathrin selbst. In Arabidopsis gibt es sieben ENTH-Domänen Proteine. Vier von ihnen besitzen den langen C-Terminus und sind an verschiedenen, vermutlich CCV-bezogenen intrazellulären Transportprozessen beteiligt (Song et al. 2006; Lee et al. 2007; Sauer et al. 2013; Heinze et al. 2020; Collins et al. 2020; Mason et al. 2023). Die verbleibenden drei ENTH-Domänen Proteine haben jedoch stark verkürzte C-Termini und wurden als EPSINOIDe bezeichnet (Zouhar and Sauer 2014; Freimuth 2015). Ihre Funktion ist derzeit unklar. Vorangegangene Studien, die sich auf EPSINOID2 konzentrierten, deuteten auf eine Rolle bei der Wurzelhaarbildung hin: epsinoid2 T-DNA-Mutanten zeigten eine erhöhte Wurzelhaardichte und EPSINOID2-GFP war speziell in Nicht-Haarzellen in der Wurzelepidermis von Arabidopsis lokalisiert (Freimuth 2015, 2019). In dieser Arbeit wurde durch Analysen von drei unabhängigen mutierten Allelen, einschließlich einer neu generierten CRISPR/Cas9-Deletionsmutante, klar gezeigt, dass der Verlust von EPSINOID2 zu einer Erhöhung der Wurzelhaardichte führt. Die ektopischen Wurzelhaare, die in allen epsinoid2 Allelen aus Nicht-Haar-Positionen hervorgehen, sind höchstwahrscheinlich keine Folge eines veränderten Zellschicksals, da umfangreiche genetische Analysen EPSINOID2 dem etablierten Netzwerk zur Ausbildung der epidermalen Identität nachgeschaltet platziert haben. Somit scheint EPSINOID2 als zellautonomer Inhibitor der Wurzelhaarbildung zu wirken. Versuche, diese Hypothese durch ektopische Überexpression von EPSINOID2 zu bestätigen, führten zur Entdeckung einer post-transkriptionellen und translationalen Regulation durch verschiedene Mechanismen. Bei einem davon handelt es sich um die wenig charakterisierte miRNA844-3p. Eine Beeinträchtigung dieses Signalwegs führte zu einer ektopischen Überexpression von EPSINOID2 und einer verringerten Wurzelhaardichte, was bestätigt, dass es sich um einen negativen Faktor bei der Wurzelhaarbildung handelt. Ein zweiter Mechanismus beinhaltet wahrscheinlich den proteasomalen Abbau. Die Behandlung mit dem proteasomalen Inhibitor MG132 führte zur Akkumulation von EPSINOID2-GFP, und in der Sequenz von EPSINOID2 wurde ein KEN-Box Degron Motiv identifiziert, das mit dem Abbau über einen Ubiquitin/Proteasom-abhängigen Weg verbunden ist. Im Einklang mit einer strengen Dosisregulierung zeigten genetische Analysen aller drei mutierten Allele, dass EPSINOID2 haploinsuffizient ist. Abschließend wurde festgestellt, dass die Aktivität des EPSINOID2 Promotors zwar in allen Epidermiszellen zu finden war, eine Proteinakkumulation jedoch nur in Nicht-Haarzellen beobachtet wurde, was auf eine weitere Ebene der Regulation hindeutet. KW - ENTH domain proteins KW - ENTH-Domänen Proteine KW - root hair formation KW - Wurzelhaarbildung KW - miRNA regulation KW - miRNA Regulation Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-634994 ER - TY - THES A1 - Hippel, Barbara von T1 - Long-term bacteria-fungi-plant associations in permafrost soils inferred from palaeometagenomics N2 - The arctic is warming 2 – 4 times faster than the global average, resulting in a strong feedback on northern ecosystems such as boreal forests, which cover a vast area of the high northern latitudes. With ongoing global warming, the treeline subsequently migrates northwards into tundra areas. The consequences of turning ecosystems are complex: on the one hand, boreal forests are storing large amounts of global terrestrial carbon and act as a carbon sink, dragging carbon dioxide out of the global carbon cycle, suggesting an enhanced carbon uptake with increased tree cover. On the other hand, with the establishment of trees, the albedo effect of tundra decreases, leading to enhanced soil warming. Meanwhile, permafrost thaws, releasing large amounts of previously stored carbon into the atmosphere. So far, mainly vegetation dynamics have been assessed when studying the impact of warming onto ecosystems. Most land plants are living in close symbiosis with bacterial and fungal communities, sustaining their growth in nutrient poor habitats. However, the impact of climate change on these subsoil communities alongside changing vegetation cover remains poorly understood. Therefore, a better understanding of soil community dynamics on multi millennial timescales is inevitable when addressing the development of entire ecosystems. Unravelling long-term cross-kingdom dependencies between plant, fungi, and bacteria is not only a milestone for the assessment of warming on boreal ecosystems. On top, it also is the basis for agriculture strategies to sustain society with sufficient food in a future warming world. The first objective of this thesis was to assess ancient DNA as a proxy for reconstructing the soil microbiome (Manuscripts I, II, III, IV). Research findings across these projects enable a comprehensive new insight into the relationships of soil microorganisms to the surrounding vegetation. First, this was achieved by establishing (Manuscript I) and applying (Manuscript II) a primer pair for the selective amplification of ancient fungal DNA from lake sediment samples with the metabarcoding approach. To assess fungal and plant co-variation, the selected primer combination (ITS67, 5.8S) amplifying the ITS1 region was applied on samples from five boreal and arctic lakes. The obtained data showed that the establishment of fungal communities is impacted by warming as the functional ecological groups are shifting. Yeast and saprotroph dominance during the Late Glacial declined with warming, while the abundance of mycorrhizae and parasites increased with warming. The overall species richness was also alternating. The results were compared to shotgun sequencing data reconstructing fungi and bacteria (Manuscripts III, IV), yielding overall comparable results to the metabarcoding approach. Nonetheless, the comparison also pointed out a bias in the metabarcoding, potentially due to varying ITS lengths or copy numbers per genome. The second objective was to trace fungus-plant interaction changes over time (Manuscripts II, III). To address this, metabarcoding targeting the ITS1 region for fungi and the chloroplast P6 loop for plants for the selective DNA amplification was applied (Manuscript II). Further, shotgun sequencing data was compared to the metabarcoding results (Manuscript III). Overall, the results between the metabarcoding and the shotgun approaches were comparable, though a bias in the metabarcoding was assumed. We demonstrated that fungal shifts were coinciding with changes in the vegetation. Yeast and lichen were mainly dominant during the Late Glacial with tundra vegetation, while warming in the Holocene lead to the expansion of boreal forests with increasing mycorrhizae and parasite abundance. Aside, we highlighted that Pinaceae establishment is dependent on mycorrhizal fungi such as Suillineae, Inocybaceae, or Hyaloscypha species also on long-term scales. The third objective of the thesis was to assess soil community development on a temporal gradient (Manuscripts III, IV). Shotgun sequencing was applied on sediment samples from the northern Siberian lake Lama and the soil microbial community dynamics compared to ecosystem turnover. Alongside, podzolization processes from basaltic bedrock were recovered (Manuscript III). Additionally, the recovered soil microbiome was compared to shotgun data from granite and sandstone catchments (Manuscript IV, Appendix). We assessed if the establishment of the soil microbiome is dependent on the plant taxon and as such comparable between multiple geographic locations or if the community establishment is driven by abiotic soil properties and as such the bedrock area. We showed that the development of soil communities is to a great extent driven by the vegetation changes and temperature variation, while time only plays a minor role. The analyses showed general ecological similarities especially between the granite and basalt locations, while the microbiome on species-level was rather site-specific. A greater number of correlated soil taxa was detected for deep-rooting boreal taxa in comparison to grasses with shallower roots. Additionally, differences between herbaceous taxa of the late Glacial compared to taxa of the Holocene were revealed. With this thesis, I demonstrate the necessity to investigate subsoil community dynamics on millennial time scales as it enables further understanding of long-term ecosystem as well as soil development processes and such plant establishment. Further, I trace long-term processes leading to podzolization which supports the development of applied carbon capture strategies under future global warming. N2 - Die Arktis erwärmt sich schneller als der weltweite Durschnitt, was die dortigen Ökosysteme wie die borealen Nadelwälder stark beeinflusst. Die Baumgrenze verschiebt sich durch veränderte Wachstumsbedingungen nach Norden und breitet sich in Tundra-Gegenden aus. Das führt zu komplexen Auswirkungen auf den Kohlenstoffkreislauf, da durch das Baumwachstum vermehrt CO2 im Boden gespeichert wird. Andererseits wird der Albedo-Effekt der Tundra verringert und der Boden erwärmt sich verstärkt. Das wiederum führt zum Tauen von Permafrost und setzt große Mengen an gespeichertem Kohlenstoff frei. Bislang wurde vor allem die Auswirkung der Erwärmung auf Vegetationsdynamiken untersucht. Für ein gesundes Pflanzenwachstum stehen die meisten Landpflanzen in engem Austausch mit einer Vielzahl an Bakterien und Pilzen. Es ist bislang wenig verstanden, wie diese Bodengemeinschaften durch den Klimawandel beeinflusst werden. Es ist deshalb notwendig, verstärkt auch die Langzeitabhängigkeiten der Pflanzen von Mikroorganismen zu betrachten. Dies ist nicht nur ein Meilenstein bei der Untersuchung des Klimawandels auf arktische Ökosysteme. Zudem wird so die Entwicklung angepasster Strategien im Bereich der Landwirtschaft ermöglicht, was die Grundlage dafür ist, die wachsende Bevölkerung auch in Zukunft mit ausreichend Nahrungsmitteln versorgen zu können. Im ersten Teil meiner Arbeit untersuche ich das Potential, die Dynamiken von Bodenmikroorganismen aus Seesedimenten zu rekonstruieren. Ich habe gezeigt, dass molekulargenetische Analysen das sowohl für Pilze als auch Bakterien auf großen Zeitskalen ermöglichen. Eine Zuweisung der Mikroorganismen zu ihren Funktionen im Ökosystem ermöglichte, Dynamiken in den Nährstoffkreisläufen sowie in Pilzökologien zu verstehen. Die Analyse der komplexen Assoziationen von Pilzen und Pflanzen bildete den zweiten Teil meiner Arbeit. Hier konnte ich zeigen, dass Pilze und Pflanzen spezifische Muster in ihren Vorkommen miteinander zeigen und dass die Vegetation das Pilzvorkommen auch auf großen Zeitskalen beeinflusst. Die Tundravegetation des Spätglazials war vor allem von Flechten und Hefevorkommen dominiert, während die Einwanderung von borealen Wäldern in die untersuchten Gebiete zu zunehmder Mykorrhiza- und Parasitenverbreitung führte. Ich habe auch gezeigt, dass die Etablierung von Pinaceen langfristig von spezifischen Mykorrhiza-Pilzen wie Suillineae, Inocybaceae oder Hyaloscypha-Arten abhängt. Das dritte Ziel meiner Arbeit war es, zeitliche Dynamiken in der Zusammensetzung von Bodenorganismen im Bezug zur Entstehung von Böden zu rekonstruieren. Mir gelang es, die Verwitterung von Basalt nachzuvollziehen und daraus die Entstehung von Podsol abzuleiten. Ein Vergleich zu Bodengesellschaften aus Granit- und Sandstein-Einzugsgebieten zeigte, dass sich die Granit- und Basalt-Bodeneigenschaften ähneln. Allerdings zeigten die Pflanzen an den Standorten ein sehr ortsspezifisches Mikrobiom und somit eine lokale Anpassung an die Wachstumsbedingungen. Ich konnte mit dieser Arbeit zeigen, dass die Rekonstruktion von Bodenmikroorganismen im Vergleich zur Vegetation einen Einblick in Ökosystemdynamiken unter Klimawandel ermöglicht. Dies ermöglicht ein besseres Verständnis von Bodenentstehungsprozessen und vereinfacht die Entwicklung angewandter carbon capture Strategien. KW - sedimentary ancient DNA KW - ecology KW - lake sediment KW - Arctic KW - ecosystem reconstruction KW - climate change KW - treeline dynamics KW - microbial soil communities KW - plant-microbe interactions KW - Arktis KW - Klimawandel KW - Ökologie KW - Ökosystem-Rekonstruktion KW - Seesediment KW - mikrobielle Bodengemeinschaften KW - Pflanzen-Mikroben-Interaktionen KW - sedimentary ancient DNA KW - Baumgrenzen-Dynamik Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-636009 ER - TY - THES A1 - Kiss, Andrea T1 - Moss-associated bacterial and archaeal communities of northern peatlands: key taxa, environmental drivers and potential functions T1 - Moos-assoziierte bakterielle und archaelle Gemeinschaften nördlicher Moore: Schlüsselspezies, beeinflussende Umweltfaktoren und potentielle Funktionen N2 - Moss-microbe associations are often characterised by syntrophic interactions between the microorganisms and their hosts, but the structure of the microbial consortia and their role in peatland development remain unknown. In order to study microbial communities of dominant peatland mosses, Sphagnum and brown mosses, and the respective environmental drivers, four study sites representing different successional stages of natural northern peatlands were chosen on a large geographical scale: two brown moss-dominated, circumneutral peatlands from the Arctic and two Sphagnum-dominated, acidic peat bogs from subarctic and temperate zones. The family Acetobacteraceae represented the dominant bacterial taxon of Sphagnum mosses from various geographical origins and displayed an integral part of the moss core community. This core community was shared among all investigated bryophytes and consisted of few but highly abundant prokaryotes, of which many appear as endophytes of Sphagnum mosses. Moreover, brown mosses and Sphagnum mosses represent habitats for archaea which were not studied in association with peatland mosses so far. Euryarchaeota that are capable of methane production (methanogens) displayed the majority of the moss-associated archaeal communities. Moss-associated methanogenesis was detected for the first time, but it was mostly negligible under laboratory conditions. Contrarily, substantial moss-associated methane oxidation was measured on both, brown mosses and Sphagnum mosses, supporting that methanotrophic bacteria as part of the moss microbiome may contribute to the reduction of methane emissions from pristine and rewetted peatlands of the northern hemisphere. Among the investigated abiotic and biotic environmental parameters, the peatland type and the host moss taxon were identified to have a major impact on the structure of moss-associated bacterial communities, contrarily to archaeal communities whose structures were similar among the investigated bryophytes. For the first time it was shown that different bog development stages harbour distinct bacterial communities, while at the same time a small core community is shared among all investigated bryophytes independent of geography and peatland type. The present thesis displays the first large-scale, systematic assessment of bacterial and archaeal communities associated both with brown mosses and Sphagnum mosses. It suggests that some host-specific moss taxa have the potential to play a key role in host moss establishment and peatland development. N2 - Während die Beziehungen zwischen Moosen und den mit ihnen assoziierten Mikroorganismen oft durch syntrophische Wechselwirkungen charakterisiert sind, ist die Struktur der Moos-assoziierten mikrobiellen Gemeinschaften sowie deren Rolle bei der Entstehung von Mooren weitgehend unbekannt. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit mikrobiellen Gemeinschaften, die mit Moosen nördlicher, naturnaher Moore assoziiert sind, sowie mit den Umweltfaktoren, die sie beeinflussen. Entlang eines groß angelegten geographischen Gradienten, der von der Hocharktis bis zur gemäßigten Klimazone reicht, wurden vier naturbelassene Moore als Probenstandorte ausgesucht, die stellvertretend für verschiedene Stadien der Moorentwicklung stehen: zwei Braunmoos-dominierte Niedermoore mit nahezu neutralem pH-Wert sowie zwei Sphagnum-dominierte Torfmoore mit saurem pH-Wert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit machen deutlich, dass die zu den Bakterien zählenden Acetobacteraceae das vorherrschende mikrobielle Taxon der Sphagnum-Moose gleich welchen geographischen Ursprungs darstellen und insbesondere innerhalb des Wirtsmoosgewebes dominieren. Gleichzeitig gehörten die Acetobacteraceae zum wesentlichen Bestandteil der mikrobiellen Kerngemeinschaft aller untersuchten Moose, die sich aus einigen wenigen Arten, dafür zahlreich vorkommenden Prokaryoten zusammensetzt. Die vorliegende Arbeit zeigt zudem erstmals, dass sowohl Braunmoose als auch Torfmoose ein Habitat für Archaeen darstellen. Die Mehrheit der Moos-assoziierten Archaeen gehörte dabei zu den methanbildenden Gruppen, wenngleich die metabolischen Aktivitätsraten unter Laborbedingungen meistens kaum messbar waren. Im Gegensatz hierzu konnte die Bakterien-vermittelte Methanoxidation sowohl an Braunmoosen als auch an Sphagnum-Moosen gemessen werden. Dies zeigt eindrucksvoll, dass Moos-assoziierte Bakterien potenziell zur Minderung von Methanemissionen aus nördlichen, aber auch wiedervernässten Mooren beitragen können. Ein weiteres wichtiges Resultat der vorliegenden Arbeit ist die Bedeutung des Moortyps (Niedermoor oder Torfmoor), aber auch der Wirtsmoosart selbst für die Struktur der Moos-assoziierten Bakteriengemeinschaften, während die archaeellen Gemeinschaftsstrukturen weder vom Moortyp noch von der Wirtsmoosart beeinflusst wurden und sich insgesamt deutlich ähnlicher waren als die der Bakterien. Darüber hinaus konnte erstmalig gezeigt werden, dass sich die bakteriellen Gemeinschaften innerhalb der unterschiedlichen Moorsukzessionsstadien zwar ganz erheblich voneinander unterscheiden, ein kleiner Teil der Bakterien dennoch Kerngemeinschaften bilden, die mit allen untersuchten Moosarten assoziiert waren. Bei der hier präsentierten Arbeit handelt es sich um die erste systematische Studie, die sich auf einer großen geographischen Skala mit den bakteriellen und archaeellen Gemeinschaften von Braunmoosen und Torfmoosen aus naturbelassenen nördlichen Mooren befasst. Die vorliegenden Ergebnisse machen deutlich, dass die untersuchten Moose ein ganz spezifisches mikrobielles Konsortium beherbergen, welches mutmaßlich eine Schlüsselrolle bei der Etablierung der Wirtspflanzen am Anfang der Moorentwicklung spielt und darüber hinaus das Potential hat, die charakteristischen Eigenschaften von Mooren sowie deren weitere Entwicklung zu prägen. KW - moss-microbe-interactions KW - moss-associated bacteria KW - moss-associated archaea KW - northern peatlands KW - peatland core microbiome KW - Acetobacteraceae KW - moss-associated methanotrophy KW - moss-associated methanogenesis KW - Sphagnum KW - Amblystegiaceae KW - endophytes KW - brown mosses KW - epiphytes KW - peatland development KW - bryophytes KW - host-specificity KW - large-scale study KW - methanotrophic bacteria KW - methanogenic archaea KW - Essigsäurebakterien KW - Amblystegiaceae KW - Torfmoose KW - Braunmoose KW - Bryophyten KW - Endophyten KW - Epiphyten KW - Wirtsspezifität KW - geographische Großstudie KW - methanproduzierende Archaeen KW - methanoxidierende Bakterien KW - Moos-assoziierte Methanproduktion KW - Moos-assoziierte Methanoxidation KW - Moos-Mikroben-Interaktion KW - nördliche Moore KW - mikrobielle Moor-Kerngemeinschaft KW - Moorsukzession Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-630641 ER - TY - THES A1 - Artins, Anthony T1 - Crosstalk between Target Of Rapamycin (TOR) and sugar signaling in Arabidopsis thaliana Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Amen, Rahma T1 - Adaptive radiation in African weakly electric fish genus Campylomormyrus BT - a behavior, ecological and morphological perspective N2 - The African weakly electric fish genus Campylomormyrus includes 15 described species mostly native to the Congo River and its tributaries. They are considered sympatric species, because their distribution area overlaps. These species generate species-specific electric organ discharges (EODs) varying in waveform characteristics, including duration, polarity, and phase number. They exhibit also pronounced divergence in their snout, i.e. the length, thickness, and curvature. The diversifications in these two phenotypical traits (EOD and snout) have been proposed as key factors promoting adaptive radiation in Campylomormyrus. The role of EODs as a pre-zygotic isolation mechanism driving sympatric speciation by promoting assortative mating has been examined using behavioral, genetical, and histological approaches. However, the evolutionary effects of the snout morphology and its link to species divergence have not been closely examined. Hence, the main objective of this study is to investigate the effect of snout morphology diversification and its correlated EOD to better understand their sympatric speciation and evolutionary drivers. Moreover, I aim to utilize the intragenus and intergenus hybrids of Campylomormyrus to better understand trait divergence as well as underlying molecular/genetic mechanisms involved in the radiation scenario. To this end, I utilized three different approaches: feeding behavior analysis, diet assessment, and geometric morphometrics analysis. I performed feeding behavior experiments to evaluate the concept of the phenotype-environment correlation by testing whether Campylomormyrus species show substrate preferences. The behavioral experiments showed that the short snout species exhibits preference to sandy substrate, the long snout species prefers a stone substrate, and the species with intermediate snout size does not exhibit any substrate preference. The experiments suggest that the diverse feeding apparatus in the genus Campylomormyrus may have evolved in adaptation to their microhabitats. I also performed diet assessments of sympatric Campylomormyrus species and a sister genus species (Gnathonemus petersii) with markedly different snout morphologies and EOD using NGS-based DNA metabarcoding of their stomach contents. The diet of each species was documented showing that aquatic insects such as dipterans, coleopterans and trichopterans represent the major diet component. The results showed also that all species are able to exploit diverse food niches in their habitats. However, comparing the diet overlap indices showed that different snout morphologies and the associated divergence in the EOD translated into different prey spectra. These results further support the idea that the EOD could be a ‘magic trait’ triggering both adaptation and reproductive isolation. Geometric morphometrics method was also used to compare the phenotypical shape traits of the F1 intragenus (Campylomormyrus) and intergenus (Campylomormyrus species and Gnathonemus petersii) hybrids relative to their parents. The hybrids of these species were well separated based on the morphological traits, however the hybrid phenotypic traits were closer to the short-snouted species. In addition, the likelihood that the short snout expressed in the hybrids increases with increasing the genetic distance of the parental species. The results confirmed that additive effects produce intermediate phenotypes in F1-hybrids. It seems, therefore, that morphological shape traits in hybrids, unlike the physiological traits, were not expressed straightforward. KW - adaptive radiation KW - ecological speciation KW - African weakly electric fish KW - trophic apparatus KW - DNA metabarcoding KW - geometric morphometric Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Martinez-Seidel, Federico T1 - Ribosome Heterogeneity and Specialization during Temperature Acclimation in Plants N2 - Ribosomes decode mRNA to synthesize proteins. Ribosomes, once considered static, executing machines, are now viewed as dynamic modulators of translation. Increasingly detailed analyses of structural ribosome heterogeneity led to a paradigm shift toward ribosome specialization for selective translation. As sessile organisms, plants cannot escape harmful environments and evolved strategies to withstand. Plant cytosolic ribosomes are in some respects more diverse than those of other metazoans. This diversity may contribute to plant stress acclimation. The goal of this thesis was to determine whether plants use ribosome heterogeneity to regulate protein synthesis through specialized translation. I focused on temperature acclimation, specifically on shifts to low temperatures. During cold acclimation, Arabidopsis ceases growth for seven days while establishing the responses required to resume growth. Earlier results indicate that ribosome biogenesis is essential for cold acclimation. REIL mutants (reil-dkos) lacking a 60S maturation factor do not acclimate successfully and do not resume growth. Using these genotypes, I ascribed cold-induced defects of ribosome biogenesis to the assembly of the polypeptide exit tunnel (PET) by performing spatial statistics of rProtein changes mapped onto the plant 80S structure. I discovered that growth cessation and PET remodeling also occurs in barley, suggesting a general cold response in plants. Cold triggered PET remodeling is consistent with the function of Rei-1, a REIL homolog of yeast, which performs PET quality control. Using seminal data of ribosome specialization, I show that yeast remodels the tRNA entry site of ribosomes upon change of carbon sources and demonstrate that spatially constrained remodeling of ribosomes in metazoans may modulate protein synthesis. I argue that regional remodeling may be a form of ribosome specialization and show that heterogeneous cytosolic polysomes accumulate after cold acclimation, leading to shifts in the translational output that differs between wild-type and reil-dkos. I found that heterogeneous complexes consist of newly synthesized and reused proteins. I propose that tailored ribosome complexes enable free 60S subunits to select specific 48S initiation complexes for translation. Cold acclimated ribosomes through ribosome remodeling synthesize a novel proteome consistent with known mechanisms of cold acclimation. The main hypothesis arising from my thesis is that heterogeneous/ specialized ribosomes alter translation preferences, adjust the proteome and thereby activate plant programs for successful cold acclimation. N2 - Ribosomen dekodieren mRNA, um Proteine zu synthetisieren. Ribosomen, früher als statische, ausführende Maschinen betrachtet, werden heute als dynamische Modulatoren der Translation angesehen. Zunehmend detailliertere Analysen der Strukturheterogenität von Ribosomen führte zu einem Paradigmenwechsel hin zu einer Spezialisierung von Ribosomen für eine selektive Translation. Als sessile Organismen können Pflanzen schädlichen Umwelteinflüssen nicht ausweichen und haben Strategien entwickelt, um diesen zu widerstehen. Zytosolische Ribosomen von Pflanzen sind in mancher Hinsicht vielfältiger, als die von anderen Metazoen. Diese Vielfalt könnte zur Stressakklimatisierung der Pflanzen beitragen. Ziel dieser Arbeit war es, festzustellen, ob Pflanzen die Heterogenität der Ribosomen nutzen, um die Proteinsynthese durch spezialisierte Translation zu regulieren. Ich habe mich auf die Temperaturakklimatisierung konzentriert, insbesondere auf den Wechsel zu niedrigen Temperaturen. Im Verlauf der Kälteakklimatisierung stellt Arabidopsis das Wachstum für sieben Tage ein. Währenddessen etabliert sie die für die Wiederaufnahme des Wachstums erforderlichen Anpassungen. Vorherige Ergebnisse deuten darauf hin, dass Ribosomenbiogenese für die Kälteakklimatisierung essentiell ist. REIL-Mutanten (reil-dkos), denen ein 60S-Reifungsfaktor fehlt, akklimatisieren sich nicht erfolgreich und nehmen das Wachstum nicht wieder auf. Anhand dieser Genotypen habe ich kältebedingte Defekte der Ribosomenbiogenese auf den Aufbau des Polypeptidaustritts-Tunnels (PET) zurückgeführt, indem ich räumliche statistische Analysen von rProtein-Veränderungen auf die pflanzliche 80S-Struktur abgebildet habe. Ich habe entdeckt, dass Wachstumsstillstand und PET-Umbau auch in Gerste auftreten, was auf eine allgemeine Kältereaktion in Pflanzen hindeutet. Der durch Kälte ausgelöste PET-Umbau stimmt über ein mit der Funktion von Rei-1, einem REIL-homologen Protein aus Hefe, in der Rei-1 die PET-Qualitätskontrolle durchführt. Anhand bahnbrechender Daten zur Ribosomenspezialisierung zeige ich, dass Hefe die tRNA-Eintrittsstelle von Ribosomen bei einem Wechsel von Kohlenstoffquellen umbaut, und demonstriere, dass ein räumlich begrenzter Umbau von Ribosomen in Metazoen die Proteinsynthese modulieren kann. Ich argumentiere, dass die regionale Umgestaltung eine Form der Ribosomenspezialisierung sein kann, und zeige, dass nach einer Kälteakklimatisierung heterogene zytosolische Polysomen akkumulieren, was zu Verschiebungen im Translationsoutput führt, der sich zwischen Wildtyp und reil-dkos unterscheidet. Ich habe festgestellt, dass die heterogenen Komplexe aus neu synthetisierten und wiederverwendeten Proteinen bestehen. Ich schlage vor, dass maßgeschneiderte Ribosomenkomplexe freie 60S-Untereinheiten in die Lage versetzen, spezifische 48S-Initiationskomplexe für die Translation auszuwählen. Kälte-akklimatisierte Ribosomen synthetisieren durch Ribosomenumbau ein neues Proteom, das mit bekannten Mechanismen der Kälteakklimatisierung übereinstimmt. Die Haupthypothese, die sich aus meiner Arbeit ergibt, ist, dass heterogene/spezialisierte Ribosomen ihre Translationspräferenzen verändern, das Proteom anpassen und dadurch Pflanzenprogramme für eine erfolgreiche Kälteakklimatisierung aktivieren. T2 - Ribosomenheterogenität und -spezialisierung während der Temperaturakklimatisierung in Pflanzen KW - Ribosome specialization KW - Ribosomal protein heterogeneity KW - Ribosomal protein substoichiometry KW - Protein synthesis KW - Translational regulation KW - Plant cytosolic translation KW - Cold acclimation KW - Ribosome biogenesis KW - 60S maturation KW - Hordeum vulgare KW - Arabidopsis thaliana KW - 60S-Reifung KW - Kälteakklimatisierung KW - Cytosolische Translation in Pflanzen KW - Proteinsynthese KW - Ribosomale Proteinheterogenität KW - Ribosomale Protein Substöchiometrie KW - Ribosomen-Biogenese KW - Ribosomen-Spezialisierung KW - Translationsregulation Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-580724 ER - TY - THES A1 - Gonzalez Duran, Enrique T1 - Genetic control of intracellular gene transfer by DNA repair in N. tabacum N2 - Mitochondria and plastids are organelles with an endosymbiotic origin. During evolution, many genes are lost from the organellar genomes and get integrated in the nuclear genome, in what is known as intracellular/endosymbiotic gene transfer (IGT/EGT). IGT has been reproduced experimentally in Nicotiana tabacum at a gene transfer rate (GTR) of 1 event in 5 million cells, but, despite its centrality to eukaryotic evolution, there are no genetic factors known to influence the frequency of IGT in higher eukaryotes. The focus of this work was to determine the role of different DNA repair pathways of double strand break repair (DSBR) in the integration step of organellar DNA in the nuclear genome during IGT. Here, a CRISPR/Cas9 mutagenesis strategy was implemented in N. tabacum, with the aim of generating mutants in nuclear genes without expected visible phenotypes. This strategy led to the generation of a collection of independent mutants in the LIG4 (necessary for non-homologous end joining, NHEJ) and POLQ genes (necessary for microhomology mediated end joining, MMEJ). Targeting of other DSBR genes (KU70, KU80, RPA1C) generated mutants with unexpectedly strong developmental phenotypes.. These factors have telomeric roles, hinting towards a possible relationship between telomere length, and strength of developmental disruption upon loss of telomere structure in plants. The mutants were made in a genetic background encoding a plastid-encoded IGT reporter, that confers kanamycin resistance upon transfer to the nucleus. Through large scale independent experiments, increased IGT from the chloroplast to the nucleus was observed in lig4 mutants, as well as lines encoding a POLQ gene with a defective polymerase domain (polqΔPol). This shows that NHEJ or MMEJ have a double-sided relationship with IGT: while transferred genes may integrate using either pathway, the presence of both pathways suppresses IGT in wild-type somatic cells, thus demonstrating for the first time the extent on which nuclear genes control IGT frequency in plants. The IGT frequency increases in the mutants are likely mediated by increased availability of double strand breaks for integration. Additionally, kinetic analysis reveals that gene transfer (GT) events accumulate linearly as a function of time spent under antibiotic selection in the experiment, demonstrating that, contrary to what was previously thought, there is no such thing as a single GTR in somatic IGT experiments. Furthermore, IGT in tissue culture experiments appears to be the result of a "race against the clock" for integration in the nuclear genome, that starts when the organellar DNA arrives to the nucleus granting transient antibiotic resistance. GT events and escapes of kanamycin selection may be two possible outcomes from this race: those instances where the organellar DNA gets to integrate are recovered as GT events, and in those cases where timely integration fails, antibiotic resistance cannot be sustained, and end up considered as escapes. In the mutants, increased opportunities for integration in the nuclear genome change the overall ratio between IGT and escape events. The resources generated here are promising starting points for future research: (1) the mutant collection, for the further study of processes that depend on DNA repair in plants (2) the collection of GT lines obtained from these experiments, for the study of the effect of DSBR pathways over integration patterns and stability of transferred genes and (3) the developed CRISPR/Cas9 workflow for mutant generation, to make N. tabacum meet its potential as an attractive model for answering complex biological questions. N2 - Mitochondrien und Plastiden sind beides Organellen endosymbiotischen Ursprungs. Im Laufe der Evolution gehen viele Gene aus den Organellengenomen verloren und werden in das Kerngenom integriert, was als intrazellulärer/endosymbiotischer Gentransfer (IGT/EGT) bezeichnet wird. IGT konnte experimentell in Nicotiana tabacum mit einer Gentransferrate (GTR) von einem Ereignis in fünf Millionen Zellen nachgestellt werden, aber trotz seiner zentralen Bedeutung für die eukaryotische Evolution sind keine genetischen Faktoren bekannt, die die Häufigkeit von IGT in höheren Eukaryoten beeinflussen. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Bestimmung der Rolle verschiedener DNA-Reparaturwege der Doppelstrangbruchreparatur (DSBR) bei der Integration von Organellen-DNA in das Kerngenom während des IGT. Dazu wurde in N. tabacum eine CRISPR/Cas9-basierte Mutagenesestrategie angewandt, mit dem Ziel, Mutanten in Kerngenen zu erzeugen, für die keine sichtbaren Phänotypen zu erwarten sind. Diese Strategie führte zur Erzeugung einer Reihe unabhängiger Mutanten im LIG4-Gen (notwendig für „non-homologous end joining“, die nicht-homologe Verbindung von Enden, NHEJ) und POLQ (notwendig für „microhomology mediated end joining“, die Mikrohomologie-vermittelte Verbindung von Enden, MMEJ). Die gezielte Beeinflussung anderer DSBR-Gene (KU70, KU80, RPA1C) führte zu Mutanten mit unerwartet starken Entwicklungsphänotypen. Diese Gene spielen eine Rolle beim Erhalt der Telomere, was auf einen möglichen Zusammenhang zwischen der Telomerlänge und der Stärke der Entwicklungsstörung bei Verlust der Telomerstruktur in Pflanzen hindeutet. Die Mutanten wurden in einem genetischen Hintergrund erzeugt, der über einen in den Plastiden lokalisierten IGT-Reporter verfügt, der nach Übertragung in den Zellkern Kanamycin-Resistenz vermittelt. In groß angelegten unabhängigen Experimenten wurde in lig4-Mutanten sowie in Linien, die für ein POLQ-Gen mit einer defekten Polymerase-Domäne (polqΔPol) kodieren, eine erhöhte GTR vom Chloroplasten zum Zellkern beobachtet. Dies zeigt, dass NHEJ oder MMEJ eine zweischneidige Beziehung zum IGT haben: Während übertragene Gene folglich über jeden der beiden Mechanismen integriert werden können, unterdrückt das gleichzeitige Vorhandensein beider Wege IGT in somatischen Wildtyp-Zellen, wodurch zum ersten Mal gezeigt wird, in welchem Ausmaß Kerngene die IGT-Häufigkeit in Pflanzen kontrollieren. Die erhöhte Verfügbarkeit von Doppelstrangbrüchen für die Integration könnte für die erhöhte IGT-Häufigkeit in den Mutanten verantwortlich sein. Darüber hinaus zeigt die Analyse des Zeitverlaufs, dass Gentransferereignisse (GT) in Abhängigkeit von der Zeit, die im Experiment unter Antibiotikaselektion verbracht wurde, linear akkumulieren, was beweist, dass es, anders als bisher angenommen, in somatischen IGT-Experimenten keine statische GTR gibt. Darüber hinaus scheint IGT in Gewebekulturexperimenten das Ergebnis eines Wettlaufs mit der Zeit um die Integration in das Kerngenom zu sein, der beginnt, wenn die Organellen-DNA in den Zellkern gelangt und eine vorübergehende Antibiotikaresistenz gewährt. Echte GT-Ereignisse und „Escapes“ (scheinbare Resistenz, ein vorläufiges Ausweichen vor der Kanamycin-Selektion) können zwei mögliche Ergebnisse dieses Wettlaufs sein: Die Fälle, in denen die Organellen-DNA integriert wird, werden als GT-Ereignisse gewertet, und in den Fällen, in denen die rechtzeitige Integration scheitert, kann die Antibiotikaresistenz nicht aufrechterhalten werden und sie werden als „Escape“ betrachtet. In den Mutanten verändern sich die Möglichkeiten zur Integration in das Kerngenom, wodurch sich das Gesamtverhältnis zwischen IGT- und „Escape“-Ereignissen ändert. Die hier erzeugten Ressourcen sind vielversprechende Ausgangspunkte für künftige Forschungen: (1) die Mutantensammlung, für die Untersuchung von weiteren Prozessen, die von der DNA-Reparatur in Pflanzen abhängen, (2) die Sammlung von GT-Linien, die aus den hier beschriebenen Experimenten gewonnen wurden, für die Untersuchung der Auswirkungen von DSBR-Mechanismen auf Integrationsmuster und Stabilität übertragener Gene und (3) der hier entwickelte Arbeitsablauf für die Mutantenerzeugung mittels CRISPR/Cas9, damit N. tabacum sein Potenzial als attraktives Modell für die Beantwortung komplexer biologischer Fragestellungen erfüllen kann. T2 - Genetische Kontrolle des intrazellulären Gentransfers durch DNA-Reparatur in N. tabacum KW - endosymbiosis KW - organelles KW - gene KW - transfer KW - DNA KW - repair KW - genome KW - editing KW - evolution KW - plant Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Bühler, Miriam T1 - The role of (xeno)hormone-activated GPER1 for centrosome amplification and whole chromosomal instability in colon cell lines N2 - The G protein-coupled estrogen receptor (GPER1) is acknowledged as an important mediator of estrogen signaling. Given the ubiquitous expression of GPER1, it is likely that the receptor plays a role in a variety of malignancies, not only in the classic hormonally regulated tissues (e.g., breast, ovary, and prostate), but also in the colon. As colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer in both men and women worldwide and environmental factors and dietary habits are important risk factors, it is increasingly recognized that natural and synthetic hormones and their associated receptors might play a role in CRC. Through oral consumption, environmental contaminants with endocrine activity are in contact with the gastrointestinal mucosa, where they might exert their toxic effects. Although GPER1 has been shown to be engaged in physiological and pathophysiological processes, its role in CRC remains poorly understood. Thus, pro- as well as anti-tumorigenic effects are described in the literature. This thesis has uncovered novel roles of GPER1 in mediating major CRC-associated phenotypes in transformed and non-transformed colon cell lines. Exposure to the estrogens 17β-estradiol (E2), bisphenol-A (BPA) and diethylstilbestrol (DES) but also the androgen dihydrotestosterone (DHT) resulted in GPER1-dependent induction of supernumerary centrosomes, whole chromosomal instability (w-CIN) and aneuploidy. Indeed, both knockdown and inhibition of GPER1 attenuated the generation of (xeno)hormone-driven supernumerary centrosomes and karyotype instability. Mechanistically, (xeno)hormone-induced centrosome amplification was associated with transient multipolar mitosis and the generation of so called anaphase “lagging” chromosomes. The results of this thesis propose a GPER1/PKA/AKAP9-pathway in regulating centrosome numbers in colorectal cancer cells and the involvement of the centriolar protein centrin. Remarkably, exposure to (xeno)hormones resulted in atypical enlargement and unexpected phosphorylation of the centriole marker centrin in interphase. These findings provide a novel role for GPER1 in key CRC-prone lesions and shed light on underlying mechanisms that involve GPER1 function in the colon. Elucidating to what extent centrosomal proteins are involved in the GPER1-mediated aneugenic effect will be an important task for future studies. The present study was intended to lay a first foundation to understand the molecular basis and potential risk factors of CRC which might help to reduce the use of laboratory animals. Since numerous animal experiments are conducted in biomedical research, the development of alternative methods is indispensable. The Federal Institute for Risk Assessment (BfR) as the German Center for the Protection of Laboratory Animals (Bf3R) addresses this issue by uncovering underlying mechanisms leading to colorectal cancer as necessary prerequisite in order to develop alternative methods. N2 - Der G-Protein-gekoppelte Östrogenrezeptor (GPER1) ist als wichtiger Vermittler von Östrogensignalen bekannt. Angesichts der ubiquitären Expression von GPER1 ist es wahrscheinlich, dass der Rezeptor bei einer Vielzahl von Krebserkrankungen eine Rolle spielt, nicht nur in den klassischen hormonell regulierten Geweben (z. B. Brust, Eierstöcke und Prostata), sondern auch im Darm. Da Darmkrebs (Colorectal cancer, CRC) weltweit die dritthäufigste Krebserkrankung sowohl bei Männern als auch bei Frauen ist und Umweltfaktoren und Ernährungsgewohnheiten wichtige Risikofaktoren darstellen, geht man zunehmend davon aus, dass natürliche und synthetische Hormone und ihre zugehörigen Rezeptoren eine Rolle im Darmkrebs spielen könnten. Durch orale Aufnahme kommen Umweltschadstoffe mit endokriner Aktivität mit der Magen-Darm-Schleimhaut in Kontakt, wo sie ihre toxischen Wirkungen entfalten könnten. Obwohl gezeigt wurde, dass GPER1 an physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt ist, ist seine Rolle im Darmkrebs nach wie vor unzureichend geklärt. So werden in der Literatur sowohl Tumor-fördernde als auch -hemmende Wirkungen beschrieben werden. In dieser Arbeit wurden neue Rollen von GPER1 bei der Vermittlung wichtiger Darmkrebs-assoziierter Phänotypen in transformierten und nicht-transformierten Kolonzelllinien aufgedeckt. Die Exposition gegenüber den Östrogenen 17β-Östradiol (E2), Bisphenol-A (BPA) und Diethylstilbestrol (DES), aber auch dem Androgen Dihydrotestosteron (DHT) führte zu einer GPER1-abhängigen Induktion von überzähligen Zentrosomen, chromosomaler Instabilität (w-CIN) und Aneuploidie. Sowohl der Knockdown, als auch die Inhibierung von GPER1 verringerten die Entstehung von (xeno)hormon-bedingten überzähligen Zentrosomen und Karyotyp Instabilität. Mechanistisch gesehen war die (Xeno-)Hormon-induzierte Zentrosomen Amplifikation mit einer vorübergehenden multipolaren Mitose und der Bildung von sogenannten Anaphasen „lagging“ Chromosomen verbunden. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf einen GPER1/PKA/AKAP9-Weg zur Regulierung der Zentrosomenzahl in Darmkrebszellen und eine Beteiligung des zentriolären Proteins Zentrin hin. Bemerkenswerterweise führte die Exposition gegenüber (Xeno-)Hormonen zu einer atypischen Vergrößerung und unerwarteten Phosphorylierung des Zentriolen Markers Centrin in der Interphase. Diese Ergebnisse enthüllen eine neue Rolle für GPER1 in wichtigen, mit Darmkrebs assoziierten Läsionen und geben Aufschluss auf die zugrundeliegenden Mechanismen der GPER1-Funktion im Darm. Die Aufklärung zu welchem Ausmaßes zentrosomale Proteine an der GPER1-vermittelten aneugenischen Wirkung beteiligt sind, wird eine wichtige Aufgabe für zukünftige Studien sein. Mit der vorliegenden Studie sollte eine erste Grundlage für das Verständnis der molekularen Grundlagen und potenziellen Risikofaktoren von Darmkrebs geschaffen werden, was dazu beitragen könnte, den Einsatz von Versuchstieren zu reduzieren. Da in der biomedizinischen Forschung zahlreiche Tierversuche durchgeführt werden, ist die Entwicklung von Alternativmethoden unerlässlich. Das Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) als Deutsches Zentrum zum Schutz von Versuchstieren (Bf3R) widmet sich diesem Thema, indem es die zugrundeliegenden Mechanismen, die zu Darmkrebs führen, als notwendige Voraussetzung für die Entwicklung alternativer Methoden aufdeckt. KW - centrosome amplification KW - colon cancer KW - G protein-coupled estrogen receptor KW - whole chromosomal instability KW - (xeno)hormones KW - Zentrosomen Amplifikation KW - Darmkrebs KW - G protein-gekoppelter Östrogen Rezeptor KW - chromosomale Instabilität KW - (Xeno)Hormone Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - von Bismarck, Thekla T1 - The influence of long-term light acclimation on photosynthesis in dynamic light N2 - Photosynthesis converts light into metabolic energy which fuels plant growth. In nature, many factors influence light availability for photosynthesis on different time scales, from shading by leaves within seconds up to seasonal changes over months. Variability of light energy supply for photosynthesis can limit a plant´s biomass accumulation. Plants have evolved multiple strategies to cope with strongly fluctuation light (FL). These range from long-term optimization of leaf morphology and physiology and levels of pigments and proteins in a process called light acclimation, to rapid changes in protein activity within seconds. Therefore, uncovering how plants deal with FL on different time scales may provide key ideas for improving crop yield. Photosynthesis is not an isolated process but tightly integrates with metabolism through mutual regulatory interactions. We thus require mechanistic understanding of how long-term light acclimation shapes both, dynamic photosynthesis and its interactions with downstream metabolism. To approach this, we analyzed the influence of growth light on i) the function of known rapid photosynthesis regulators KEA3 and VCCN1 in dynamic photosynthesis (Chapter 2-3) and ii) the interconnection of photosynthesis with photorespiration (PR; Chapter 4). We approached topic (i) by quantifying the effect of different growth light regimes on photosynthesis and photoprotection by using kea3 and vccn1 mutants. Firstly, we found that, besides photosynthetic capacity, the activities of VCCN1 and KEA3 during a sudden high light phase also correlated with growth light intensity. This finding suggests regulation of both proteins by the capacity of downstream metabolism. Secondly, we showed that KEA3 accelerated photoprotective non-photochemical quenching (NPQ) kinetics in two ways: Directly via downregulating the lumen proton concentration and thereby de-activating pH-dependent NPQ, and indirectly via suppressing accumulation of the photoprotective pigment zeaxanthin. For topic (ii), we analyzed the role of PR, a process which recycles a toxic byproduct of the carbon fixation reactions, in metabolic flexibility in a dynamically changing light environment. For this we employed the mutants hpr1 and ggt1 with a partial block in PR. We characterized the function of PR during light acclimation by tracking molecular and physiological changes of the two mutants. Our data, in contrast to previous reports, disprove a generally stronger physiological relevance of PR under dynamic light conditions. Additionally, the two different mutants showed pronounced and distinct metabolic changes during acclimation to a condition inducing higher photosynthetic activity. This underlines that PR cannot be regarded purely as a cyclic detoxification pathway for 2PG. Instead, PR is highly interconnected with plant metabolism, with GGT1 and HPR1 representing distinct metabolic modulators. In summary, the presented work provides further insight into how energetic and metabolic flexibility is ensured by short-term regulators and PR during long-term light acclimation. N2 - Photosynthese wandelt Lichtenergie in metabolische Energie um, welche das Pflanzenwachstum antreibt. In der Natur wird die Verfügbarkeit von Licht von vielerlei Faktoren auf unterschiedlichen Zeitskalen beeinflusst, z. B. von der Beschattung durch Blätter innerhalb von Sekunden bis hin zu jahreszeitlichen Veränderungen über Monate. Fluktuationen in der Lichtenergieverfügbarkeit in der Natur kann die Biomasseakkumulation der Pflanzen limitieren. Pflanzen haben verschiedene Strategien entwickelt, um stark fluktuierendes Licht nutzen zu können. Diese reichen von der langfristigen Optimierung der Blattmorphologie und Physiologie und des Gehalts an Pigmenten und Proteinen in dem Prozess der Lichtakklimatisierung bis hin zu schnellen Veränderungen der Proteinaktivität innerhalb von Sekunden. Daher kann die Aufdeckung der Art und Weise, wie Pflanzen mit FL auf verschiedenen Zeitskalen umgehen, wichtige Ideen zur Verbesserung der Ernteerträge liefern. Die Photosynthese ist kein isolierter Prozess, sondern steht in enger Interaktion mit den nachgeschalteten Stoffwechselwegen. Daher benötigen wir mechanistisches Verständnis, wie Lichtakklimatisierung die dynamische Photosynthese als auch deren Interaktion mit Downstream-Metabolismus moduliert. Dafür haben wir den Einfluss von Lichtakklimatisierung auf i) die Funktion der schnellen Photosyntheseregulatoren KEA3 und VCCN1 in der dynamischen Photosynthese und ii) die flexible Interaktion von Photorespiration mit Photosynthese analysiert. Im ersten Themenkomplex (i) wurden die Auswirkungen verschiedener Wachstumslicht-bedingungen auf Photosynthese und Photoprotektion anhand von kea3- und vccn1-Mutanten quantifiziert. Zum einen konnten wir zeigen, dass neben der photosynthetischen Kapazität auch die Aktivitäten von VCCN1 und KEA3 während eines Hochlichtpulses mit der Wachstumslichtintensität korrelierten. Dies deutet auf eine Regulierung beider Proteine durch die Kapazität des Downstream-Metabolismus hin. Zum anderen beschleunigte KEA3 die Kinetik des photoprotektiven nicht-photochemischen Quenchings (NPQ) auf zweifache Weise: Direkt über die Herabregulierung der lumenalen Protonenkonzentration, was den pH-abhängigen NPQ deaktivierte, und indirekt über die Unterdrückung der Akkumulation des photoprotektiven Pigments Zeaxanthin. Für das zweite Thema (ii) untersuchten wir die Rolle des photorespiratorischen Metabolismus (PR), welcher ein toxisches Nebenprodukt der Kohlenstofffixierungsreaktionen recycelt, in der metabolischen Flexibilität in einer sich dynamisch verändernden Lichtumgebung. Dazu verwendeten wir die Mutanten hpr1 und ggt1 mit teilweise blockiertem PR Flux. Unsere Daten widerlegen, im Gegensatz zu früheren Berichten, eine allgemein größere physiologische Bedeutung von PR unter dynamischen Lichtbedingungen. Die beiden Mutanten zeigten ausgeprägte und distinkte metabolische Veränderungen während der Akklimatisierung an eine Bedingung mit höherer photosynthetischer Aktivität. Dies zeigt, dass PR nicht ausschließlich als zyklischer Entgiftungsweg für 2PG angesehen werden kann. Vielmehr ist PR tief in den pflanzlichen Stoffwechsel eingebettet, wobei GGT1 und HPR1 als distinkte Stellschrauben des Downstream-Metabolismus agieren. Zusammenfassend liefert die vorliegende Arbeit weitere Erkenntnisse darüber, wie die energetische und metabolische Flexibilität durch kurzfristige Regulatoren und den photorespiratorischen Metabolismus während der langfristigen Lichtakklimatisierung gewährleistet wird. KW - photosynthesis KW - fluctuating light KW - Arabidopsis thaliana KW - Photosynthese KW - fluktuierendes Licht Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Rolo, David T1 - Assembly of photosystem I in thylakoid membranes T1 - Die Assemblierung des Photosystems I in der Thylakoidmembran N2 - The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of multiprotein complexes embedded in thylakoid membranes. Among them, photosystem I (PSI), acting as plastocyanin-ferderoxin oxidoreductase, catalyzes the final reaction. Together with light-harvesting antenna I, PSI forms a high-molecular-weight supercomplex of ~600 kDa, consisting of eighteen subunits and nearly two hundred co-factors. Assembly of the various components into a functional thylakoid membrane complex requires precise coordination, which is provided by the assembly machinery. Although this includes a small number of proteins (PSI assembly factors) that have been shown to play a role in the formation of PSI, the process as a whole, as well as the intricacy of its members, remains largely unexplored. In the present work, two approaches were used to find candidate PSI assembly factors. First, EnsembleNet was used to select proteins thought to be functionally related to known PSI assembly factors in Arabidopsis thaliana (approach I), and second, co-immunoprecipitation (Co-IP) of tagged PSI assembly factors in Nicotiana tabacum was performed (approach II). Here, the novel PSI assembly factors designated CO-EXPRESSED WITH PSI ASSEMBLY 1 (CEPA1) and Ycf4-INTERACTING PROTEIN 1 (Y4IP1) were identified. A. thaliana null mutants for CEPA1 and Y4IP1 showed a growth phenotype and pale leaves compared with the wild type. Biophysical experiments using pulse amplitude modulation (PAM) revealed insufficient electron transport on the PSII acceptor side. Biochemical analyses revealed that both CEPA1 and Y4IP1 are specifically involved in PSI accumulation in A. thaliana at the post-translational level but are not essential. Consistent with their roles as factors in the assembly of a thylakoid membrane protein complex, the two proteins localize to thylakoid membranes. Remarkably, cepa1 y4ip1 double mutants exhibited lethal phenotypes in early developmental stages under photoautotrophic growth. Finally, co-IP and native gel experiments supported a possible role for CEPA1 and Y4IP1 in mediating PSI assembly in conjunction with other PSI assembly factors (e.g., PPD1- and PSA3-CEPA1 and Ycf4-Y4IP1). The fact that CEPA1 and Y4IP1 are found exclusively in green algae and higher plants suggests eukaryote-specific functions. Although the specific mechanisms need further investigation, CEPA1 and Y4IP1 are two novel assembly factors that contribute to PSI formation. N2 - Die Lichtreaktionen der Photosynthese werden von einer Reihe von Multiproteinkomplexen durchgeführt, die in Thylakoidmembranen eingebettet sind. Hier katalysiert das Photosystem I (PSI), das als Plastocyanin-Ferderoxin-Oxidoreduktase fungiert, die letzte Reaktion. Zusammen mit der lichtsammelnden Antenne I bildet PSI einen hochmolekularen Superkomplex von etwa 600 kDa, der aus achtzehn Untereinheiten und fast zweihundert Co-Faktoren besteht. Der Zusammenbau der verschiedenen Komponenten zu einem funktionsfähigen Thylakoidmembrankomplex erfordert eine präzise Koordination, die durch den Assemblierungsapparat gewährleistet wird. Obwohl dieser eine kleine Anzahl von Proteinen (PSI-Assemblierungsfaktoren) umfasst, die nachweislich eine Rolle bei der Bildung des PSI spielen, ist der Prozess als Ganzes sowie die Komplexität seiner Mitglieder noch weitgehend unerforscht. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Ansätze verwendet, um Kandidaten für PSI-Assemblierungsfaktoren zu finden. Erstens wurde EnsembleNet verwendet, um Proteine auszuwählen, von denen angenommen wird, dass sie funktionell mit bekannten PSI-Assemblierungsfaktoren in Arabidopsis thaliana verwandt sind (Ansatz I), und zweitens wurde eine Co-Immunopräzipitation (Co-IP) von markierten PSI-Assemblierungsfaktoren in Nicotiana tabacum durchgeführt (Ansatz II). Dabei wurden die neuartigen PSI-Assemblierungsfaktoren mit der Bezeichnung CO-EXPRESSED WITH PSI ASSEMBLY 1 (CEPA1) und Ycf4-INTERACTING PROTEIN 1 (Y4IP1) identifiziert. A. thaliana Nullmutanten für CEPA1 und Y4IP1 zeigten einen Wachstumsphänotyp und blasse Blätter im Vergleich zum Wildtyp. Biophysikalische Experimente unter Verwendung der Pulsamplitudenmodulation (PAM) zeigten einen unzureichenden Elektronentransport auf der PSII-Akzeptorseite. Biochemische Analysen ergaben, dass sowohl CEPA1 als auch Y4IP1 spezifisch an der PSI-Akkumulation in A. thaliana auf posttranslationaler Ebene beteiligt, jedoch nicht essentiell sind. Entsprechend ihrer Rolle als Faktoren für den Aufbau eines Thylakoidmembran-Proteinkomplexes sind die beiden Proteine an Thylakoidmembranen lokalisiert. Bemerkenswerterweise wiesen cepa1 y4ip1-Doppelmutanten in frühen Entwicklungsstadien unter photoautotrophem Wachstum tödliche Phänotypen auf. Schließlich untermauerten Co-IP- und native Gelexperimente eine mögliche Rolle von CEPA1 und Y4IP1 bei der Vermittlung des PSI-Aufbaus in Verbindung mit anderen PSI-Aufbaufaktoren (z. B. PPD1- und PSA3-CEPA1, und Ycf4-Y4IP1). Die Tatsache, dass CEPA1 und Y4IP1 ausschließlich in Grünalgen und höheren Pflanzen vorkommen, lässt auf eukaryontenspezifische Funktionen schließen. Obwohl die spezifischen Mechanismen noch weiter untersucht werden müssen, sind CEPA1 und Y4IP1 zwei neuartige Assemblierungsfaktoren, die zur PSI-Bildung beitragen. KW - photosynthesis KW - photosystem I KW - biogenesis KW - thylakoid membranes KW - assembly factor KW - Photosynthese KW - Photosystem I KW - Biogenese KW - Thylakoidmembran KW - Assemblierungsfaktor Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Leer, Marina T1 - Computational analysis of the effects of ageing and diet on stem cell function and ectopic fat accumulation in the musculoskeletal system N2 - The musculoskeletal system provides support and enables movement to the body, and its deterioration is a crucial aspect of age-related functional decline. Mesenchymal stromal cells (MSCs) play an important role in musculoskeletal homeostasis due to their broad differentiation potentials and their ability to support osteogenic and myogenic tissue maintenance and regeneration. In the bone, MSCs differentiate either into osteochondrogenic progenitors to form osteocytes and chondrocytes, or increasingly with age into adipogenic progenitors which give rise to bone-resident adipocytes. In skeletal muscle, during healthy regeneration MSCs provide regulatory signals that activate local, tissue-specific stem cells, known as satellite cells, which regenerate contractile myofibres. This process involves a significant cross-talk to immune cells stemming from both lymphoid and myeloid lineages. During ageing, muscle-resident MSCs undergo increased adipogenic lineage commitment, causing niche changes that contribute to fatty infiltration in muscles. These shifts in cell populations in bone lead to the loss of osteogenic cells and subsequently osteoporosis, or in muscle to impaired regeneration and to the development of sarcopenia. However, the signals that drive transition of MSCs into their respective cellular fates remain elusive. This thesis aims to elucidate the transcriptional shifts modulating cell states and cell types in musculoskeletal MSC fate determination. Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) was used to characterise cell type-specific transcript regulation. State-of-the-art bioinformatics tools were combined with different analytical platforms that include both droplet-based scRNA-seq for large heterogeneous populations, and microfluidics-based scRNA-seq to assess small, rare subpopulations. For each platform, distinct computational pipelines were established including filtering steps to exclude low-quality cells, and data visualisation was performed by dimensionality reduction. Downstream analysis included clustering, cell type annotation, and differential gene expression to investigate transcriptional states in defined cell types during ageing and injury in the muscle and bone. Finally, a novel tool to assess publication activities in defined areas of research for the identified marker genes was developed. The results in the bone indicate that ageing MSCs increasingly commit towards an adipogenic fate at the expense of osteogenic specialisation. The data also suggests that significant cell population shifts of MSC-type fibro-adipogenic progenitors during muscle ageing underlie the pathologies observed in homeostatic and post-injury regenerative conditions. High-throughput visualisation of publication activity for candidate genes enabled more effective biological evaluation of scRNA-seq data. These results expose critical age-related changes in the stem cell niches of skeletal muscle and bone, highlight their respective sensitivity to nutrition and pathology, and elucidate novel factors that modulate stem cell-based regeneration. Targeting these processes might improve musculoskeletal health in the context of ageing and prevent the negative effects of pathological lineage determination. N2 - Der Stütz- und Bewegungsapparat durchläuft eine altersbedingte gesundheitliche Verschlechterung, welche mit voranschreitendem Funktionsverlust einhergeht. Mesenchymale Stromazellen (MSCs) spielen aufgrund ihres breiten Differenzierungspotenzials und ihrer Fähigkeit, myogene bzw. osteogene Regenerationsprozesse zu unterstützen, eine wichtige Rolle in der muskuloskelettalen Homöostase. Im Knochen differenzieren MSCs entweder zu osteochondrogenen Vorläufern, um Knochen- bzw. Knorpelzellen zu bilden. Oder mit zunehmendem Alter werden vermehrt adipogene Vorläufer gebildet, aus denen Knochen-Fettzellen entstehen. Im Skelettmuskel sezernieren MSCs während der Muskelregeneration beispielsweise regulatorische Signale, die lokale, gewebespezifische Stammzellen, sogenannte Satellitenzellen, aktivieren, und diese daraufhin die kontraktilen Muskelfasern regenerieren. Dieser Prozess umfasst bedeutsame Wechselwirkung von Stammzellen mit Immunzellen sowohl der lymphoiden als auch aus myeloischen Abstammungslinien. Während des Alterns erhalten muskelresidente MSCs jedoch ein erhöhtes adipogenenes Potential, welches Nischenveränderung verursacht und damit zu einer Fettinfiltration in den Muskeln beitragen kann. Die Verschiebungen der Zellpopulationen verursachen einerseits den Verlust von osteogenen Vorläufern und fördern degenerative Prozesse im Knochengewebe, die Osteoporose zur Folge haben, oder beeinträchtigen die Regeneration im Muskel sowie dessen Funktionalität, und können damit zur altersbedingten Sarkopenie beitragen. MSCs durchlaufen einen Entscheidungsprozess um final zu differenzieren, der jedoch bislang nur unzureichend charakterisiert ist. Um diesen Aspekt zu beleuchten, untersucht diese Dissertation die diesem Prozess zugrundeliegende Veränderung der Transkriptionsprofile, welche die Zellzustände und Zelltypen bei der Differenzierung von muskuloskelettalen MSCs steuern. Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) wurde verwendet, um die zelltyp-spezifische Transkriptionsregulation zu charakterisieren. Moderne bioinformatische Analyse-Tools und -Plattformen wurden kombiniert, die sowohl droplet-basierte (für große heterogene Populationen) als auch mikrofluidik-basierte scRNA-seq (für kleine, seltene Subpopulationen), umfassten. Es wurden plattform-spezifische Datenverarbeitungs-Pipelines generiert, einschließlich des Herausfilterns von Zellen geringer Qualität und Datenvisualisierung mit verschiedenen Dimensionsreduktions-Methoden. Die anschließende Analyse umfasste Clustering von Subpopulationen, Zelltyp-Annotation und differenzielle Genexpression, um die Transkriptionszustände in den definierten Zelltypen während des Alterns und bei Regeneration im Muskel und Knochen zu untersuchen. Abschließend wurde eine Software zur Bewertung der Publikationsaktivitäten in definierten Forschungsgebieten für die identifizierten Markergene entwickelt. Die Ergebnisse deuten im Knochen darauf hin, dass alternde MSCs auf Kosten der osteogenen Spezialisierung zunehmend adipogener werden. Weiterhin deuten unsere Daten darauf hin, dass im alternden Muskel eine signifikante Zellpopulationsanreicherung von MSCs zu fibro-adipogenen Vorläuferzellen stattfindet, welche den Pathologien in den Prozessen der Homöostase und Muskelregeneration nach Verletzung unterliegen. Die Visualisierung der Publikationsaktivität für Kandidatengene ermöglicht eine effektivere biologische Bewertung von scRNA-seq-Daten. Diese Ergebnisse offenbaren kritische altersbedingte Veränderungen innerhalb der Stammzellnischen von Skelettmuskeln und Knochen, und identifizieren neue Faktoren, die an stammzell-basierten Regeneration beteiligt sind. Diese Prozesse gezielt zu beeinflussen, könnte die muskuloskelettale Gesundheit im Alter verbessern und negative Effekte einer pathologischen Differenzierung verhindern. KW - single-cell RNA-sequencing KW - single-cell analysis KW - transcriptomics KW - mesenchymal stromal cells KW - musculoskeletal system KW - stem cell differentiation KW - mesenchymale stromale Zellen KW - Muskel-Skelett-System / Bewegungsapparat KW - Einzelzell-Sequenzierung KW - Einzelzell-Analyse KW - Stammzelldifferenzierung KW - Transkriptomik Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Koikkarah Aji, Amit T1 - Quantitative sub cellular characterization of Hantavirus structural proteins T1 - Quantitativ Subzellulär Charakterisierung Von Hantavirus-Strukturproteine. N2 - Hantaviruses (HVs) are a group of zoonotic viruses that infect human beings primarily through aerosol transmission of rodent excreta and urine samplings. HVs are classified geographically into: Old World HVs (OWHVs) that are found in Europe and Asia, and New World HVs (NWHVs) that are observed in the Americas. These different strains can cause severe hantavirus diseases with pronounced renal syndrome or severe cardiopulmonary system distress. HVs can be extremely lethal, with NWHV infections reaching up to 40 % mortality rate. HVs are known to generate epidemic outbreaks in many parts of the world including Germany, which has seen periodic HV infections over the past decade. HV has a trisegmented genome. The small segment (S) encodes the nucleocapsid protein (NP), the middle segment (M) encodes the glycoproteins (GPs) Gn and Gc which forms up to tetramers and primarily monomers \& dimers upon independent expression respectively and large segment (L) encodes RNA dependent RNA polymerase (RdRp). Interactions between these viral proteins are crucial in providing mechanistic insights into HV virion development. Despite best efforts, there continues to be lack of quantification of these associations in living cells. This is required in developing the mechanistic models for HV viral assembly. This dissertation focuses on three key questions pertaining to the initial steps of virion formation that primarily involves the GPs and NP. The research investigations in this work were completed using Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) approaches. FCS is frequently used in assessing the biophysical features of bio-molecules including protein concentration and diffusion dynamics and circumvents the requirement of protein overexpression. FCS was primarily applied in this thesis to evaluate protein multimerization, at single cell resolution. The first question addressed which GP spike formation model proposed by Hepojoki et al.(2010) appropriately describes the evidence in living cells. A novel in cellulo assay was developed to evaluate the amount of fluorescently labelled and unlabeled GPs upon co-expression. The results clearly showed that Gn and Gc initially formed a heterodimeric Gn:Gc subunit. This sub-unit then multimerizes with congruent Gn:Gc subunits to generate the final GP spike. Based on these interactions, models describing the formation of GP complex (with multiple GP spike subunits) were additionally developed. HV GP assembly primarily takes place in the Golgi apparatus (GA) of infected cells. Interestingly, NWHV GPs are hypothesized to assemble at the plasma membrane (PM). This led to the second research question in this thesis, in which a systematic comparison between OWHV and NWHV GPs was conducted to validate this hypothesis. Surprisingly, GP localization at the PM was congruently observed with OWHV and NWHV GPs. Similar results were also discerned with OWHV and NWHV GP localization in the absence of cytoskeletal factors that regulate HV trafficking in cells. The final question focused on quantifying the NP-GP interactions and understanding their influence of NP and GP multimerization. Gc mutlimers were detected in the presence of NP and complimented by the presence of localized regions of high NP-Gc interactions in the perinuclear region of living cells. Gc-CT domain was shown to influence NP-Gc associations. Gn, on the other hand, formed up to tetrameric complexes, independent from the presence of NP. The results in this dissertation sheds light on the initial steps of HV virion formation by quantifying homo and heterotypic interactions involving NP and GPs, which otherwise are very difficult to perform. Finally, the in cellulo methodologies implemented in this work can be potentially extended to understand other key interactions involved in HV virus assembly. N2 - Hantaviren (HVs) gehören zu einer Gruppe von Zoonosenviren, die den Menschen hauptsächlich über Aerosolübertragung von Nagetierausscheidungen und Urinproben infizieren. HVs werden geografisch unterteilt in: Alte Welt-HVs (OWHVs), die in Europa und Asien vorkommen, und Neue Welt-HVs (NWHVs), die auf dem amerikanischen Kontinent beobachtet werden. Diese verschiedenen Stämme können schwere Krankheiten verursachen, wie hämorrhagisches Fieber mit Nierensyndrom oder schwere Herz-Lungen-Störungen. HVs haben eine hohe Sterblichkeitsrate, wobei NWHV-Infektionen eine Sterblichkeitsrate von bis zu 40 % erreichen. Es ist bekannt, dass HVs in vielen Teilen der Welt epidemische Ausbrüche verursachen können, so auch in Deutschland, wo in den letzten zehn Jahren regelmäßig HV-Infektionen vorkamen. HV besitzt ein trisegmentiertes Genom. Das kleine Segment (S) kodiert das Nukleokapsidprotein (NP), das mittlere Segment (M) kodiert die Glykoproteine (GPs) Gn und Gc, die bei unabhängiger Expression Tetramere und Dimere bilden, und das große Segment (L) kodiert die RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp). Die Wechselwirkungen zwischen diesen viralen Proteinen sind von entscheidender Bedeutung für die Aufklärung der Mechanismen der HV-entwicklung. Trotz aller Bemühungen fehlt es nach wie vor an der Quantifizierung dieser Verbindungen in lebenden Zellen. Dies ist für die Entwicklung komplexer Modelle für den Aufbau von HV erforderlich. Diese Arbeit konzentriert sich auf drei Schlüsselfragen im Zusammenhang mit den ersten Phasen der Virionenbildung, an denen hauptsächlich die GPs und NP beteiligt sind. Die Forschungsaufgaben in dieser Arbeit wurden mit Hilfe der Fluoreszenzkorrelationspektroskopie (FCS) untersucht. Die FCS wird häufig zur Bewertung der biophysikalischen Eigenschaften von Biomolekülen, einschließlich der Proteinkonzentration und Diffusionsdynamik, eingesetzt und macht eine Überexpression von Proteinen überflüssig. In dieser Arbeit wurde FFS in erster Linie eingesetzt, um die Multimerisierung von Proteinen bei Einzelzellauflösung zu untersuchen. Die erste Frage lautete, welches das von Hepojoki et al. (2010) vorgeschlagene Modell der GP-Spike-Bildung den Vorgang in lebenden Zellen adäquat beschreibt. Es wurde ein neuartiger in cellulo-Assay entwickelt, um die Konzentration von fluoreszenzmarkierten und unmarkierten GPs bei der Ko-expression zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass Gn und Gc zunächst eine heterodimere Gn:Gc-Untereinheit bilden. Diese Untereinheit multimerisiert dann mit kongruenten Gn:Gc-Untereinheiten, um den finalen GP-Spike zu erzeugen. Auf der Grundlage dieser Interaktionen wurden zusätzlich Modelle entwickelt, die die Bildung des GP-Komplexes (mit mehreren GP-Spike-Untereinheiten) beschreiben. Die HV-GP-Assemblierung findet hauptsächlich im Golgi-Apparat (GA) von infizierten Zellen statt. Interessanterweise wird angenommen, dass NWHV GPs an der Plasmamembran (PM) assembliert werden. Dies führte zur zweiten Frage dieser Arbeit, bei der ein systematischer Vergleich zwischen OWHV- und NWHV-GP durchgeführt wurde, um diese Hypothese zu bestätigen. Überraschenderweise wurde die GP-Lokalisierung an der PM bei OWHV- und NWHV-GPs gleichermaßen beobachtet. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei der Lokalisierung von OWHV- und NWHV-GP in Abwesenheit von zytoskelettalen Faktoren festgestellt, die die HV-Infektion regulieren. Die letzte Frage dieser Arbeit konzentrierte sich auf die Quantifizierung der NP-GP-Wechselwirkungen und das Verständnis ihres Einflusses auf die Multimerisierung von NP und GPs. Gc-Multimere, die in Gegenwart von NP nachgewiesen wurden, wurden durch das Vorhandensein von perinukleär lokalisierten Regionen mit starken NP-Gc-Wechselwirkungen in lebenden Zellen komplettiert. Es wurde gezeigt, dass die Gc-CT-Domäne die NP-Gc-Assoziationen beeinflusst. Gn hingegen bildete unabhängig von der Anwesenheit von NP tetramerische Komplexe. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben Aufschluss über die ersten Phasen der HV-Assemblierung, indem sie die Homo- und Hetero-Interaktionen zwischen NP und GPs quantifizieren, was sonst nur sehr schwer möglich ist. Schließlich können die in dieser Arbeit implementierten in cellulo-Methoden potenziell erweitert werden, um andere Schlüsselinteraktionen zu verstehen, die an der HV-Assemblierung beteiligt sind. KW - Hantavirus KW - fluorescence microscopy KW - fluorescence correlation spectroscopy KW - protein multimerization KW - virus assembly KW - single cell imaging KW - Hantaviren KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Fluoreszenzkorrelationspektroskopie KW - Virionenbildung KW - Proteinmultimerisierung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-586612 ER - TY - THES A1 - Gätjen, Dominic T1 - A Pichia pastoris surface display system for the efficient screening of high-producing antibody clones N2 - Pichia pastoris (syn. Komagataella phaffi) is a distinguished expression system widely used in industrial production processes. Recent molecular research has focused on numerous approaches to increase recombinant protein yield in P. pastoris. For example, the design of expression vectors and synthetic genetic elements, gene copy number optimization, or co-expression of helper proteins (transcription factors, chaperones, etc.). However, high clonal variability of transformants and low screening throughput have hampered significant success. To enhance screening capacities, display-based methodologies inherit the potential for efficient isolation of producer clones via fluorescence-activated cell sorting (FACS). Therefore, this study focused on developing a novel clone selection method that is based on the non-covalent attachment of Fab fragments on the P. pastoris cell surface to be applicable for FACS. Initially, a P. pastoris display system was developed, which is a prerequisite for the surface capture of secreted Fabs. A Design of Experiments approach was applied to analyze the influence of various genetic elements on antibody fragment display. The combined P. pastoris formaldehyde dehydrogenase promoter (PFLD1), Saccharomyces cerevisiae invertase 2 signal peptide (ScSUC2), - agglutinin (ScSAG1) anchor protein, and the ARS of Kluyveromyces lactis (panARS) conferred highest display levels. Subsequently, eight single-chain variable fragments (scFv) specific for the constant part of the Fab heavy or light chain were individually displayed in P. pastoris. Among the tested scFvs, the anti-human CH1 IgG domain scFv allowed the most efficient Fab capture detected by flow cytometry. Irrespective of the Fab sequence, exogenously added as well as simultaneously secreted Fabs were successfully captured on the cell surface. Furthermore, Fab secretion capacities were shown to correlate to the level of surface-bound Fabs as demonstrated for characterized producer clones. Flow-sorted clones presenting high amounts of Fabs showed an increase in median Fab titers (factor of 21 to 49) compared to unsorted clones when screened in deep-well plates. For selected candidates, improved functional Fab yields of sorted cells vs. unsorted cells were confirmed in an upscaled shake flask production. Since the scFv capture matrix was encoded on an episomal plasmid with inherently unstable autonomously replicating sequences (ARS), efficient plasmid curing was observed after removing the selective pressure. Hence, sorted clones could be immediately used for production without the need to modify the expression host or vector. The resulting switchable display/secretion system provides a streamlined approach for the isolation of Fab producers and subsequent Fab production. KW - Pichia pastoris KW - Antibody Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Riedel, Soraya Lisanne T1 - Development of electrochemical antibody-based and enzymatic assays for mycotoxin analysis in food T1 - Entwicklung elektrochemischer Antikörper- und Enzym-basierter Assays für die Analyse von Mykotoxinen in Lebensmitteln N2 - Electrochemical methods are promising to meet the demand for easy-to-use devices monitoring key parameters in the food industry. Many companies run own lab procedures for mycotoxin analysis, but it is a major goal to simplify the analysis. The enzyme-linked immunosorbent assay using horseradish peroxidase as enzymatic label, together with 3,3',5,5' tetramethylbenzidine (TMB)/H2O2 as substrates allows sensitive mycotoxin detection with optical detection methods. For the miniaturization of the detection step, an electrochemical system for mycotoxin analysis was developed. To this end, the electrochemical detection of TMB was studied by cyclic voltammetry on different screen-printed electrodes (carbon and gold) and at different pH values (pH 1 and pH 4). A stable electrode reaction, which is the basis for the further construction of the electrochemical detection system, could be achieved at pH 1 on gold electrodes. An amperometric detection method for oxidized TMB, using a custom-made flow cell for screen-printed electrodes, was established and applied for a competitive magnetic bead-based immunoassay for the mycotoxin ochratoxin A. A limit of detection of 150 pM (60 ng/L) could be obtained and the results were verified with optical detection. The applicability of the magnetic bead-based immunoassay was tested in spiked beer using a handheld potentiostat connected via Bluetooth to a smartphone for amperometric detection allowing to quantify ochratoxin A down to 1.2 nM (0.5 µg/L). Based on the developed electrochemical detection system for TMB, the applicability of the approach was demonstrated with a magnetic bead-based immunoassay for the ergot alkaloid, ergometrine. Under optimized assay conditions a limit of detection of 3 nM (1 µg/L) was achieved and in spiked rye flour samples ergometrine levels in a range from 25 to 250 µg/kg could be quantified. All results were verified with optical detection. The developed electrochemical detection method for TMB gives great promise for the detection of TMB in many other HRP-based assays. A new sensing approach, based on an enzymatic electrochemical detection system for the mycotoxin fumonisin B1 was established using an Aspergillus niger fumonisin amine oxidase (AnFAO). AnFAO was produced recombinantly in E. coli as maltose-binding protein fusion protein and catalyzes the oxidative deamination of fumonisins, producing hydrogen peroxide. It was found that AnFAO has a high storage and temperature stability. The enzyme was coupled covalently to magnetic particles, and the enzymatically produced H2O2 in the reaction with fumonisin B1 was detected amperometrically in a flow injection system using Prussian blue/carbon electrodes and the custom-made wall-jet flow cell. Fumonisin B1 could be quantified down to 1.5 µM (≈ 1 mg/L). The developed system represents a new approach to detect mycotoxins using enzymes and electrochemical methods. N2 - Zur Entwicklung von einfach zu bedienenden Vor-Ort-Geräten, welche für die Analytik von wichtigen Parametern in der Lebensmittelindustrie eingesetzt werden können, sind elektrochemische Methoden besonders vielversprechend. Viele Unternehmen führen bereits Mykotoxinanalytik in eigenen Laboren am Produktionsstandort durch, dennoch gibt es große Bestrebungen Analysenmethoden weiter zu vereinfachen. Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), welcher häufig mit der Meerrettichperoxidase als enzymatischem Label und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB)/H2O2 als Enzymsubstraten arbeitet, ermöglicht den sensitiven Mykotoxinnachweis mithilfe optischer Detektionsmethoden. Zur Miniaturisierung des Detektionsschrittes wurde in dieser Arbeit der Aufbau von elektrochemischen Detektionssystemen für die Mykotoxinanalytik untersucht. Dazu wurde zunächst die elektrochemische Reaktion von TMB an verschiedenen Materialien siebgedruckter Elektroden (Kohlenstoff und Gold) sowie bei verschiedenen pH-Werten (pH 1 und pH 4) untersucht. Eine stabile Elektrodenreaktion, welche die Grundlage für den weiteren Aufbau des elektrochemischen Detektionssystems darstellt, konnte bei pH 1 an Goldelektroden erzielt werden. Basierend darauf wurde eine amperometrische Detektionsmethode für oxidiertes TMB entwickelt, wofür eine maßgefertigte Durchflusszelle verwendet wurde. Die amperometrische TMB-Detektion wurde für einen kompetitiven Magnetpartikel-basierten Immunoassay für Ochratoxin A eingesetzt. Mit diesem Assay wurde eine Nachweisgrenze von 150 pM (60 ng L-1) erreicht und die Ergebnisse konnten durch optische Detektion verifiziert werden. Die Anwendbarkeit des Assays konnte in Ochratoxin A dotiertem Bier demonstriert werden, wobei für die Detektion ein tragbarer Potentiostat verwendet wurde, welcher über Bluetooth mit einem Smartphone verbunden war. Hiermit konnten niedrige Ochratoxin A Konzentration von bis zu 1.2 nM (0.5 µg L-1) bestimmt werden. Aufbauend auf dem entwickelten elektrochemischen Detektionssystem für TMB wurde die Anwendbarkeit des Ansatzes auf einen Magnetpartikel-basierten Immunoassay für das Ergotalkaloid Ergometrine, evaluiert. Unter optimierten Bedingungen konnte mit dem Assay eine Nachweisgrenze von 3 nM (1 µg L-1) erreicht werden. In mit Ergometrin versetztem Roggenmehl konnten Konzentrationen von 25 bis 250 µg kg-1 nachgewiesen werden. Die entwickelte elektrochemische Nachweismethode für TMB bietet einen vielversprechenden Ansatz für den Einsatz in vielen anderen Meerrettichperoxidase-basierten Assays. Für das Mykotoxin Fumonisin B1, wurde ein neues sensorisches System entwickelt, welches auf einem enzymatischen elektrochemischen Nachweis basiert. Hierfür wurde eine Aspergillus niger Fumonisin Aminoxidase (AnFAO) rekombinant als Fusionsprotein mit dem Maltose-bindenden Protein exprimiert. AnFAO katalysiert die oxidative Deaminierung von Fumonisinen, wobei H2O2 gebildet wird. Es konnte gezeigt werden, dass AnFAO eine hohe Lagerungs- und Temperaturstabilität hat. Für den Nachweis von Fumonisin B1 wurde das Enzym kovalent an Magnetpartikel gekoppelt. Das enzymatisch produzierte H2O2 konnte anschließend amperometrisch mithilfe von Preußisch Blau/Kohlenstoff-Elektroden in der maßgefertigten Durchflusszelle detektiert werden. Fumonisin B1 konnte bis zu einer Konzentration von 1,5 µM (≈ 1 mg L-1) quantifiziert werden. Das entwickelte System stellt einen neuen Ansatz dar, um Mykotoxine unter Nutzung von Enzymen und elektrochemischen Methoden zu detektieren. KW - mycotoxins KW - Mykotoxine KW - immunoassay KW - Immunoassay KW - food analysis KW - Lebensmittelanalytik KW - enzyme KW - Enzym KW - amperometry KW - Amperometrie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-607477 ER - TY - THES A1 - Gramma, Vladislav T1 - Potato FLC-like and SVP-like proteins jointly control growth and distinct developmental processes N2 - Based on worldwide consumption, Solanum tuberosum L. (potato) is the most important non-grain food crop. Potato has two ways of stable propagation: sexually via flowering and vegetatively via tuberization. Remarkably, these two developmental processes are controlled by similar molecular regulators and mechanisms. Given that FLC and SVP genes act as key flowering regulators in the model species Arabidopsis and in various other crop species, this study aimed at identifying FLC and SVP homologs in potato and investigating their roles in the regulation of plant development, with a particular focus on flowering and tuberization. Our analysis demonstrated that there are five FLC-like and three SVP like proteins encoded in the potato genome. The expression profiles of StFLCs and StSVPs throughout potato development and the detected interactions between their proteins indicate tissue specificity of the individual genes and distinct roles of a variety of putative protein complexes. In particular, we discovered that StFLC-D, as well as StFLC-B, StSVP-A, and StSVP-B play a complex role in the regulation of flowering time, as not only increased but also decreased levels of their transcripts promote earlier flowering. Most importantly, StFLC-D has a marked impact on tuberization under non-inductive conditions and susceptibility to temperature-induced tuber malformation, also known as second growth. Plants with decreased levels of StFLC-D demonstrated a strong ability to produce tubers under long days and appeared to be insensitive to temperature-induced second growth. Lastly, our data also suggests that StFLCs and StSVPs may be involved in the nitrogen-dependent regulation of potato development. Taken together, this study highlights the functional importance of StFLC and StSVP genes in the regulation of distinct developmental processes in potato. KW - potato KW - Solanum tuberosum KW - tuberization KW - flowering KW - FLOWERING LOCUS C KW - FLC KW - short vegetative phase KW - SVP KW - tuber second growth Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Parry, Victor T1 - From individual to community level: Assessing swimming movement, dispersal and fitness of zooplankton T1 - Vom Individuum zur Gemeinschaft: Bewertung von Schwimmbewegungen, Ausbreitung und Fitness von Zooplankton N2 - Movement is a mechanism that shapes biodiversity patterns across spatialtemporal scales. Thereby, the movement process affects species interactions, population dynamics and community composition. In this thesis, I disentangled the effects of movement on the biodiversity of zooplankton ranging from the individual to the community level. On the individual movement level, I used video-based analysis to explore the implication of movement behavior on preypredator interactions. My results showed that swimming behavior was of great importance as it determined their survival in the face of predation. The findings also additionally highlighted the relevance of the defense status/morphology of prey, as it not only affected the prey-predator relationship by the defense itself but also by plastic movement behavior. On the community movement level, I used a field mesocosm experiment to explore the role of dispersal (time i.e., from the egg bank into the water body and space i.e., between water bodies) in shaping zooplankton metacommunities. My results revealed that priority effects and taxon-specific dispersal limitation influenced community composition. Additionally, different modes of dispersal also generated distinct community structures. The egg bank and biotic vectors (i.e. mobile links) played significant roles in the colonization of newly available habitat patches. One crucial aspect that influences zooplankton species after arrival in new habitats is the local environmental conditions. By using common garden experiments, I assessed the performance of zooplankton communities in their home vs away environments in a group of ponds embedded within an agricultural landscape. I identified environmental filtering as a driving factor as zooplankton communities from individual ponds developed differently in their home and away environments. On the individual species level, there was no consistent indication of local adaptation. For some species, I found a higher abundance/fitness in their home environment, but for others, the opposite was the case, and some cases were indifferent. Overall, the thesis highlights the links between movement and biodiversity patterns, ranging from the individual active movement to the community level. N2 - Fortbewegung ist ein Mechanismus, der die Biodiversitätsmuster sowohl über räumliche als auch zeitliche Skalen hinweg prägt. Dabei beeinflusst der Bewegungsprozess die Interaktionen zwischen den Arten, die Populationsdynamik und die Zusammensetzung der Gemeinschaften. Diese Arbeit dient dazu die Auswirkungen der Bewegung auf die Biodiversitätsmuster des Zooplanktons sowohl auf der individuellen als auch gemeinschaftlichen Ebene zu untersuchen. Um auf der individuellen Ebene die Auswirkungen des Bewegungsverhaltens auf die Interaktionen zwischen Räuber und Beute zu untersuchen, wurde eine videobasierte Analyse durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Schwimmverhalten von großer Bedeutung ist, da es über das Überleben der Tiere im Angesicht von Räubern entscheidet. Darüber hinaus verdeutlichen die Ergebnisse die Rolle des Verteidigungsstatus bzw. der Morphologie der Beutetiere, da diese nicht nur durch die Verteidigung selbst, sondern auch durch die Plastizität des Bewegungsverhaltens, die Beziehung zwischen Beute und Raubtier beeinflussen. Auf der Ebene der Bewegung von Gemeinschaften habe ich ein Mesokosmen-Feldexperiment durchgeführt, um die Rolle der Ausbreitung (zeitlich, d. h. von den Überdauerungsstadien, welche im Sediment gelagert sind, in Kleingewässer, und räumlich, d. h. zwischen Kleingewässer) bei der Strukturierung von Zooplankton-Metagemeinschaften zu untersuchen. Die Ergebnisse konnten zeigen, dass Prioritätseffekte und taxon-spezifische Ausbreitungslimitierungen die Zusammensetzung der Gemeinschaften beeinflussen. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass die unterschiedlichen Ausbreitungsarten (Windausbreitung und Tierverbreitung). Einfluss auf die Gemeinschaftsstrukturen haben. Zusätzlich spielt das Überdauerungsstadien-Reservoir in Sedimenten“, sowie biotische Ausbreitungsvektoren (d. h. Tiere, engl. mobile links), eine wichtige Rolle bei der Besiedlung neuer Habitate. Die lokalen Umweltbedingungen, die eine ankommende Art in einem Habitat vorfindet, sind ein entscheidender Aspekt, der die Struktur der Zooplanktongemeinschaft beeinflusst. Mit Hilfe eines Laborexperiments, für welches Wasserproben aus Kleingewässern/Söllen genutzt wurden, die von einer Agrarlandschaft umgeben sind, konnte ich die Fitness von Zooplanktongemeinschaften in ihrem Heimathabitat vs. in einem neuen Habitat untersuchen. Hierbei konnte ich zeigen, dass die Umweltfilterung ein entscheidender Faktor für die Gemeinschaftsstrukturierung ist, da sich die Zooplanktongemeinschaften der einzelnen Kleingewässer in ihrer Heimatumgebung anders entwickelten als in einer neuen Umgebung. Auf der Art-Ebene, konnte ich jedoch keine eindeutigen Hinweise auf eine lokale Anpassung finden. Bei einigen Arten konnten allerdings höhere Abundanz/Fitness in ihrer Heimatumgebung festgestellt werden, bei anderen war das Gegenteil der Fall, und in einigen F¨allen gab es keine eindeutigen Unterschiede. Zusammenfassend, unterstreicht diese Arbeit die Zusammenhänge zwischen Bewegungs- und Biodiversitätsmustern, die von der aktiven Bewegung des Einzelnen bis hin zur Gemeinschaftsebene reichen. KW - movement KW - zooplankton KW - dispersal KW - video analysis KW - environment filtering KW - Fortbewegung KW - Ausbreitung KW - Videoanalyse KW - Umweltfilterung KW - Zooplankton Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-597697 ER - TY - THES A1 - Pramanik, Shreya T1 - Protein reconstitution in giant vesicles N2 - Das Leben auf der Erde ist vielfältig und reicht von einzelligen Organismen bis hin zu mehrzelligen Lebewesen wie dem Menschen. Obwohl es Theorien darüber gibt, wie sich diese Organismen entwickelt haben könnten, verstehen wir nur wenig darüber, wie "Leben" aus Molekülen entstanden ist. Die synthetische Bottom-up-Biologie zielt darauf ab, minimale Zellen zu schaffen, indem sie verschiedene Module wie Kompartimentierung, Wachstum, Teilung und zelluläre Kommunikation kombiniert. Alle lebenden Zellen haben eine Membran, die sie von dem sie umgebenden wässrigen Medium trennt und sie schützt. Darüber hinaus haben alle eukaryotischen Zellen Organellen, die von intrazellulären Membranen umschlossen sind. Jede Zellmembran besteht hauptsächlich aus einer Lipiddoppelschicht mit Membranproteinen. Lipide sind amphiphile Moleküle, die molekulare Doppelschichten aus zwei Lipid-Monoschichten oder Blättchen bilden. Die hydrophoben Ketten der Lipide sind einander zugewandt, während ihre hydrophilen Kopfgruppen die Grenzflächen zur wässrigen Umgebung bilden. Riesenvesikel sind Modellmembransysteme, die Kompartimente mit einer Größe von mehreren Mikrometern bilden und von einer einzigen Lipiddoppelschicht umgeben sind. Die Größe der Riesenvesikel ist mit der Größe von Zellen vergleichbar und macht sie zu guten Membranmodellen, die mit einem Lichtmikroskop untersucht werden können. Allerdings fehlen den Riesenvesikelmembranen nach der ersten Präparation Membranproteine, die in weiteren Präparationsschritten in diese Membranen eingebaut werden müssen. Je nach Protein kann es entweder über Ankerlipide an eines der Membranblättchen gebunden oder über seine Transmembrandomänen in die Lipiddoppelschicht eingebaut werden. Diese Arbeit befasst sich mit der Herstellung von Riesenvesikeln und der Rekonstitution von Proteinen in diesen Vesikeln. Außerdem wird ein mikrofluidischer Chip entworfen, der in verschiedenen Experimenten verwendet werden kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit werden anderen Forschern helfen, die Protokolle für die Herstellung von GUVs zu verstehen, Proteine in GUVs zu rekonstituieren und Experimente mit dem mikrofluidischen Chip durchzuführen. Auf diese Weise wird die vorliegende Arbeit für das langfristige Ziel von Nutzen sein, die verschiedenen Module der synthetischen Biologie zu kombinieren, um eine Minimalzelle zu schaffen. N2 - Life on Earth is diverse and ranges from unicellular organisms to multicellular creatures like humans. Although there are theories about how these organisms might have evolved, we understand little about how ‘life’ started from molecules. Bottom-up synthetic biology aims to create minimal cells by combining different modules, such as compartmentalization, growth, division, and cellular communication. All living cells have a membrane that separates them from the surrounding aqueous medium and helps to protect them. In addition, all eukaryotic cells have organelles that are enclosed by intracellular membranes. Each cellular membrane is primarily made of a lipid bilayer with membrane proteins. Lipids are amphiphilic molecules that assemble into molecular bilayers consisting of two leaflets. The hydrophobic chains of the lipids in the two leaflets face each other, and their hydrophilic headgroups face the aqueous surroundings. Giant unilamellar vesicles (GUVs) are model membrane systems that form large compartments with a size of many micrometers and enclosed by a single lipid bilayer. The size of GUVs is comparable to the size of cells, making them good membrane models which can be studied using an optical microscope. However, after the initial preparation, GUV membranes lack membrane proteins which have to be reconstituted into these membranes by subsequent preparation steps. Depending on the protein, it can be either attached via anchor lipids to one of the membrane leaflets or inserted into the lipid bilayer via its transmembrane domains. The first step is to prepare the GUVs and then expose them to an exterior solution with proteins. Various protocols have been developed for the initial preparation of GUVs. For the second step, the GUVs can be exposed to a bulk solution of protein or can be trapped in a microfluidic device and then supplied with the protein solution. To minimize the amount of solution and for more precise measurements, I have designed a microfluidic device that has a main channel, and several dead-end side channels that are perpendicular to the main channel. The GUVs are trapped in the dead-end channels. This design exchanges the solution around the GUVs via diffusion from the main channel, thus shielding the GUVs from the flow within the main channel. This device has a small volume of just 2.5 μL, can be used without a pump and can be combined with a confocal microscope, enabling uninterrupted imaging of the GUVs during the experiments. I used this device for most of the experiments on GUVs that are discussed in this thesis. In the first project of the thesis, a lipid mixture doped with an anchor lipid was used that can bind to a histidine chain (referred to as His-tag(ged) or 6H) via the metal cation Ni2+. This method is widely used for the biofunctionalization of GUVs by attaching proteins without a transmembrane domain. Fluorescently labeled His-tags which are bound to a membrane can be observed in a confocal microscope. Using the same lipid mixture, I prepared the GUVs with different protocols and investigated the membrane composition of the resulting GUVs by evaluating the amount of fluorescently labeled His-tagged molecules bound to their membranes. I used the microfluidic device described above to expose the outer leaflet of the vesicle to a constant concentration of the His-tagged molecules. Two fluorescent molecules with a His-tag were studied and compared: green fluorescent protein (6H-GFP) and fluorescein isothiocyanate (6H-FITC). Although the quantum yield in solution is similar for both molecules, the brightness of the membrane-bound 6H-GFP is higher than the brightness of the membrane-bound 6H-FITC. The observed difference in the brightness reveals that the fluorescence of the 6H-FITC is quenched by the anchor lipid via the Ni2+ ion. Furthermore, my measurements also showed that the fluorescence intensity of the membranebound His-tagged molecules depends on microenvironmental factors such as pH. For both 6H-GFP and 6H-FITC, the interaction with the membrane is quantified by evaluating the equilibrium dissociation constant. The membrane fluorescence is measured as a function of the fluorophores’ molar concentration. Theoretical analysis of these data leads to the equilibrium dissociation constants of (37.5 ± 7.5) nM for 6H-GFP and (18.5 ± 3.7) nM for 6H-FITC. The anchor lipid mentioned previously used the metal cation Ni2+ to mediate the bond between the anchor lipid and the His-tag. The Ni2+ ion can be replaced by other transition metal ions. Studies have shown that Co3+ forms the strongest bonds with the His-tags attached to proteins. In these studies, strong oxidizing agents were used to oxidize the Co2+ mediated complex with the His-tagged protein to a Co3+ mediated complex. This procedure puts the proteins at risk of being oxidized as well. In this thesis, the vesicles were first prepared with anchor lipids without any metal cation. The Co3+ was added to these anchor lipids and finally the His-tagged protein was added to the GUVs to form the Co3+ mediated bond. This system was also established using the microfluidic device. The different preparation procedures of GUVs usually lead to vesicles with a spherical morphology. On the other hand, many cell organelles have a more complex architecture with a non spherical topology. One fascinating example is provided by the endoplasmic reticulum (ER) which is made of a continuous membrane and extends throughout the cell in the form of tubes and sheets. The tubes are connected by three-way junctions and form a tubular network of irregular polygons. The formation and maintenance of these reticular networks requires membrane proteins that hydrolyize guanosine triphosphate (GTP). One of these membrane proteins is atlastin. In this thesis, I reconstituted the atlastin protein in GUV membranes using detergent-assisted reconstitution protocols to insert the proteins directly into lipid bilayers. This thesis focuses on protein reconstitution by binding His-tagged proteins to anchor lipids and by detergent-assisted insertion of proteins with transmembrane domains. It also provides the design of a microfluidic device that can be used in various experiments, one example is the evaluation of the equilibrium dissociation constant for membrane-protein interactions. The results of this thesis will help other researchers to understand the protocols for preparing GUVs, to reconstitute proteins in GUVs, and to perform experiments using the microfluidic device. This knowledge should be beneficial for the long-term goal of combining the different modules of synthetic biology to make a minimal cell. KW - protein reconstitution KW - giant vesicles KW - microfluidics KW - synthetic biology KW - Riesenvesikel KW - Mikrofluidik KW - Proteinrekonstitution KW - synthetische Biologie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-612781 ER - TY - THES A1 - Mendes Ferreira, Clara T1 - Indirect, tri-trophic effects of fear on biodiversity N2 - Predator-forager interactions are a major factor in evolutionary adaptation of many species, as predators need to gain energy by consuming prey species, and foragers needs to avoid the worst fate of mortality while still consuming resources for energetic gains. In this evolutionary arms race, the foragers have constantly evolved anti-predator behaviours (e.g. foraging activity changes). To describe all these complex changes, researchers developed the framework of the landscape of fear, that is, the spatio-temporal variation of perceived predation risk. This concept simplifies all the involved ecological processes into one framework, by integrating animal biology and distribution with habitat characteristics. Researchers can then evaluate the perception of predation risk in prey species, what are the behavioural responses of the prey and, therefore, understand the cascading effects of landscapes of fear at the resource levels (tri-trophic effects). Although tri-trophic effects are well studied at the predator-prey interaction level, little is known on how the forager-resource interactions are part of the overall cascading effects of landscapes of fear, despite the changes of forager feeding behaviour - that occur with perceived predation risk - affecting directly the level of the resources. This thesis aimed to evaluate the cascading effects of the landscape of fear on biodiversity of resources, and how the feeding behaviour and movement of foragers shaped the final resource species composition (potential coexistence mechanisms). We studied the changes caused by landscapes of fear on wild and captive rodent communities and evaluated: the cascading effects of different landscapes of fear on a tri-trophic system (I), the effects of fear on a forager’s movement patterns and dietary preferences (II) and cascading effects of different types of predation risk (terrestrial versus avian, III). In Chapter I, we applied a novel measure to evaluate the cascading effects of fear at the level of resources, by quantifying the diversity of resources left after the foragers gave-up on foraging (diversity at the giving-up density). We tested the measure at different spatial levels (local and regional) and observed that with decreased perceived predation risk, the density and biodiversity of resources also decreased. Foragers left a very dissimilar community of resources based on perceived risk and resources functional traits, and therefore acted as an equalising mechanism. In Chapter II, we wanted to understand further the decision-making processes of rodents in different landscapes of fear, namely, in which resource species rodents decided to forage on (based on three functional traits: size, nutrients and shape) and how they moved depending on perceived predation risk. In safe landscapes, individuals increased their feeding activity and movements and despite the increased costs, they visited more often patches that were further away from their central-place. Despite a preference for the bigger resources regardless of risk, when perceived predation risk was low, individuals changed their preference to fat-rich resources. In Chapter III, we evaluated the cascading effects of two different types of predation risk in rodents: terrestrial (raccoon) versus avian predation risk. Raccoon presence or absence did not alter the rodents feeding behaviour in different landscapes of fear. Rodent’s showed risk avoidance behaviours towards avian predators (spatial risk avoidance), but not towards raccoons (lack of temporal risk avoidance). By analysing the effects of fear in tri-trophic systems, we were able to deepen the knowledge of how non-consumptive effects of predators affect the behaviour of foragers, and quantitatively measure the cascading effects at the level of resources with a novel measure. Foragers are at the core of the ecological processes and responses to the landscape of fear, acting as variable coexistence agents for resource species depending on perceived predation risk. This newly found measures and knowledge can be applied to more trophic chains, and inform researchers on biodiversity patterns originating from landscapes of fear. N2 - Die Wechselwirkungen zwischen Raubtier und Beute sind ein wichtiger Faktor in der Evolution der Tierwelt, da sich die Raubtiere anpassen müssen, um ihre Beute besser jagen zu können und die Beutetiere vermeiden müssen, gefressen zu werden, während sie immer noch genügend Ressourcen für ihre täglichen Bedürfnisse verbrauchen. In diesem ständigen Kampf müssen die Beutetiere ihr Verhalten ständig ändern, da sie die Anwesenheit von Raubtieren fürchten. Die Landschaft der Angst ist ein Rahmen, der alle ökologischen Prozesse beschreibt, die ablaufen, wenn die Tiere das Raubtierrisiko auf unterschiedliche Weise wahrnehmen. In Angstlandschaften reichen die indirekten Auswirkungen der Angst vor einem Raubtier aus, um eine Vielzahl von Reaktionen bei den Beutetieren hervorzurufen und folglich die Art und Weise zu beeinflussen, in der die Beutetiere Naturgutstype fressen (tritrophe Effekte). Während die Interaktionen zwischen Raubtieren und Beutetieren gut erforscht sind, fehlt es an Wissen darüber, wie die Landschaft der Angst die Interaktionen zwischen Beutetieren und Naturgutstype beeinflussen kann (z. B. Pflanzenfresser, die Pflanzen fressen). In dieser Arbeit untersuchten wir die Kaskadeneffekte (d.h. Domino Effekte), die Beutetiere auf Naturgutstype haben, wenn sie verschiedene Prädationsrisiken wahrnehmen. Insbesondere wollten wir untersuchen, wie die Beutetiere entscheiden, was sie fressen und wohin sie sich bewegen, wie sich diese Veränderungen auf die biologische Vielfalt der Ressourcen auswirken können und welche Folgen dies für die Evolution der Ressourcenarten hat. Für alle unsere Studien haben wir Nagetiere als Modellarten verwendet. Wir entwickelten ein neues Maß zur Quantifizierung der Auswirkungen von Angst auf die biologische Vielfalt von Ressourcen und testeten es erfolgreich an wilden Nagetierpopulationen. Wir konnten beobachten, dass die Nagetiere unterschiedliche Samenarten und -mengen fressen, je nachdem, wie sie das Raubtierrisiko einschätzen und abhängig von den Eigenschaften der Samen und der Art der vorhandenen Raubtiere (terrestrische oder aviäre Fleischfresser). Wir konnten diese Veränderungen quantifizieren und Vorhersagen darüber machen, wie sich der Wettbewerb zwischen den Samen um das Wachstum verändern würde (Koexistenzmechanismen). Mit diesem Wissen haben wir den Rahmen der Angstlandschaft um die komplexen Wechselwirkungen zwischen Beute und Ressourcen erweitert und können unsere Erkenntnisse auch dazu nutzen, um zu verstehen, wie weitere Tierarten die biologische Vielfalt anderer Arten verändern, indem wir einfach verstehen, wie ängstlich sie sind. KW - landscape of fear KW - functional traits KW - foraging behaviour KW - biodiversity KW - giving-up density KW - cascading effects KW - Biodiversität KW - Kaskadeneffekte KW - Futtersuchverhalten KW - funktionale Merkmale KW - Landschaft der Angst Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-611020 ER - TY - THES A1 - Bysani Kondagari, Viswanada Reddy T1 - Engineering and evolution of saccharomyces cerevisiae for synthetic formatotrophic growth via the reductive glycine pathway N2 - Increasing demand for food, healthcare, and transportation arising from the growing world population is accompanied by and driving global warming challenges due to the rise of the atmospheric CO2 concentration. Industrialization for human needs has been increasingly releasing CO2 into the atmosphere for the last century or more. In recent years, the possibility of recycling CO2 to stabilize the atmospheric CO2 concentration and combat rising temperatures has gained attention. Thus, using CO2 as the feedstock to address future world demands is the ultimate solution while controlling the rapid climate change. Valorizing CO2 to produce activated and stable one-carbon feedstocks like formate and methanol and further upgrading them to industrial microbial processes to replace unsustainable feedstocks would be crucial for a future biobased circular economy. However, not all microbes can grow on formate as a feedstock, and those microbes that can grow are not well established for industrial processes. S. cerevisiae is one of the industrially well-established microbes, and it is a significant contributor to bioprocess industries. However, it cannot grow on formate as a sole carbon and energy source. Thus, engineering S. cerevisiae to grow on formate could potentially pave the way to sustainable biomass and value-added chemicals production. The Reductive Glycine Pathway (RGP), designed as the aerobic twin of the anaerobic Reductive Acetyl-CoA pathway, is an efficient formate and CO2 assimilation pathway. The RGP comprises of the glycine synthesis module (Mis1p, Gcv1p, Gcv2p, Gcv3p, and Lpd1p), the glycine to serine conversion module (Shmtp), the pyruvate synthesis module (Cha1p), and the energy supply module (Fdh1p). The RGP requires formate and elevated CO2 levels to operate the glycine synthesis module. In this study, I established the RGP in the yeast system using growth-coupled selection strategies to achieve formate and CO2-dependent biomass formation in aerobic conditions. Firstly, I constructed serine biosensor strains by disrupting the native serine and glycine biosynthesis routes in the prototrophic S288c and FL100 yeast strains and insulated serine, glycine, and one-carbon metabolism from the central metabolic network. These strains cannot grow on glucose as the sole carbon source but require the supply of serine or glycine to complement the engineered auxotrophies. Using growth as a readout, I employed these strains as selection hosts to establish the RGP. Initially, to achieve this, I engineered different serine-hydroxymethyltransferases in the genome of serine biosensor strains for efficient glycine to serine conversion. Then, I implemented the glycine synthesis module of the RGP in these strains for the glycine and serine synthesis from formate and CO2. I successfully conducted Adaptive Laboratory Evolution (ALE) using these strains, which yielded a strain capable of glycine and serine biosynthesis from formate and CO2. Significant growth improvements from 0.0041 h-1 to 0.03695 h-1 were observed during ALE. To validate glycine and serine synthesis, I conducted carbon tracing experiments with 13C formate and 13CO2, confirming that more than 90% of glycine and serine biosynthesis in the evolved strains occurs via the RGP. Interestingly, labeling data also revealed that 10-15% of alanine was labelled, indicating pyruvate synthesis from the formate-derived serine using native serine deaminase (Cha1p) activity. Thus, RGP contributes to a small pyruvate pool which is converted to alanine without any selection pressure for pyruvate synthesis from formate. Hence, this data confirms the activity of all three modules of RGP even in the presence of glucose. Further, ALE in glucose limiting conditions did not improve pyruvate flux via the RGP. Growth characterization of these strains showed that the best growth rates were achieved in formate concentrations between 25 mM to 300 mM. Optimum growth required 5% CO2, and dropped when the CO2 concentration was reduced from 5% to 2.5%. Whole-genome sequencing of these evolved strains revealed mutations in genes that encode Gdh1p, Pet9p, and Idh1p. These enzymes might influence intracellular NADPH, ATP, and NADH levels, indicating adjustment to meet the energy demand of the RGP. I reverse-engineered the GDH1 truncation mutation on unevolved serine biosensor strains and reproduced formate dependent growth. To elucidate the effect of the GDH1 mutation on formate assimilation, I reintroduced this mutation in the S288c strain and conducted carbon-tracing experiments to compared formate assimilation between WT and ∆gdh1 mutant strains. Comparatively, enhanced formate assimilation was recorded in the ∆gdh1 mutant strain. Although the 13C carbon tracing experiments confirmed the activity of all three modules of the RGP, the overall pyruvate flux via the RGP might be limited by the supply of reducing power. Hence, in a different approach, I overexpressed the formate dehydrogenase (Fdh1p) for energy supply and serine deaminase (Cha1p) for active pyruvate synthesis in the S288c parental strain and established growth on formate and serine without glucose in the medium. Further reengineering and evolution of this strain with a consistent energy, and formate-derived serine supply for pyruvate synthesis, is essential to achieve complete formatotrophic growth in the yeast system. N2 - Die steigende Nachfrage nach Lebensmitteln, Gesundheitsfürsorge und Transportmitteln durch die stetig wachsende Weltbevölkerung, sorgen für eine dramatisch fortschreitende globale Erwärmung; verursacht durch den massiven weltweiten CO2 Ausstoß. Durch die Industrialisierung wurde im vergangenen Jahrhundert immer mehr CO2 in die Atmosphäre freigesetzt. Recycling von CO2 hat in den letzten Jahren an Aufmerksamkeit gewonnen, um die steigenden Temperaturen zu stabilisieren. CO2 ist somit der ultimative Rohstoff, um den künftigen weltweiten Bedarf zu decken und gleichzeitig den raschen Klimawandel zu kontrollieren. Die Verwendung von CO2 zur Herstellung von aktivierten Ein-Kohlenstoff-Verbindungen wie Formiat und Methanol und die weitere Aufwertung durch mikrobielle Prozesse, wäre für die biobasierte Kreislaufwirtschaft von entscheidender Bedeutung. Allerdings können die allermeisten Mikroorganismen auf den genannten Ein-Kohlenstoffverbindungen- als Ausgangsstoff nicht wachsen und diejenigen, dies es können sind für industrielle Prozesse nicht geeignet. S. cerevisiae gehört zu den industriell etablierten Mikroorganismen und leistet einen wichtigen Beitrag zur Bioprozessindustrie. Sie kann jedoch nicht auf Formiat als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen. Die biotechnologische Anpassung von S. cerevisiae für das Wachstum auf Formiat könnte daher nachhaltige Wege für die Produktion von Biomasse und wertschöpfenden Chemikalien ebnen. Der Reduktive Glycinweg (RGP), der als aerober Zwilling des anaeroben Reduktiven Acetyl-CoA-Wegs konzipiert wurde, ist ein effizienter Formiat- und CO2 Assimilationsweg. Der RGP besteht aus dem Glycin-Synthesemodul (Mis1p, Gcv1p, Gcv2p, Gcv3p und Lpd1p), dem Modul zur Umwandlung von Glycin in Serin (Shmtp), dem Pyruvat-Synthesemodul (Cha1p) und dem Energieversorgungsmodul (Fdh1p). Der RGP benötigt Formiat und erhöhte CO2 Verfügbarkeit, um das Glycin-Synthesemodul zu betreiben. In dieser Studie habe ich das RGP im Hefesystem mit wachstumsgekoppelten Selektionsstrategien etabliert, um ein von Formiat und CO2 abhängiges zelluläres Wachstum unter aeroben Bedingungen zu erreichen. Zunächst habe ich Serin-Biosensor-Stämme konstruiert, indem ich die nativen Serin- und Glycin-Biosynthesewege in den prototrophen Stämmen S288c und FL100 unterbrochen und den Serin-, Glycin- und Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsel vom zentralen Stoffwechselnetz isoliert habe. Diese Stämme können nicht mit Glukose als alleinige Kohlenstoffquelle wachsen, sondern benötigen die Zufuhr von Serin oder Glycin, um die eingeführten Auxotrophien zu ergänzen. Unter Verwendung von zellulärem Wachstum als Indikator, habe ich diese Stämme als Selektionswirte verwendet, um den RGP zu etablieren. Zu diesem Zweck habe ich durch genomische Integration von Serin-Hydroxymethyltransferasen (SHMTs) in diese Biosensorstämme effiziente Module zur Umwandlung von Glycin in Serin geschaffen. Dann implementierte ich das Glycin-Modul des RGP in die Stämme für die Glycin- und Serinsynthese aus Formiat und CO2. Mit diesen Stämmen führte ich erfolgreich eine adaptive Laborevolution (ALE) durch, die einen Stamm hervorbrachte, der zur Glycin- und Serinbiosynthese aus Ameisensäure und CO2 fähig ist. Während der ALE wurden signifikante Wachstumsverbesserungen von 0,0041 h-1 auf 0,03695 h-1 beobachtet. Um die Glycin- und Serinsynthese zu bestätigen, führte ich Experimente zur Kohlenstoffverfolgung mit 13C-Formiat und 13CO2 durch, die bestätigten, dass mehr als 90% der Glycin- und Serinbiosynthese über den RGP erfolgt. Interessanterweise ergaben die Markierungsdaten auch 10-15% markiertes Alanin, was auf eine Pyruvatsynthese aus dem von Formiat abgeleiteten Serin durch die native Serindeaminase (Cha1p) hinweist. Somit trägt der RGP zu einem kleinen Pyruvat-Pool bei, ohne dass ein Selektionsdruck für die Pryuvat Synthese aus Formiat besteht. Diese Daten bestätigen somit die Aktivität aller drei Module von RGP auch in Gegenwart von Glukose. Weitere ALE unter glukoselimitierenden Bedingungen verbesserte den Pyruvatfluss aus dem RGP allerdings nicht. Die Wachstumscharakterisierung der beschriebnen Stämme zeigte, dass die besten Wachstumsraten bei Formiatkonzentrationen zwischen 25 mM und 300 mM erzielt wurden. Für optimales Wachstum wurde 5% CO2 benötigt und die Wachstumsrate verschlechterte sich bei einer CO2 Konzentration von 2.5 %. Die Sequenzierung des gesamten Genoms dieser weiterentwickelten Stämme ergab Mutationen in Genen, die für Gdh1p, Pet9p und Idh1p kodieren. Diese Enzyme beeinflussen den intrazellulären NADPH-, ATP- und NADH-Spiegel, was auf den Energiebedarf für die Aktivität des RGP hinweist. Ich habe die GDH1-Mutation in nicht evolvierte Serin-Biosensor-Stämme eingebracht und damit das von Formiat und CO2 abhängige Wachstum reproduziert. Um die Auswirkung der GDH1-Mutation auf die Formationsassimilation zu klären, habe ich diese Mutation in den WT-Stamm eingeführt und ein Experiment zur Kohlenstoffverfolgung mit 13C-Formiat und Glukose durchgeführt. Es wurde nachgewiesen, dass die gdh1-Mutante im Vergleich zum WT-Stamm eine verbesserte Assimilation aufweist. Obwohl die 13C-Isotopenmarkierung die Aktivität aller drei Module der RGP bestätigte, könnte der Gesamtpyruvatfluss über den RGP durch die Versorgung mit Redox-Äuquivalenten begrenzt sein. In einem anderen Ansatz wurden daher die Formiatdehydrogenase (Fdh1p) für die Energieversorgung und die Serindesaminase (Cha1p) für die aktive Pyruvatsynthese überexprimiert und ein Wachstum mit Formiat und Serin ohne Glukose in der WT-Hefe festgestellt. Die weitere Entwicklung des gesamten Stoffwechsels in Kombination mit Evolutionsstrategien,und einer aus Formiat gewonnenen Serin- und Energiezufuhr für die Pyruvatsynthese ist unerlässlich, um ein vollständiges formatotrophes Wachstum im Hefesystem zu erreichen. KW - synthetic formatotrphy KW - green house gases KW - CHO-THF, CH-THF, CH2-THF, and CH3-THF KW - reductive glycine pathway KW - reductive acetyl-CoA pathway KW - glycine decarboxylase complex (=GCV) KW - glycine cleavage system KW - glycine synthase complex (reversal of GCV) KW - One-carbon KW - 10-Formyltetrahydrofolate KW - 5,10-Methenyltetrahydrofolate KW - 5,10-Methylenetetrahydrofolate KW - 5-Methyltetrahydrofolate KW - serine hydroxymethyltransferase KW - serine biosensor KW - adaptive laboratory evolution KW - next generation sequencing KW - Treibhausgase KW - Rahmenübereinkommen der Vereinten Nationen über Klimaänderungen KW - reduktiver Glycinweg KW - reduktiver Acetyl-CoA-Weg KW - Glycin-Spaltsystem KW - Glycin-Decarboxylase-Komplex (=GCV) KW - Glycin-Synthase-Komplex (Umkehrung von GCV) KW - Ein Kohlenstoff KW - 10-Formyltetrahydrofolat KW - 5,10-Methenyltetrahydrofolat KW - 5-Methyltetrahydrofolat KW - CHO-THF, CH-THF, CH2-THF und CH3-THF KW - 3-Phosphoglycerinsäure KW - Serin-Hydroxymethyltransferase KW - Serin-Biosensor KW - Evolutionsrunde KW - adaptive Laborentwicklung KW - Sequenzierung der nächsten Generation KW - Codierungssequenz KW - autonom replizierende Sequenz Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-582222 ER - TY - THES A1 - Göthel, Markus T1 - Entwicklung eines Verfahrens zur Generierung von spezifischen monoklonalen Antikörpern gegen Mikroorganismen basierend auf in silico Epitopanalysen T1 - A new workflow to generate monoclonal antibodies against microorganisms based on in silico epitope predictions N2 - Monoklonale Antikörper (mAK) sind eines der wichtigsten Biomoleküle für die Umweltanalytik und die medizinische Diagnostik. Für die Detektion von Mikroorganismen bilden sie die Grundlage für ein schnelles und präzises Testverfahren. Bis heute gibt es, aufgrund des hohen zeitlichen und materiellen Aufwandes und der unspezifischen Immunisierungsstrategien, nur wenige mAK, die spezifisch Mikroorganismen erkennen. Zu diesem Zweck sollte ein anwendbares Verfahren für die Generierung von mAK gegen Mikroorganismen entwickelt werden, welches anhand von Escherichia coli O157:H7 und Legionella pneumophila validiert wurde. In dieser Dissertation konnten neue Oberflächenstrukturen auf den Mikroorganismen mittels vergleichender Genomanalysen und in silico Epitopanalysen identifiziert werden. Diese wurden in das Virushüllprotein VP1 integriert und für eine gezielte Immunisierungsstrategie verwendet. Für die Bestimmung antigenspezifischer antikörperproduzierender Hybridome wurde ein Immunfärbeprotokoll entwickelt und etabliert, um die Hybridome im Durchflusszytometer zu sortieren. In der vorliegenden Studie konnten für E. coli O157:H7 insgesamt 53 potenzielle Proteinkandidaten und für L. pneumophila 38 Proteine mithilfe der bioinformatischen Analyse identifiziert werden. Fünf verschiedene potenzielle Epitope wurden für E. coli O157:H7 und drei verschiedenen für L. pneumophila ausgewählt und für die Immunisierung mit chimären VP1 verwendet. Alle Immunseren zeigten eine antigenspezifische Immunantwort. Aus den nachfolgend generierten Hybridomzellen konnten mehrere Antikörperkandidaten gewonnen werden, welche in Charakterisierungsstudien eine starke Bindung zu E. coli O157:H7 bzw. L. pneumophila vorwiesen. Kreuzreaktivitäten zu anderen relevanten Mikroorganismen konnten keine bzw. nur in geringem Maße festgestellt werden. Folglich konnte der hier beschriebene interdisziplinäre Ansatz zur Generierung spezifischer mAK gegen Mikroorganismen nachweislich spezifische mAK hervorbringen und ist als hocheffizienter Arbeitsablauf für die Herstellung von Antikörpern gegen Mikroorganismen einsetzbar. N2 - Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most important biomolecules for environmental analysis and medical diagnostics. For the detection of microorganisms, they form the basis for a rapid and precise test procedure. Until today, due to the substantial time and material effort and the non-specific immunization strategies, there are only a few mAbs that specifically detect microorganisms. Therefore, an easy-to-use methodology for the generation of mAbs against microorganisms was developed and validated using Legionella pneumophila and Escherichia coli O157:H7. In this dissertation, several new surface structures on the microorganisms were identified using comparative genomic analyses and in silico epitope modeling. These were integrated into the VP1 viral envelope protein and used for a specific immunization strategy. For the identification of antigen-specific antibody-producing hybridomas, an immunostaining protocol was developed and established to sort the hybridomas. In the present study, 53 potential protein candidates were identified for E. coli O157:H7 and 38 proteins for L. pneumophila using bioinformatic analysis methods. Five different peptide epitopes were selected for E. coli O157:H7 and three different peptide epitopes for L. pneumophila for immunization using chimeric VP1. All immune sera showed an antigen-specific immune response. Several antibody candidates were obtained from the generated hybridoma cells, which showed strong binding to E. coli O157:H7 and L. pneumophila. Cross-reactivity to other relevant microorganisms could not be detected or could only be observed to a minor extent. Consequently, the interdisciplinary approach to generate specific mAbs against microorganisms has been shown to generate specific mAbs and is applicable as a highly efficient workflow for the generation of antibodies against microorganisms. KW - Antikörper KW - antibody KW - Epitopvorhersage KW - epitop prediction KW - Escherichia coli KW - legionella pneumophila Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-588017 ER - TY - THES A1 - Jiang, Li T1 - Analysis of the role of Heat shock factors and Mediator subunits in heat stress memory in Arabidopsis thaliana N2 - In nature, plants often encounter biotic and abiotic stresses, which can cause reduced crop yield and quality, and threaten the nutrition of a growing human population. As heat stress (HS) is one of the main abiotic stresses, and is projected to increase due to global warming, it is necessary to better understand how plants respond and survive under HS. In Arabidopsis thaliana, plants can survive under severe HS if primed by a non-lethal HS, a process called acquisition of thermotolerance. This primed stated can be maintained for several days, and the ability of plants to maintain the primed state is called maintenance of acquired thermotolerance (mATT) or HS memory. According to current research, two Heat shock factors (HSFs) HSFA2 and HSFA3 are known to account for the majority of mATT capability, and there are other HSFs e.g. HSFA1b and HSFA6b in HSF complexes containing HSFA2 and/or HSFA3, however, the roles of these HSFs in HS memory is not clearly understood. Moreover, the mechanism of these HSFs in regulating HS memory is unclear, whether transcriptional machinery e.g. the Mediator complex contributes to transcriptional memory. This work investigates the role of HSFs and Mediator subunits in HS memory in A. thaliana. For the role of HSFs, the interaction between HSFA1b and HSFA2 during HS memory phase was confirmed by in vivo co- immunoprecipitation (Co-IP). HSFA1b, HSFA2, HSFA3 and HSFA6b targeted HS memory-related genes according to DNA affinity purification sequencing (DAP-seq) data, and targets of HSFA1b were confirmed in vivo by chromatin immunoprecipitation qPCR (ChIP-qPCR). The mutant of hsfa6b showed an HS memory deficiency phenotype in mATT survival assay. These data confirmed the role for HSFA2 and HSFA3 in HS memory, and suggest that HSFA1b and HSFA6b also function in HS memory. The Mediator complex functions as an RNA Polymerase II (RNA Pol II) co-regulator, and includes Head, Middle, Tail and Kinase modules. Both MED23 and MED32 belong to the Tail module, and they have a positive role in HS memory. MED23 interacted with HSFA3, as determined by yeast two hybrid (Y2H) and in vivo Co-IP assays. The med23 mutant showed a decreased HS memory phenotype, reduced expression of Type I (sustained expression) memory genes following HS, and reduced accumulation of the memory-associated Tri-methylation of histone H3 lysine 4 (H3K4me3)histone modification at HS memory-related gene loci after HS. MED23 was recruited to HS-inducible memory and non-memory genes after HS, as determined by ChIP-qPCR. The med32 mutant showed a reduced HS memory phenotype, decreased expression of Type I and Type II (hyper-induction) memory genes, and lower accumulation of H3K4me3 at memory gene lociafter HS. However, MED32 did not show interaction with any tested HSF in Y2H or in vivo Co-IP. MED32 regulated the recruitment of RNA Pol II at HS-inducible genes after HS, but was not itself recruited to HS memory genes after HS. These results provided more evidence that the Mediator subunits MED23 and MED32 regulate HS memory on transcriptional and epigenetic levels. In general, this work provides a better insight into the molecular mechanism of how HSFs and Mediator subunits regulate HS memory in plants and will provide new perspectives to breed crops with improved thermotolerance. N2 - In der Natur sind Pflanzen häufig mit biotischen und abiotischen Stressfaktoren konfrontiert, die zu Ertrags- und Qualitätsmängeln führen können und die Ernährung der wachsenden Weltbevölkerung gefährden. Da Hitzestress (HS) einer der wichtigsten abiotischen Stressfaktoren ist und aufgrund der globalen Erwärmung voraussichtlich noch zunehmen wird, steigt die Notwendigkeit zu verstehen wie Pflanzen auf HS reagieren und überleben. Arabidopsis thaliana können unter schwerem Hitzestress überleben, wenn sie durch einen nicht-tödlichen Hitzestress vorbereitet werden, diesen Prozess bezeichnet man als Erwerb von Thermotoleranz. Die Fähigkeit der Pflanzen, diesen Zustand aufrechtzuerhalten, wird als Aufrechterhaltung der erworbenen Thermotoleranz (mATT) oder HS-Gedächtnis bezeichnet. Nach dem derzeitigen Stand der Forschung sind zwei Hitzeschockfaktoren (HSFs), HSFA2 und HSFA3, für den Großteil der mATT-Fähigkeit verantwortlich. Außerdem gibt es weitere HSFs z.B. HSFA1b und HSFA6b, die ebenfalls im HSF-Komplex neben HSFA2 und/oder HSFA3 enthalten sind. Jedoch ist ihre Rolle im HS-Gedächtnis noch nicht eindeutig geklärt. Darüber hinaus ist der Mechanismus dieser HSFs bei der Regulierung des HS-Gedächtnisses unklar, ob z. B. die Transkriptionsmaschinerie, unter anderem der Mediator-Komplex, zum Transkriptionsgedächtnis beiträgt. In dieser Arbeit wird die Rolle der HSFs und der Mediator-Untereinheiten beim HS-Gedächtnis in A. thaliana untersucht. Bezüglich der Rolle der HSFs, wurde die Interaktion zwischen HSFA1b und HSFA2, während der HS-Gedächtnisphase, durch in vivo Co-Immunopräzipitation (Co-IP) bestätigt. HSFA1b, HSFA2, HSFA3 und HSFA6b binden, laut DNA-Affinitätsreinigungs-Sequenzierung (DAP-seq), zielgerichtet an HS-Gedächtnis-verwandte Gene. Die Ziele von HSFA1b wurden in vivo durch Chromatin-Immunpräzipitation qPCR (ChIP-qPCR) bestätigt. Die hsfa6b-Mutante zeigte im mATT-Überlebenstest einen Phänotypen für HS-Gedächtnisdefizit. Diese Daten bestätigten die Rolle von HSFA2 und HSFA3 im HS-Gedächtnis und legen nahe, dass HSFA1b und HSFA6b ebenfalls eine Funktion im HS-Gedächtnis haben. Der Mediator-Komplex fungiert als Co-Regulator der RNA-Polymerase II (RNA Pol II) und umfasst die Module Head, Middle, Tail und Kinase. Sowohl MED23 als auch MED32 gehören zum Tail-Modul und spielen eine positive Rolle im HS-Gedächtnis. MED23 interagiert mit HSFA3, wie durch Hefe-Zwei-Hybrid- (Y2H) und In-vivo-Co-IP-Assays festgestellt wurde. Die med23-Mutante zeigte einen verminderten HS-Gedächtnisphänotyp, eine verringerte Expression von Gedächtnisgenen des Typ I (anhaltende Expression) nach HS und eine verringerte Akkumulation der gedächtnisassoziierten Histonmodifikation Tri-Methylierung von Histon H3 Lysin 4 (H3K4me3) an HS-Gedächtnis-bezogenen Genorten nach HS. MED23 wurde nach HS an HS-induzierbaren Gedächtnis- und Nicht-Gedächtnis-Genen rekrutiert, wie durch ChIP-qPCR festgestellt wurde. Die med32-Mutante zeigte einen reduzierten HS-Gedächtnisphänotyp, eine verringerte Expression von Typ-I- und Typ-II-Gedächtnisgenen (Hyperinduktion) und eine geringere Anhäufung von H3K4me3 an Gedächtnisgenloci nach HS. MED32 zeigte jedoch keine Interaktion mit einem der getesteten HSFs in Y2H oder in vivo Co-IP. MED32 regulierte die Rekrutierung von RNA Pol II an HS-induzierbaren Genen nach HS, wurde aber selbst nicht an HS-Gedächtnisgenen nach HS rekrutiert. Diese Ergebnisse liefern weitere Beweise dafür, dass die Mediator-Untereinheiten MED23 und MED32 das HS-Gedächtnis auf transkriptioneller und epigenetischer Ebene regulieren. Im Allgemeinen bietet diese Arbeit einen besseren Einblick in den molekularen Mechanismus, wie HSFs und Mediator-Untereinheiten das HS-Gedächtnis in Pflanzen regulieren und wird neue Perspektiven für die Züchtung von Pflanzen mit verbesserter Thermotoleranz eröffnen. KW - Heat stress memory, Heat shock factors, Mediator subunits, MED23, MED32, Arabidopsis thaliana Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Agarwal, Pallavi T1 - Functional characterization of ROS-responsive genes, ANAC085 and ATR7, in Arabidopsis thaliana Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Rasul, Fiaz T1 - Biostimulant SuperFifty based molecular priming to increase plant strength and stress tolerance Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Mariette, Alban T1 - Building a wall: Developing small molecule biosensors to visualize cell wall biosynthesis and untangling mechanismus underlying nucleotide sugar transport Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Kiemel, Katrin T1 - Zooplankton adaptations and community dynamics in space and time N2 - In times of ongoing biodiversity loss, understanding how communities are structured and what mechanisms and local adaptations underlie the patterns we observe in nature is crucial for predicting how future ecological and anthropogenic changes might affect local and regional biodiversity. Aquatic zooplankton are a group of primary consumers that represent a critical link in the food chain, providing nutrients for the entire food web. Thus, understanding the adaptability and structure of zooplankton communities is essential. In this work, the genetic basis for the different temperature adaptations of two seasonally shifted (i.e., temperature-dependent) occurring freshwater rotifers of a formerly cryptic species complex (Brachionus calyciflorus) was investigated to understand the overall genetic diversity and evolutionary scenario for putative adaptations to different temperature regimes. Furthermore, this work aimed to clarify to what extent the different temperature adaptations may represent a niche partitioning process thus enabling co-existence. The findings were then embedded in a metacommunity context to understand how zooplankton communities assemble in a kettle hole metacommunity located in the northeastern German "Uckermark" and which underlying processes contribute to the biodiversity patterns we observe. Using a combined approach of newly generated mitochondrial resources (genomes/cds) and the analysis of a candidate gene (Heat Shock Protein 40kDa) for temperature adaptation, I showed that the global representatives of B. calyciflorus s.s.. are genetically more similar than B. fernandoi (average pairwise nucleotide diversity: 0.079 intraspecific vs. 0.257 interspecific) indicating that both species carry different standing genetic variation. In addition to differential expression in the thermotolerant B. calyciflorus s.s. and thermosensitive B. fernandoi, the HSP 40kDa also showed structural variation with eleven fixed and six positively selected sites, some of which are located in functional areas of the protein. The estimated divergence time of ~ 25-29 Myr combined with the fixed sites and a prevalence of ancestral amino acids in B. calyciflorus s.s. indicate that B. calyciflorus s.s. remained in the ancestral niche, while B. fernandoi partitioned into a new niche. The comparison of mitochondrial and nuclear markers (HPS 40kDa, ITS1, COI) revealed a hybridisation event between the two species. However, as hybridisation between the two species is rare, it can be concluded that the temporally isolated niches (i.e., seasonal-shifted occurrence) they inhabit based on their different temperature preferences most likely represent a pre-zygotic isolation mechanism that allows sympatric occurrence while maintaining species boundaries. To determine the processes underlying zooplankton community assembly, a zooplankton metacommunity comprising 24 kettle holes was sampled over a two-year period. Active (i.e., water samples) and dormant communities (i.e., dormant eggs hatched from sediment) were identified using a two-fragment DNA metabarcoding approach (COI and 18S). Species richness and diversity as well as community composition were analysed considering spatial, temporal and environmental parameters. The analysis revealed that environmental filtering based on parameters such as pH, size and location of the habitat patch (i.e., kettle hole) and surrounding field crops largely determined zooplankton community composition (explained variance: Bray-Curtis dissimilarities: 10.5%; Jaccard dissimilarities: 12.9%), indicating that adaptation to a particular habitat is a key feature of zooplankton species in this system. While the spatial configuration of the kettle holes played a minor role (explained variance: Bray-Curtis dissimilarities: 2.8% and Jaccard dissimilarities: 5.5%), the individual kettle hole sites had a significant influence on the community composition. This suggests monopolisation/priority effects (i.e., dormant communities) of certain species in individual kettle holes. As environmental filtering is the dominating process structuring zooplankton communities, this system could be significantly influenced by future land-use change, pollution and climate change. N2 - In Zeiten des fortschreitenden Verlusts biologischer Vielfalt ist es von entscheidender Bedeutung zu verstehen, wie natürliche Gemeinschaften strukturiert sind und welche Mechanismen und lokalen Anpassungen den beobachteten Biodiversitätsmustern zugrunde liegen, um eine wissenschaftliche Grundlage für die Vorhersage künftiger Veränderungen der lokalen und regionalen biologische Vielfalt zu schaffen. Aquatisches Zooplankton ist eine artenreiche Gruppe Primärkonsumenten, die ein entscheidendes Glied in der Nahrungskette darstellen, indem sie Nährstoffe für das gesamte Nahrungsnetz bereitstellen. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die Anpassungsfähigkeit und Struktur von Zooplanktongemeinschaften zu verstehen. In dieser Arbeit wurden die genetischen Grundlagen für die unterschiedliche Temperaturanpassung zweier saisonal-versetzt (d.h. temperaturabhängig) vorkommender limnischen Rädertierarten eines ehemals kryptischen Artenkomplexes (Brachionus calyciflorus) untersucht, um die genetische Variation und das evolutionäre Divergenz-Szenario sowie Grundlagen für die mutmaßliche Anpassungen an unterschiedliche Temperaturregime zu verstehen. Weiterhin sollte untersucht werden, ob die Temperaturanpassungen als Prozess der Nischenaufteilung verstanden werden können die die Koexistenz der Arten ermöglicht. Diese Ergebnisse wurden dann in einen Metagemeinschaftskontext eingebettet, um zu verstehen, wie sich Zooplanktongemeinschaften in einer Soll-Metagemeinschaft, welche sich in der nordostdeutschen Region "Uckermark" befindet, zusammensetzen und welche zugrundeliegenden Prozesse zu den beobachteten Biodiversitätsmustern führen. Eine Kombination aus neu generierten mitochondrialen Ressourcen (Genome/codierende Sequenzen) und der Analyse eines Kandidatengens (HSP 40kDa Gen) für die Temperaturanpassung ergab zum einen, dass die globalen Vertreter von B. calyciflorus s.s. einander genetisch ähnlicher sind als B. fernandoi (Nukleotiddiversität: 0,079 intraspezifisch vs. 0,257 interspezifisch) und beide Arten somit eine unterschiedliche genetische Variation besitzen. Zum anderen wird das HSP 40kDa wird nicht nur in dem wärmetoleranten B. calyciflorus s.s. und wärmeempfindlichen B. fernandoi unterschiedlich exprimiert, sondern weist auch strukturelle Variationen mit elf fixierten und sechs positiv selektierten Positionen auf, von denen einige in funktionellen Regionen des HSP 40kDa liegen. Die geschätzte Divergenzzeit von ca. 25-29 Millionen Jahren sowie die fixierten Positionen und die Dominanz anzestraler Aminosäuren in B. calyciflorus s.s. legen nahe, dass B. calyciflorus s.s. in der anzestralen Nische verblieb, während B. fernandoi eine neue Nische besetzte. Der Vergleich von mitochondrialen und nukleären Markern (HSP 40kDa, ITS1, COI) ergab ein Hybridisierungsereignis zwischen beiden Arten. Da Hybridisierung jedoch selten ist, können die zeitlich isolierten Nischen (d.h. saisonal-versetztes Auftreten), die sie aufgrund ihrer unterschiedlichen Temperaturpräferenzen bewohnen, als prä-zygotischer Isolationsmechanismus verstanden werden, der ein sympatrisches Vorkommen der Arten unter Aufrechterhaltung der Artgrenzen ermöglicht. Um die Prozesse zu bestimmen, die der Strukturierung von Zooplanktongemeinschaften zugrunde liegen, wurde über einen Zeitraum von zwei Jahren eine Zooplankton-Metagemeinschaft, bestehend aus 24 Söllen beprobt. Aktive (d.h. Wasserproben) und ruhende Gemeinschaften (d.h. aus dem Sediment geschlüpfte Gemeinschaften) wurden mit einem Zwei-Fragment-DNA-Metabarcoding-Ansatz (COI und 18S) bestimmt. Die Artenzahl und Abundanz sowie die Zusammensetzung der Gemeinschaften wurden unter Berücksichtigung räumlicher, zeitlicher und umweltbezogener Parameter analysiert. Die Analyse ergab, dass Umweltfilterung basierend auf Parametern wie pH-Wert, Größe, Lage und Typ des Habitats (d.h. des Solls) und der umgebenden Feldfrüchte die Zusammensetzung der Zooplanktongemeinschaft weitgehend bestimmt (erklärte Varianz: Bray-Curtis-Dissimilaritäten: 10,5%; Jaccard-Dissimilaritäten: 12,9%), was darauf hindeutet, dass die Anpassung an einen bestimmten Lebensraum ein wichtiges Merkmal der Zooplanktonarten in diesem System ist. Während die räumliche Struktur der Sölle eine geringe Rolle spielte (erklärte Varianz: Bray-Curtis-Dissimilaritäten: 2,8% und Jaccard-Dissimilaritäten: 5,5%), hatten die einzelnen Standorte einen erheblichen Einfluss auf die Zusammensetzung der Gemeinschaft. Dies deutet auf Monopolisierung/Prioritätseffekte (d.h. ruhende Gemeinschaften) bestimmter Arten in einzelnen Söllen hin. Da Umweltfilterung der dominierende Prozess für die Strukturierung der Zooplanktongemeinschaften ist, könnte dieses System durch künftige Landnutzungsänderungen, Verschmutzung und Klimawandel erheblich beeinflusst werden. KW - Zooplankton KW - Metacommunity KW - B. calyciflorus species complex KW - adaptation KW - hybridization KW - Metagemeinschaft KW - Anpassung KW - Hybridisierung Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Prüfer, Mareike T1 - Charakterisierung und wechselfeldgestützte Herstellung von Enzym-Nanoarrays T1 - Characterization and AC-electrokinetical production of enzyme nanoarrays N2 - Dielektrophorese ist die Manipulation polarisierbarer Partikel durch inhomogene elektrische Wechselfelder. In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Enzyme durch Dielektrophorese immobilisiert und anschließend hinsichtlich ihrer katalytischen Aktivität untersucht: Meerrettichperoxidase, Cholinoxidase aus Alcaligenes sp. und Glucoseoxidase aus Aspergillus niger. Die Immobilisierung erfolgte durch Dielektrophorese auf nano-Elektrodenarrays aus Wolfram-Zylindern mit 500 nm Durchmesser oder aus Titannitrid-Ringen mit 20 nm Breite. Die Immobilisierung der Enzyme konnte fluoreszenzmikroskopisch entweder anhand der intrinsischen Fluoreszenz oder aufgrund einer Fluoreszenzmarkierung vor oder nach der Immobilisierung für alle getesteten Enzyme nachgewiesen werden. Die Messung der Enzymaktivität erfolgte quantitativ durch den direkten oder indirekten Nachweis des gebildeten Produktes oder, im Falle der Cholinoxidase, durch Beobachtung der intrinsischen Fluoreszenz des Cofaktors FAD, die vom Oxidationszustand dieses Enzyms abhängt. Für die Meerrettichperoxidase konnte so eine hohe erhaltene Enzymaktivität nach der Immobilisierung nachgewiesen werden. Die Aktivität der permanent immobilisierten Fraktion der Meerrettichperoxidase entsprach bis zu 47 % der höchstmöglichen Aktivität einer Monolage dieses Enzyms auf den Elektroden des Chips. Diese Aktivität kann als aktive, aber zufällig gegenüber der Oberfläche ausgerichtete Enzymschicht interpretiert werden. Für die permanent immobilisierte Glucoseoxidase wurde nur eine Aktivität entsprechend <1,3 % der Aktivität einer solchen Enzymschicht detektiert, während für die immobilisierte Cholinoxidase gar keine Aktivität nachgewiesen werden konnte. Die Aktivität der durch DEP immobilisierten Enzyme konnte somit quantitativ bestimmt werden. Der Anteil an erhaltener Aktivität hängt dabei stark vom verwendeten Enzym ab. N2 - Dielectrophoresis is the manipulation of polarizable particles by alternating inhomogeneous electric fields. In this work, three enzymes were immobilized by dielectrophoresis and were analyzed regarding their catalytic activity afterwards: Horseradish peroxidase, choline oxidase from Alcaligenes sp. and glucose oxidase from Aspergillus niger. Immobilization by dielectrophoresis took place on nanoelectrode arrays consisting of tungsten cylinders with a diameter of 500 nm or of titanium nitride rings with a width of 20 nm. Immobilization was verified by fluorescence microscopy using either the intrinsic fluorescence of the enzymes or fluorescent labeling of the enzymes before or after immobilization. Enzyme activity measurements were performed quantitatively by direct or indirect detection of the enzyme’s product or, in the case of choline oxidase, by observing the intrinsic fluorescence of the enzyme’s cofactor FAD which is a function of its oxidation state. For horesradish peroxidase, a rather high retained activity of the enzyme after immobilization was observed. The activity of the permanently immobilized fraction of horseradish peroxidase equaled up to 47 % of the activity which can be maximally expected for a fully active monolayer of the enzyme molecules on all electrodes of the chip. This activity can be interpreted as the result of a fully active, but randomly oriented monolayer of immobilized horseradish peroxidase. The activity of permanently immobilized glucose oxidase equaled only <1,3 % of a fully active monolayer, whereas no activity was evident for immobilized choline oxidase. Accordingly, the activity of enzymes immobilized by DEP was measured quantitatively. The percentage of retained activity thereby strongly depends on the enzyme under investigation. KW - Enzyme KW - Dielektrophorese KW - enzymes KW - dielectrophoresis Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-612329 ER - TY - THES A1 - Petrich, Annett T1 - Quantitative fluorescence microscopy methods to investigate molecular interactions and dynamics in living cells T1 - Quantitative Fluoreszenzmikroskopiemethoden zur Untersuchung molekularer Interaktionen und Dynamik in lebenden Zellen N2 - Biomolecules such as proteins and lipids have vital roles in numerous cellular functions, including biomolecule transport, protein functions, cellular homeostasis and biomembrane integrity. Traditional biochemistry methods do not provide precise information about cellular biomolecule distribution and behavior under native environmental conditions since they are not transferable to live cell samples. Consequently, this can lead to inaccuracies in quantifying biomolecule interactions due to potential complexities arising from the heterogeneity of native biomembranes. To overcome these limitations, minimal invasive microscopic techniques, such as fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) in combination with fluorescence proteins (FPs) and fluorescence lipid analogs, have been developed. FFS techniques and membrane property sensors enable the quantification of various parameters, including concentration, dynamics, oligomerization, and interaction of biomolecules in live cell samples. In this work, several FFS approaches and membrane property sensors were implemented and employed to examine biological processes of diverse context. Multi-color scanning fluorescence fluctuation spectroscopy (sFCS) was used the examine protein oligomerization, protein-protein interactions (PPIs) and protein dynamics at the cellular plasma membrane (PM). Additionally, two-color number and brightness (N&B) analysis was extended with the cross-correlation analysis in order to quantify hetero-interactions of proteins in the PM with very slow motion, which would not accessible with sFCS due strong initial photobleaching. Furthermore, two semi-automatic analysis pipelines were designed: spectral Förster resonance energy transfer (FRET) analysis to study changes in membrane charge at the inner leaflet of the PM, and spectral generalized polarization (GP) imaging and spectral phasor analysis to monitor changes in membrane fluidity and order. An important parameter for studying PPIs is molecular brightness, which directly determines oligomerization and can be extracted from FFS data. However, FPs often display complex photophysical transitions, including dark states. Therefore, it is crucial to characterize FPs for their dark-states to ensure reliable oligomerization measurements. In this study, N&B and sFCS analysis were applied to determine photophysical properties of novel green FPs under different conditions (i.e., excitation power and pH) in living cells. The results showed that the new FPs, mGreenLantern (mGL) and Gamillus, exhibited the highest molecular brightness at the cost of lower photostability. The well-established monomeric enhanced green fluorescent protein (mEGFP) remained the best option to investigate PPIs at lower pH, while mGL was best suited for neutral pH, and Gamillus for high pH. These findings provide guidance for selecting an appropriate FP to quantify PPIs via FFS under different environmental conditions. Next, several biophysical fluorescence microscopy approaches (i.e., sFCS, GP imaging, membrane charge FRET) were employed to monitor changes in lipid-lipid-packing in biomembranes in different biological context. Lipid metabolism in cancer cells is known to support rapid proliferation and metastasis. Therefore, targeting lipid synthesis or membrane integrity holds immense promise as an anticancer strategy. However, the mechanism of action of the novel agent erufosine (EPC3) on membrane stability is not fully under stood. The present work revealed that EPC3 reduces lipid packing and composition as well as increased membrane fluidity and dynamic, hence, modifies lipid-lipid-interaction. These effects on membrane integrity were likely triggered by modulations in lipid metabolism and membrane organization. In the case of influenza A virus (IAV) infection, regulation of lipid metabolism is crucial for multiple steps in IAV replication and is related to the pathogenicity of IAV. Here, it is shown for the first time that IAV infection triggers a local enrichment of negatively charged lipids at the inner leaflet of the PM, which decreases membrane fluidity and dynamic, as well as increases lipid packing at the assembly site in living cells. This suggests that IAV alters lipid-lipid interactions and organization at the PM. Overall, this work highlights the potential of biophysical techniques as a screening platform for studying membrane properties in living cells at the single-cell level. Finally, this study addressed remaining questions about the early stage of IAV assembly. The recruitment of matrix protein 1 (M1) and its interaction with other viral surface proteins, hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), and matrix protein 2 (M2), has been a subject of debate due to conflicting results. In this study, different FFS approaches were performed in transfected cells to investigate interactions between IAV proteins themselves and host factors at the PM. FFS measurements revealed that M2 interacts strongly with M1, leading to the translocation of M1 to the PM. This interaction likely took place along the non-canonical pathway, as evidenced by the detection of an interaction between M2 and the host factor LC3-II, leading to the recruitment of LC3-II to the PM. Moreover, weaker interaction was observed between HA and membrane-bound M1, and no interaction between NA and M1. Interestingly, higher oligomeric states of M1 were only detectable in infected cells. These results indicate that M2 initiates virion assembly by recruiting M1 to the PM, which may serve as a platform for further interactions with viral proteins and host factors. N2 - Biomoleküle wie Proteine und Lipide spielen eine wichtige Rolle bei zahlreichen Zellfunktionen, darunter Biomolekültransport, Proteinfunktionen, zelluläre Homöostase und Biomembranintegrität. Traditionelle biochemische Methoden liefern keine Informationen über die Verteilung und das Verhalten zellulärer Biomolekülen unter natürlichen Bedingungen, da sie nicht auf lebende Zellproben übertragbar sind. Folglich kann dies zu Ungenauigkeiten bei der Quantifizierung von Biomolekülinteraktionen führen und potenzielle Komplexitäten der Heterogenität nativer Biomembranen übersehen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden minimalinvasive mikroskopische Techniken wie die Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie (FFS) in Kombination mit Fluoreszenzproteinen (FPs) und Fluoreszenzlipidanaloga entwickelt. FFS-Techniken und Membraneigenschaftssensoren ermöglichen die Quantifizierung verschiedener Parameter, einschließlich Konzentration, Dynamik, Oligomerisierung und Wechselwirkung von Biomolekülen in lebenden Zellproben. In dieser Arbeit wurden mehrere FFS-Ansätze und Sensoren für Membraneigenschaften implementiert und eingesetzt, um biologische Prozesse in verschiedenen Zusammenhängen zu untersuchen. Die Mehrfarben-Scanning-Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie (sFCS) wurde zur Untersuchung von Protein-Oligomerisierung, Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) und Proteindynamik an der zellulären Plasmamembran (PM) eingesetzt. Zusätzlich wurde die Zweifarben-Analyse von Anzahl und Helligkeit (N&B) mit der Kreuzkorrelationsanalyse erweitert, um Hetero-Interaktionen von Proteinen in der PM mit sehr langsamer Dynamik zu quantifizieren, die mit sFCS aufgrund starker anfänglicher Bleiche der Fluorophore nicht zugänglich wären. Darüber hinaus wurden zwei halbautomatische Analysepipelines entwickelt: die spektrale Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Analyse zur Untersuchung von Änderungen der Membranladung auf der Innenseite der PM und die spektrale generalisierte Polarisation (GP)-Bildgebung sowie die spektrale Phasor-Analyse zur Überwachung von Änderungen der Membranfluidität und -ordnung. Ein wichtiger Parameter zur Untersuchung von PPIs ist die molekulare Helligkeit, die die Oligomerisierung direkt bestimmt und aus FFS daten extrahiert werden kann. Allerdings weisen FPs häufig komplexe photophysikalische Übergänge auf, einschließlich nichtfluoreszierender Zustände. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, FPs hinsichtlich ihrer dunklen Zustände zu charakterisieren, um zuverlässige Oligomerisierungsmessungen sicherzustellen. In dieser Studie wurden N&B- und sFCS-Analysen angewendet, um die photophysikalischen Eigenschaften neuartiger grüner FPs unter verschiedenen Bedingungen (d. h. Anregungsleistung und pH-Wert) in lebenden Zellen zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten, dass die neuen FPs mGreenLantern (mGL) und Gamillus die höchste molekulare Helligkeit aufwiesen, allerdings auf Kosten einer geringeren Photostabilität. Das etablierte mEGFP blieb die beste Option, um PPIs bei niedrigerem pH-Wert zu untersuchen, während mGL am besten für neutralen pH-Wert und Gamillus für hohen pH-Wert geeignet war. Diese Ergebnisse bieten Orientierung für die Auswahl eines geeigneten FP zur Quantifizierung von PPIs über FFS unter verschiedenen Umgebungsbedingungen. Als nächstes wurden mehrere biophysikalische Fluoreszenzmikroskopie-Ansätze (z. B. sFCS, GP-Bildgebung, Membranladung-FRET) eingesetzt, um Veränderungen in der Lipid-Lipid-Packung in Biomembranen in verschiedenen biologischen Kontexten zu überwachen. Es ist bekannt, dass der Lipidstoffwechsel in Krebszellen die schnelle Vermehrung und Metastasierung fördert. Daher ist die gezielte Beeinflussung der Lipidsynthese oder der Membranintegrität eine vielversprechende Strategie zur Krebsbekämpfung. Der Wirkungsmechanismus des neuartigen Wirkstoffs Erufosin (EPC3) auf die Membranstabilität ist nicht vollständig geklärt. Die vorliegende Arbeit ergab, dass EPC3 die Lipidpackung und -zusammensetzung reduziert sowie die Fluidität und Dynamik der Membran erhöht und somit die Lipid-Lipid-Wechselwirkung verändert. Diese Auswirkungen auf die Membranintegrität wurden wahrscheinlich durch Modulationen des Lipidstoffwechsels und der Membranorganisation ausgelöst. Im Falle einer Infektion mit dem Influenza-A-Virus (IAV) ist die Regulierung des Lipidstoffwechsels für mehrere Schritte der IAV-Replikation von entscheidender Bedeutung und hängt mit der Pathogenität von IAV zusammen. Hier wird zum ersten Mal gezeigt, dass eine IAV-Infektion eine lokale Anreicherung negativ geladener Lipide an der Innenseite der PM auslöst, die Fluidität und Dynamik der Membran verringert und die Lipidpackung an der Assemblierungsstelle in lebenden Zellen erhöht. Dies legt nahe, dass IAV die Lipid-Lipid-Wechselwirkungen und die Organisation am PM verändert. Insgesamt unterstreicht diese Arbeit das Potenzial biophysikalischer Techniken als Screening-Plattform zur Untersuchung von Membraneigenschaften in lebenden Zellen auf Einzelzellebene. Abschließend ging diese Studie auf verbleibende Fragen zur frühen Phase der IAV-Assemblierung ein. Die Rekrutierung von Matrixprotein 1 (M1) und seine Wechselwirkung mit anderen viralen Oberflächenproteinen, Hämagglutinin (HA), Neuraminidase (NA) und Matrixprotein 2 (M2), war aufgrund widersprüchlicher Ergebnisse Gegenstand von Debatten. In dieser Studie wurden verschiedene FFS-Ansätze in transfizierten Zellen durchgeführt, um Wechselwirkungen zwischen IAV-Proteinen untereinander und Wirtsfaktoren an der PM zu untersuchen. FFS-Messungen ergaben, dass M2 stark mit M1 interagiert, was zur Translokation von M1 zur PM führt. Diese Interaktion fand wahrscheinlich entlang des nichtkanonischen Weges statt, was durch den Nachweis einer Interaktion zwischen M2 und dem Wirtsfaktor LC3-II belegt wurde, die zur Rekrutierung von LC3-II zur PM führte. Darüber hinaus wurde eine schwächere Wechselwirkung zwischen HA und membrangebundenem M1 beobachtet und keine Wechselwirkung zwischen NA und M1. Interessanterweise waren höhere oligomere Zustände von M1 nur in infizierten Zellen nachweisbar. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass M2 den Zusammenbau von Virionen initiiert, indem es M1 zur PM rekrutiert, welches als Plattform für weitere Interaktionen mit viralen Proteinen und Wirtsfaktoren dienen könnte. KW - influenza A virus KW - virus-host interaction KW - cancer KW - biomolecule interactions KW - membrane fluidity KW - fluorescence fluctuation spectroscopy KW - fluorescent proteins KW - biosensors KW - Biomolekülinteraktionen KW - Biosensoren KW - Krebs KW - Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie KW - fluoreszierende Proteine KW - Influenza A Virus KW - Membranfluidität KW - Virus-Wirt-Interaktion Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-611800 ER - TY - THES A1 - Stanke, Sandra T1 - AC electrokinetic immobilization of influenza viruses and antibodies on nanoelectrode arrays for on-chip immunoassays T1 - AC elektrokinetische Immobilisierung von Influenzaviren und Antikörpern auf Nanoelektrodenarrays für on-Chip Immunoassays N2 - In the present thesis, AC electrokinetic forces, like dielectrophoresis and AC electroosmosis, were demonstrated as a simple and fast method to functionalize the surface of nanoelectrodes with submicrometer sized biological objects. These nanoelectrodes have a cylindrical shape with a diameter of 500 nm arranged in an array of 6256 electrodes. Due to its medical relevance influenza virus as well as anti-influenza antibodies were chosen as a model organism. Common methods to bring antibodies or proteins to biosensor surfaces are complex and time-consuming. In the present work, it was demonstrated that by applying AC electric fields influenza viruses and antibodies can be immobilized onto the nanoelectrodes within seconds without any prior chemical modification of neither the surface nor the immobilized biological object. The distribution of these immobilized objects is not uniform over the entire array, it exhibits a decreasing gradient from the outer row to the inner ones. Different causes for this gradient have been discussed, such as the vortex-shaped fluid motion above the nanoelectrodes generated by, among others, electrothermal fluid flow. It was demonstrated that parts of the accumulated material are permanently immobilized to the electrodes. This is a unique characteristic of the presented system since in the literature the AC electrokinetic immobilization is almost entirely presented as a method just for temporary immobilization. The spatial distribution of the immobilized viral material or the anti-influenza antibodies at the electrodes was observed by either the combination of fluorescence microscopy and deconvolution or by super-resolution microscopy (STED). On-chip immunoassays were performed to examine the suitability of the functionalized electrodes as a potential affinity-based biosensor. Two approaches were pursued: A) the influenza virus as the bio-receptor or B) the influenza virus as the analyte. Different sources of error were eliminated by ELISA and passivation experiments. Hence, the activity of the immobilized object was inspected by incubation with the analyte. This resulted in the successful detection of anti-influenza antibodies by the immobilized viral material. On the other hand, a detection of influenza virus particles by the immobilized anti-influenza antibodies was not possible. The latter might be due to lost activity or wrong orientation of the antibodies. Thus, further examinations on the activity of by AC electric fields immobilized antibodies should follow. When combined with microfluidics and an electrical read-out system, the functionalized chips possess the potential to serve as a rapid, portable, and cost-effective point-of-care (POC) device. This device can be utilized as a basis for diverse applications in diagnosing and treating influenza, as well as various other pathogens. N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden AC elektrokinetische Kräfte, wie die Dielektrophorese und die AC Elektroosmose, als einfache und schnelle Methode zur Funktionalisierung der Oberfläche von Nanoelektroden mit biologischen Objekten in Submikrometergröße demonstriert. Diese Nanoelektroden haben eine zylindrische Form mit einem Durchmesser von 500 nm und sind in einem Array aus 6256 Elektroden angeordnet. Aufgrund ihrer medizinischen Relevanz wurden Influenzaviren sowie anti-Influenza Antikörper als Modellorganismus ausgewählt. Gängige Methoden, um Antikörper oder Proteine auf Biosensoroberflächen zu bringen, sind komplex und zeitaufwändig. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass durch die Anwendung elektrischer Wechselfelder Influenzaviren und Antikörper innerhalb von Sekunden auf den Nanoelektroden immobilisiert werden können, ohne dass zuvor eine chemische Modifikation der Oberfläche noch des immobilisierten biologischen Objekts erforderlich ist. Die Verteilung dieser immobilisierten Objekte ist über das gesamte Array ungleichmäßig. Es kommt zur Ausbildung eines Gradienten, welcher von der äußeren zur den inneren Reihen hin abnimmt. Verschiedene Ursachen für diesen Gradienten wurden diskutiert, beispielsweise der Vortex-förmige Flüssigkeitsstrom über den Nanoelektroden, der unter anderem durch elektrothermische Flüssigkeitsbewegung erzeugt wird. Es wurde gezeigt, dass Teile des akkumulierten Materials dauerhaft an den Elektroden immobilisiert sind. Dies ist ein Alleinstellungsmerkmal des vorgestellten Systems, da in der Literatur die AC elektrokinetische Immobilisierung fast ausschließlich als Methode nur zur temporären Immobilisierung dargestellt wird. Die räumliche Verteilung des immobilisierten Virusmaterials bzw. der anti-Influenza Antikörper an den Elektroden wurde entweder durch die Kombination aus Fluoreszenzmikroskopie und Dekonvolution oder durch super-resolution Mikroskopie (STED) betrachtet. Es wurden On-Chip-Immunoassays durchgeführt, um die Eignung der funktionalisierten Elektroden für einen potenziellen affinitätsbasierten Biosensor zu untersuchen. Dabei wurden zwei Ansätze verfolgt: A) Influenzaviren als Biorezeptor oder B) Influenzavirus als Analyt. Verschiedene Fehlerquellen wurden mittels ELISA und Passivierungsexperimente eliminiert. Infolgedessen wurde die Aktivität der immobilisierten Objekte durch Inkubation mit dem Analyten überprüft. Dies führte zum erfolgreichen Nachweis von anti-Influenza Antikörpern mittels immobilisiertem Virusmaterial. Andererseits war ein Nachweis von Influenzaviruspartikeln durch die immobilisierten anti-Influenza Antikörper nicht möglich. Letzteres könnte auf einen Aktivitätsverlust oder eine falsche Ausrichtung der Antikörper zurückzuführen sein. Daher sollten weitere Untersuchungen zur Aktivität von durch elektrische Wechselfelder immobilisierte Antikörper folgen. In Kombination mit Mikrofluidik und einem elektrischen Auslesesystem besitzen die funktionalisierten Chips das Potenzial, als schnelle, tragbare und kostengünstige Point-of-Care-Einheit (POC) zu dienen. Dieses Einheit kann als Grundlage für vielfältige Anwendungen bei der Diagnose und Behandlung von Influenza und verschiedenen anderen Krankheitserregern genutzt werden. KW - AC electrokinetics KW - AC Elektrokinetik KW - AC electroosmosis KW - AC Elektroosmosis KW - dielectrophoresis KW - Dielektrophorese KW - virus KW - Virus KW - influenza KW - Influenza KW - antibody KW - Antikörper KW - nanoelectrodes KW - Nanoelektroden KW - lab-on-chip KW - lab-on-chip KW - LOC KW - LOC KW - point-of-care KW - point-of-care KW - POC KW - POC KW - immunoassay KW - Immunoassay Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-617165 ER - TY - THES A1 - Leins, Johannes A. T1 - Combining model detail with large scales T1 - Die Verbindung von Modelldetails und großen Skalen BT - a simulation framework for population viability analyses in changing and disturbed environments BT - ein Simulationswerkzeug zur Analyse der Überlebensfähigkeit von Populationen in einer sich verändernden und gestörten Umwelt N2 - The global climate crisis is significantly contributing to changing ecosystems, loss of biodiversity and is putting numerous species on the verge of extinction. In principle, many species are able to adapt to changing conditions or shift their habitats to more suitable regions. However, change is progressing faster than some species can adjust, or potential adaptation is blocked and disrupted by direct and indirect human action. Unsustainable anthropogenic land use in particular is one of the driving factors, besides global heating, for these ecologically critical developments. Precisely because land use is anthropogenic, it is also a factor that could be quickly and immediately corrected by human action. In this thesis, I therefore assess the impact of three climate change scenarios of increasing intensity in combination with differently scheduled mowing regimes on the long-term development and dispersal success of insects in Northwest German grasslands. The large marsh grasshopper (LMG, Stethophyma grossum, Linné 1758) is used as a species of reference for the analyses. It inhabits wet meadows and marshes and has a limited, yet fairly good ability to disperse. Mowing and climate conditions affect the development and mortality of the LMG differently depending on its life stage. The specifically developed simulation model HiLEG (High-resolution Large Environmental Gradient) serves as a tool for investigating and projecting viability and dispersal success under different climate conditions and land use scenarios. It is a spatially explicit, stage- and cohort-based model that can be individually configured to represent the life cycle and characteristics of terrestrial insect species, as well as high-resolution environmental data and the occurrence of external disturbances. HiLEG is a freely available and adjustable software that can be used to support conservation planning in cultivated grasslands. In the three case studies of this thesis, I explore various aspects related to the structure of simulation models per se, their importance in conservation planning in general, and insights regarding the LMG in particular. It became apparent that the detailed resolution of model processes and components is crucial to project the long-term effect of spatially and temporally confined events. Taking into account conservation measures at the regional level has further proven relevant, especially in light of the climate crisis. I found that the LMG is benefiting from global warming in principle, but continues to be constrained by harmful mowing regimes. Land use measures could, however, be adapted in such a way that they allow the expansion and establishment of the LMG without overly affecting agricultural yields. Overall, simulation models like HiLEG can make an important contribution and add value to conservation planning and policy-making. Properly used, simulation results shed light on aspects that might be overlooked by subjective judgment and the experience of individual stakeholders. Even though it is in the nature of models that they are subject to limitations and only represent fragments of reality, this should not keep stakeholders from using them, as long as these limitations are clearly communicated. Similar to HiLEG, models could further be designed in such a way that not only the parameterization can be adjusted as required, but also the implementation itself can be improved and changed as desired. This openness and flexibility should become more widespread in the development of simulation models. N2 - Die globale Klimakrise trägt maßgeblich dazu bei, dass sich Ökosysteme verändern, die Artenvielfalt sinkt und zahlreiche Spezies vom Aussterben bedroht sind. Viele Arten sind prinzipiell in der Lage, sich wandelnden Bedingungen anzugleichen oder ihre Habitate in geeignetere Regionen zu verlagern. Allerdings schreitet der Wandel schneller voran als sich einige Spezies anpassen können oder die mögliche Anpassung wird durch direkte und indirekte menschliche Eingriffe blockiert und gestört. Gerade die nicht-nachhaltige Landnutzung durch den Menschen ist neben der Klimaerhitzung einer der treibenden Faktoren für diese ökologisch kritischen Entwicklungen. Gleichzeitig ist sie durch ihre unmittelbare menschliche Ursache ein Faktor, der sich kurzfristig und schnell korrigieren ließe. Zu diesem Zweck untersuche ich in dieser Dissertation, wie sich drei Klimawandelszenarien ansteigender Intensität im Zusammenspiel mit unterschiedlich terminierten Mahdregimen im Nordwestdeutschen Grünland auf die langfristige Entwicklung und Ausbreitung von Insekten auswirken. In der Untersuchung fungiert die Sumpfschrecke (Stethophyma grossum, Linné 1758) als Bezugsspezies. Sie ist in Feucht- und Nasswiesen zu Hause und zu räumlicher Ausbreitung fähig, auch wenn sie nur eingeschränkt mobil ist. Mahd und Klimabedingungen wirken sich je nach Lebensstadium unterschiedlich stark auf die Entwicklung und Mortalität der Sumpfschrecke aus. Das eigens entwickelte Simulationsmodell HiLEG (High-resolution Large Environmental Gradient) dient als Werkzeug zur Untersuchung und Projektion der Überlebens- und Ausbreitungswahrscheinlichkeit unter verschiedenen Klima- und Landnutzungsszenarien. Es ist ein räumlich explizites, stadien- und kohortenbasiertes Modell, das individuell konfiguriert werden kann, um den Lebenszyklus und die Charakteristiken terrestrischer Insektenarten sowie hochaufgelöste Umweltdaten und das zeitlich variierende Auftreten externer Störfaktoren abzubilden. HiLEG ist eine frei verfügbare Software und kann zur Unterstützung bei der Planung von Umweltschutzmaßnahmen in kultiviertem Grünland verwendet werden. In den drei Fallstudien dieser Arbeit habe ich verschiedene Aspekte in Bezug auf die Struktur von Simulationsmodellen an sich, deren Bedeutung im Naturschutz im Allgemeinen und Erkenntnisse für die Sumpfschrecke im Speziellen untersucht. Es zeigte sich, dass die detaillierte Auflösung der Modellprozesse und -komponenten entscheidend ist, um den langfristigen Effekt räumlich und zeitlich begrenzter Ereignisse projizieren zu können. Insbesondere in Anbetracht der Klimakrise hat sich die gesteigerte Relevanz von Naturschutzmaßnahmen auf regionaler Ebene herausgestellt. Ich konnte außerdem bestätigen, dass die Sumpfschrecke zwar im Prinzip von der Klimaerwärmung profitiert, aber weiterhin durch ungeeignete Mahdregime beschränkt wird. Bewirtschaftungspläne könnten allerdings in dem Sinne angepasst werden, dass sie die Ausbreitung und Etablierung der Sumpfschrecke erlauben, ohne sich über die Maßen auf den Ertrag der Landwirtschaft auszuwirken. Insgesamt können Simulationsmodelle wie HiLEG einen wichtigen Beitrag und Mehrwert für die Planung von Naturschutzmaßnahmen und Politikinstrument leisten. Richtig eingesetzt beleuchten die Simulationsergebnisse Aspekte, die durch subjektive Bewertung und Erfahrung einzelner Akteure möglicherweise übersehen würden. Auch wenn es in der Natur von Modellen liegt, dass sie Einschränkungen unterworfen sind und nur Ausschnitte der Realität abbilden, sollte dies kein Hindernis für ihren Einsatz sein, solange diese Limitierungen klar kommuniziert werden. Analog zu HiLEG könnten Modelle so konzipiert werden, dass nicht nur ihre Parametrisierung nach Bedarf angepasst, sondern auch die Implementierung selbst beliebig verbessert und verändert werden kann. Diese Offenheit und Flexibilität sollte sich bei der Entwicklung von Simulationsmodelle stärker durchsetzen. KW - spatially explicit model KW - large marsh grasshopper KW - simulation framework KW - climate change KW - land use KW - Open Source KW - Open Access KW - dispersal KW - PVA (population viability analysis) KW - high resolution KW - scaling KW - grassland KW - disturbance timing KW - Klimawandel KW - Ausbreitung KW - Zeitpunkt von Störungen KW - Grünland KW - hohe Auflösung KW - Landnutzung KW - Sumpfschrecke KW - Open Access KW - Open Source KW - Populationsgefährdungsanalyse KW - Skalierung KW - Simulationsframework KW - räumlich explizites Modell KW - Stethophyma grossum Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-582837 ER - TY - THES A1 - Stübler, Sabine T1 - Mathematical model of the mucosal immune response to study inflammatory bowel diseases and their treatments T1 - Mathematisches Modell der mukosalen Immunantwort zur Analyse von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen und deren Behandlung N2 - Inflammatory bowel diseases (IBD), characterised by a chronic inflammation of the gut wall, develop as consequence of an overreacting immune response to commensal bacteria, caused by a combination of genetic and environmental conditions. Large inter-individual differences in the outcome of currently available therapies complicate the decision for the best option for an individual patient. Predicting the prospects of therapeutic success for an individual patient is currently only possible to a limited extent; for this, a better understanding of possible differences between responders and non-responders is needed. In this thesis, we have developed a mathematical model describing the most important processes of the gut mucosal immune system on the cellular level. The model is based on literature data, which were on the one hand used (qualitatively) to choose which cell types and processes to incorporate and to derive the model structure, and on the other hand (quantitatively) to derive the parameter values. Using ordinary differential equations, it describes the concentration-time course of neutrophils, macrophages, dendritic cells, T cells and bacteria, each subdivided into different cell types and activation states, in the lamina propria and mesenteric lymph nodes. We evaluate the model by means of simulations of the healthy immune response to salmonella infection and mucosal injury. A virtual population includes IBD patients, which we define through their initially asymptomatic, but after a trigger chronically inflamed gut wall. We demonstrate the model's usefulness in different analyses: (i) The comparison of virtual IBD patients with virtual healthy individuals shows that the disease is elicited by many small or fewer large changes, and allows to make hypotheses about dispositions relevant for development of the disease. (ii) We simulate the effects of different therapeutic targets and make predictions about the therapeutic outcome based on the pre-treatment state. (iii) From the analysis of differences between virtual responders and non-responders, we derive hypotheses about reasons for the inter-individual variability in treatment outcome. (iv) For the example of anti-TNF-alpha therapy, we analyse, which alternative therapies are most promising in case of therapeutic failure, and which therapies are most suited for combination therapies: For drugs also directly targeting the cytokine levels or inhibiting the recruitment of innate immune cells, we predict a low probability of success when used as alternative treatment, but a large gain when used in a combination treatment. For drugs with direct effects on T cells, via modulation of the sphingosine-1-phosphate receptor or inhibition of T cell proliferation, we predict a considerably larger probability of success when used as alternative treatment, but only a small additional gain when used in a combination therapy. N2 - Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen (CED), charakterisiert durch chronische Entzündung der Darmwand, entstehen durch eine Überreaktion der Immunantwort auf kommensale Bakterien, ausgelöst durch eine Kombination an genetischen und Umwelteinflüssen. Große inter-individuelle Unterschiede im Behandlungserfolg mit den verfügbaren Medikamenten erschweren die Wahl der für den jeweiligen Patienten besten Therapieoption. Eine Vorhersage der Erfolgsaussichten einer Behandlung für einen Patienten ist zum jetzigen Zeitpunkt nur sehr bedingt möglich; dafür wird ein besseres Verständnis möglicher Unterschiede zwischen sogenannten Respondern und Non-Respondern (Patienten, die gut bzw. schlecht auf ein Medikament ansprechen) benötigt. In der Dissertation haben wir ein mathematisches Modell entwickelt, das die wichtigsten Prozesse des mukosalen Immunsystems des Darms auf zellulärer Ebene beschreibt. Das Modell basiert auf Literaturdaten, die einerseits (qualitativ) zur Auswahl der zu betrachtenden Zelltypen und Prozesse und zur Herleitung der Modellstruktur und andererseits (quantitativ) zur Herleitung der Parameterwerte verwendet wurden. Mithilfe gewöhnlicher Differentialgleichungen wird der Konzentrations-Zeit-Verlauf von Neutrophilen, Makrophagen, dendritischen Zellen, T-Zellen und Bakterien, jeweils unterteilt in unterschiedliche Zelltypen und Aktivierungszustände, in der Lamina propria und den mesenterischen Lymphknoten, beschrieben. Wir evaluieren das Modells anhand von Simulationen der gesunden Immunantwort auf Salmonelleninfektion und Verletzung der Darmbarriere. Eine virtuelle Population beinhaltet CED-Patienten, die wir durch ein zunächst asymptomatisches, aber nach einem Auslöser chronisch entzündetes Darmgewebe definieren. Wir zeigen den Nutzen des Modells anhand verschiedener Analysen: (i) Der Vergleich von virtuellen CED-Patienten und virtuellen gesunden Individuen zeigt, dass die Krankheit durch viele kleine oder wenige große Veränderungen ausgelöst werden kann, und erlaubt, Hypothesen über krankheitsauslösende Veränderungen aufzustellen. (ii) Wir simulieren verschiedene Therapiemechanismen und treffen, basierend auf dem Zustand vor Behandlungsstart, Vorhersagen über den Therapieerfolg. (iii) Durch Analyse der Unterschiede zwischen virtuellen Respondern und Non-Respondern leiten wir Hypothesen über Ursachen für die inter-individuelle Variabilität im Therapieerfolg her. (iv) Am Beispiel von TNF-alpha-Antikörpern untersuchen wir, welche alternativen Therapien bei Therapieversagen am vielversprechendsten sind und welche Therapien sich besonders für Kombinationstherapien eignen: Für Medikamente, die auch direkt die Zytokinlevel beeinflussen oder die Rekrutierung von Zellen der natürlichen Immunantwort inhibieren, sagen wir eine geringe Erfolgswahrscheinlichkeit bei Nutzung als Alternativtherapie, aber einen großen Gewinn durch Nutzung in einer Kombinationstherapie vorher. Für Medikamente mit direkten Effekten auf T-Zellen, durch Modulation des Sphingosin-1-Phosphat-Rezeptors oder Inhibierung der T-Zellproliferation, sagen wir eine deutlich größere Erfolgswahrscheinlichkeit bei Nutzung als Alternativtherapie, aber nur einen geringen zusätzlichen Effekt bei Nutzung in einer Kombinationstherapie vorher. KW - systems biology KW - IBD KW - QSP KW - Systembiologie KW - CED KW - QSP Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-612301 ER - TY - THES A1 - Calderón Quiñónez, Ana Patricia T1 - Ecology and conservation of the jaguar (Panthera onca) in Central America T1 - Ökologie und Schutz des Jaguars (Panthera onca) in Mittelamerika N2 - Conservation of the jaguar relies on holistic and transdisciplinary conservation strategies that integratively safeguard essential, connected habitats, sustain viable populations and their genetic exchange, and foster peaceful human-jaguar coexistence. These strategies define four research priorities to advance jaguar conservation throughout the species’ range. In this thesis I provide several relevant ecological and sociological insights into these research priorities, each addressed in a separate chapter. I focus on the effects of anthropogenic landscapes on jaguar habitat use and population gene flow, spatial patterns of jaguar habitat suitability and functional population connectivity, and on innovative governance approaches which can work synergistically to help achieve human-wildlife conviviality. Furthermore, I translate these insights into recommendations for conservation practice by providing tools and suggestions that conservation managers and stakeholders can use to implement local actions but also make broad scale conservation decisions in Central America. In Chapter 2, I model regional habitat use of jaguars, producing spatially-explicit maps for management of key areas of habitat suitability. Using an occupancy model of 13-year-camera-trap occurrence data, I show that human influence has the strongest impact on jaguar habitat use, and that Jaguar Conservation Units are the most important reservoirs of high quality habitat in this region. I build upon these results by zooming in to an area of high habitat suitability loss in Chapter 3, northern Central America. Here I study the drivers of jaguar gene flow and I produce spatially-explicit maps for management of key areas of functional population connectivity in this region. I use microsatellite data and pseudo-optimized multiscale, multivariate resistance surfaces of gene flow to show that jaguar gene flow is influenced by environmental, and even more strongly, by human influence variables; and that the areas of lowest gene flow resistance largely coincide with the location of the Jaguar Conservation Units. Given that human activities significantly impact jaguar habitat use and gene flow, securing viable jaguar populations in anthropogenic landscapes also requires fostering peaceful human-wildlife coexistence. This is a complex challenge that cannot be met without transdisciplinary academic research and cross-sectoral, collaborative governance structures that effectively respond to the multiple challenges of such coexistence. With this in mind, I focus in Chapter 4 on carnivore conservation initiatives that apply transformative governance approaches to enact transformative change towards human-carnivore coexistence. Using the frameworks of transformative biodiversity governance and convivial conservation, I highlight in this chapter concrete pathways, supported by more inclusive, democratic forms of conservation decision-making and participation that promote truly transformative changes towards human-jaguar conviviality. N2 - Die Erhaltung des Jaguars beruht auf ganzheitlichen und transdisziplinären Erhaltungsstrategien, die wesentliche, zusammenhängende Lebensräume schützen, lebensfähige Populationen und deren genetischen Austausch erhalten und die friedliche Koexistenz von Mensch und Jaguar fördern. Diese Strategien werden durch die vier Forschungsprioritäten veranschaulicht, die den Schutz des Jaguars im gesamten Verbreitungsgebiet der Art vorantreiben sollen. In dieser Arbeit möchte ich die Forschung zum Schutz des Jaguars vorantreiben, indem ich mehrere relevante ökologische und soziologische Einblicke in diese Forschungsschwerpunkte gebe, die jeweils in einem eigenen Kapitel behandelt werden. Ich konzentriere mich auf die Auswirkungen anthropogener Landschaften auf die Lebensraumnutzung von Jaguaren und den Genfluss in der Population, auf räumliche Muster der Lebensraumeignung von Jaguaren und die funktionale Konnektivität von Populationen sowie auf innovative Governance-Ansätze, die synergetisch wirken können, um die Konvivenz zwischen Mensch und Wildtier zu fördern. Darüber hinaus setze ich diese Erkenntnisse in Empfehlungen für die Naturschutzpraxis um, indem ich konkrete Instrumente und Vorschläge für Maßnahmen anbiete, die Naturschutzmanager und Interessenvertreter nutzen können, um lokale Maßnahmen umzusetzen, aber auch um weitreichende Naturschutzentscheidungen in Zentralamerika zu treffen. In Kapitel 2 modelliere ich die regionale Lebensraumnutzung von Jaguaren und erstelle räumlich explizite Karten für das Management von Schlüsselgebieten mit geeigneter Lebensraumnutzung. Mithilfe eines Habitatmodells basierend auf 13-Jahres-Kamerfangdaten-Studien zeige ich, dass der menschliche Einfluss die stärkste Auswirkung auf die Lebensraumnutzung von Jaguaren hat und dass die Jaguar-Schutzgebiete die wichtigsten Reservoirs für hochwertige Lebensräume in dieser Region sind. Auf diesen Ergebnissen baue ich auf, indem ich in Kapitel 3 ein Gebiet mit einem hohen Verlust an Lebensraumeignung, das nördliche Mittelamerika, näher betrachte. Hier untersuche ich die Triebkräfte des Genflusses bei Jaguaren und erstelle räumlich explizite Karten für das Management von Schlüsselgebieten mit funktionaler Populationskonnektivität in dieser Region. Ich verwende Mikrosatellitendaten und pseudo-optimierte multiskalige, multivariate Widerstandsflächen des Genflusses, um zu zeigen, dass der Genfluss von Jaguaren durch Umweltvariablen und noch stärker durch menschliche Einflussfaktoren beeinflusst wird und dass die Gebiete mit dem geringsten Genflusswiderstand weitgehend mit den Standorten der Jaguar-Schutzgebiete übereinstimmen. Da sich menschliche Aktivitäten erheblich auf die Lebensraumnutzung der Jaguare und den Genfluss auswirken, ist für die Sicherung lebensfähiger Jaguarpopulationen in anthropogenen Landschaften auch die Förderung einer friedlichen Koexistenz von Mensch und Wildtieren erforderlich. Dies ist eine komplexe Herausforderung, die ohne transdisziplinäre akademische Forschung und sektorübergreifende, kooperative Governance-Strukturen, die wirksam auf die vielfältigen Herausforderungen einer solchen Koexistenz reagieren, nicht zu bewältigen ist. Vor diesem Hintergrund konzentriere ich mich in Kapitel 4 auf Initiativen zum Schutz von Raubtieren, die transformative Governance-Ansätze anwenden, um einen Wandel hin zu einer Konvivenz zwischen Mensch und Raubtier zu bewirken. Unter Verwendung des Rahmens der transformativen Biodiversitäts-Governance und des konvivialen Naturschutzes zeige ich in diesem Kapitel konkrete Wege auf, die durch integrativere, demokratische Formen der Entscheidungsfindung im Naturschutz unterstützt werden und wirklich transformative Veränderungen in Richtung Konvivialität zwischen Mensch und Jaguar fördern. KW - jaguar KW - ecology KW - felid conservation KW - Central America KW - habitat use KW - coexistence KW - population connectivity KW - Mittelamerika KW - Koexistenz KW - Ökologie KW - Schutz von Raubtieren KW - Lebensraumnutzung KW - Jaguar KW - Populationskonnektivität Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-613671 ER - TY - THES A1 - Sureshkumar, Priyavathi T1 - Erweiterung der zellbasierten Calcium-Imaging-Methode im eukaryotischen zellfreien Proteinsynthese-System für die transient-receptor-potential (TRP) - Ionenkanäle N2 - Die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode wird auch heute noch als gängige Methode verwendet, vor allem wegen der geringeren Kosten für das Wirkstoffscreening in der pharmazeutischen Forschung, wobei Ionenkanäle sowie einige der G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) die Mehrzahl der Wirkstoffziele ansprechen. Die zellfreie Synthese eukaryotischer Proteine hat nicht die Nachteile, die bei der Überexpression dieser ionenpermeablen Proteine in Zellen auftreten können, wie z. B. Zelltoxizität, geringere Proteinexpression und die Beseitigung der exprimierten Proteine aufgrund veränderter Domänen sowie die zeitaufwändige Pflege von Zelllinien. Die Synthese von Ionenkanälen in zellfreien Proteinsyntheseplattformen für das künftige Wirkstoffscreening ist noch in der Grundlagenforschung. Obwohl die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode in zellbasierten Assays weit verbreitet ist, wurde diese Methode bisher noch nicht in zellfreien Proteinexpressionssystemen verwendet. Insgesamt ist die neue Anwendung der Calcium-Imaging-Methode in eukaryontischen zellfreien Systemen eine Voraussetzung für die schnelle pharmakologische Analyse von Wirkstoffen. Das erste Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit bestand darin, die grundlegenden Prinzipien der Calcium-Imaging-Methode zur Untersuchung von Ionenkanälen in zellbasierten Systemen zu untersuchen. Hierfür wurden zwei Tumorzelllinien des Auges verwendet, und zwar benigne Pterygiumzellen und maligne Aderhautmelanom 92.1 Zellen. In diesen Studien wurde die Interaktion zwischen den nativ überexprimierten transient-receptor-potential-Ionenkanälen (TRPs) wie TRP Vanilliod 1 (TRPV1) (Capsaicinrezeptor) und TRP Melastatin 8 (TRPM8) (Mentholrezeptor) in diesen Tumorzellen nach Zugabe von verschiedenen Medikamenten und Hormonen untersucht. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, den Calcium-Mechanismus von GPCRs in den Zellen zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde Mas, ein GPCR und Angiotensin (1-7) -Hormonrezeptor, aus dem renin-angiotensin-aldosteron-system (RAAS) in der Human Embryonic Kidney-293 (HEK293) Zelllinie überexprimiert. In dieser Studie wurden insbesondere die Aktivierung klassischer GPCR-Signalwege wie Phospholipase C und Proteinkinase C durch Angiotensin-(1-7) über Mas und die Beteiligung von TRP-Kanälen nachgewiesen. Die zellbasierte-Calcium-Imaging-Methode für chemische Calcium-Indikatoren ließ sich aufgrund der Anwesenheit einer großen Menge cytosolischer Carboxylesterasen gut anwenden. Carboxylesterase ist das wichtigste Enzym in der Calcium Imaging Methode, das die Verarbeitung chemischen Calcium-Farbstoffe behandelt. Dieses Enzym fehlt jedoch in Mikrosomen, die als Basismembran für die Integration synthetisierter Ionenkanäle in eukaryontischen zellfreien Systemen verwendet werden. Das dritte Ziel dieser Forschungsarbeit war die Umsetzung der zellbasierten Calcium-Imaging Methode und der Calcium-Signalwege in zellfreie Systeme. Hier wurde die zellfrei synthetisierte Carboxylesterase in Mikrosomen von Spodoptera frugiperda (Sf21) als praktikables Calcium-Imaging-Werkzeug etabliert, um sowohl native ionenpermeable Proteine als auch zellfrei-synthetisierte Ionenkanäle zu untersuchen. Die Enzymaktivität der zellfrei-synthetisierten Carboxylesterase in Mikrosomen wurde durch Esterase-Assays und den Calcium-Fluoreszenzfarbstoff Fluo-5N Acetoxymethylester (Fluo-5N AM) Belastungstests nachgewiesen. Das Calcium-Imaging der nativ vorhandenen Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen/endoplasmatischen Retikulums (SERCA) und der Ryanodin-Rezeptoren (RyR) in den Mikrosomen sowie der zell-frei exprimierten TRP-Ionenkanäle wurden mit dem Fura-5N-AM- Fluoreszenzfarbstoff in mit Carboxylesterase vorsynthetisierten Mikrosomen nachgewiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Prinzip der zellbasierten Calcium-Imaging -Methode vielversprechend an das eukaryotische zellfreie Sf21-System angepasst werden konnte, um Ionenkanäle zu analysieren. Nach entsprechender Forschung könnte die etablierte Methode in Zukunft auch auf andere Membranproteine ausgeweitet werden. Dies umfasst die Untersuchung anderer zell-frei exprimierte GPCRs oder anderer Ionenkanäle wie Kalium-, Natrium- und Chlorid-Ionenkanäle. N2 - Fluorescence calcium imaging is still used today used as the common method, mainly due to its cheaper costs for drug screening in pharmaceutical research encompassing both ion channels, and part of G- Protein Coupled Receptors (GPCRs) in the major share of drug targets. Eukaryotic cell-free protein translation overcomes several drawbacks that might occur for overexpression of these ion-permeable proteins in the cells such as cell toxicity, poor protein expression, and deletion due to modified protein domain and time-consuming cell line maintenance. Expressing ion channels in the cell-free protein synthesis platform for future drug screening processes is still ongoing basic research and so far, no calcium imaging technique for cell-free expressed ion channels is available. Taken together, the novel application of the fluorescence calcium imaging method in eukaryotic cell-free systems is a prerequisite for rapid pharmacological drug investigations, which are not feasible using conventional call-based approaches. The aim of this thesis is to investigate the common calcium signaling pathways relevant to drug research via ion channels and GPCRs in cell-based systems. Thereby, the basic mechanism of the cell-based calcium imaging for chemical calcium indicators is studied and then translate its principle to the cell-free protein synthesis platforms. In order to study the cell-based calcium imaging and calcium pathways, two types of eye tumor cell-based models, namely benign pterygial tumor cells and malign uveal melanoma 92.1 cells were used. Specifically, the interplay between the natively expressed Transient Receptor Potential Channels (TRPs) like TRP-Vanilloid 1 (TRPV1) (Capsaicin receptor) and TRP-Melastatin 8 (TRPM8) (Menthol receptor) in these tumor cells was investigated by application of various drugs and hormones. The second aim of this thesis was to investigate the cell-based calcium mechanism of GPCRs. For this, overexpressed Mas, a GPCR and Angiotensin-(1-7) hormone receptor, from the Renin Angiotensin Aldosterone System (RAAS) in the Human Embryonic Kidney (HEK293) cells was used. Particularly, the activation of classical GPCR pathways like Phospholipase C and Proteinkinase C via Ang-(1-7) through Mas and the involvement of TRPs was proven in this study. The third aim of this thesis is to translate the cell-based calcium imaging principle to cell-free systems. Cell-based calcium imaging for chemical calcium indicators could be performed with all ease due to the presence of a large amount of cytosolic carboxylesterase, the crucial enzyme which handles the chemical calcium dyes. But this enzyme is absent in microsomes. Microsomes are used as a backbone membrane to integrate the synthesized ion channels in a eukaryotic cell-free system. Cell-free synthesized carboxylesterase in Spodoptera frugiperda (Sf21) microsomes is established as a viable calcium imaging tool to study both natively present ion permeable proteins and cell-free synthesized ion channels. The enzyme activity of the carboxylesterase in microsomes was confirmed by esterase assays and fluorescent calcium dye Fluo-5N Acetoxymethylester (Fluo-5N AM) loading assays. Fluorescent calcium imaging of natively present SERCA (Sarco Endoplasmic Reticulum Calcium ATPase) and ryanodine channels in the microsomes and cell-free expressed TRPV1 channel was demonstrated using Fluo-5N AM fluorescent dye in carboxylesterase pre-synthesized microsomes. With adequate research in future, the established method could be promisingly extended to study other cell-free expressed GPCRs or other ion channels like potassium, sodium, and chloride ion channels. KW - zellfreie Proteinsynthese KW - Calcium-Imaging KW - transient-receptor-potential-Ionenkanäle KW - calcium imaging KW - transient receptor potential ion channels KW - cell-free protein synthesis Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-619872 ER - TY - THES A1 - Malchow, Anne-Kathleen T1 - Developing an integrated platform for predicting niche and range dynamics BT - inverse calibration of spatially-explicit eco-evolutionary models N2 - Species are adapted to the environment they live in. Today, most environments are subjected to rapid global changes induced by human activity, most prominently land cover and climate changes. Such transformations can cause adjustments or disruptions in various eco-evolutionary processes. The repercussions of this can appear at the population level as shifted ranges and altered abundance patterns. This is where global change effects on species are usually detected first. To understand how eco-evolutionary processes act and interact to generate patterns of range and abundance and how these processes themselves are influenced by environmental conditions, spatially-explicit models provide effective tools. They estimate a species’ niche as the set of environmental conditions in which it can persist. However, the currently most commonly used models rely on static correlative associations that are established between a set of spatial predictors and observed species distributions. For this, they assume stationary conditions and are therefore unsuitable in contexts of global change. Better equipped are process-based models that explicitly implement algorithmic representations of eco-evolutionary mechanisms and evaluate their joint dynamics. These models have long been regarded as difficult to parameterise, but an increased data availability and improved methods for data integration lessen this challenge. Hence, the goal of this thesis is to further develop process-based models, integrate them into a complete modelling workflow, and provide the tools and guidance for their successful application. With my thesis, I presented an integrated platform for spatially-explicit eco-evolutionary modelling and provided a workflow for their inverse calibration to observational data. In the first chapter, I introduced RangeShiftR, a software tool that implements an individual-based modelling platform for the statistical programming language R. Its open-source licensing, extensive help pages and available tutorials make it accessible to a wide audience. In the second chapter, I demonstrated a comprehensive workflow for the specification, calibration and validation of RangeShiftR by the example of the red kite in Switzerland. The integration of heterogeneous data sources, such as literature and monitoring data, allowed to successfully calibrate the model. It was then used to make validated, spatio-temporal predictions of future red kite abundance. The presented workflow can be adopted to any study species if data is available. In the third chapter, I extended RangeShiftR to directly link demographic processes to climatic predictors. This allowed me to explore the climate-change responses of eight Swiss breeding birds in more detail. Specifically, the model could identify the most influential climatic predictors, delineate areas of projected demographic suitability, and attribute current population trends to contemporary climate change. My work shows that the application of complex, process-based models in conservation-relevant contexts is feasible, utilising available tools and data. Such models can be successfully calibrated and outperform other currently used modelling approaches in terms of predictive accuracy. Their projections can be used to predict future abundances or to assess alternative conservation scenarios. They further improve our mechanistic understanding of niche and range dynamics under climate change. However, only fully mechanistic models, that include all relevant processes, allow to precisely disentangle the effects of single processes on observed abundances. In this respect, the RangeShiftR model still has potential for further extensions that implement missing influential processes, such as species interactions. Dynamic, process-based models are needed to adequately model a dynamic reality. My work contributes towards the advancement, integration and dissemination of such models. This will facilitate numeric, model-based approaches for species assessments, generate ecological insights and strengthen the reliability of predictions on large spatial scales under changing conditions. N2 - Arten sind an ihren jeweiligen Lebensraum angepasst, doch viele Lebensräume sind heute einem globalen Wandel unterworfen. Dieser äußert sich vor allem in Veränderungen von Landnutzung und Klima, welche durch menschliche Aktivitäten verursacht werden und ganze Ökosysteme in ihrem Gefüge stören können. Störungen der grundlegenden öko-evolutionären Prozesse können auf der Populationsebene in Form von veränderten Verbreitungsgebieten und Häufigkeitsmustern sichtbar werden. Hier werden die Auswirkungen des globalen Wandels auf eine Art oftmals zuerst beobachtet. Um zu untersuchen, wie die Wirkung und Wechselwirkung der verschiedenen öko-evolutionären Prozesse die beobachteten Verbreitungs- und Häufigkeitsmuster erzeugen, und wie diese Prozesse wiederum von Umweltbedingungen beeinflusst werden, stellen räumlich explizite Modelle wirksame Instrumente dar. Sie beschreiben die ökologische Nische einer Art, also die Gesamtheit aller Umweltbedingungen, unter denen die Art fortbestehen kann. Die derzeit am häufigsten verwendeten Modelle stützen sich auf statische, korrelative Zusammenhänge, die zwischen bestimmten räumlichen Prädiktoren und den beobachteten Artverteilungen hergestellt werden. Allerdings werden dabei stationäre Bedingungen angenommen, was sie im Kontext des globalen Wandels ungeeignet macht. Deutlich besser geeignet sind prozessbasierte Modelle, welche explizite, algorithmische Repräsentationen von ökologischen Prozessen beinhalten und deren gemeinsame Dynamik berechnen. Solche Modelle galten lange Zeit als schwierig zu parametrisieren, doch die zunehmende Verfügbarkeit von Beobachtungsdaten sowie die verbesserten Methoden zur Datenintegration machen ihre Verwendung zunehmend praktikabel. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, diese prozessbasierten Modelle weiterzuentwickeln, sie in umfassende Modellierungsabläufe einzubinden, sowie Software und Anleitungen für ihre erfolgreiche Anwendung verfügbar zu machen. In meiner Dissertation präsentiere ich eine integrierte Plattform für räumlich-explizite, öko-evolutionäre Modellierung und entwickle einen Arbeitsablauf für dessen inverse Kalibrierung an Beobachtungsdaten. Im ersten Kapitel stelle ich RangeShiftR vor: eine Software, die eine individuenbasierte Modellierungsplattform für die statistische Programmiersprache R implementiert. Durch die Open-Source-Lizenzierung, umfangreichen Hilfeseiten und online verfügbaren Tutorials ist RangeShiftR einem breiten Publikum zugänglich. Im zweiten Kapitel demonstriere ich einen vollständigen Modellierungsablauf am Beispiel des Rotmilans in der Schweiz, der die Spezifikation, Kalibrierung und Validierung von RangeShiftR umfasst.Durch die Integration heterogener Datenquellen, wie Literatur- und Monitoringdaten, konnte das Modell erfolgreich kalibriert werden. Damit konnten anschließend validierte, raum-zeitliche Vorhersagen über das Vorkommen des Rotmilans erstellt und die dafür relevanten Prozesse identifiziert werden. Der vorgestellte Arbeitsablauf kann auf andere Arten übertragen werden, sofern geeignete Daten verfügbar sind. Im dritten Kapitel habe ich RangeShiftR erweitert, sodass demografische Prozessraten direkt mit Klimavariablen verknüpft werden können. Dies ermöglichte es, die Reaktionen von acht Schweizer Brutvogelarten auf den Klimawandel genauer zu untersuchen. Insbesondere konnte das Modell die einflussreichsten klimatischen Faktoren identifizieren, demografisch geeignete Gebiete abgrenzen und aktuelle Populationstrends auf den bisherigen Klimawandel zurückführen. Meine Arbeit zeigt, dass die Anwendung komplexer, prozessbasierter Modelle in naturschutzrelevanten Kontexten mit verfügbaren Daten möglich ist. Solche Modelle können erfolgreich kalibriert werden und andere, derzeit verwendete Modellierungsansätze in Bezug auf ihre Vorhersagegenauigkeit übertreffen. Ihre Projektionen können zur Vorhersage zukünftiger Artvorkommen und zur Einschätzung alternativer Naturschutzmaßnahmen verwendet werden. Sie verbessern außerdem unser mechanistisches Verständnis von Nischen- und Verbreitungsdynamiken unter dem Einfluss des Klimawandels. Jedoch ermöglichen nur vollständig prozessbasierte Modelle, die alle relevanten Prozesse vereinen, eine korrekte Aufschlüsselung der Auswirkungen einzelner Prozesse auf die beobachteten Abundanzen. In dieser Hinsicht hat das RangeShiftR-Modell noch Potenzial für Weiterentwicklungen, um fehlende, einflussreiche Prozesse hinzuzufügen, wie zum Beispiel die Interaktionen zwischen Arten. Um eine dynamische Realität adäquat abbilden zu können, werden dynamische, prozessbasierte Modelle benötigt. Meine Arbeit leistet einen Beitrag zur Weiterentwicklung, Integration und Verbreitung solcher Modelle und stärkt somit die Anwendung numerischer, modellbasierter Methoden für die Bewertung des Zustands von Arten, die Untersuchung ökologischer Zusammenhänge und die Steigerung der Zuverlässigkeit von Vorhersagen auf großen räumlichen Skalen unter Umweltveränderungen. T2 - Entwicklung einer integrierten Modellierungs-Plattform zur Vorhersage von Nischen- und Verbreitungs-dynamiken: Inverse Kalibrierung räumlich-expliziter öko-evolutionärer Modelle KW - species distribution modelling KW - Bayesian inference KW - individual-based modelling KW - range shifts KW - ecological modelling KW - population dynamics KW - Bayes'sche Inferenz KW - ökologische Modellierung KW - individuen-basierte Modellierung KW - Populationsdynamik KW - Arealverschiebungen KW - Artverbreitungsmodelle Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-602737 ER - TY - THES A1 - Kulshreshtha, Ritika T1 - Dissecting the functional of role of microtubule and cellulose microfibril patterning during flower development in Arabidopsis Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Bastos Lima, Rita T1 - Seed coat-derived brassnosteroids non-cell autonomously regulate endosperm development Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Yildiz, Tugba T1 - Dissecting the role of the TusA protein for cell functionality and FtsZ ring assembly in Escherichia coli T1 - Entschlüsselung der Rolle des TusA-Proteins für die Zellfunktionalität und FtsZ-Ringbildung in Escherichia coli N2 - In this work, the role of the TusA protein was investigated for the cell functionality and FtsZ ring assembly in Escherichia coli. TusA is the tRNA-2-thiouridine synthase that acts as a sulfur transferase in tRNA thiolation for the formation of 2-thiouridine at the position 34 (wobble base) of tRNALys, tRNAGlu and tRNAGln. It binds the persulfide form of sulfur and transfers it to further proteins during mnm5s2U tRNA modification at wobble position and for Moco biosynthesis. With this thiomodification of tRNA, the ribosome binding is more efficient and frameshifting is averted during the protein translation. Previous studies have revealed an essential role of TusA in bacterial cell physiology since deletion of the tusA gene resulted in retarded growth and filamentous cells during the exponential growth phase in a rich medium which suddenly disappeared during the stationary phase. This indicates a problem in the cell division process. Therefore the focus of this work was to investigate the role of TusA for cell functionality and FtsZ ring formation and thus the cell separation. The reason behind the filamentous growth of the tusA mutant strain was investigated by growth and morphological analyses. ΔtusA cells showed a retarded growth during the exponential phase compared to the WT strain. Also, morphological analysis of ΔtusA cells confirmed the filamentous cell shape. The growth and cell division defects in ΔtusA indicated a defect in FtsZ protein as a key player of cell division. The microscopic investigation revealed that filamentous ΔtusA cells possessed multiple DNA parts arranged next to each other. This suggested that although the DNA replication occurred correctly, there was a defect in the step where FtsZ should act; probably FtsZ is unable to assemble to the ring structure or the assembled ring is not able to constrict. All tested mutant strains (ΔtusD, ΔtusE and ΔmnmA) involved in the mnm5s2U34 tRNA modification pathway shared the similar retarded growth and filamentous cell shape like ΔtusA strain. Thus, the cell division defect arises from a defect in mnm5s2U34 tRNA thiolation. Since the FtsZ ring formation was supposed to be defective in filaments, a possible intracellular interaction of TusA and FtsZ was examined by fluorescent (EGFP and mCherry) fusion proteins expression and FRET. FtsZ expressing tusA mutant (DE3) cells showed a red mCherry signal at the cell poles, indicating that FtsZ is still in the assembling phase. Interestingly, the cellular region of EGFP-TusA fusion protein expressed in ΔtusA (DE3) was conspicuous; the EGFP signal was spread throughout the whole cell and, in addition, a slight accumulation of the EGFP-TusA fluorescence was detectable at the cell poles, the same part of the cell as for mCherry-FtsZ. Thus, this strongly suggested an interaction of TusA and FtsZ. Furthermore, the cellular FtsZ and Fis concentrations, and their change during different growth phases were determined via immunoblotting. All tested deletion strains of mnm5s2U34 tRNA modification show high cellular FtsZ and Fis levels in the exponential phase, shifting to the later growth phases. This shift reflects the retarded growth, whereby the deletion strains reach later the exponential phase. Conclusively, the growth and cell division defect, and thus the formation of filaments, is most likely caused by changes in the cellular FtsZ and Fis concentrations. Finally, the translation efficiencies of certain proteins (RpoS, Fur, Fis and mFis) in tusA mutant and in additional gene deletion strains were studied whether they were affected by using unmodified U34 tRNAs of Lys, Glu and Gln. The translation efficiency is decreased in mnm5s2U34 tRNA modification-impaired strains in addition to their existing growth and cell division defect due to the elimination of these three amino acids. Finally, these results confirm and reinforce the importance of Lys, Glu and Gln and the mnm5s2U34 tRNA thiolation for efficient protein translation. Thus, these findings verify that the translation of fur, fis and rpoS is regulated by mnm5s2U34 tRNA modifications, which is growth phase-dependent. In total, this work showed the importance of the role of TusA for bacterial cell functionality and physiology. The deletion of the tusA gene disrupted a complex regulatory network within the cell, that most influenced by the decreased translation of Fis and RpoS, caused by the absence of mnm5s2U34 tRNA modifications. The disruption of RpoS and Fis cellular network influences in turn the cellular FtsZ level in the early exponential phase. Finally, the reduced FtsZ concentration leads to elongated, filamentous E. coli cells, which are unable to divide. N2 - In dieser Arbeit wurde die Rolle des TusA-Proteins für die Zellfunktionalität und FtsZ-Ringbildung in Escherichia coli untersucht. Bei TusA handelt es sich um die tRNA-2-Thiouridine-Synthase, die als Schwefeltransferase bei der tRNA-Thiolierung zur Bildung von 2-Thiouridin an der Position 34 (Wobble-Base) von tRNALys, tRNAGlu und tRNAGln dient. Dieses Protein bindet das Schwefelatom als Persulfid und überträgt dieses bei der mnm5s2U tRNA-Modifikation an der Wobble-Position und der Molybdän-Cofaktor (Moco)-Biosynthese auf weitere Proteine. Durch diese Thiomodifikation der tRNA wird eine effizientere Bindung des Ribosoms erreicht und zudem eine Verschiebung des Leserasters während der Proteintranslation verhindert. Frühere Studien haben eine essenzielle Rolle für TusA in der bakteriellen Zellphysiologie gezeigt: die Deletion des tusA-Gens führte zu einem verlangsamten Wachstum und filamentösen (fadenförmigen) Zellen als WT-Zellen während der exponentiellen Wachstumsphase in einem reichhaltigen Medium. In der stationären Phase waren diese Filamente hingegen nicht mehr zu beobachten, was auf einen Defekt während der Zellteilung hindeutete. Ziel dieser Arbeit war es daher die Rolle des TusA-Proteins für die Zellfunktionalität und FtsZ-Ringbildung zu analysieren. Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurde die Ursache für das filamentöse Wachstum der tusA-Mutante untersucht. Dafür wurden Wachstums- und Morphologieanalysen durchgeführt. Die ΔtusA-Zellen zeigten im Vergleich zum WT-Stamm ein verzögertes Wachstum in der exponentiellen Phase. Die filamentöse Zellform der ΔtusA-Zellen wurde ebenfalls durch die Analyse der Zellmorphologie bestätigt. Demnach deutete das Wachstums- und Zellteilungsproblem von ΔtusA auf einen Defekt des FtsZ-Proteins hin, das eine Schlüsselrolle bei der Zellteilung besitzt. Anhand von mikroskopischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die filamentöse ΔtusA-Zellen mehrere nebeneinander angeordnete DNA-Abschnitte besaßen. Dies ließ die Vermutung zu, dass trotz korrekt verlaufender DNA-Replikation, ein Defekt in dem Schritt, in dem FtsZ einsetzen sollte, vorliegt. Folglich scheint FtsZ sich nicht zur Ringstruktur anordnen zu können. Denkbar wäre auch, dass der zusammengesetzte Ring nicht in der Lage ist zu kontrahieren. Alle getesteten Mutantenstämme (ΔtusD, ΔtusE und ΔmnmA), die an der mnm5s2U34-Modifikation beteiligt sind, zeigten ein ähnlich verzögertes Wachstum und eine ähnliche filamentöse Zellform wie der ΔtusA-Stamm. Somit ist der Zellteilungsdefekt auf einen Defekt in der mnm5s2U34-tRNA-Thiolierung zurückzuführen. Des Weiteren wurde eine mögliche intrazelluläre Interaktion von TusA und FtsZ anhand der Expression von fluoreszierender (EGFP und mCherry) Fusionsproteine und FRET-Analysen überprüft, da die Bildung des FtsZ-Rings in den Filamenten defekt zu sein scheint. Für FtsZ-exprimierende tusA (DE3)-Zellen wurden rote mCherry-Signale an den Zellpolen detektiert, was auf das sich noch assemblierende FtsZ hindeutete. Interessanterweise war die zelluläre Region des EGFP-TusA Signals, das in ΔtusA (DE3) exprimiert wurde, überlappend mit dem von mCherry-FtsZ. Das EGFP-Signal zeigte eine Verteilung über die gesamte Zelle, wobei noch zusätzlich eine leichte Akkumulation der EGFP-TusA-Fluoreszenz an den Zellpolen (wie bei mCherry-FtsZ) festgestellt wurde. Somit deutet dies auf eine Interaktion zwischen TusA und FtsZ hin. Zusätzlich wurden die FtsZ- und Fis-Konzentrationen und deren Änderung während der unterschiedlichen Wachstumsphasen anhand von Immunoblot-Analysen ermittelt. Alle getesteten Deletionsstämme der mnm5s2U34-tRNA-Modifikation zeigten hohe zelluläre FtsZ- und Fis-Mengen in der exponentiellen Phase, die in die späteren Wachstumsphasen verschoben sind. Diese Verschiebung spiegelt das verlangsamte Wachstum wider, wodurch die Deletionsstämme später die exponentielle Phase erreichen. Demzufolge ist anzunehmen, dass der Wachstums- und Zellteilungsdefekt und daraus die Bildung von Filamenten durch Veränderungen der zellulären FtsZ- und Fis-Konzentrationen verursacht werden. Abschließend wurde in dieser Arbeit mittels Durchflusszytometrie die Translationseffizienz bestimmter Proteine (RpoS, Fur, Fis und mFis) in ΔtusA und zusätzlichen Gendeletionsstämmen untersucht. Insbesondere sollte gezeigt werden, ob die Translation der Proteine durch die Verwendung von unmodifizierten U34-tRNAs für Lys, Glu und Gln beeinträchtigt wird. Somit ist die Translationseffizienz in den Stämmen mit beeinträchtigter mnm5s2U34-tRNA-Modifikation verringert, was zusätzlich zu ihren bereits bestehenden Wachstums- und Zellteilungsdefekten aufgrund der Eliminierung dieser drei Aminosäuren hinzukommt. Damit bestätigen und verstärken diese Ergebnisse die Bedeutung von Lys, Glu und Gln und der mnm5s2U34 tRNA-Thiolierung für eine effiziente Proteintranslation. Sie belegen auch, dass die Translation von fur, fis und rpoS durch die mnm5s2U34-tRNA-Modifikation reguliert wird, welche wachstumsphasenabhängig ist. Im Résumé zeigen die Ergebnisse dieser Forschungsarbeit neue Funktionen des TusA-Proteins für die Funktionalität und Physiologie von Bakterienzellen. Durch die Deletion des tusA-Gens wurde ein komplexes regulatorisches Netzwerk innerhalb der Zelle gestört, das vor allem durch die verringerte Translation von Fis und RpoS beeinflusst wird (die durch das Fehlen der mnm5s2U34-tRNA-Modifikation verursacht wird). Die Unterbrechung des zellulären RpoS- und Fis-Netzwerks beeinflusst wiederum die zelluläre FtsZ-Menge in der frühen exponentiellen Phase. Schließlich führt diese Verringerung der FtsZ-Konzentration zu filamentösen E. coli-Zellen, die sich nicht mehr teilen können. KW - tRNA thiomodifications KW - 5-methylaminomethyl-2-thiouridine KW - TusA KW - growth defect KW - cell division KW - FtsZ KW - FtsZ ring assemby KW - RpoS KW - Fis KW - translation efficiency KW - tRNA Thiomodifikation KW - 5-Methylaminomethyl-2-Thiouridin KW - TusA KW - Zellteilungsdefekt KW - Zellteilung KW - FtsZ-Ringbildung KW - Translationseffizienz KW - filaments KW - Filamente Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-617135 ER - TY - THES A1 - Peng, Maolin T1 - The role of prion-like domains in plant temperatur sensing Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Soltani, Ouad T1 - BLF1-Mode of Action in Barley Leaf Size Control N2 - Establishment of final leaf size in plants represents a complex mechanism that relies on the precise regulation of two interconnected cellular processes, cell division and cell expansion. In previous work, the barley protein BROAD LEAF1 (BLF1) was identified as a novel negative regulator of cell proliferation, that mainly limits leaf growth in the width direction. Here I identified a novel RING/U-box protein that interacts with BLF1 through a yeast two hybrid screen. Using BiFC, Co-IP and FRET I confirmed the interaction of the two proteins in planta. Enrichment of the BLF1-mEGFP fusion protein and the increase of the FRET signal upon MG132 treatment of tobacco plants, together with an in vivo ubiquitylation assay in bacteria, confirmed that the RING/U-box E3 interacts with BLF1 to mediate its ubiquitylation and degradation by the 26S proteasome system. Consistent with regulation of endogenous BLF1 in barley by proteasomal degradation, inhibition of the proteasome by bortezomib treatment on BLF1-vYFP transgenic barley plants also resulted in an enrichment of the BLF1 protein. I thus demonstrated that RING/U-box E3 is colocalized with BLF1 in nuclei and negatively regulates BLF1 protein levels. Analysis of ring-e3_1 knock-out mutants suggested the involvement of the RING/U-box E3 gene in leaf growth control, although the effect was mainly on leaf length. Together, my results suggest that proteasomal degradation, possibly mediated by RING/U-box E3, contributes to fine-tuning BLF1 protein-level in barley. N2 - Die Festlegung der endgültigen Blattgröße bei Pflanzen ist ein komplexer Mechanismus, der auf der präzisen Regulierung zweier miteinander verbundener zellulärer Prozesse beruht, der Zellteilung und der Zellexpansion. In einer früheren Arbeit wurde das Gerstenprotein BROAD LEAF1 (BLF1), als ein neuartiger negativer Regulator der Zellproliferation identifiziert, der das Blattwachstum hauptsächlich in Richtung der Breite begrenzt. Hier habe ich durch einen Hefe-Zwei-Hybrid-Screen ein neuartiges RING/U-Box-Protein identifiziert, das mit BLF1 interagiert. Mittels BiFC, Co-IP und FRET konnte ich die Interaktion der beiden Proteine in der Pflanze bestätigen. Die Anreicherung des BLF1-mEGFP-Fusionsproteins und der Anstieg des FRET-Signals bei der Behandlung von Tabakpflanzen mit MG132 sowie ein in vivo Ubiquitylierungsassay in Bakterien bestätigten, dass das RING/U-Box-E3 mit BLF1 interagiert und dessen Ubiquitylierung und Abbau durch das 26S-Proteasom-System vermittelt. Darüber hinaus habe ich festgestellt, dass die Behandlung mit Bortezomib, einem Inhibitor des Proteasoms, bei BLF1-vYFP-transgenen Pflanzen ebenfalls zu einer Anreicherung des BLF1-Proteins führt. Ich zeige dass RING/U-Box E3 mit BLF1 in den Zellkernen kolokalisiert ist und den BLF1-Proteinspiegel negativ reguliert. Die Analyse der Knock-out-Mutante ring-e3_1 legte eine Beteiligung das RING/U-Box-E3 Gen an der Kontrolle des Blattlänge nahe, was es zu einem guten Kandidaten macht, der die Funktion des BLF1-Gens regulieren könnte. KW - Barley KW - Gerste KW - leaf width KW - Blattbreite KW - cell proliferation KW - Zellproliferation KW - INDETERMINATE DOMAIN protein KW - INDETERMINATE DOMAIN-Protein KW - BROAD LEAF1 KW - RING/U-box E3 KW - ubiquitination KW - Ubiquitinierung KW - proteasomal degradation KW - 26S-Proteasom-System-Abbau KW - protein-level regulation KW - Proteinspiegel regulieren Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-607054 ER - TY - THES A1 - John, Sheeba T1 - Characterizing the role of Heat Shock Factor HSFA 7b in regulating thermomemory at the SAM in Arabidopsis thaliana N2 - Heat stress (HS) is one of the major abiotic stresses which adversely affects the survival and growth of plants due to their sessile nature. To combat the detrimental effects of HS and develop thermotolerance, plants have evolved several defense mechanisms. Thermomemory is one such molecular mechanism whereby plants that have been acclimated (or primed/P) by a moderate HS can respond more efficiently and continue their growth after exposure to a severe or lethal HS (called triggering/T), while unprimed plants cannot survive. Thermomemory is known to be regulated by several transcription factors (TFs), epigenetic changes, chromatin remodellers, post-transcriptional changes and it also involves protein stability control and primary metabolism adjustment. Recent research has suggested that the shoot apical meristem (SAM) in Arabidopsis thaliana has a distinct transcriptional thermomemory which is possibly regulated by eight TFs called HEAT SHOCK FACTORS (HSFs). The main objective of this PhD thesis is to investigate the role of HSFA7b (one of the eight HSFs), in regulating thermomemory at the SAM by identifying the molecular networks it regulates. HSFA7a, a close homolog of HSFA7b, is also one of the eight HSFs that are involved in regulating thermomemory at the SAM. Thermomemory was found to be defective in the hsfa7b and hsfa7a hsfa7b mutants; the percentage survival of these seedlings was significantly lower than in wild-type (WT) seedlings after the priming and triggering (PT) treatment. Transcriptome and ChIP analyses were performed to identify the molecular networks controlled by HSFA7b and its close homolog HSFA7a, in regulating thermomemory at the SAM. The chromatin regulator SPLAYED (SYD) was found to be regulated by both HSFA7a and HSFA7b at the SAM during thermomemory. SYD is directly involved in SAM maintenance by directly regulating WUSCHEL (WUS), a master regulator of stem cell maintenance. WUS expression was down-regulated at the SAM of PT treated hsfa7a/b mutants compared to WT-Col-0 seedlings. HSFA7a and HSFA7b also jointly regulate the expression of orphan gene QUA QUINE STARCH (QQS) during thermomemory. Starch accumulation negatively correlates with QQS expression and this trend was observed in WT plants in response to thermopriming. The remobilization of starch was affected in the hsfa7a/b mutants compared to WT plants during the recovery period after T treatment. These findings indicate that defects in SAM maintenance and starch remobilization could possibly contribute to the reduced thermomemory in the hsfa7a/b mutants. Moreover, transcriptome and ChIP analysis indicate that ethylene signaling genes are directly regulated by HSFA7b during thermomemory. Transcriptome analysis of the HSFA7b-IOE line indicates that HSFA7b positively regulates the expression of HEAT STRESS ASSOCIATED 32 (HSA32), an important thermomemory gene, and HSFA7b strongly suppresses the expression of the reactive oxygen species (ROS) responsive REDOX RESPONSIVE TRANSCRIPTION FACTOR 1 (RRTF1) gene, which is also a repressed target of SYD. In Arabidopsis, the HSFA7b transcript undergoes alternative splicing at high temperatures to form two splice variants: one correctly/constitutively spliced variant which is functional and codes for the HSFA7b protein and one intron retained splice variant. Higher accumulation of the functional HSFA7b splice variant was found at the SAM compared to other tissues. Moreover, accumulation of the functional splice variant was higher in P and PT plants compared to control plants, whereas higher levels of the intron retained splice variant is found in plants subjected directly to the T treatment. The intron retained HSFA7b splice variant is degraded by the non-sense mediated decay (NMD) pathway as a means of regulating transcript level essential for protein synthesis at high temperatures. Importantly, HSFA7b protein accumulation was observed in plants subjected to PT treatment that survive and continue growth, but not in plants subjected directly to T treatment that do not survive, indicating that constitutive/ correct splicing of the HSFA7b transcript is a component of thermomemory. Taken together, these findings suggest that HSFA7a and HSFA7b jointly regulate SAM maintenance via the chromatin remodeller SYD and starch remobilization via QQS. In addition to them, HSFA7b also regulates the expression of ethylene signaling genes, heat responsive genes and the ROS responsive RRTF1. Furthermore, constitutive/correct splicing in the HSFA7b transcript is also an essential component of thermomemory. Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Machani, Fridah Gechemba T1 - Functional analysis of ATAF1 and ANAC032 NAC transcription factors in response to nitrogen Supply in Arabidopsis thaliana Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Romero Prada, Lorena Margarita T1 - Crop improvement towards oxidative stress Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Stiegler, Jonas T1 - Mobile link functions in unpredictable agricultural landscapes N2 - Animal movement is a crucial aspect of life, influencing ecological and evolutionary processes. It plays an important role in shaping biodiversity patterns, connecting habitats and ecosystems. Anthropogenic landscape changes, such as in agricultural environments, can impede the movement of animals by affecting their ability to locate resources during recurring movements within home ranges and, on a larger scale, disrupt migration or dispersal. Inevitably, these changes in movement behavior have far-reaching consequences on the mobile link functions provided by species inhabiting such extensively altered matrix areas. In this thesis, I investigate the movement characteristics and activity patterns of the European hare (Lepus europaeus), aiming to understand their significance as a pivotal species in fragmented agricultural landscapes. I reveal intriguing results that shed light on the importance of hares for seed dispersal, the influence of personality traits on behavior and space use, the sensitivity of hares to extreme weather conditions, and the impacts of GPS collaring on mammals' activity patterns and movement behavior. In Chapter I, I conducted a controlled feeding experiment to investigate the potential impact of hares on seed dispersal. By additionally utilizing GPS data of hares in two contrasting landscapes, I demonstrated that hares play a vital role, acting as effective mobile linkers for many plant species in small and isolated habitat patches. The analysis of seed intake and germination success revealed that distinct seed traits, such as density, surface area, and shape, profoundly affect hares' ability to disperse seeds through endozoochory. These findings highlight the interplay between hares and plant communities and thus provide valuable insights into seed dispersal mechanisms in fragmented landscapes. By employing standardized behavioral tests in Chapter II, I revealed consistent behavioral responses among captive hares while simultaneously examining the intricate connection between personality traits and spatial patterns within wild hare populations. This analysis provides insights into the ecological interactions and dynamics within hare populations in agricultural habitats. Examining the concept of animal personality, I established a link between personality traits and hare behavior. I showed that boldness, measured through standardized tests, influences individual exploration styles, with shy and bold hares exhibiting distinct space use patterns. In addition to providing valuable insights into the role of animal personality in heterogeneous environments, my research introduced a novel approach demonstrating the feasibility of remotely assessing personality types using animal-borne sensors without additional disturbance of the focal individual. While climate conditions severely impact the activity and, consequently, the fitness of wildlife species across the globe, in Chapter III, I uncovered the sensitivity of hares to temperature, humidity, and wind speed during their peak reproduction period. I found a strong response in activity to high temperatures above 25°C, with a particularly pronounced effect during temperature extremes of over 35°C. The non-linear relationship between temperature and activity was characterized by contrasting responses observed for day and night. These findings emphasize the vulnerability of hares to climate change and the potential consequences for their fitness and population dynamics with the ongoing rise of temperature. Since such insights can only be obtained through capturing and tagging free-ranging animals, I assessed potential impacts and the recovery process post-collar attachment in Chapter IV. For this purpose, I examined the daily distances moved and the temporal-associated activity of 1451 terrestrial mammals out of 42 species during their initial tracking period. The disturbance intensity and the speed of recovery varied across species, with herbivores, females, and individuals captured and collared in relatively secluded study areas experiencing more pronounced disturbances due to limited anthropogenic influences. Mobile linkers are essential for maintaining biodiversity as they influence the dynamics and resilience of ecosystems. Furthermore, their ability to move through fragmented landscapes makes them a key component for restoring disturbed sites. Individual movement decisions determine the scale of mobile links, and understanding variations in space use among individuals is crucial for interpreting their functions. Climate change poses further challenges, with wildlife species expected to adjust their behavior, especially in response to high-temperature extremes, and comprehending the anthropogenic influence on animal movements will remain paramount to effective land use planning and the development of successful conservation strategies. This thesis provides a comprehensive ecological understanding of hares in agricultural landscapes. My research findings underscore the importance of hares as mobile linkers, the influence of personality traits on behavior and spatial patterns, the vulnerability of hares to extreme weather conditions, and the immediate consequences of collar attachment on mammalian movements. Thus, I contribute valuable insights to wildlife conservation and management efforts, aiding in developing strategies to mitigate the impact of environmental changes on hare populations. Moreover, these findings enable the development of methodologies aimed at minimizing the impacts of collaring while also identifying potential biases in the data, thereby benefiting both animal welfare and the scientific integrity of localization studies. N2 - Die Bewegung von Tieren ist ein entscheidender Aspekt des Lebens, der ökologische und evolutionäre Prozesse beeinflusst. Sie spielt eine wichtige Rolle bei der Gestaltung der biologischen Vielfalt und verbindet Lebensräume und Ökosysteme miteinander. Anthropogene Landschaftsveränderungen, z.B. in der Landwirtschaft, können die Bewegung von Tieren behindern, indem sie ihre Fähigkeiten beeinträchtigen, Ressourcen innerhalb ihres täglichen Bewegungsradius zu lokalisieren und im größeren Maßstab, ihre Wanderung oder Ausbreitung limitieren. In dieser Thesis untersuche ich die Bewegungsmerkmale und Aktivitätsmuster des Feldhasen (Lepus europaeus), um seine Bedeutung als Schlüsselart in fragmentierten Agrarlandschaften zu verstehen. Ich lege faszinierende Ergebnisse vor, die die Bedeutung des Hasen für die Verbreitung von Saatgut, den Einfluss von Persönlichkeitsmerkmalen auf das Verhalten und die Raumnutzung, die Sensibilität des Hasen gegenüber extremen Witterungsbedingungen und die Auswirkungen von GPS-Empfängern auf die Aktivitätsmuster und das Bewegungsverhalten der Säugetiere beleuchten. In Kapitel I führte ich ein kontrolliertes Fütterungsexperiment durch, um den potenziellen Einfluss von Hasen auf die Samenausbreitung zu analysieren. Durch die zusätzliche Verwendung von GPS-Daten von Hasen in zwei kontrastierenden Landschaften konnte ich nachweisen, dass Hasen eine wichtige Rolle spielen, da sie in kleinen und isolierten Habitatfeldern als effektive mobile Verbindungsglieder für viele Pflanzenarten fungieren. Die Analyse der Samenaufnahme und des Keimungserfolgs zeigte, dass verschiedene Eigenschaften der Samen, wie Dichte, Oberfläche und Form, die Fähigkeit der Hasen, Samen durch Endozoochorie zu verbreiten, stark beeinflussen. Diese Ergebnisse verdeutlichen die Wechselwirkung zwischen Hasen und Pflanzengemeinschaften und liefern somit wertvolle Erkenntnisse über die Mechanismen der Samenverbreitung in fragmentierten Landschaften. Durch den Einsatz standardisierter Verhaltenstests in Kapitel II konnte ich konsistente Verhaltensreaktionen bei in Gefangenschaft lebenden Hasen aufdecken und zeitgleich den komplexen Zusammenhang zwischen Persönlichkeitsmerkmalen und räumlichen Mustern in Wildhasenpopulationen untersuchen. Diese Analyse bietet Einblicke in die ökologischen Interaktionen und die Dynamik von Hasenpopulationen in landwirtschaftlichen Lebensräumen. Indem ich das Konzept der Tierpersönlichkeit untersuchte, stellte ich eine Verbindung zwischen Persönlichkeitsmerkmalen und dem Verhalten von Hasen her. Ich habe gezeigt, dass die durch standardisierte Tests gemessene Kühnheit den individuellen Erkundungsstil beeinflusst, wobei schüchterne und kühne Hasen unterschiedliche Raumnutzungsmuster aufweisen. Meine Forschung liefert nicht nur wertvolle Einblicke in die Rolle der Tierpersönlichkeit in heterogenen Umgebungen, sondern stellt auch einen neuartigen Ansatz vor, der die Durchführbarkeit einer Fernbeurteilung von Persönlichkeitstypen mithilfe von am Tier angebrachten Sensoren ohne zusätzliche Störung des Zielindividuums demonstrierte. Da die Klimabedingungen die Aktivität und folglich die Fitness von Wildtierarten auf der ganzen Welt stark beeinflussen, habe ich in Kapitel III die Sensibilität von Hasen gegenüber Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Windgeschwindigkeit während ihrer Hauptfortpflanzungszeit ermittelt. Ich stellte fest, dass die Aktivität stark auf hohe Temperaturen über 25 °C reagiert, wobei die Auswirkungen bei extremen Temperaturen von über 35 °C besonders ausgeprägt sind. Die nicht lineare Beziehung zwischen Temperatur und Aktivität war durch gegensätzliche Reaktionen bei Tag und Nacht gekennzeichnet. Diese Ergebnisse unterstreichen die Anfälligkeit der Hasen für den Klimawandel und die möglichen Folgen für ihre Fitness und Populationsdynamik bei einem anhaltenden Temperaturanstieg. Da solche Erkenntnisse nur durch Fangen und Besendern von Wildtieren ermöglicht werden können, habe ich in Kapitel IV die potenziellen negativen Auswirkungen auf das Individuuum, sowie den Erholungsprozess nach dem Anlegen des Halsbandes untersucht. Hierfür analysierte ich die zurückgelegten täglichen Entfernungen in Verbindung mit der Aktivität von 1451 terrestrischen Säugetieren aus 42 verschiedenen Arten während ihrer anfänglichen Verfolgung. Die Intensität der Störung sowie die Geschwindigkeit der Erholung variieren je nach Art, wobei Pflanzenfresser, Weibchen und Individuen, die in relativ abgelegenen Untersuchungsgebieten gefangen und mit Halsbändern versehen wurden, aufgrund bisher begrenzter anthropogener Einflüsse stärkere Störungen erfahren. Mobile Verbindungsglieder sind essentiell für die Erhaltung der Biodiversität, indem sie eine wichtige Rolle in der Dynamik und Resilienz von Ökosystemen spielen. Weiterhin macht ihre Fähigkeit, sich durch zerstückelte Landschaften zu bewegen sie zu wichtigen Schlüsselkomponenten bei der Wiederherstellung von zerstörten Landschaften. Individuelle Bewegungsentscheidungen bestimmen den Maßstab der mobilen Verbindungen und die Schwankungen der Raumnutzung unter Individuen zu verstehen ist unerlässlich, um deren Funktion zu interpretieren. Der Klimawandel stellt eine weitere Herausforderung dar, indem Wildtiere dazu gezwungen werden, sich zu adaptieren, insbesondere an Hochtemperatur-Extreme. Den anthropogenen Einfluss auf Tierbewegungen aufzudecken bleibt von größter Bedeutung in der Landnutzungsplanung und die Entwicklung von erfolgreichen Strategien zum Schutz der Natur. Diese Thesis liefert ein umfassendes ökologisches Verständnis von Feldhasen in Agrarlandschaften. Die Ergebnisse meiner Forschung unterstreichen die Bedeutung von Hasen als mobile Bindeglieder, den Einfluss von Persönlichkeitsmerkmalen auf Verhalten und räumliche Muster, die Anfälligkeit von Hasen gegenüber extremen Wetterbedingungen und die unmittelbaren Folgen der Halsbandanbringung auf Tierbewegungen. Damit leiste ich einen wertvollen Beitrag zum Schutz und zur Bewirtschaftung von Wildtieren, indem ich die Entwicklung von Strategien zur Abschwächung der Auswirkungen von Umweltveränderungen auf Hasenpopulationen unterstütze. Darüber hinaus ermöglichen diese Erkenntnisse die Entwicklung von Methoden, die darauf abzielen, die Folgen der Halsbandanbringung zu minimieren und gleichzeitig potenzielle Verzerrungen in den Daten zu identifizieren, was sowohl dem Tierschutz als auch der wissenschaftlichen Integrität von Lokalisierungsstudien zugutekommt. KW - European hare KW - mammals KW - ecology KW - animal personality KW - seed dispersal KW - movement ecology KW - tracking impacts KW - energy budget KW - climate change KW - accelerometry KW - GPS KW - tracking KW - Feldhase KW - GPS KW - Beschleunigungsmessungen KW - Tierpersönlichkeit KW - Klimawandel KW - Tierökologie KW - Energiebudget KW - Säugetiere KW - Bewegungsökologie KW - Samenausbreitung KW - Tierortung KW - Konsequenzen von Fang und Besenderung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-622023 ER - TY - THES A1 - Pankaj, Rishabh T1 - Epigenetic reprogramming of seed development BT - exploring the role of histone demethylases and DNA methylation in arabidopsis N2 - The development of seeds in angiosperms starts with a complex process of double fertilization, involving the fusion of the maternal egg cell and central cell with two paternal sperm cells. This gives rise to the embryo and the nourishing endosperm, which are then enclosed by the seed coat, derived from the maternal integuments. The growth of the seed coat in Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) is actively inhibited before fertilization by epigenetic regulators known as Polycomb Group (PcG) proteins. These proteins deposit a repressive histone mark called H3K27me3, which must be removed to enable seed coat formation. In this thesis, I explored the mechanism of removal of H3K27me3 marks from the integument cells following fertilization, which allows for seed coat formation. We hypothesized that this removal should be primarily facilitated by histone demethylases from the JMJ family and potentially influenced by the plant hormones Brassinosteroids (BRs). This hypothesis was supported by the expression patterns of the JMJ protein REF6 and of BR related genes, which are specifically expressed in the integuments and in the seed coat. Moreover, mutations in both these pathways lead to developmental defects, such as reduced ovule viability and delayed seed coat growth. Our research provides evidence suggesting that BR signalling is likely involved in recruiting JMJ-type histone demethylases to target loci responsible for seed coat growth. Moreover, we have discovered an additional pathway through which BRs regulate seed coat development, independent of their influence on H3K27me3 marks. This finding emphasizes the diverse roles of BRs in coordinating seed development, extending beyond their well-known involvement in plant growth and development. Furthermore, I explored the role of another epigenetic mark, DNA methylation, in fertilization-independent (or autonomous) seed formation in Arabidopsis. For this, we utilized epigenetic Recombinant Inbred Lines (epiRILs) and thus identified an epigenetic Quantitative Trait Locus (epiQTL) on chromosome II, potentially responsible for the larger autonomous seed size observed in DNA methylation mutants. Overall, this thesis significantly enhances our comprehension of the intricate relationship between epigenetic modifications, hormonal signaling, and plant reproductive processes. It offers valuable insights into the genetic mechanisms governing both sexual and asexual seed formation, while also presenting potential avenues for the engineer of advantageous traits in agricultural crops. KW - Epigenetics KW - Seed development KW - Seed Coat Development KW - H3K27me3 Methylation KW - Auxin KW - Brassinosteriods KW - DNA Methylation KW - JUMONJI KW - Histone Modification Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Ogunkola, Moses T1 - Role of the tRNA thiouridine modification protein (TUM1) as a sulfurtransferase in humans T1 - Die Rolle des tRNA-Thiouridin-Modifikationsproteins (TUM1) als Sulfurtransferase beim Menschen N2 - Sulfur is essential for the functionality of some important biomolecules in humans. Biomolecules like the Iron-sulfur clusters, tRNAs, Molybdenum cofactor, and some vitamins. The trafficking of sulfur involves proteins collectively called sulfurtransferase. Among these are TUM1, MOCS3, and NFS1. This research investigated the role of TUM1 for molybdenum cofactor biosynthesis and cytosolic tRNA thiolation in humans. The rhodanese-like protein MOCS3 and the L-cysteine desulfurase (NFS1) have been previously demonstrated to interact with TUM1. These interactions suggested a dual function of TUM1 in sulfur transfer for Moco biosynthesis and cytosolic tRNA thiolation. TUM1 deficiency has been implicated to be responsible for a rare inheritable disorder known as mercaptolactate cysteine disulfiduria (MCDU), which is associated with a mental disorder. This mental disorder is similar to the symptoms of sulfite oxidase deficiency which is characterised by neurological disorders. Therefore, the role of TUM1 as a sulfurtransferase in humans was investigated, in CRISPR/Cas9 generated TUM1 knockout HEK 293T cell lines. For the first time, TUM1 was implicated in Moco biosynthesis in humans by quantifying the intermediate product cPMP and Moco using HPLC. Comparing the TUM1 knockout cell lines to the wild-type, accumulation and reduction of cPMP and Moco were observed respectively. The effect of TUM1 knockout on the activity of a Moco-dependent enzyme, Sulfite oxidase, was also investigated. Sulfite oxidase is essential for the detoxification of sulfite to sulfate. Sulfite oxidase activity and protein abundance were reduced due to less availability of Moco. This shows that TUM1 is essential for efficient sulfur transfer for Moco biosynthesis. Reduction in cystathionin -lyase in TUM1 knockout cells was quantified, a possible coping mechanism of the cell against sulfite production through cysteine catabolism. Secondly, the involvement of TUM1 in tRNA thio-modification at the wobble Uridine-34 was reported by quantifying the amount of mcm5s2U and mcm5U via HPLC. The reduction and accumulation of mcm5s2U and mcm5U in TUM1 knockout cells were observed in the nucleoside analysis. Herein, exogenous treatment with NaHS, a hydrogen sulfide donor, rescued the Moco biosynthesis, cytosolic tRNA thiolation, and cell proliferation deficits in TUM1 knockout cells. Further, TUM1 was shown to impact mitochondria bioenergetics through the measurement of the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate (ECAR) via the seahorse cell Mito stress analyzer. Reduction in total ATP production was also measured. This reveals how important TUM1 is for H2S biosynthesis in the mitochondria of HEK 293T. Finally, the inhibition of NFS1 in HEK 293T and purified NFS1 protein by 2-methylene 3-quinuclidinone was demonstrated via spectrophotometric and radioactivity quantification. Inhibition of NFS1 by MQ further affected the iron-sulfur cluster-dependent enzyme aconitase activity. N2 - Schwefel ist für die Funktionalität einiger wichtiger Biomoleküle beim Menschen wie die Eisen-Schwefel-Cluster, tRNA, Molybdän-Cofaktoren und einige Vitamine unerlässlich. Am Schwefelverkehr ist eine weit verbreitete Gruppe von Proteinen beteiligt, die als Rhodanese (Sulfurtransferase) bezeichnet wird. Zu dieser Klasse von Enzymen gehören die humanen (Proteine) TUM1, MOCS3 und NFS1. Es hat sich gezeigt, dass TUM1 mit der L-Cystein-Desulfurase (NFS1) und dem rhodaneseähnlichen Protein MOCS3 interagiert. Diese Wechselwirkungen deuten auf eine Doppelfunktion von TUM1 beim Schwefeltransfer für die Moco-Biosynthese und die zytosolische tRNA-Thiolierung hin. Ein TUM1-Mangel wird für eine seltene vererbbare Störung verantwortlich gemacht, die als Mercaptolactat-Cystein-Disulfidurie (MCDU) bekannt ist und mit geistigen Störungen einhergeht. Diese psychische Störung könnte auf die Symptome des Sulfit-Oxidase-Mangels zurückzuführen sein, der auch durch neurologische Störungen gekennzeichnet ist. In dieser Studie wurde zum ersten Mal die Rolle von TUM1 bei der Biosynthese von Molybdän-Cofaktoren und der zytosolischen tRNA-Thiolierung beim Menschen untersucht. Dies wurde durch die Verwendung von einer zuvor generierten TUM1-Deletion in HEK 293T-Zelllinien unter Verwendung von CRISPR/Cas9 erreicht. Hier wurde zum ersten Mal die Funktion von TUM1 in der Moco-Biosynthese im Menschen untersucht, wobei das Zwischenprodukt cPMP und Moco mittels HPLC quantifiziert wurde. Beim Vergleich der TUM1-deletierten-Zelllinien mit dem Wildtyp wurde eine Akkumulation bzw. Reduktion von cPMP und Moco beobachtet. Die Auswirkungen der TUM1-Deletion auf die Aktivität eines Moco-abhängigen Enzyms, der Sulfit-Oxidase, wurden ebenfalls untersucht. Sulfit ist wichtig für die Entgiftung von Sulfit zu Sulfat. Die Aktivität der Sulfit-Oxidase und die Proteinquantität waren aufgrund der geringeren Verfügbarkeit von Moco reduziert. Dies zeigt, dass TUM1 für einen effizienten Schwefeltransfer für die Moco-Biosynthese wichtig ist. Wir berichteten auch über die Verringerung der Cystathionin -Lyase in TUM1-deletierten-Zellen, ein möglicher Bewältigungsmechanismus der Zelle gegen die Sulfitproduktion. Zweitens wurde die Beteiligung von TUM1 an der tRNA-ThioModifikation am Wobble Uridin-34 durch Quantifizierung der Menge an mcm5s2U und mcm5U mittels HPLC untersucht. Es wurde eine Reduktion bzw. Akkumulation von mcm5s2U und mcm5U in TUM1-Knockout-Zellen beobachtet. Die exogene Behandlung mit NaHS, einem Schwefelwasserstoff-Donor, rettete die Moco-Biosynthese, die zytosolische tRNA-Thiolation und das Defizit der Zellproliferation in TUM1-deletion-Zellen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass TUM1 die Bioenergetik der Mitochondrien beeinflusst, indem die Sauerstoffverbrauchsrate und die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) über den Seahorse XF Analyzer gemessen wurden. Eine Verringerung der gesamten ATP-Produktion war ebenfalls erkennbar. Dies zeigt, wie wichtig TUM1 für die H2S-Biosynthese in den Mitochondrien von HEK 293T ist. Schließlich wurde die Hemmung von NFS1 in HEK 293T und gereinigtem NFS1-Protein durch 2-Methylen-3-chinuclidinon mittels spektrophotometrischer und radioaktiver Quantifizierung nachgewiesen. Die Hemmung von NFS1 durch 2-Methylen-3-chinuclidinon verringerte die Aktivität des von Eisen-Schwefel-Clustern abhängigen Enzyms Aconitase in HEK 293T. KW - Moco biosynthesis KW - sulfite oxidase KW - cytosolic tRNA thiolation KW - 5-methoxycarbonylmethyl-2-thiouridine KW - H2S biosynthesis KW - cellular bioenergetics KW - Moco-Biosynthese KW - Sulfit-Oxidase KW - zytosolische tRNA-Thiolierung KW - 5-Methoxycarbonylmethyl-2-Thiouridin KW - H2S-Biosynthese KW - zelluläre Bioenergetik Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-611357 ER - TY - THES A1 - Li, Xiaoping T1 - Regulation of starch granule number and morphology in arabidopsis thaliana Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Schlossarek, Dennis T1 - Identification of dynamic protein-metabolite complexes in saccharomyces cerevisiae using co-fractionation mass spectrometry T1 - Identifikation von dynamischen Protein-Metabolit Komplexes in Saccharomyces cerevisiae unter Nutzung der Co-Fraktionierungs Massenspektrometrie N2 - Cells are built from a variety of macromolecules and metabolites. Both, the proteome and the metabolome are highly dynamic and responsive to environmental cues and developmental processes. But it is not their bare numbers, but their interactions that enable life. The protein-protein (PPI) and protein-metabolite interactions (PMI) facilitate and regulate all aspects of cell biology, from metabolism to mitosis. Therefore, the study of PPIs and PMIs and their dynamics in a cell-wide context is of great scientific interest. In this dissertation, I aim to chart a map of the dynamic PPIs and PMIs across metabolic and cellular transitions. As a model system, I study the shift from the fermentative to the respiratory growth, known as the diauxic shift, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. To do so, I am applying a co-fractionation mass spectrometry (CF-MS) based method, dubbed protein metabolite interactions using size separation (PROMIS). PROMIS, as well as comparable methods, will be discussed in detail in chapter 1. Since PROMIS was developed originally for Arabidopsis thaliana, in chapter 2, I will describe the adaptation of PROMIS to S. cerevisiae. Here, the obtained results demonstrated a wealth of protein-metabolite interactions, and experimentally validated 225 previously predicted PMIs. Applying orthogonal, targeted approaches to validate the interactions of a proteogenic dipeptide, Ser-Leu, five novel protein-interactors were found. One of those proteins, phosphoglycerate kinase, is inhibited by Ser-Leu, placing the dipeptide at the regulation of glycolysis. In chapter 3, I am presenting PROMISed, a novel web-tool designed for the analysis of PROMIS- and other CF-MS-datasets. Starting with raw fractionation profiles, PROMISed enables data pre-processing, profile deconvolution, scores differences in fractionation profiles between experimental conditions, and ultimately charts interaction networks. PROMISed comes with a user-friendly graphic interface, and thus enables the routine analysis of CF-MS data by non-computational biologists. Finally, in chapter 4, I applied PROMIS in combination with the isothermal shift assay to the diauxic shift in S. cerevisiae to study changes in the PPI and PMI landscape across this metabolic transition. I found a major rewiring of protein-protein-metabolite complexes, exemplified by the disassembly of the proteasome in the respiratory phase, the loss of interaction of an enzyme involved in amino acid biosynthesis and its cofactor, as well as phase and structure specific interactions between dipeptides and enzymes of central carbon metabolism. In chapter 5, I am summarizing the presented results, and discuss a strategy to unravel the potential patterns of dipeptide accumulation and binding specificities. Lastly, I recapitulate recently postulated guidelines for CF-MS experiments, and give an outlook of protein interaction studies in the near future. N2 - Die Zelle besteht aus einer Vielzahl von großen und kleinen Molekülen, und sowohl das Proteom als auch das Metabolom passen sich dynamisch den vorherrschenden Umweltbedingungen oder zellulären Anforderungen an. Allerdings ist es nicht die bloße Menge an biologischen Molekülen, sondern deren Interaktionen miteinander, die das Leben erst ermöglichen. Protein-Protein (PPI) und Protein-Metabolit Interaktionen (PMI) vollbringen und regulieren alle Aspekte der Zelle, vom Stoffwechsel bis zur Mitose. Die Studie dieser Interaktionen ist daher von fundamentalem wissenschaftlichem Interesse. In dieser Dissertation strebe ich an, eine Karte der Protein-Protein und Protein-Metabolit Interaktionen zu zeichnen, die den Übergang vom fermentativen zum respiratioschen Stoffwechsel in der Hefe Saccharomyces cerevisiae umfasst. Zu diesem Zweck nutze ich PROMIS (egl. protein metabolite interactions using size separation), eine auf der co-Fraktionierungs Massensprektrometrie (CF-MS) aufbauende Methode. PROMIS, und ähnliche Methoden zur Untersuchung von Protein-Interkationen, werden ausgiebig in Kapitel 1 vorgestellt. Da PROMIS ursprünglich für die Modellpflanze Arabadopsis thaliana entwickelt wurde, beschreibe ich in Kapitel 2 zunächst die erste Anwendung der Methode in S. cerevisiae. Die Ergebnisse stellen eine Fülle an Protein-Metabolit Interaktionen dar, und 225 zuvor prognostizierte Interaktionen wurden das erste Mal experimentell beschrieben. Mit Hilfe orthogonaler Methoden wurde außerdem eine inhibitorische Interaktion zwischen dem proteinogenen Dipeptid Ser-Leu und einem Enzym der Glykolyse gefunden. In Kapitel 3 präsentiere ich PROMISed, eine neue Web-Anwendung zur Auswertung von Daten von PROMIS oder anderen CF-MS Experimente. PROMISed kann genutzt werden um in rohen Fraktionierungs-Profile lokale Maxima zu finden, aus denen ein Interaktions-Netzwerk basierend auf Korrelationen erstellt wird. Außerdem kann die Anwendung Unterschiede in den Profilen zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen bewerten. PROMISed umfasst eine benutzerfreundliche grafische Oberfläche und bedarf daher keiner Programmierkenntnisse zur Nutzung. In Kapitel 4 benutze ich schließlich PROMIS und ItSA (engl. isothermal shift assay) um PPI und PMI während des Übergangs vom fermentativen zum respiratorischen Stoffwechsel in Hefe zu untersuchen. Hier beschreibe ich eine zellweite Umbildung der Protein-Metabolit-Komplexe, bespielhaft beschrieben anhand des Auseinanderfallens des Proteasoms im respiratorischen Stoffwechsel, des Verlustes der Interaktion zwischen einem Enzym des Aminosäure Stoffwechsels mit seinem Cofaktor und spezifischen Interaktionen zwischen Dipeptiden und Enzymen des zentralen Stoffwechsels. In Kapitel 5 fasse ich die gefundenen Ergebnisse zusammen und stelle eine Strategie zur Untersuchung der Spezifität sowohl der Bildung als auch der Protein-Interaktionen von Dipeptiden vor. Zu aller letzt rekapituliere ich Richtlinien für CF-MS Experimente und gebe einen Ausblick auf die nahe Zukunft der Studien der Protein-Interkationen. KW - Protein KW - Metabolit KW - Interaktion KW - Interaktions Netzwerk KW - Stoffwechsel KW - Saccharomyces cerevisiae KW - protein KW - metabolite KW - interaction KW - interaction network KW - metabolism KW - saccharomyces cerevisiae KW - interactomics KW - proteomics KW - metabolomics Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-582826 ER - TY - THES A1 - Sarlet, Adrien T1 - Tuning the viscoelasticity of Escherichia coli biofilms T1 - Abstimmung der Viskoelastizität von Escherichia coli-Biofilmen BT - interplay between extrinsic and intrinsic factors BT - Wechselspiel zwischen extrinsischen und intrinsischen Faktoren N2 - Biofilms are heterogeneous structures made of microorganisms embedded in a self-secreted extracellular matrix. Recently, biofilms have been studied as sustainable living materials with a focus on the tuning of their mechanical properties. One way of doing so is to use metal ions. In particular biofilms have been shown to stiffen in presence of some metal cations and to soften in presence of others. However, the specificity and the determinants of those interactions vary between species. While Escherichia coli is a widely studied model organism, little is known concerning the response of its biofilms to metal ions. In this work, we aimed at tuning the mechanics of E. coli biofilms by acting on the interplay between matrix composition and metal cations. To do so, we worked with E. coli strains producing a matrix composed of curli amyloid fibres or phosphoethanolamine-cellulose (pEtN-cellulose) fibres or both. The viscoelastic behaviour of the resulting biofilms was investigated with rheology after incubation with one of the following metal ion solutions: FeCl3, AlCl3, ZnCl2 and CaCl2 or ultrapure water. We observed that the strain producing both fibres stiffen by a factor of two when exposed to the trivalent metal cations Al(III) and Fe(III) while no such response is observed for the bivalent cations Zn(II) and Ca(II). Strains producing only one matrix component did not show any stiffening in response to either cation, but even a small softening. In order to investigate further the contribution of each matrix component to the mechanical properties, we introduced additional bacterial strains producing curli fibres in combination with non-modified cellulose, non-modified cellulose only or neither component. We measured biofilms produced by those different strains with rheology and without any solution. Since rheology does not preserve the architecture of the matrix, we compared those results to the mechanical properties of biofilms probed with the non-destructive microindentation. The microindentation results showed that biofilm stiffness is mainly determined by the presence of curli amyloid fibres in the matrix. However, this clear distinction between biofilm matrices containing or not containing curli is absent from the rheology results, i.e. following partial destruction of the matrix architecture. In addition, rheology also indicated a negative impact of curli on biofilm yield stress and flow stress. This suggests that curli fibres are more brittle and therefore more affected by the mechanical treatments. Finally, to examine the molecular interactions between the biofilms and the metal cations, we used Attenuated total reflectance - Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to study the three E.coli strains producing a matrix composed of curli amyloid fibres, pEtN-cellulose fibres or both. We measured biofilms produced by those strains in presence of each of the aforementioned metal cation solutions or ultrapure water. We showed that the three strains cannot be distinguished based on their FTIR spectra and that metal cations seem to have a non-specific effect on bacterial membranes in absence of pEtN-cellulose. We subsequently conducted similar experiments on purified curli or pEtN-cellulose fibres. The spectra of the pEtN-cellulose fibres revealed a non-valence-specific interaction between metal cations and the phosphate of the pEtN-modification. Altogether, these results demonstrate that the mechanical properties of E. coli biofilms can be tuned via incubation with metal ions. While the mechanism involving curli fibres remains to be determined, metal cations seem to adsorb onto pEtN-cellulose and this is not valence-specific. This work also underlines the importance of matrix architecture to biofilm mechanics and emphasises the specificity of each matrix composition. N2 - Biofilme sind heterogene Strukturen aus Mikroorganismen, die in eine selbst-abgesonderte extrazelluläre Matrix eingebettet sind. In letzter Zeit wurden Biofilme als nachhaltige lebende Materialien untersucht, mit dem Ziel ihre mechanischen Eigenschaften zu modifizieren. Eine Möglichkeit, dies zu tun, ist die Verwendung von Metallionen. Es hat sich gezeigt, dass Biofilme in Gegenwart einiger Metallkationen steifer und in Gegenwart anderer weicher werden. Die Spezifität und die Bestimmungsfaktoren dieser Wechselwirkungen sind jedoch je nach Spezies unterschiedlich. Obwohl Escherichia coli ein weithin untersuchter Modellorganismus ist, ist wenig über den Einfluss von Metallionen auf die Eigenschaften von E. coli-Biofilmen bekannt. Ziel dieser Arbeit war, die mechanischen Eigenschaften von E. coli-Biofilmen durch Beeinflussung des Zusammenspiels von Matrixzusammensetzung und Metallkationen zu untersuchen und zu verändern. Zu diesem Zweck wurden E. coli-Stämme verwendet, die eine Matrix aus Curli-Fasern oder Phosphoethanolamin-modifizierter Zellulose (pEtN-Zellulose) oder aus beiden produzieren. Das viskoelastische Verhalten der resultierenden Biofilme wurde nach Inkubation mit einer der folgenden Metallsalzlösungen (oder Reinstwasser) rheologisch untersucht: FeCl3, AlCl3, ZnCl2 und CaCl2. Es zeigte sich, dass die Steifigkeit von Biofilmen des Stammes, der beide Fasern produziert, um das Doppelte höher ist, wenn sie den dreiwertigen Metallkationen Al(III) und Fe(III) ausgesetzt werden. Im Gegensatz dazu konnte keine derartige Veränderung der Steifigkeit beobachtet werden, wenn stattdessen die zweiwertigen Kationen Zn(II) und Ca(II) zugesetzt wurden. Stämme, die nur eine Matrixkomponente produzieren, zeigten keine Versteifung in Gegenwart von Kationen, sondern sogar eine geringe Erweichung. Um den Beitrag der einzelnen Matrixkomponenten zu den mechanischen Eigenschaften weiter zu untersuchen, wurden weitere Bakterienstämme mit den bereits genannten verglichen. Diese Stämme produzieren entweder Curli-Fasern in Kombination mit nicht modifizierter Zellulose, ausschließlich nicht modifizierte Zellulose oder keine der beiden Komponenten. Die resultierenden Biofilme wurden ohne den Zusatz von Salzlösung rheologisch charakterisiert. Da die Matrixarchitektur bei Rheologiemessungen zerstört wird, wurden die Biofilme ebenfalls mit Mikroindentation untersucht, welche mit intakten Biofilmen durchgeführt werden kann. Die Ergebnisse der Mikroindentation zeigen, dass die Steifigkeit der Biofilme hauptsächlich durch das Vorhandensein von Curli-Fasern bestimmt wird. Diese klare Unterscheidung der mechanischen Eigenschaften zwischen Biofilmmatrices mit und ohne Curli ist jedoch in den rheologischen Ergebnissen nicht erkennbar, d. h. nach teilweiser Zerstörung der Matrixarchitektur. Darüber hinaus zeigte die Rheologie eine niedrigere Fließspannung für Biofilme, die Curli enthalten. In der Kombination deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Curli-Fasern spröder und daher stärker von der mechanischen Behandlung betroffen sind. Um die molekularen Wechselwirkungen zwischen der Biofilm-Matrix und Metallkationen zu untersuchen, wurden die drei E. coli-Stämme, die eine Matrix aus Curli-Fasern, pEtN-Zellulose oder beidem bilden, mit abgeschwächter Totalreflexions-Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie (ATR-FTIR) charakterisiert. Die von diesen Stämmen produzierten Biofilme wurden in Gegenwart jeder der oben genannten Metallsalzlösungen und in Reinstwasser untersucht. Es wurde gezeigt, dass die drei Stämme anhand ihrer FTIR-Spektren nicht unterschieden werden können und dass in Abwesenheit von pEtN-Zellulose eine mögliche unspezifische Wirkung auf bakterielle Membranen besteht. Ähnliche Experimente mit gereinigten Curli-Fasern oder pEtN-Zellulose deuten darauf hin, dass Metallkationen in erster Linie eine nicht-valenzspezifische Wechselwirkung mit der Phosphatgruppe der pEtN-Modifikation eingehen. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die mechanischen Eigenschaften von E. coli-Biofilmen durch Inkubation mit Metallkationen modifiziert werden können. Während die Mechanismen, an denen Curli-Fasern beteiligt sind, noch nicht aufgeklärt sind, scheinen Metallkationen an pEtN-Zellulose zu adsorbieren. Diese Arbeit unterstreicht auch die Bedeutung der Matrixarchitektur für die Mechanik von Biofilmen und verdeutlicht die Wichtigkeit der jeweiligen Matrixzusammensetzung für die Spezifität und das Ausmaß der beobachteten Effekte. KW - E. coli KW - biofilm KW - metal cation KW - matrix KW - viscoelasticity KW - E. coli KW - Biofilm KW - Metallkation KW - Matrix KW - Viskoelastizität Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Flores Castellanos, Junio T1 - Potato tuber (Solanum tuberosum L. cv Desiree) — characterization of starch interacting proteins and maltodextrin metabolism T1 - Kartoffelknolle (Solanum tuberosum L. cv Desiree) - Charakterisierung von Stärke-interagierenden Proteinen und Maltodextrin-Stoffwechsel N2 - Starch is a biopolymer for which, despite its simple composition, understanding the precise mechanism behind its formation and regulation has been challenging. Several approaches and bioanalytical tools can be used to expand the knowledge on the different parts involved in the starch metabolism. In this sense, a comprehensive analysis targeting two of the main groups of molecules involved in this process: proteins, as effectors/regulators of the starch metabolism, and maltodextrins as starch components and degradation products, was conducted in this research work using potato plants (Solanum tuberosum L. cv. Desiree) as model of study. On one side, proteins physically interacting to potato starch were isolated and analyzed through mass spectrometry and western blot for their identification. Alternatively, starch interacting proteins were explored in potato tubers from transgenic plants having antisense inhibition of starch-related enzymes and on tubers stored under variable environmental conditions. Most of the proteins recovered from the starch granules corresponded to previously described proteins having a specific role in the starch metabolic pathway. Another set of proteins could be grouped as protease inhibitors, which were found weakly interacting to starch. Variations in the protein profile obtained after electrophoresis separation became clear when tubers were stored under different temperatures, indicating a differential expression of proteins in response to changing environmental conditions. On the other side, since maltodextrin metabolism is thought to be involved in both starch initiation and degradation, soluble maltooligosaccharide content in potato tubers was analyzed in this work under diverse experimental variables. For this, tuber disc samples from wild type and transgenic lines strongly repressing either the plastidial or cytosolic form of the -glucan phosphorylase and phosphoglucomutase were incubated with glucose, glucose-6-phosphate, and glucose-1-phosphate solutions to evaluate the influence of such enzymes on the conversion of the carbon sources into soluble maltodextrins, in comparison to wild-type samples. Relative maltodextrin amounts analyzed through capillary electrophoresis equipped with laser-induced fluorescence (CE-LIF) revealed that tuber discs could immediately uptake glucose-1-phosphate and use it to produce maltooligosaccharides with a degree of polymerization of up to 30 (DP30), in contrast to transgenic tubers with strong repression of the plastidial glucan phosphorylase. The results obtained from the maltodextrin analysis support previous indications that a specific transporter for glucose-1-phosphate may exist in both the plant cells and the plastidial membranes, thereby allowing a glucose-6-phosphate independent transport. Furthermore, it confirms that the plastidial glucan phosphorylase is responsible for producing longer maltooligosaccharides in the plastids by catalyzing a glucan polymerization reaction when glucose-1-phosphate is available. All these findings contribute to a better understanding of the role of the plastidial glucan phosphorylase as a key enzyme directly involved in the synthesis and degradation of glucans and their implication on starch metabolism. N2 - Stärke ist ein Biopolymer, bei dem es trotz seiner einfachen Zusammensetzung schwierig ist, den genauen Mechanismus seiner Bildung und Regulierung zu verstehen. Verschiedene Ansätze und bioanalytische Instrumente können genutzt werden, um das Wissen über die verschiedenen am Stärkemetabolismus beteiligten Komponenten zu erweitern. In diesem Sinne wurde in dieser Forschungsarbeit eine umfassende Analyse durchgeführt, die auf zwei der wichtigsten Molekülgruppen abzielt, die an diesem Prozess beteiligt sind: Proteine als Effektoren/Regulatoren des Stärkestoffwechsels und Maltodextrine als Stärkebestandteile und Abbauprodukte, wobei Kartoffelpflanzen (Solanum tuberosum L. cv. Desiree) als Untersuchungsmodell dienten. Einerseits wurden Proteine, die physisch mit Kartoffelstärke interagieren, isoliert und mittels Massenspektrometrie und Western Blot analysiert, um sie zu identifizieren. Andererseits wurden die mit Stärke interagierenden Proteine in Kartoffelknollen von transgenen Pflanzen mit Antisense-Hemmung von stärkeverwandten Enzymen und in Knollen, die unter variablen Umweltbedingungen gelagert wurden, untersucht. Die meisten der aus den Stärkekörnchen gewonnenen Proteine entsprachen zuvor beschriebenen Proteinen, die eine spezifische Rolle im Stärkestoffwechselweg spielen. Eine andere Gruppe von Proteinen konnte als Proteaseinhibitoren gruppiert werden, die nur schwach mit der Stärke interagieren. Variationen im Proteinprofil nach der Elektrophorese-Trennung wurden deutlich, wenn die Knollen bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert wurden, was auf eine unterschiedliche Expression von Proteinen als Reaktion auf wechselnde Umweltbedingungen hindeutet. Da man davon ausgeht, dass der Maltodextrin-Stoffwechsel sowohl an der Entstehung als auch am Abbau von Stärke beteiligt ist, wurde in dieser Arbeit der Gehalt an löslichen Maltooligosacchariden in Kartoffelknollen unter verschiedenen experimentellen Variablen analysiert. Zu diesem Zweck wurden Knollenscheibenproben von Wildtypen und transgenen Linien, die entweder die plastidiale oder die cytosolische Form der α-Glucanphosphorylase und Phosphoglucomutase stark unterdrücken, mit Glucose-, Glucose-6-Phosphat- und Glucose-1-Phosphat-Lösungen inkubiert, um den Einfluss dieser Enzyme auf die Umwandlung der Kohlenstoffquellen in lösliche Maltodextrine im Vergleich zu Wildtyp-Proben zu bewerten. Relative Maltodextrinmengen, die durch Kapillarelektrophorese mit laserinduzierter Fluoreszenz (CE-LIF) analysiert wurden, zeigten, dass die Knollenscheiben Glukose-1-Phosphat sofort aufnehmen und zur Herstellung von Maltooligosacchariden mit einem Polymerisationsgrad von bis zu 30 (DP30) verwenden konnten, im Gegensatz zu transgenen Knollen mit starker Unterdrückung der plastidialen Glukanphosphorylase. Die Ergebnisse der Maltodextrin-Analyse stützen frühere Hinweise darauf, dass ein spezifischer Transporter für Glucose-1-Phosphat sowohl in den Pflanzenzellen als auch in den plastidialen Membranen vorhanden sein könnte, was einen von Glucose-6-Phosphat unabhängigen Transport ermöglicht. Außerdem wird bestätigt, dass die plastidiale Glucanphosphorylase für die Herstellung längerer Maltooligosaccharide in den Plastiden verantwortlich ist, indem sie eine Glucanpolymerisationsreaktion katalysiert, wenn Glucose-1-Phosphat verfügbar ist. All diese Erkenntnisse tragen zu einem besseren Verständnis der Rolle der plastidialen Glucanphosphorylase als Schlüsselenzym bei, das direkt an der Synthese und dem Abbau von Glucanen und deren Auswirkungen auf den Stärkemetabolismus beteiligt ist. KW - Solanum tuberosum KW - potato KW - maltodextrin KW - starch KW - Stärke KW - Solanum tuberosum KW - Maltodextrin KW - Kartoffel Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-615055 ER - TY - THES A1 - Apriyanto, Ardha T1 - Analysis of starch metabolism in source and sink tissue of plants T1 - Analyse des Stärkestoffwechsels im Source und Sink Gewebe von Pflanzen N2 - Starch is an essential biopolymer produced by plants. Starch can be made inside source tissue (such as leaves) and sink tissue (such as fruits and tubers). Nevertheless, understanding how starch metabolism is regulated in source and sink tissues is fundamental for improving crop production. Despite recent advances in the understanding of starch and its metabolism, there is still a knowledge gap in the source and sink metabolism. Therefore, this study aimed to summarize the state of the art regarding starch structure and metabolism inside plants. In addition, this study aimed to elucidate the regulation of starch metabolism in the source tissue using the leaves of a model organism, Arabidopsis thaliana, and the sink tissue of oil palm (Elaeis guineensis) fruit as a commercial crop. The research regarding the source tissue will focus on the effect of the blockage of starch degradation on the starch parameter in leaves, especially in those of A. thaliana, which lack both disproportionating enzyme 2 (DPE2) and plastidial glucan phosphorylase 1 (PHS1) (dpe2/phs1). The additional elimination of phosphoglucan water dikinase (PWD), starch excess 4 (SEX4), isoamylase 3 (ISA3), and disproportionating enzyme 1 (DPE1) in the dpe2/phs1 mutant background demonstrates the alteration of starch granule number per chloroplast. This study provides insights into the control mechanism of granule number regulation in the chloroplast. The research regarding the sink tissue will emphasize the relationship between starch metabolism and the lipid metabolism pathway in oil palm fruits. This study was conducted to observe the alteration of starch parameters, metabolite abundance, and gene expression during oil palm fruit development with different oil yields. This study shows that starch and sucrose can be used as biomarkers for oil yield in oil palms. In addition, it is revealed that the enzyme isoforms related to starch metabolism influence the oil production in oil palm fruit. Overall, this thesis presents novel information regarding starch metabolism in the source tissue of A.thaliana and the sink tissue of E.guineensis. The results shown in this thesis can be applied to many applications, such as modifying the starch parameter in other plants for specific needs. N2 - Stärke ist ein unverzichtbares Biopolymer, das von Pflanzen sowohl in den Quellgeweben (sources, z. B. Blätter) als auch in den Senkengeweben (sinks, z. B. Früchten und Knollen) gebildet wird. Daher ist ein profundes Wissen über die Regulation des Stärkestoffwechsel in den source und sink Organen von grundlegender Bedeutung für die Verbesserung der Pflanzenproduktion. Trotz der jüngsten Fortschritte im Verständnis des Stärkestoffwechsels bleiben weiterhin viele Fragen über den detaillierten source und sink Metabolismus offen. Ziel dieser Studie war es daher, den aktuellen Forschungsstand über die Struktur und den Stoffwechsel von Stärke in Pflanzen aufzuzeigen. Darüber hinaus sollte in dieser Studie die Regulierung des Stärkestoffwechsels in den Blättern (source) des Modellorganismus Arabidopsis thaliana und in den Ölpalmfrüchten (sink) von Elaeis guineensis, einer Nutzpflanze, aufgeklärt werden. Die Analyse des source Gewebes konzentrierte sich dabei auf die Auswirkungen auf Stärkeparamter wie beispielsweise die Granulazahl durch die Blockierung des Stärkeabbaus in Blättern. Dazu wurde die Arabidopsis Mutante, der das cytosolische Disproportionating Enzym 2 (DPE2) und die plastidiale Glucanphosphorylase 1 (PHS1) fehlen (dpe2/phs1), untersucht. Ebenfalls wurden Dreifachmutanten im Hintergund von dpe2/phs1, denen Starch excess 4 (SEX4), Isoamylase 3, Phosphoglucan-Wasser-Dikinase (PWD) oder das Disproportionating Enzym 1 (DPE1) fehlen, erzeugt. Die Analyse zeigt, dass die Anzahl der Stärkegranula pro Chloroplast nicht festgelegt ist und während des gesamten Wachstums der Pflanze reguliert wird. Diese Daten liefern ein verbessertes Verständnis über die Komplexität der Kontrollmechanismen der Granulazahlregulation in Chloroplasten. Die Untersuchung des sink Gewebes soll die Beziehung zwischen dem Stärkestoffwechsel und dem Lipidstoffwechselweg in Ölpalmenfrüchten verdeutlichen. Diese Studie wurde durchgeführt, um die Veränderung von Stärkeparametern, die Häufigkeit von Metaboliten und die Genexpression während der Entwicklung von Ölpalmenfrüchten mit unterschiedlichen Ölausbeuten zu erforschen. Die Analyse zeigt, dass sowohl Stärke als auch Saccharose als reliable Biomarker für den Ölertrag von Ölpalmen verwendet werden können. Darüber hinaus konnte bewiesen werden, dass die mit dem Stärkestoffwechsel verbundenen Enzymisoformen die Ölproduktion in Ölpalmenfrüchten beeinflussen. Insgesamt liefert diese Arbeit neue Informationen über den Stärkestoffwechsel im source Gewebe von A.thaliana und im sink von E.guineensis. Die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse können für viele Anwendungen genutzt werden, z. B. für die Veränderung der Stärkeparameter in anderen Pflanzen für spezifische Bedürfnisse. KW - starch KW - oil palm KW - Arabidopsis thaliana KW - source and sink KW - Arabidopsis thaliana KW - Palmöl KW - Source und Sink KW - Stärke Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Bulut, Mustafa T1 - Assessing the genetic architecture underlying systemic responses to variable environments in crops using multi-omics N2 - Plant metabolism serves as the primary mechanism for converting assimilated carbon into essential compounds crucial for plant growth and ultimately, crop yield. This renders it a focal point of research with significant implications. Despite notable strides in comprehending the genetic principles underpinning metabolism and yield, there remains a dearth of knowledge regarding the genetic factors responsible for trait variation under varying environmental conditions. Given the burgeoning global population and the advancing challenges posed by climate change, unraveling the intricacies of metabolic and yield responses to water scarcity became increasingly important in safeguarding food security. Our research group has recently started to work on the genetic resources of legume species. To this end, the study presented here investigates the metabolic diversity across five different legume species at a tissue level, identifying species-specific biosynthesis of alkaloids as well as iso-/flavonoids with diverse functional groups, namely prenylation, phenylacylation as well as methoxylation, to create a resource for follow up studies investigation the metabolic diversity in natural diverse populations of legume species. Following this, the second study investigates the genetic architecture of drought-induced changes in a global common bean population. Here, a plethora of quantitative trait loci (QTL) associated with various traits are identified by performing genome-wide association studies (GWAS), including for lipid signaling. On this site, overexpression of candidates highlighted the induction of several oxylipins reported to be pivotal in coping with harsh environmental conditions such as water scarcity. Diverging from the common bean and GWAS, the following study focuses on identifying drought-related QTL in tomato using a bi-parental breeding population. This descriptive study highlights novel multi-omic QTL, including metabolism, photosynthesis as well as fruit setting, some of which are uniquely assigned under drought. Compared to conventional approaches using the bi-parental IL population, the study presented improves the resolution by assessing further backcrossed ILs, named sub-ILs. In the final study, a photosynthetic gene, namely a PetM subunit of the cytochrome b6f complex encoding gene, involved in electron flow is characterized in an horticultural important crop. While several advances have been made in model organisms, this study highlights the transition of this fundamental knowledge to horticultural important crops, such as tomato, and investigates its function under differing light conditions. Overall, the presented thesis combines different strategies in unveiling the genetic components in multi-omic traits under drought using conventional breeding populations as well as a diverse global population. To this end, it allows a comparison of either approach and highlights their strengths and weaknesses. N2 - Der pflanzliche Stoffwechsel ist der wichtigste Mechanismus für die Umwandlung von assimiliertem Kohlenstoff in essenzielle Verbindungen, die für das Pflanzenwachstum und letztlich den Ernteertrag entscheidend sind. Dies macht ihn zu einem Schwerpunkt der Forschung mit erheblichen Auswirkungen. Trotz bemerkenswerter Fortschritte beim Verständnis der genetischen Prinzipien, die dem Stoffwechsel und den Erträgen zugrunde liegen, gibt es nach wie vor einen Mangel an Wissen über die genetischen Faktoren, die für die Variation von Merkmalen unter verschiedenen Umweltbedingungen verantwortlich sind. In Anbetracht der wachsenden Weltbevölkerung und der zunehmenden Herausforderungen durch den Klimawandel wird es immer wichtiger, die Feinheiten des Stoffwechsels und des Ertrags auf Wasserknappheit zu entschlüsseln, um die Ernährungssicherheit zu gewährleisten. Unsere Forschungsgruppe hat vor kurzem damit begonnen, sich mit den genetischen Ressourcen von Leguminosen zu befassen. Zu diesem Zweck untersucht die hier vorgestellte Studie die Stoffwechselvielfalt bei fünf verschiedenen Leguminosen auf Gewebeebene und identifiziert die artspezifische Biosynthese von Alkaloiden sowie Iso-/Flavonoiden mit verschiedenen funktionellen Gruppen, nämlich Prenylierung, Phenylacylierung sowie Methoxylierung, um eine Ressource für Folgestudien zu schaffen, die die Stoffwechselvielfalt in verschiedenen natürlichen Populationen von Leguminosen untersuchen. Im Anschluss daran wird in der zweiten Studie die genetische Architektur trockenheitsbedingter Veränderungen in einer globalen Bohnenpopulation untersucht. Hier wird eine Vielzahl von quantitativen Merkmalsloci (QTL) identifiziert, die mit verschiedenen Merkmalen assoziiert sind, darunter auch für die Lipidsignalübertragung, unter Durchführung genomweite Assoziationsstudien (GWAS). Die Überexpression von Kandidaten auf dieser Seite hat die Induktion mehrerer Oxylipine hervorgehoben, die Berichten zufolge für die Bewältigung rauer Umweltbedingungen wie Wasserknappheit von zentraler Bedeutung sind. Abweichend von der Bohne und der GWAS konzentriert sich die folgende Studie auf die Identifizierung trockenheitsbezogener QTL bei der Tomate unter Verwendung einer bi-elterlichen Zuchtpopulation. Diese deskriptive Studie hebt neuartige multi-omische QTL hervor, einschließlich für Stoffwechsel, Photosynthese und Fruchtansatz, von denen einige eindeutig dem Dürre-Stress zugeordnet werden. Im Vergleich zu herkömmlichen Ansätzen, bei denen die bi-elterliche IL-Population verwendet wird, verbessert die vorgestellte Studie die Auflösung, indem weitere rückgekreuzte ILs, so genannte sub-ILs, untersucht werden. In der letzten Studie wird ein photosynthetisches Gen, nämlich eine PetM-Untereinheit des Cytochrom b6fKomplexes, das am Elektronenfluss beteiligt ist, in einer für den Gartenbau wichtigen Pflanze charakterisiert. Während bei Modellorganismen bereits zahlreiche wissenschaftliche Fortschritte erzielt wurden, beleuchtet diese Studie den Übergang dieses grundlegenden Wissens auf wichtige Gartenbaupflanzen wie die Tomate und untersucht ihre Funktion unter verschiedenen Lichtbedingungen. Insgesamt werden in der vorliegenden Arbeit verschiedene Strategien kombiniert, um die genetischen Komponenten multi-omischer Merkmale bei Trockenheit aufzudecken, wobei sowohl konventionelle Zuchtpopulationen als auch eine vielfältige globale Population verwendet werden. Zu diesem Zweck ermöglicht sie einen Vergleich beider Ansätze und zeigt ihre Stärken und Schwächen auf. KW - genomics KW - metabolomics KW - phenomics KW - genome-wide association studies (GWAS) KW - genotype-by-Environmental interaction (GxE) KW - plasticity Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Kappel, Sandrine T1 - Photosynthesis in fluctuating light BT - pgr5 suppressor mutant screen : low NPQ mutant identification and characterization N2 - Light is the essential energy source for plants to drive photosynthesis. In nature, light availability is highly variable and often fluctuates on very short time scales. As a result, plants developed mechanisms to cope with these fluctuations. Understanding how to improve light use efficiency in natural fluctuating light (FL) conditions is a major target for agronomy. In the first project, we identified an Arabidopsis thaliana plant that showed reduced levels of rapidly inducible non-photochemical quenching (NPQ). This plant was devoid of any T-DNA insertion. Using a mapping-by-sequencing approach, we successfully located the causal genomic region near the end of chromosome 4. Through variant investigations in that region, we identified a deletion of about 20 kb encompassing 9 genes. By complementation analysis, we confirmed that one of the deleted genes, VTC2, is the causal gene responsible for the low NPQ. Loss of VTC2 decreased NPQ particularly in old leaves, with young leaves being only slightly affected. Additionally, ascorbate levels were almost abolished in old leaves, likely causing the NPQ decrease by reducing the activity of the xanthophyll cycle. Although ascorbate levels in younger leaves were reduced compared to wild-type plants, they remained at a comparably higher level. This difference may be due to the VTC2 paralog VTC5, which is expressed at a higher level in young leaves than in old ones. Plants require the PROTON GRADIENT REGULATION 5 (PGR5) protein for survival in FL. pgr5 mutants die because they fail to increase the luminal proton concentration in response to high light (HL) phases. A rapid elevation in ∆pH is needed to slow down electron transport through the Cytochrome b6 f complex (photosynthetic control). In FL, such lack of control in the pgr5 mutants results in photosystem I (PSI) overreduction, reactive oxygen species (ROS) production, and cell death. Decreases in photosystem II (PSII) activity introduced by crossing pgr5 with PSII deficient mutants rescued the lethality of pgr5 in FL. PGR5 was suggested to act as part of the ferredoxin-plastoquinone reductase (FQR), involved in cyclic electron transfer around PSI. However, the proposed molecular role of PGR5 remains highly debated. To learn more about PGR5 function, we performed a forward genetic screen in Arabidopsis thaliana to identify EMS-induced suppressor mutants surviving longer when grown in FL compared to pgr5 mutants (referred to as ”suppressor of pgr5 lethality in fluctuating light”, splf ). 11 different candidate genes were identified in a total of 22 splf plants. Mutants of seven of these genes in the pgr5 background showed low Fv/Fm values when grown in non-fluctuating low light (LL). Five of these 4genes were previously reported to have a role in PSII biogenesis or function. Two others, RPH1 and a DEAD/DEAH box helicase (AT3G02060), have not been linked to PSII function before. Three of splf candidate genes link to primary metabolism, fructose-2,6-bisphosphatase (F2KP ), udp-glucose pyrophosphorylase 1 (UGP1 ) and ferredoxin-dependent glutamate synthase (Fd-GOGAT ). They are characterized by the fact that they survive longer in FL than pgr5 mutants but do not procede beyond the early vegetative phase and then die. N2 - Pflanzen wandeln Sonnenlicht durch die Photosynthese in chemische Energie um. In der Natur unterliegt die Verfügbarkeit von Licht jedoch starken Schwankungen, beispielsweise durch kurzzeitige Wolkenverdeckungen. Um mit diesen Veränderungen umzugehen, haben Pflanzen spezielle Mechanismen entwickelt. Das Verständnis, wie die Lichtnutzung unter diesen fluktuierenden Bedingungen optimiert werden kann, stellt eines der Hauptziele in der Landwirtschaft dar. Ziel dieser Arbeit ist es, zu diesem Verständnis beizutragen. Wir haben eine neue Mutante der Ackerschmalwand identifiziert, die reduzierte Levels des schnell induzierbaren nicht-photochemischen Quenchings (NPQ) aufwies. NPQ ist ein wichtiger Mechanismus, mit dem Pflanzen auf schnelle Wechsel zu stärkerem Licht reagieren können. Die Untersuchung ergab, dass das Fehlen des Gens VTC2 die Ursache für die Reduzierung des NPQ war, mit Auswirkungen auf den Vitamin-C-Spiegel und die Aktivität des Xanthophyllzyklus. Besonders interessant war, dass der Verlust des Gens hauptsächlich ältere Blätter beeinflusste. Das Gen PGR5 ist für das Überleben von Pflanzen in schwankenden Lichtverhältnissen notwendig. Obwohl viele wissenschaftliche Arbeiten diesem Gen gewidmet sind, sind seine genauen Funktionen nur im Ansatz bekannt. In unserer Studie haben wir Ackerschmalwand Pflanzen ohne dieses Gen mit Chemikalien mutagenisiert und sie dann in schwankenden Lichtverhältnissen wachsen lassen. Dabei konnten wir Suppressormutanten finden, die überlebt haben. Durch diese Herangehensweise haben wir 11 Kandidatengene identifiziert, die eine mögliche Verbindung zum PGR5-Mechanismus aufweisen könnten. Einige dieser Mutanten hemmen das Photosystem II, das für das Einfangen der Lichtenergie verantwortlich ist, während andere Teile den Primärmetabolismus für Zucker und Stickstoff verändern. Zusammenfassend bietet die Arbeit Einsichten in die Mechanismen, mit denen Pflanzen auf schwankende Lichtbedingungen reagieren, und identifiziert spezifische Gene, die in diesen Prozessen eine Rolle spielen. KW - photosynthesis KW - fluctuating light KW - PGR5 KW - suppressor mutant screen KW - low NPQ Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Hashemi Ranjbar, Seirana T1 - Plasticity and trade-offs in plant metabolic networks N2 - A biological trade-off situation denotes the dependence between traits whereby an increase in the value of one of the traits leads to a decrease in the value of at least one of the others. Understanding trade-offs in cellular systems is relevant to understanding the limits and constraints to tuning desired phenotypes. Therefore, it is mainly the case for rates (i.e. fluxes) of biochemical reactions that shape not only molecular traits, like metabolite concentrations but also determine physiological traits, like growth. Intracellular fluxes are the final phenotype from transcriptional and (post)translational regulation. Quantifying intracellular fluxes provides insights into cellular physiology under particular growth conditions and can be used to characterize the metabolic activity of different pathways. However, estimating fluxes from labelling experiments is labour-intensive; therefore, developing approaches to accurately and precisely predict intracellular fluxes is essential. This thesis addresses two main problems: (i) identifying flux trade-offs and (ii) predicting accurate and precise reaction flux at a genome-scale level. To this end, the concept of an absolute flux trade-off is defined, and a constraint-based approach, termed FluTO, was developed to identify absolute flux trade-offs. FluTO is cast as a mixed integer programming approach applied to genome-scale metabolic models of E. coli, S. cerevisiae, and A. thaliana, imposing realistic constraints on growth and nutrient uptake.. The findings showed that trade-offs are not only species-specific but also specific to carbon sources. In addition, we found that different models of a single species have a different number of reactions in trade-offs. We also showed that absolute flux trade-offs depend on the biomass reaction used to model the growth of A. thaliana under different carbon and nitrogen conditions. Findings reflect the strong relation between nitrogen, carbon, and sulphur metabolisms in the leaves of C3 plants. The concept of relative trade-offs was introduced to further study trade-offs in metabolic networks. A constraint-based approach, FluTOr, was proposed to identify reactions whose fluxes are in relative trade-off concerning an optimized fitness-related cellular task, like growth. FluTOr was employed to find the relative flux trade-offsin the genome-scale metabolic networks of E. coli, S. cerevisiae, and A. thaliana. The results showed that in contrast to the A. thaliana model, the relative trade-offs in the two microorganisms depend on the carbon source, reflecting the differences in the underlying metabolic network. Furthermore, applying FluTOr also showed that reactions that participated in relative trade-offs were implicated in cofactor biosynthesis in the two microorganisms. Prediction of reaction fluxes in the constraint-based metabolic framework is usually performed by parsimonious flux balance analysis (pFBA), employing the principle of efficient usage of protein resources. However, we argued that principles related to the coordination of flux values, neglected in previous studies, provide other means to predict intracellular fluxes. To this end, we designed a constraint-based approach, termed complex-balanced FBA (cbFBA), to predict steady-state flux distributions that maximize the number of balanced complexes in a flux distribution, whereby multi-reaction dependencies are maximized. The comparative analysis showed a better agreement of the flux distributions resulting from cbFBA compared to pFBA with experimentally measured fluxes from 17 E. coli strains and 26 S. cerevisiae knock-out mutants. The results also showed that the predictions from cbFBA are more precise than those from pFBA since cbFBA results in a smaller space of alternative solutions than pFBA. N2 - Eine biologische Abwägungssituation bezeichnet die Abhängigkeit zwischen Merkmalen, wobei ein Anstieg des Wertes eines der Merkmale zu einer Abnahme des Wertes mindestens eines der anderen Merkmale führt. Das Verständnis von Abwägungen in zellulären Systemen ist relevant, um die Grenzen und Einschränkungen bei der Differenzierung gewünschter Phänotypen zu verstehen. Dieses ist häufig der Fall bei Fließgeschwindigkeiten (d.h. Ströme) biochemischer Reaktionen, die nicht nur molekulare Merkmale wie Metabolitkonzentrationen beschreiben, sondern auch physiologische Merkmale wie Wachstum bestimmen. Intrazelluläre Ströme sind der endgültige Phänotyp der transkriptionellen und (post)translationalen Regulation. Die Quantifizierung intrazellulärer Ströme liefert Einblicke in die Zellphysiologie unter bestimmten Wachstumsbedingungen und kann verwendet werden, um die Stoffwechselaktivität verschiedener Wege zu charakterisieren. Die Schätzung von Strömen aus Markierungsexperimenten ist jedoch arbeitsintensiv. Daher ist die Entwicklung von Ansätzen zur genauen und präzisen Vorhersage intrazellulärer Ströme unerlässlich. Diese Dissertation befasst sich mit zwei Hauptproblemen: (i) Identifizierung von Abwägungspunkten (Trade-offs) zwischen Strömen und (ii) Vorhersage des genauen und präzisen Reaktionsflusses auf Genomebene. Zu diesem Zweck wird das Konzept eines absoluten Trade-offs von Strömen definiert und ein Constraint-basierter Ansatz namens FluTO entwickelt, um absolute Trade-offs von Strömen zu identifizieren. FluTO ist als gemischter ganzzahliger Programmieransatz konzipiert, der auf genomweite Stoffwechselmodelle von E. coli, S. cerevisiae und A. thaliana angewendet wird und realistische Einschränkungen für Wachstum und Nährstoffaufnahme auferlegt. Die Ergebnisse zeigten, dass Trade-offs nicht nur artspezifisch, sondern auch spezifisch für Kohlenstoffquellen sind. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass verschiedene Modelle einer einzelnen Art eine unterschiedliche Anzahl von Reaktionen in Trade-offs aufweisen. Wir haben auch gezeigt, dass absolute Trade-offs von Strömen von der Biomassereaktion abhängen, die verwendet wird, um das Wachstum von A. thaliana unter verschiedenen Kohlenstoff- und Stickstoffbedingungen zu modellieren. Die Ergebnisse spiegeln die starke Beziehung zwischen dem Stickstoff-, Kohlenstoff- und Schwefelstoffwechsel in den Blättern von C3-Pflanzen wieder. Das Konzept der relativen Trade-Offs wurde eingeführt, um Trade-Offs in metabolischen Netzwerken weiter zu untersuchen. Ein Constraint-basierter Ansatz, FluTOr, wurde entwickelt, um Reaktionen zu identifizieren, deren Ströme in einem relativen Trade-off bezüglich einer optimierten fitnessbezogenen zellulären Aufgabe wie Wachstum stehen. FluTOr wurde eingesetzt, um die relativen Trade-offs von Strömen in den metabolischen Netzwerken von E. coli, S. cerevisiae und A. thaliana auf Genomebene zu finden. Die Ergebnisse zeigten, dass im Gegensatz zum A. Thaliana Modell die relativen Trade-offs in den beiden Mikroorganismen von der Kohlenstoffquelle abhängen, was die Unterschiede im zugrunde liegenden metabolischen Netzwerk wiederspiegelt. Darüber hinaus zeigte die Anwendung von FluTOr auch, dass Reaktionen, die an relativen Trade-offs teilnahmen, an der Cofaktor-Biosynthese in den beiden Mikroorganismen beteiligt waren. Die Vorhersage von Reaktionsflüssen mittels Constraint-basierten metabolischen Methoden wird normalerweise durch eine überschaubare Flussbilanzanalyse (pFBA) durchgeführt, die das Prinzip der effizienten Nutzung von Proteinressourcen anwendet. Wir argumentierten jedoch, dass Prinzipien im Zusammenhang mit der Koordination von Flusswerten, die in früheren Studien vernachlässigt wurden, andere Mittel zur Vorhersage intrazellulärer Ströme bieten. Zu diesem Zweck haben wir einen Constraint-basierten Ansatz entwickelt, der als Complex-Balanced FBA (cbFBA) bezeichnet wird, um Steady-State-Verteilungen von Strömen vorherzusagen, die die Anzahl der ausgewogenen Komplexe in einer Verteilung von Strömen maximieren, wodurch Abhängigkeiten von mehreren Reaktionen maximiert werden. Die vergleichende Analyse zeigte eine bessere Übereinstimmung der Verteilungen von Strömen, die sich aus cbFBA im Vergleich zu pFBA ergaben, mit experimentell gemessenen Strömen von 17 E. coli Stämmen und 26 S. cerevisiae Knock-out-Mutanten. Die Ergebnisse zeigten auch, dass die Vorhersagen von cbFBA genauer sind als die von pFBA, da cbFBA zu weniger alternativen Lösungen führt als pFBA. T2 - Plastizität und Kompromisse in pflanzlichen Stoffwechselnetzwerken KW - trade-off KW - cbFBA KW - metabolic network KW - balanced complex KW - reaction rate KW - Kompromiss KW - cbFBA KW - metabolisches Netzwerk KW - ausgewogener Komplex KW - Reaktionsgeschwindigkeit Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Stephan, Mareike Sophia T1 - A bacterial mimetic system to study bacterial inactivation and infection N2 - The emerging threat of antibiotic-resistant bacteria has become a global challenge in the last decades, leading to a rising demand for alternative treatments for bacterial infections. One approach is to target the bacterial cell envelope, making understanding its biophysical properties crucial. Specifically, bacteriophages use the bacterial envelope as an entry point to initiate infection, and they are considered important building blocks of new antibiotic strategies against drug-resistant bacteria.. Depending on the structure of the cell wall, bacteria are classified as Gram-negative and Gram-positive. Gram-negative bacteria are equipped with a complex cell envelope composed of two lipid membranes enclosing a rigid peptidoglycan layer. The synthesis machinery of the Gram-negative cell envelope is the target of antimicrobial agents, including new physical sanitizing procedures addressing the outer membrane (OM). It is therefore very important to study the biophysical properties of the Gram-negative bacterial cell envelope. The high complexity of the Gram-negative OM sets the demand for a model system in which the contribution of individual components can be evaluated separately. In this respect, giant unilamellar vesicles (GUVs) are promising membrane systems to study membrane properties while controlling parameters such as membrane composition and surrounding medium conditions. The aim of this work was to develop methods and approaches for the preparation and characterization of a GUV-based membrane model that mimics the OM of the Gram-negative cell envelope. A major component of the OM is the lipopolysaccharide (LPS) on the outside of the OM heterobilayer. The vesicle model was designed to contain LPS in the outer leaflet and lipids in the inner leaflet. Furthermore, the interaction of the prepared LPS-GUVs with bacteriophages was tested. LPS containing GUVs were prepared by adapting the inverted emulsion technique to meet the challenging properties of LPS, namely their high self-aggregation rate in aqueous solutions. Notably, an additional emulsification step together with the adaption of solution conditions was employed to asymmetrically incorporate LPS containing long polysaccharide chains into the artificial membranes. GUV membrane asymmetry was verified with a fluorescence quenching assay. Since the necessary precautions for handling the quenching agent sodium dithionite are often underestimated and poorly described, important parameters were tested and identified to obtain a stable and reproducible assay. In the context of varied LPS incorporation, a microscopy-based technique was introduced to determine the LPS content on individual GUVs and to directly compare vesicle properties and LPS coverage. Diffusion coefficient measurements in the obtained GUVs showed that increasing LPS concentrations in the membranes resulted in decreased diffusivity. Employing LPS-GUVs we could demonstrate that a Salmonella bacteriophage bound with high specificity to its LPS receptor when presented at the GUV surface, and that the number of bound bacteriophages scaled with the amount of presented LPS receptor. In addition to binding, the bacteriophages were able to eject their DNA into the vesicle lumen. LPS-GUVs thus provide a starting platform for bottom-up approaches for the generation of more complex membranes, in which the effects of individual components on the membrane properties and the interaction with antimicrobial agents such as bacteriophages could be explored. N2 - Die wachsende Bedrohung durch antibiotikaresistente Bakterien ist in den letzten Jahrzehnten zu einer globalen Herausforderung geworden, was zu einer steigenden Nachfrage nach alternativen Behandlungsmethoden für bakterielle Infektionen geführt hat. Ein Ansatz besteht darin, die bakterielle Zellhülle anzugreifen, weshalb das Verständnis ihrer biophysikalischen Eigenschaften entscheidend ist. Insbesondere Bakteriophagen, Viren, die Bakterien infizieren, nutzen die Bakterienhülle als ersten Angriffspunkt für die Infektion und gelten als wichtige Bausteine für neue Antibiotikastrategien gegen arzneimittelresistente Bakterien. Je nach Struktur der Zellwand werden Bakterien in gramnegative und grampositive Bakterien eingeteilt. Gramnegative Bakterien sind mit einer komplexen Zellhülle ausgestattet. Daher ist es sehr wichtig, ihre biophysikalischen Eigenschaften zu untersuchen. Die hohe Komplexität der äußeren Zellhülle, auch äußere Membran genannt, erfordert ein Modellsystem, in dem der Beitrag jeder einzelnen Komponente separat bewertet werden kann. In dieser Hinsicht sind Vesikel-basierte Modellsysteme sehr vielversprechend, da sie wichtige Eigenschaften der äußeren Membran simulieren können, aber in ihrer Komplexität stark reduziert und kontrollierbar sind. Ziel dieser Arbeit war es, Methoden und Ansätze für die Herstellung und Charakterisierung eines Vesikel-basierten Modells zu entwickeln, das die äußere Membran der gramnegativen bakteriellen Zellhülle nachahmt. Ein Hauptbestandteil der äußeren Membran ist Lipopolysaccharid (LPS), das asymmetrisch auf der Außenseite der äußeren Membran vorhanden ist. Das Vesikelmodell wurde so konzipiert, dass es außen LPS und innen Phospholipide enthält. Die Herstellung des beschriebenen Modellsystems erforderte einige Anpassungen, da die Hüllkomponente LPS eine hohe Tendenz zur Bildung von Selbstaggregaten aufweist. Durch die Einführung eines zusätzlichen Schrittes in das Standardprotokoll konnten Vesikel mit LPS-Inkorporation erzeugt werden. Es wurde sowohl die Menge als auch die asymmetrische Verteilung des LPS-Einbaus bestimmt. Mit Hilfe von Bakteriophagen sollte die biologische Wirkung des Modellsystems getestet werden. Es wurde gezeigt, dass Bakteriophagen, die spezifisch LPS erkennen und binden, nach Zugabe zum Modellsystem die Vesikel binden und ihr genetisches Material in das Vesikel-Innere injizieren. Die hier beschriebenen LPS-haltigen Vesikel können als Ausgangsplattform für Bottom-up-Ansätze zur Herstellung komplexerer Membranen verwendet werden. Mit diesen komplexeren, aber kontrollierbaren Systemen lassen sich die Auswirkungen einzelner Komponenten der bakteriellen Zellhülle auf die Eigenschaften der Zellhülle sowie ihre Wechselwirkung mit antimikrobiellen Wirkstoffen wie Bakteriophagen untersuchen. KW - Bakterien KW - Bakteriophagen KW - Zellmembran KW - Vesikel KW - Konfokale Mikroskopie KW - Lipopolysaccharid KW - gramnegativ KW - bacteria KW - bacteriophage KW - cell membrane KW - vesicle KW - confocal microscopy KW - lipopolysaccharide KW - gram-negative Y1 - 2023 ER - TY - THES A1 - Derežanin, Lorena T1 - Contribution of structural variation to adaptive evolution of mammalian genomes T1 - Beteiligung der strukturellen Variation zur adaptiven Evolution von Säugetiergenomen N2 - Following the extinction of dinosaurs, the great adaptive radiation of mammals occurred, giving rise to an astonishing ecological and phenotypic diversity of mammalian species. Even closely related species often inhabit vastly different habitats, where they encounter diverse environmental challenges and are exposed to different evolutionary pressures. As a response, mammals evolved various adaptive phenotypes over time, such as morphological, physiological and behavioural ones. Mammalian genomes vary in their content and structure and this variation represents the molecular mechanism for the long-term evolution of phenotypic variation. However, understanding this molecular basis of adaptive phenotypic variation is usually not straightforward. The recent development of sequencing technologies and bioinformatics tools has enabled a better insight into mammalian genomes. Through these advances, it was acknowledged that mammalian genomes differ more, both within and between species, as a consequence of structural variation compared to single-nucleotide differences. Structural variant types investigated in this thesis - such as deletion, duplication, inversion and insertion, represent a change in the structure of the genome, impacting the size, copy number, orientation and content of DNA sequences. Unlike short variants, structural variants can span multiple genes. They can alter gene dosage, and cause notable gene expression differences and subsequently phenotypic differences. Thus, they can lead to a more dramatic effect on the fitness (reproductive success) of individuals, local adaptation of populations and speciation. In this thesis, I investigated and evaluated the potential functional effect of structural variations on the genomes of mustelid species. To detect the genomic regions associated with phenotypic variation I assembled the first reference genome of the tayra (Eira barbara) relying on linked-read sequencing technology to achieve a high level of genome completeness important for reliable structural variant discovery. I then set up a bioinformatics pipeline to conduct a comparative genomic analysis and explore variation between mustelid species living in different environments. I found numerous genes associated with species-specific phenotypes related to diet, body condition and reproduction among others, to be impacted by structural variants. Furthermore, I investigated the effects of artificial selection on structural variants in mice selected for high fertility, increased body mass and high endurance. Through selective breeding of each mouse line, the desired phenotypes have spread within these populations, while maintaining structural variants specific to each line. In comparison to the control line, the litter size has doubled in the fertility lines, individuals in the high body mass lines have become considerably larger, and mice selected for treadmill performance covered substantially more distance. Structural variants were found in higher numbers in these trait-selected lines than in the control line when compared to the mouse reference genome. Moreover, we have found twice as many structural variants spanning protein-coding genes (specific to each line) in trait-selected lines. Several of these variants affect genes associated with selected phenotypic traits. These results imply that structural variation does indeed contribute to the evolution of the selected phenotypes and is heritable. Finally, I suggest a set of critical metrics of genomic data that should be considered for a stringent structural variation analysis as comparative genomic studies strongly rely on the contiguity and completeness of genome assemblies. Because most of the available data used to represent reference genomes of mammalian species is generated using short-read sequencing technologies, we may have incomplete knowledge of genomic features. Therefore, a cautious structural variation analysis is required to minimize the effect of technical constraints. The impact of structural variants on the adaptive evolution of mammalian genomes is slowly gaining more focus but it is still incorporated in only a small number of population studies. In my thesis, I advocate the inclusion of structural variants in studies of genomic diversity for a more comprehensive insight into genomic variation within and between species, and its effect on adaptive evolution. N2 - Nach dem Aussterben der Dinosaurier kam es zu einer großen adaptiven Radiation der Säugetiere, die eine erstaunliche ökologische und phänotypische Vielfalt von Säugetierarten hervorbrachte. Selbst eng verwandte Arten bewohnen oft sehr unterschiedliche Lebensräume, in denen sie verschiedenen Umwelteinflüssen und evolutionärem Druck ausgesetzt sind. Als Reaktion darauf haben Säugetiere im Laufe der Zeit verschiedene adaptive Phänotypen entwickelt, z. B. morphologische, physiologische und verhaltensbezogene. Die Genome von Säugetieren variieren in ihrem Inhalt und ihrer Struktur, und diese Variation stellt den molekularen Mechanismus für die langfristige Evolution der phänotypischen Variation dar. Das Verständnis dieser molekularen Grundlage der adaptiven phänotypischen Variation ist jedoch meist nicht trivial. Die jüngste Entwicklung von Sequenzierungstechnologien und Bioinformatik-Tools hat einen besseren Einblick in die Genome von Säugetieren ermöglicht. Durch diese Fortschritte wurde erkannt, dass sich die Genome von Säugetieren sowohl innerhalb als auch zwischen den Arten stärker durch strukturelle Variationen als durch Unterschiede zwischen einzelnen Nukleotiden unterscheiden. Variantenarten, die in dieser Arbeit untersucht werden - wie Deletion, Duplikation, Inversion und Insertion - stellen eine Veränderung der Genomstruktur dar, die sich auf die Größe, die Kopienzahl, die richtung und den Inhalt der DNA-Sequenzen auswirken. Im Gegensatz zu kurzen Varianten können strukturelle Varianten mehrere Gene umfassen. Sie können die Genkopien verändern und bemerkenswerte Unterschiede in der Genexpression und in der Folge phänotypische Unterschiede hervorrufen. Dadurch können sie dramatischere Auswirkungen auf die Fitness (den Fortpflanzungserfolg) von Individuen, die lokale Anpassung von Populationen und die Artbildung haben. In dieser Arbeit untersuchte und bewertete ich die potenziellen funktionellen Auswirkungen von strukturellen Variationen auf die Genome von Mustelidenarten. Weil für die zuverlässige Entdeckung struktureller Varianten ein hohes Maß an Genomvollständigkeit wichtig ist, habe ich das erste Referenzgenom der Tayra (Eira barbara) mit Hilfe der Linked-Read-Sequenzierungstechnologie zusammengestellt, um die mit der phänotypischen Variation verbundenen Genomregionen zu ermitteln. Anschließend habe ich eine Bioinformatik-Pipeline aufgesetzt, um eine vergleichende Genomanalyse durchzuführen und die Variationen zwischen den in unterschiedlichen Umgebungen lebenden Mustelidenarten zu untersuchen. Ich fand heraus, dass zahlreiche Gene, die mit artspezifischen Phänotypen in Verbindung stehen, durch strukturelle Variationen beeinflusst werden. Diese Phänotypen stehen u.a. in Zusammenhang mit Ernährung, Körperzustand und Fortpflanzung. Darüber hinaus untersuchte ich die Auswirkungen der künstlichen Selektion auf strukturelle Variationen bei Mäusen, die auf hohe Fruchtbarkeit, erhöhte Körpermasse und hohe Ausdauer selektiert wurden. Durch selektive Züchtung jeder Mauslinie haben sich die gewünschten Phänotypen innerhalb dieser Populationen durchgesetzt, wobei die für jede Linie spezifischen strukturellen Variationen erhalten blieben. Im Vergleich zur Kontrolllinie hat sich die Wurfgröße in den Linien selektiert auf Fruchtbarkeit verdoppelt, die Individuen in den Linien mit hoher Körpermasse sind erheblich größer geworden, und die auf Laufbandleistung selektierten Mäuse haben wesentlich mehr Strecke zurückgelegt. Im Vergleich zum Referenzgenom der Maus wurden in diesen nach Merkmalen selektierten Linien mehr strukturelle Variationen gefunden als in der Kontrolllinie. Darüber hinaus fanden wir doppelt so viele strukturelle Variationen, die proteinkodierende Gene überspannen (spezifisch für jede Linie), in nach Merkmalen selektierten Linien. Mehrere dieser Varianten betreffen Gene, die mit ausgewählten phänotypischen Merkmalen in Verbindung stehen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass strukturelle Variationen tatsächlich zur Evolution der ausgewählten Phänotypen beiträgt und vererbbar ist. Abschließend schlage ich eine Sammlung von maßgeblichen Metriken für Genomdaten vor, die für eine strenge Analyse der strukturellen Variation berücksichtigt werden sollten, da vergleichende Genomstudien in hohem Maße von der Kontiguität und Vollständigkeit der Genomassemblies abhängen. Weil die meisten der verfügbaren Daten, die verwendet wurden, um Referenzgenome von Säugetierarten zu repräsentieren mit Short-Read-Sequenzierungstechnologien erzeugt wurden, verfügen wir möglicherweise nur über unvollständige Kenntnisse der genomischen Merkmale. Daher ist eine vorsichtige Analyse der strukturellen Variationen erforderlich, um die Auswirkungen technischer Beschränkungen zu minimieren. Der Einfluss struktureller Variationen auf die adaptive Evolution von Säugetiergenomen rückt langsam immer mehr in den Mittelpunkt, wird aber immer noch nur in wenigen Populationsstudien berücksichtigt. In meiner Dissertation befürworte ich die Einbeziehung struktureller Variationen in Studien zur genomischen Diversität, um einen umfassenderen Einblick in die genomische Variation innerhalb und zwischen den Arten und ihre Auswirkungen auf die adaptive Evolution zu erhalten. KW - doctoral thesis KW - evolutionary biology KW - adaptation KW - genomics KW - Adaptation KW - Dissertation KW - Evolutionsbiologie KW - Genomik Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-591443 ER - TY - THES A1 - Dreymann, Nico T1 - Identification and functional characterization of aptamers targeting human urokinase and NDM-1 for therapeutic and diagnostic applications T1 - Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von Aptameren gegen humane Urokinase und NDM-1 für therapeutische und diagnostische Anwendungen N2 - Aptamers are single-stranded DNA (ssDNA) or RNA molecules that can bind specifically and with high affinity to target molecules due to their unique three-dimensional structure. For this reason, they are often compared to antibodies and sometimes even referred to as “chemical antibodies”. They are simple and inexpensive to synthesize, easy to modify, and smaller than conventional antibodies. Enzymes, especially hydrolases, are interesting targets in this context. This class of enzymes is capable of hydrolytically cleaving various macromolecules such as proteins, as well as smaller molecules such as antibiotics. Hence, they play an important role in many biological processes including diseases and their treatment. Hydrolase detection as well as the understanding of their function is therefore of great importance for diagnostics and therapy. Due to their various desirable features compared to antibodies, aptamers are being discussed as alternative agents for analytical and diagnostic use in various applications. The use of aptamers in therapy is also frequently investigated, as the binding of aptamers can have effects on the catalytic activity, protein-protein interactions, or proteolytic cascades. Aptamers are generated by an in vitro selection process. Potential aptamer candidates are selected from a pool of enriched nucleic acid sequences with affinity to the target, and their binding affinity and specificity is investigated. This is one of the most important steps in aptamer generation to obtain specific aptamers with high affinity for use in analytical and diagnostic applications. The binding properties or binding domains and their effects on enzyme functions form the basis for therapeutic applications. In this work, the binding properties of DNA aptamers against two different hydrolases were investigated. In view of their potential utility for analytical methods, aptamers against human urokinase (uPA) and New Delhi metallo-β-lactamase-1 (NDM-1) were evaluated for their binding affinity and specificity using different methods. Using the uPA aptamers, a protocol for measuring the binding kinetics of an aptamer-protein-interaction by surface plasmon resonance spectroscopy (SPR) was developed. Based on the increased expression of uPA in different types of cancer, uPA is discussed as a prognostic and diagnostic tumor marker. As uPA aptamers showed different binding sites on the protein, microtiter plate-based aptamer sandwich assay systems for the detection of uPA were developed. Because of the function of urokinase in cancer cell proliferation and metastasis, uPA is also discussed as a therapeutic target. In this regard, the different binding sites of aptamers showed different effects on uPA function. In vitro experiments demonstrated both inhibition of uPA binding to its receptor as well as the inhibition of uPA catalytic activity for different aptamers. Thus, in addition to their specificity and affinity for their targets, the utility of the aptamers for potential diagnostic and therapeutic applications was demonstrated. First, as an alternative inhibitor of human urokinase for therapeutic purposes, and second, as valuable recognition molecules for the detection of urokinase, as a prognostic and diagnostic marker for cancer, and for NDM-1 to detect resistance to carbapenem antibiotics. N2 - Aptamere sind einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle, die aufgrund ihrer charakteristischen dreidimensionalen Struktur spezifisch und mit hoher Affinität an Zielmoleküle binden. Häufig werden sie mit Antikörpern verglichen und als „chemische Antikörper“ bezeichnet. Sie sind einfach und kostengünstig zu synthetisieren, leicht zu modifizieren und kleiner als herkömmliche Antikörper. Enzyme, insbesondere Hydrolasen, sind hierbei unter anderem interessante Zielmoleküle. Diese Klasse von Enzymen ist in der Lage verschiedene Makromoleküle wie z.B. Proteine, aber auch kleinere Moleküle, wie z.B. Antibiotika, hydrolytisch zu spalten. Sie spielen in vielen biologischen Prozessen und somit auch in Erkrankungen und deren Behandlung eine wichtige Rolle. Daher ist ihre Detektion, sowie das Verständnis ihrer Funktion für die Diagnostik und Therapie von hoher Bedeutung. Durch ihre Vorteile gegenüber Antikörpern werden Aptamere als Alternativen für den analytischen und diagnostischen Einsatz in verschiedenen Applikationen diskutiert. Der Einsatz von Aptameren in der Therapie wird ebenfalls häufig untersucht, da die Bindung der Aptamere Auswirkungen auf die katalytische Aktivität, Protein-Protein-Interaktionen oder proteolytische Kaskaden haben kann. Aptamere werden mittels in vitro Selektion generiert. Aus einem Pool angereicherter Nukleinsäuren mit Affinität zum Zielmolekül werden anschließend potentielle Aptamerkandidaten identifiziert und ihre Bindung zum Zielmolekül untersucht. Dies ist einer der wichtigsten Schritte in der Aptamergenerierung, um spezifische Aptamere mit hoher Affinität für den späteren Einsatz in analytischen und diagnostischen Applikationen zu erhalten. Die Bindungseigenschaften einschließlich der Bindedomänen und deren Auswirkungen auf die Funktion des Zielmoleküls stellen die Grundlage für spätere therapeutische Anwendungen dar. In dieser Arbeit wurden die Bindungseigenschaften von DNA Aptameren gegen zwei verschiedene Hydrolasen untersucht. Für den potentiellen Nutzen in analytischen Methoden wurden Aptamere gegen die humane Urokinase (uPA), sowie gegen die New-Delhi metallo β-lactamase-1 (NDM-1) mittels molekularbiologischer Methoden auf deren Bindungsaffinität und Spezifität untersucht. Anhand der uPA-Aptamere wurde ein Protokoll für die Messung der Bindungskinetik einer Aptamer-Protein-Bindung mittels Oberflächenplasmonenresonanz Spektroskopie (SPR) entwickelt. Durch die erhöhte Expression von uPA in vielen Krebserkrankungen, wird dieser als prognostischer und diagnostischer Tumormarker diskutiert. Die in dieser Arbeit untersuchten Aptamere gegen die Urokinase zeigten unterschiedliche Bindestellen, wodurch Aptamer-basierte Sandwich Assay Systeme auf Mikrotiterplattenbasis für die Detektion von uPA etabliert werden konnten. Durch die Funktion der Urokinase in der Zellproliferation und Metastasierung in Krebserkrankungen wird uPA ebenfalls als therapeutisches Zielprotein diskutiert. Hierbei zeigten die unterschiedlichen Bindestellen der Aptamere verschiedene Auswirkungen auf die Funktion von uPA. Mittels in vitro Experimenten konnte die Inhibierung der Bindung von uPA zu ihrem Rezeptor, sowie die Inhibierung der katalytischen Aktivität von uPA mit Hilfe verschiedener Aptamere nachgewiesen werden. Somit wurde für die Aptamere, neben ihrer Spezifität und Affinität zu ihren Zielmolekülen, der Nutzen für potentielle diagnostische und therapeutische Anwendungen gezeigt. Zum einen als alternativer Inhibitor der Urokinase für therapeutische Zwecke, als auch als wertvolle Erkennungsmoleküle für den Nachweis von Urokinase, als prognostischer und diagnostischer Marker für Krebserkrankungen, sowie für NDM-1, zum Nachweis der Resistenz gegen Carbapenem-Antibiotika. KW - DNA-Aptamer KW - protein-aptamer interaction KW - Surface Plasmon Resonance (SPR) KW - Microscale Thermophoresis (MST) KW - aptamer-based sandwich assay KW - cancer biomarker KW - cancer therapy KW - cancer detection KW - Urokinase-type Plasminogen Activator (uPA) KW - antibiotic resistance KW - New Delhi metallo-β-lactamase 1 (NDM-1) KW - DNA-Aptamer KW - Microscale Thermophoresis (MST) KW - Neu-Delhi Metallo-Beta-Laktamase 1 (NDM-1) KW - Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR-Spektroskopie) KW - Urokinase-Typ Plasminogen Aktivator (uPA) KW - Antibiotikaresistenz KW - Sandwich-Assay auf Basis von Aptameren KW - Krebsbiomarker KW - Krebserkennung KW - Krebstherapie KW - Protein-Aptamer Interaktion Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-612919 ER - TY - THES A1 - Courtin, Jérémy T1 - Biodiversity changes in Siberia between quaternary glacial and interglacial stages T1 - Veränderungen der Biodiversität in Sibirien zwischen Quartären Glazial- und Interglazialphasen BT - exploring the potential of sedaDNA BT - das Potenzial von sedaDNA erforschen N2 - Der vom Menschen verursachte Klimawandel wirkt sich auf die biologische Vielfalt der Erde und damit auf die Ökosysteme und ihre Leistungen aus. Die Ökosysteme in den hohen Breitengraden sind aufgrund der verstärkten Erwärmung an den Polen noch stärker betroffen als der Rest der nördlichen Hemisphäre. Dennoch ist es schwierig, die Dynamik von Ökosystemen in den hohen Breitengraden vorherzusagen, da die Wechselwirkungen zwischen abiotischen und biotischen Komponenten sehr komplex sind. Da die Vergangenheit der Schlüssel zur Zukunft ist, ist die Interpretation vergangener ökologischer Veränderungen möglich, um laufende Prozesse besser zu verstehen. Im Quartär durchlief das Pleistozän mehrere glaziale und interglaziale Phasen, welche die Ökosysteme der Vergangenheit beeinflussten. Während des letzten Glazials bedeckte die pleistozäne Steppentundra den größten Teil der unvergletscherten nördlichen Hemisphäre und verschwand parallel zum Aussterben der Megafauna am Übergang zum Holozän (vor etwa 11 700 Jahren). Der Ursprung des Rückgangs der Steppentundra ist nicht gut erforscht, und die Kenntnis über die Mechanismen, die zu den Veränderungen in den vergangenen Lebensgemeinschaften und Ökosystemen geführt haben, ist von hoher Priorität, da sie wahrscheinlich mit denen vergleichbar sind, die sich auf moderne Ökosysteme auswirken. Durch die Entnahme von See- oder Permafrostkernsedimenten kann die vergangene Artenvielfalt an den Übergängen zwischen Eis- und Zwischeneiszeiten untersucht werden. Sibirien und Beringia waren der Ursprung der Ausbreitung der Steppentundra, weshalb die Untersuchung dieses Gebiets hohe Priorität hat. Bis vor kurzem waren Makrofossilien und Pollen die gängigsten Methoden. Sie dienen der Rekonstruktion vergangener Veränderungen in der Zusammensetzung der Bevölkerung, haben aber ihre Grenzen und Schwächen. Seit Ende des 20. Jahrhunderts kann auch sedimentäre alte DNA (sedaDNA) untersucht werden. Mein Hauptziel war es, durch den Einsatz von sedaDNA-Ansätzen wissenschaftliche Beweise für Veränderungen in der Zusammensetzung und Vielfalt der Ökosysteme der nördlichen Hemisphäre am Übergang zwischen den quartären Eiszeiten und Zwischeneiszeiten zu liefern. In dieser Arbeit liefere ich Momentaufnahmen ganzer alter Ökosysteme und beschreibe die Veränderungen in der Zusammensetzung zwischen Quartärglazialen und Interglazialen und bestätige die Vegetationszusammensetzung sowie die räumlichen und zeitlichen Grenzen der pleistozänen Steppentundra. Ich stelle einen allgemeinen Verlust der Pflanzenvielfalt fest, wobei das Aussterben der Pflanzen parallel zum Aussterben der Megafauna verlief. Ich zeige auf, wie der Verlust der biotischen Widerstandsfähigkeit zum Zusammenbruch eines zuvor gut etablierten Systems führte, und diskutiere meine Ergebnisse im Hinblick auf den laufenden Klimawandel. Mit weiteren Arbeiten zur Eingrenzung von Verzerrungen und Grenzen kann sedaDNA parallel zu den etablierteren Makrofossilien- und Pollenansätzen verwendet werden oder diese sogar ersetzen, da meine Ergebnisse die Robustheit und das Potenzial von sedaDNA zur Beantwortung neuer paläoökologischer Fragen wie Veränderungen der Pflanzenvielfalt und -verluste belegen und Momentaufnahmen ganzer alter Biota liefern. N2 - Climate change of anthropogenic origin is affecting Earth’s biodiversity and therefore ecosystems and their services. High latitude ecosystems are even more impacted than the rest of Northern Hemisphere because of the amplified polar warming. Still, it is challenging to predict the dynamics of high latitude ecosystems because of complex interaction between abiotic and biotic components. As the past is the key to the future, the interpretation of past ecological changes to better understand ongoing processes is possible. In the Quaternary, the Pleistocene experienced several glacial and interglacial stages that affected past ecosystems. During the last Glacial, the Pleistocene steppe-tundra was covering most of unglaciated northern hemisphere and disappeared in parallel to the megafauna’s extinction at the transition to the Holocene (~11,700 years ago). The origin of the steppe-tundra decline is not well understood and knowledge on the mechanisms, which caused shifts in past communities and ecosystems, is of high priority as they are likely comparable to those affecting modern ecosystems. Lake or permafrost core sediments can be retrieved to investigate past biodiversity at transitions between glacial and interglacial stages. Siberia and Beringia were the origin of dispersal of the steppe-tundra, which make investigation this area of high priority. Until recently, macrofossils and pollen were the most common approaches. They are designed to reconstruct past composition changes but have limit and biases. Since the end of the 20th century, sedimentary ancient DNA (sedaDNA) can also be investigated. My main objectives were, by using sedaDNA approaches to provide scientific evidence of compositional and diversity changes in the Northern Hemisphere ecosystems at the transition between Quaternary glacial and interglacial stages. In this thesis, I provide snapshots of entire ancient ecosystems and describe compositional changes between Quaternary glacial and interglacial stages, and confirm the vegetation composition and the spatial and temporal boundaries of the Pleistocene steppe-tundra. I identify a general loss of plant diversity with extinction events happening in parallel of megafauna’ extinction. I demonstrate how loss of biotic resilience led to the collapse of a previously well-established system and discuss my results in regards to the ongoing climate change. With further work to constrain biases and limits, sedaDNA can be used in parallel or even replace the more established macrofossils and pollen approaches as my results support the robustness and potential of sedaDNA to answer new palaeoecological questions such as plant diversity changes, loss and provide snapshots of entire ancient biota. KW - sedaDNA KW - pleistocene KW - paleoecology KW - climate change KW - holocene KW - Siberia KW - sedaDNA KW - Pleistozän KW - Paläoökologie KW - Holozän KW - Klimawandel KW - Sibirien Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-595847 ER - TY - THES A1 - Carrasco, Tomas T1 - Genome structure analysis and patterns of transposable elements evolution in the slow-evolving Testudines clade N2 - Transposable elements (TEs) are loci that can replicate and multiply within the genome of their host. Within the host, TEs through transposition are responsible for variation on genomic architecture and gene regulation across all vertebrates. Genome assemblies have increased in numbers in recent years. However, to explore in deep the variations within different genomes, such as SNPs (single nucleotide polymorphism), INDELs (Insertion-deletion), satellites and transposable elements, we need high-quality genomes. Studies of molecular markers in the past 10 years have limitations to correlate with biological differences because molecular markers rely on the accuracy of the genomic resources. This has generated that a substantial part of the studies of TE in recent years have been on high quality genomic resources such as Drosophila, zebrafinch and maize. As testudine have a slow mutation rate lower only to crocodilians, with more than 300 species, adapted to different environments all across the globe, the testudine clade can help us to study variation. Here we propose Testudines as a clade to study variation and the abundance of TE on different species that diverged a long time ago. We investigated the genomic diversity of sea turtles, identifying key genomic regions associated to gene family duplication, specific expansion of particular TE families for Dermochelyidae and that are important for phenotypic differentiation, the impact of environmental changes on their populations, and the dynamics of TEs within different lineages. In chapter 1, we identify that despite high levels of genome synteny within sea turtles, we identified that regions of reduced collinearity and microchromosomes showed higher concentrations of multicopy gene families, as well as genetic distances between species, indicating their potential importance as sources of variation underlying phenotypic differentiation. We found that differences in the ecological niches occupied by leatherback and green turtles have led to contrasting evolutionary paths for their olfactory receptor genes. We identified in leatherback turtles a long-term low population size. Nonetheless, we identify no correlation between the regions of reduced collinearity with abundance of TEs or an accumulation of a particular TE group. In chapter 2, we identified that sea turtle genomes contain a significant proportion of TEs, with differences in TE abundance between species, and the discovery of a recent expansion of Penelope-like elements (PLEs) in the highly conserved sea turtle genome provides new insights into the dynamics of TEs within Testudines. In chapter 3, we compared the proportion of TE across the Testudine clade, and we identified that the proportion of transposable elements within the clade is stable, regardless of the quality of the assemblies. However, we identified that the proportion of TEs orders has correlation with genome quality depending of their expanded abundancy. For retrotransposon, a highly abundant element for this clade, we identify no correlation. However, for DNA elements a rarer element on this clade, correlate with the quality of the assemblies. Here we confirm that high-quality genomes are fundamental for the study of transposable element evolution and the conservation within the clade. The detection and abundance of specific orders of TEs are influenced by the quality of the genomes. We identified that a reduction in the population size on D. coriacea had left signals of long-term low population sizes on their genomes. On the same note we identified an expansion of TE on D. coriacea, not present in any other member of the available genomes of Testudines, strongly suggesting that it is a response of deregulation of TE on their genomes as consequences of the low population sizes. Here we have identified important genomic regions and gene families for phenotypic differentiation and highlighted the impact of environmental changes on the populations of sea turtles. We stated that accurate classification and analysis of TE families are important and require high-quality genome assemblies. Using TE analysis we manage to identify differences in highly syntenic species. These findings have significant implications for conservation and provide a foundation for further research into genome evolution and gene function in turtles and other vertebrates. Overall, this study contributes to our understanding of evolutionary change and adaptation mechanisms. N2 - Transponierbare Elemente (TEs) sind Loci, die sich im Genom ihres Wirts replizieren und vermehren können. Innerhalb des Wirts sind TEs durch Transposition für die Variation der genomischen Architektur und der Genregulation bei allen Wirbeltieren verantwortlich. In den letzten Jahren hat die Zahl der Genomassemblies zugenommen. Um jedoch die Variationen innerhalb verschiedener Genome, wie SNPs, INDELs, Satelliten und transponierbare Elemente, eingehend zu untersuchen, benötigen wir qualitativ hochwertige Genome. Studien über molekulare Marker in den letzten 10 Jahren haben nur begrenzt mit biologischen Unterschieden korreliert, da molekulare Marker von der Genauigkeit der genomischen Ressourcen abhängen. Dies hat dazu geführt, dass ein großer Teil der TE-Studien der letzten Jahre an qualitativ hochwertigen genomischen Ressourcen wie Drosophila, Zebrafinken und Mais durchgeführt wurde. Da die Testudinen eine langsame Mutationsrate haben, die nur bei Krokodilen niedriger ist, aber mehr als 300 Arten umfassen, die an verschiedene Umgebungen auf der ganzen Welt angepasst sind, kann uns diese Gruppe bei der Untersuchung der Variation helfen. Hier schlagen wir Testudinen als Klade vor, um die Variation und die Häufigkeit von TE bei verschiedenen Arten zu untersuchen, die sich vor langer Zeit auseinanderentwickelt haben. Wir untersuchten die genomische Vielfalt der Meeresschildkröten und identifizierten genomische Schlüsselregionen, die mit der Duplikation von Genfamilien, der spezifischen Ausbreitung bestimmter TE-Familien bei den Dermochelyidae verbunden und für die phänotypische Differenzierung wichtig sind, sowie die Auswirkungen von Umweltveränderungen auf ihre Populationen und die Dynamik transponierbarer Elemente (TEs) innerhalb verschiedener Linien. In Kapitel 1 stellen wir fest, dass trotz des hohen Maßes an Genomsyntenie innerhalb der Meeresschildkröten Regionen mit geringerer Kollinearität und Mikrochromosomen eine höhere Konzentration von Genfamilien mit mehreren Kopien sowie genetische Abstände zwischen den Arten aufweisen, was auf ihre potenzielle Bedeutung als Variationsquellen für die phänotypische Differenzierung hinweist. Wir fanden heraus, dass die Unterschiede in den ökologischen Nischen, die Lederschildkröten und Suppenschildkröten besetzen, zu gegensätzlichen evolutionären Pfaden für ihre Geruchsrezeptorgene geführt haben. Bei Lederschildkröten haben wir Anzeichen für langfristig niedrige Populationsgrößen festgestellt. Dennoch konnten wir keine Korrelation zwischen den Regionen mit reduzierter Kollinearität und der Häufigkeit von TEs oder einer Akkumulation einer bestimmten TE-Gruppe feststellen. In Kapitel 2 haben wir festgestellt, dass die Genome von Meeresschildkröten einen beträchtlichen Anteil an TEs enthalten, mit Unterschieden in der TE-Häufigkeit zwischen den Arten, und die Entdeckung einer kürzlichen Ausbreitung von Penelope-ähnlichen Elementen (PLEs) im hochkonservierten Genom von Meeresschildkröten bietet neue Einblicke in die Dynamik von TEs innerhalb der Testudinen. In Kapitel 3 haben wir den Anteil der TE innerhalb der Testudinenklade verglichen und festgestellt, dass der Anteil der transponierbaren Elemente innerhalb der Klade stabil ist, unabhängig von der Qualität der Assemblies. Allerdings haben wir festgestellt, dass der Anteil der TEs Bestellungen hat Korrelation mit Genom Qualität in Abhängigkeit von ihrer erweiterten Häufigkeit, wie auf Retrotransposon, ein sehr häufig Element für diese Klade, wir identifizieren keine Korrelation, aber, DNA-Elemente ein seltener Element auf dieser Klade, korrelieren mit der Qualität der Baugruppen. Hier bestätigen wir, dass qualitativ hochwertige Genome für die Untersuchung der Entwicklung transponierbarer Elemente und der Erhaltung innerhalb der Gruppe von grundlegender Bedeutung sind. Der Nachweis und die Häufigkeit bestimmter Ordnungen von TEs werden durch die Qualität der Genome beeinflusst. Wir haben festgestellt, dass eine Verringerung der Populationsgröße bei D. coriacea Signale für langfristig niedrige Populationsgrößen in ihren Genomen hinterlassen hat. Gleichzeitig haben wir bei D. coriacea eine Ausdehnung der TE festgestellt, die in keinem anderen Mitglied der verfügbaren Genome der Testudinen vorkommt, was stark darauf hindeutet, dass es sich um eine Reaktion auf die Deregulierung der TE auf ihren Genomen als Folge der geringen Populationsgrößen handelt. Hier haben wir wichtige genomische Regionen und Genfamilien für die phänotypische Differenzierung identifiziert und die Auswirkungen von Umweltveränderungen auf die Populationen von Meeresschildkröten aufgezeigt. Wir haben festgestellt, dass eine genaue Klassifizierung und Analyse von TE-Familien wichtig ist und qualitativ hochwertige Genomassemblies erfordert. Mit Hilfe der TE-Analyse gelingt es uns, Unterschiede in hochsynthetischen Arten zu identifizieren. Diese Ergebnisse sind von großer Bedeutung für den Artenschutz und bilden eine Grundlage für die weitere Erforschung der Genomevolution und der Genfunktionen bei Schildkröten und anderen Wirbeltieren. Insgesamt trägt diese Studie zu unserem Verständnis des evolutionären Wandels und der Anpassungsmechanismen bei. KW - transposable elements KW - Chelonia mydas KW - Dermochelys coriacea KW - evolutionary biology KW - Transponierbare Elemente KW - Chelonia mydas KW - Dermochelys coriacea KW - Evolutionsbiologie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-606577 ER - TY - THES A1 - Tanner, Norman T1 - Methoden zur routinemäßigen Untersuchung von Bienenprodukten mittels Fourier-transformierter Infrarotspektroskopie Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Rakpenthai, Apidet T1 - Analysis of the regulation of the sulfur responsive genese, SD11 and SD 12 Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Ginsawaeng, Orarat T1 - Late embryogenesis abundant (LEA) proteins in Arabidopsis thaliana seeds and their role in germination Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Ogden, Michael T1 - Uncovering the interplay between nutrient availability and cellulose biosynthesis inhibitor activity N2 - All plant cells are surrounded by a dynamic, carbohydrate-rich extracellular matrix known as the cell wall. Nutrient availability affects cell wall composition via uncharacterized regulatory mechanisms, and cellulose deficient mutants develop a hypersensitive root response to growth on high concentrations of nitrate. Since cell walls account for the bulk of plant biomass, it is important to understand how nutrients regulate cell walls. This could provide important knowledge for directing fertilizer treatments and engineering plants with higher nutrient use efficiency. The direct effect of nitrate on cell wall synthesis was investigated through growth assays on varying concentrations of nitrate, measuring cellulose content of roots and shoots, and assessing cellulose synthase activity (CESA) using live cell imaging with spinning disk confocal microscopy. A forward genetic screen was developed to isolate mutants impaired in nutrient-mediated cell wall regulation, revealing that cellulose biosynthesis inhibitor (CBI) activity is modulated by nutrient availability. Various non-CESA mutants were isolated that displayed CBI resistance, with the majority of mutations causing perturbation of mitochondria-localized proteins. To investigate mitochondrial involvement, the CBI mechanism of action was investigated using a reverse genetic screen, a targeted pharmacological screen, and -omics approaches. The results generated suggest that CBI-induced cellulose inhibition is due to off-target effects. This provides the groundwork to investigate uncharacterized processes of CESA regulation and adds valuable knowledge to the understanding of CBI activity, which could be harnessed to develop new and improved herbicides. KW - cellulose synthesis KW - plant cell wall KW - cellulose biosynthesis inhibitor KW - root growth KW - herbicide Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Vyse, Kora T1 - Elucidating molecular determinants of the loss of freezing tolerance during deacclimation after cold priming and low temperature memory after triggering N2 - Während ihrer Entwicklung müssen sich Pflanzen an Temperaturschwankungen anpassen. Niedrige Temperaturen über dem Gefrierpunkt induzieren in Pflanzen eine Kälteakklimatisierung und höhere Frosttoleranz, die sich bei wärmeren Temperaturen durch Deakklimatisierung wieder zurückbildet. Der Wechsel zwischen diesen beiden Prozessen ist für Pflanzen unerlässlich, um als Reaktion auf unterschiedliche Temperaturbedingungen eine optimale Fitness zu erreichen. Die Kälteakklimatisierung ist umfassend untersucht worden,über die Regulierung der Deakklimatisierung ist jedoch wenig bekannt. In dieser Arbeit wird der Prozess der Deakklimatisierung auf physiologischer und molekularer Ebene in Arabidopsis thaliana untersucht. Messungen des Elektrolytverlustes während der Kälteakklimatisierung und bis zu vier Tagen nach Deakklimatisierung ermöglichten die Identifizierung von vier Knockout-Mutanten (hra1, lbd41, mbf1c und jub1), die im Vergleich zum Wildtyp eine langsamere Deakklimatisierungsrate aufwiesen. Eine transkriptomische Studie mit Hilfe von RNA-Sequenzierung von A. thaliana Col-0, jub1 und mbf1c zeigte die Bedeutung der Hemmung von stressreaktiven und Jasmonat-ZIM-Domänen-Genen sowie die Regulierung von Zellwandmodifikationen während der Deakklimatisierung. Darüber hinaus zeigten Messungen der Alkoholdehydrogenase Aktivität und der Genexpressionsänderungen von Hypoxiemarkern während der ersten vier Tagen der Deakklimatisierung, dass eine Hypoxie-Reaktion während der Deakklimatisierung aktiviert wird. Es wurde gezeigt, dass die epigenetische Regulierung während der Kälteakklimatisierung und der 24-stündigen Deakklimatisierung in A. thaliana eine große Rolle spielt. Darüber hinaus zeigten beide Deakklimatisierungsstudien, dass die frühere Hypothese, dass Hitzestress eine Rolle bei der frühen Deakklimatisierung spielen könnte, unwahrscheinlich ist. Eine Reihe von DNA- und Histondemethylasen sowie Histonvarianten wurden während der Deakklimatisierung hochreguliert, was auf eine Rolle im pflanzlichen Gedächtnis schließen lässt. In jüngster Zeit haben mehrere Studien gezeigt, dass Pflanzen in der Lage sind, die Erinnerung an einen vorangegangenen Kältestress auch nach einer Woche Deakklimatisierung zu bewahren. In dieser Arbeit ergaben Transkriptom- und Metabolomanalysen von Arabidopsis während 24 Stunden Priming (Kälteakklimatisierung) und Triggering (wiederkehrender Kältestress nach Deakklimatisierung) eine unikale signifikante und vorübergehende Induktion der Transkriptionsfaktoren DREB1D, DREB1E und DREB1F während des Triggerings, die zur Feinabstimmung der zweiten Kältestressreaktion beiträgt. Darüber hinaus wurden Gene, die für Late Embryogenesis Abundant (LEA) und Frostschutzproteine kodieren, sowie Proteine, die reaktive Sauerstoffspezies entgiften, während des späten Triggerings (24 Stunden) stärker induziert als nach dem ersten Kälteimpuls, während Xyloglucan- Endotransglucosylase/Hydrolase Gene, deren Produkte für eine Restrukturierung der Zellwand verantwortlich sind, früh auf das Triggering reagierten. Die starke Induktion dieser Gene, sowohl bei der Deakklimatisierung als auch beim Triggering, lässt vermuten, dass sie eine wesentliche Rolle bei der Stabilisierung der Zellen während des Wachstums und bei der Reaktion auf wiederkehrende Stressbedingungen spielen. Zusammenfassend gibt diese Arbeit neue Einblicke in die Regulierung der Deakklimatisierung und des Kältestress-Gedächtnisses in A. thaliana und eröffnet neue Möglichkeiten für künftige, gezielte Studien von essentiellen Genen in diesem Prozess. N2 - Throughout their lifetime plants need to adapt to temperature changes. Plants adapt to nonfreezing cold temperatures in a process called cold priming (cold acclimation) and lose the acquired freezing tolerance during warmer temperatures through deacclimation. The alternation of both processes is essential for plants to achieve optimal fitness in response to different temperature conditions. Cold acclimation has been extensively studied, however, little is known about the regulation of deacclimation. This thesis elucidates the process of deacclimation on a physiological and molecular level in Arabidopsis thaliana. Electrolyte leakage measurements during cold acclimation and up to four days of deacclimation enabled the identification of four knockout mutants (hra1, lbd41, mbf1c and jub1) with a slower rate of deacclimation compared to the wild type. A transcriptomic study using RNA-Sequencing in A. thaliana Col-0, jub1 and mbf1c identified the importance of the inhibition of stress responsive and Jasmonate-ZIM-domain genes as well as the regulation of cell wall modifications during deacclimation. Moreover, measurements of alcohol dehydrogenase activity and gene expression changes of hypoxia markers during the first four days of deacclimation evidently showed that a hypoxia response is activated during deacclimation. Epigenetic regulation was observed to be extensively involved during cold acclimation and 24 h of deacclimation in A. thaliana. Further, both deacclimation studies showed that the previous hypothesis that heat stress might play a role in early deacclimation, is not likely. A number of DNA- and histone demethylases as well as histone variants were upregulated during deacclimation suggesting a role in plant memory. Recently, multiple studies have shown that plants are able to retain memory of a previous cold stress even after a week of deacclimation. In this work, transcriptomic and metabolomic analyses of Arabidopsis during 24 h of priming (cold acclimation) and triggering (recurring cold stress after deacclimation) revealed a uniquely significant and transient induction of DREB1D, DREB1E and DREB1F transcription factors during triggering contributing to fine-tuning of the second cold stress response. Furthermore, genes encoding Late Embryogenesis Abundant (LEA) and antifreeze proteins and proteins detoxifying reactive oxygen species were higher induced during late triggering (24 h) compared to primed samples, while cell wall remodelers of the class xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase were early responders of triggering. The high induction of cell wall remodelers during deacclimation as well as triggering proposes that these proteins play an essential role in the stabilization of the cells during growth as well as the response to recurring stresses. Collectively this work gives new insights on the regulation of deacclimation and cold stress memory in A. thaliana and opens the door to future targeted studies of essential genes in this process. KW - cold stress KW - deacclimation KW - Arabidopsis thaliana KW - epigenetics KW - co-expression network analysis KW - WGCNA KW - RNA-sequencing KW - differential gene expression KW - hypoxia KW - transcription factors KW - Kältestress KW - Deakklimatisierung KW - Epigenetik KW - Koexpression Netzwerk Analysen KW - RNA-Sequenzierung KW - Differenzielle Genexpression KW - Hypoxie KW - Transkriptionsfaktoren Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Kontbay, Kübra T1 - Nin-Like Protein (NLP) transcription factors BT - regulation of developmental transitions in Arabidopsis thaliana and Solanum tuberosum Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Pan, Yufeng T1 - Genetic and molecular analysis of heat stress induced transcriptional memory T1 - Genetische und molekulare Analyse des durch Hitzestress ausgelösten transkriptionellen Gedächtnisses N2 - Heat stress (HS) is one of the most common abiotic stresses, frequently affecting plant growth and crop production. With its fluctuating nature, HS episodes are frequently interspersed by stress-free intervals. Plants can be primed by HS, allowing them to survive better a recurrent stress episode. A memory of this priming can be maintained during stress-free intervals and this memory is closely correlated with transcriptional memory at several HS-inducible loci. This transcriptional memory is evident from hyper-induction of a locus upon a recurrent HS. ASCORBATE PEROXIDASE 2 (APX2) shows such hyper-induction upon recurring HS, however, the molecular basis of this transcriptional memory is not understood. Previous research showed that the HSinduced transcriptional memory at APX2 can last for up to seven days, and that it is controlled by cis-regulatory elements within the APX2 promoter. To identify regulators involved in HS transcriptional memory, an unbiased forward genetic screening using EMS mutated seeds of pAPX2::LUC was performed from this screen. Two EMS mutants with affected transcriptional memory of LUC were identified. I confirmed that both two EMS mutants resulted from the gene mutations of HISTONE ACETYLTRANSFERASE 1 (HAC1). Besides pAPX2::LUC, the HS-induced transcription of other HS memory genes were also affected in hac1 mutants. Moreover, HAC1 may promote HS transcriptional memory by acetylating promoters of HS memory genes. On the other hand, to identify cis-regulatory elements that are required for transcriptional memory of APX2, I performed promoter analysis of the four conserved HSEs identified within a functional APX2 promoter. I found out that one of the HSEs (HSE1) is necessary for both HS-induced APX2 transcription and transcriptional memory, while another one of HSEs (HSE2) is important for HS-induced APX2 transcriptional memory. I also found out that the HSE1 itself (with 10 bp of flanking sequence) is sufficient to confer HS-induced APX2 transcriptional memory, and HSE1 is also necessary for HSFA2 to bind on APX2 promoter and activate APX2 transcription. The findings will provide important clues for the molecular mechanism of transcriptional memory and will enable engineering of enhanced stress tolerance in crops. N2 - Hitzestress (HS) ist einer der häufigsten abiotischen Stressfaktoren, der das Pflanzenwachstum und die Pflanzenproduktion häufig beeinträchtigt. Aufgrund seiner fluktuierenden Natur werden HS-Episoden häufig von stressfreien Intervallen unterbrochen. Pflanzen können durch HS vorbereitet werden, so dass sie eine wiederkehrende Stresssituation besser überstehen. Die Erinnerung an dieses Priming kann während stressfreier Intervalle aufrechterhalten werden, und diese Erinnerung ist eng mit der transkriptionellen Erinnerung an mehreren HS-induzierbaren Loci verbunden. Dieses transkriptionelle Gedächtnis zeigt sich in der Hyperinduktion eines Locus nach einem wiederholten HS. ASCORBATE PEROXIDASE 2 (APX2) zeigt eine solche Hyperinduktion bei wiederkehrendem HS, die molekulare Grundlage dieses Transkriptionsgedächtnisses ist jedoch nicht bekannt. Frühere Forschungsarbeiten haben gezeigt, dass das HS-induzierte Transkriptionsgedächtnis bei APX2 bis zu sieben Tage andauern kann und dass es durch cis-regulatorische Elemente innerhalb des APX2-Promotors gesteuert wird. Zur Identifizierung von Regulatoren, die am HS-Transkriptionsgedächtnis beteiligt sind, wurde ein unvoreingenommenes genetisches Vorwärtsscreening unter Verwendung von EMS-mutiertem Saatgut von pAPX2::LUC aus diesem Screening durchgeführt. Es wurden zwei EMS-Mutanten mit beeinträchtigtem Transkriptionsgedächtnis von LUC identifiziert. Ich bestätigte, dass beide EMS-Mutanten aus Genmutationen der HISTONE ACETYLTRANSFERASE 1 (HAC1) resultierten. Neben pAPX2::LUC war in den HAC1-Mutanten auch die HS-induzierte Transkription anderer HS-Gedächtnisgene beeinträchtigt. Darüber hinaus könnte HAC1 das HS-Transkriptionsgedächtnis durch Acetylierung der Promotoren von HS-Gedächtnisgenen fördern. Um andererseits cis-regulatorische Elemente zu identifizieren, die für das transkriptionelle Gedächtnis von APX2 erforderlich sind, habe ich eine Promotoranalyse der vier konservierten HSEs durchgeführt, die innerhalb eines funktionellen APX2-Promotors identifiziert wurden. Ich fand heraus, dass eine der HSEs (HSE1) sowohl für die HS-induzierte APX2-Transkription als auch für das Transkriptionsgedächtnis erforderlich ist, während eine andere HSE (HSE2) für das HS-induzierte APX2-Transkriptionsgedächtnis wichtig ist. Ich habe auch herausgefunden, dass das HSE1 selbst (mit 10 bp flankierender Sequenz) ausreicht, um HS-induziertes APX2-Transkriptionsgedächtnis zu verleihen, und dass HSE1 auch notwendig ist, damit HSFA2 an den APX2-Promotor binden und die APX2-Transkription aktivieren kann. Die Ergebnisse werden wichtige Hinweise auf den molekularen Mechanismus des Transkriptionsgedächtnisses liefern und die Entwicklung einer verbesserten Stresstoleranz bei Nutzpflanzen ermöglichen. KW - HS transcriptional memory KW - APX2 KW - HSFA2 KW - HAC1 KW - H3K9ac KW - HSE KW - HS-Transkriptionsgedächtnis KW - APX2 KW - HSFA2 KW - HAC1 KW - H3K9ac KW - HSE Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-560119 ER - TY - THES A1 - Steppert, Isabel T1 - Entwicklung einer nichtinvasiven Diagnostikmethode zum Nachweis von Infektionserregern T1 - Development of a non-invasive diagnostic method for the identification of infectious pathogens N2 - Die aktuelle COVID-19-Pandemie zeigt deutlich, wie sich Infektionskrankheiten weltweit verbreiten können. Neben Viruserkrankungen breiten sich auch multiresistente bakterielle Erreger weltweit aus. Dementsprechend besteht ein hoher Bedarf, durch frühzeitige Erkennung Erkrankte zu finden und Infektionswege zu unterbrechen. Herkömmliche kulturelle Verfahren benötigen minimalinvasive bzw. invasive Proben und dauern für Screeningmaßnahmen zu lange. Deshalb werden schnelle, nichtinvasive Verfahren benötigt. Im klassischen Griechenland verließen sich die Ärzte unter anderem auf ihren Geruchssinn, um Infektionen und andere Krankheiten zu differenzieren. Diese charakteristischen Gerüche sind flüchtige organische Substanzen (VOC), die im Rahmen des Metabolismus eines Organismus entstehen. Tiere, die einen besseren Geruchssinn haben, werden trainiert, bestimmte Krankheitserreger am Geruch zu unterscheiden. Allerdings ist der Einsatz von Tieren im klinischen Alltag nicht praktikabel. Es bietet sich an, auf technischem Weg diese VOCs zu analysieren. Ein technisches Verfahren, diese VOCs zu unterscheiden, ist die Ionenmobilitätsspektrometrie gekoppelt mit einer multikapillaren Gaschromatographiesäule (MCC-IMS). Hier zeigte sich, dass es sich bei dem Verfahren um eine schnelle, sensitive und verlässliche Methode handelt. Es ist bekannt, dass verschiedene Bakterien aufgrund des Metabolismus unterschiedliche VOCs und damit eigene spezifische Gerüche produzieren. Im ersten Schritt dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die verschiedenen Bakterien in-vitro nach einer kurzen Inkubationszeitzeit von 90 Minuten anhand der VOCs differenziert werden können. Hier konnte analog zur Diagnose in biochemischen Testreihen eine hierarchische Klassifikation der Bakterien erfolgen. Im Gegensatz zu Bakterien haben Viren keinen eigenen Stoffwechsel. Ob virusinfizierte Zellen andere VOCs als nicht-infizierte Zellen freisetzen, wurde an Zellkulturen überprüft. Hier konnte gezeigt werden, dass sich die Fingerprints der VOCs in Zellkulturen infizierter Zellen mit Respiratorischen Synzytial-Viren (RSV) von nicht-infizierten Zellen unterscheiden. Virusinfektionen im intakten Organismus unterscheiden sich von den Zellkulturen dadurch, dass hier neben Veränderungen im Zellstoffwechsel auch durch Abwehrmechanismen VOCs freigesetzt werden können. Zur Überprüfung, inwiefern sich Infektionen im intakten Organismus ebenfalls anhand VOCs unterscheiden lassen, wurde bei Patienten mit und ohne Nachweis einer Influenza A Infektion als auch bei Patienten mit Verdacht auf SARS-CoV-2 (Schweres-akutes-Atemwegssyndrom-Coronavirus Typ 2) Infektion die Atemluft untersucht. Sowohl Influenza-infizierte als auch SARS-CoV-2 infizierte Patienten konnten untereinander und von nicht-infizierten Patienten mittels MCC-IMS Analyse der Atemluft unterschieden werden. Zusammenfassend erbringt die MCC-IMS ermutigende Resultate in der schnellen nichtinvasiven Erkennung von Infektionen sowohl in vitro als auch in vivo. N2 - The current COVID-19 pandemic demonstrates the worldwide spread of infectious diseases. Besides virus infections there is also a worldwide dissemination of multiresistant bacterial strains. Therefore, there is an urgent need for rapid non-invasive screening methods. There is an unmet need to cut infection chains by early detection of infected subjects. Conventional cultural methods require minimally invasive or invasive samples and are not feasible for mass screening due to a long analysis time. In classical Greece, physicians also used their olfactory senses to differentiate infections from other diseases. These characteristic odors are volatile organic compounds (VOC) produced by the metabolism of an organism. Animals with a much better olfactory sense have been trained to detect different germs by their odors. However, the use of sniffing animals is not practicable in clinical settings. A technical detection of VOCs is therefore desirable. One technical approach for the differentiation of VOCs is ion mobility spectrometry coupled with a multicapillary gas chromatography (MCC-IMS). It could be shown that this method is a rapid, sensitive, and reliable method. It is known that various bacteria produce VOCs by their metabolism and therefore different specific smells. By the MCC-IMS method, different bacterial species could be distinguished based on the VOCs after an incubation time as short as 90 minutes in vitro. Comparable to biochemical series of tests a decision tree for the classification of bacteria could be implemented. In contrast to bacteria viruses have no own metabolism and thus are dependent on the host metabolism. Cell cultures were used to determine whether virus-infected cells release other VOCs than non-infected cells. It could be shown here that cell cultures infected with respiratory syncytial virus (RSV) differ from non-infected cell cultures in VOC profiles. Unlike in cell cultures, in the intact organism changes in VOC profiles are not only dependent on cell metabolism alterations but also in defense mechanisms. To investigate infection induced VOC changes in intact organisms, nasal breath of patients with and without influenza A infection as well as of patients with suspected SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2) infection were analyzed. It was proven that a breath analysis using a MCC-IMS is able to distinguish infected patients from non-infected as well as SARS-CoV-2 from influenza A infections. In summary, MCC-IMS delivers encouraging results in the rapid, non-invasive detection of infections in vitro as well as in vivo. KW - volatile organische Substanzen (VOCs) KW - Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS) KW - nichtinvasive Diagnostik KW - bakterielle Infektionen KW - virale Infektionen KW - volatile organic compounds (VOCs) KW - ion mobility spectrometry (IMS) KW - non-invasive Diagnostics KW - bacterial infections KW - viral infections Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-575441 ER - TY - THES A1 - Eckert, Silvia T1 - Trait variation in changing environments: Assessing the role of DNA methylation in non-native plant species T1 - Merkmalsvariation in sich verändernden Umgebungen: Bewertung der Rolle der DNA-Methylierung bei nicht einheimischen Pflanzenarten N2 - The increasing introduction of non-native plant species may pose a threat to local biodiversity. However, the basis of successful plant invasion is not conclusively understood, especially since these plant species can adapt to the new range within a short period of time despite impoverished genetic diversity of the starting populations. In this context, DNA methylation is considered promising to explain successful adaptation mechanisms in the new habitat. DNA methylation is a heritable variation in gene expression without changing the underlying genetic information. Thus, DNA methylation is considered a so-called epigenetic mechanism, but has been studied in mainly clonally reproducing plant species or genetic model plants. An understanding of this epigenetic mechanism in the context of non-native, predominantly sexually reproducing plant species might help to expand knowledge in biodiversity research on the interaction between plants and their habitats and, based on this, may enable more precise measures in conservation biology. For my studies, I combined chemical DNA demethylation of field-collected seed material from predominantly sexually reproducing species and rearing offsping under common climatic conditions to examine DNA methylation in an ecological-evolutionary context. The contrast of chemically treated (demethylated) plants, whose variation in DNA methylation was artificially reduced, and untreated control plants of the same species allowed me to study the impact of this mechanism on adaptive trait differentiation and local adaptation. With this experimental background, I conducted three studies examining the effect of DNA methylation in non-native species along a climatic gradient and also between climatically divergent regions. The first study focused on adaptive trait differentiation in two invasive perennial goldenrod species, Solidago canadensis sensu latu and S. gigantea AITON, along a climate gradient of more than 1000 km in length in Central Europe. I found population differences in flowering timing, plant height, and biomass in the temporally longer-established S. canadensis, but only in the number of regrowing shoots for S. gigantea. While S. canadensis did not show any population structure, I was able to identify three genetic groups along this climatic gradient in S. gigantea. Surprisingly, demethylated plants of both species showed no change in the majority of traits studied. In the subsequent second study, I focused on the longer-established goldenrod species S. canadensis and used molecular analyses to infer spatial epigenetic and genetic population differences in the same specimens from the previous study. I found weak genetic but no epigenetic spatial variation between populations. Additionally, I was able to identify one genetic marker and one epigenetic marker putatively susceptible to selection. However, the results of this study reconfirmed that the epigenetic mechanism of DNA methylation appears to be hardly involved in adaptive processes within the new range in S. canadensis. Finally, I conducted a third study in which I reciprocally transplanted short-lived plant species between two climatically divergent regions in Germany to investigate local adaptation at the plant family level. For this purpose, I used four plant families (Amaranthaceae, Asteraceae, Plantaginaceae, Solanaceae) and here I additionally compared between non-native and native plant species. Seeds were transplanted to regions with a distance of more than 600 kilometers and had either a temperate-oceanic or a temperate-continental climate. In this study, some species were found to be maladapted to their own local conditions, both in non-native and native plant species alike. In demethylated individuals of the plant species studied, DNA methylation had inconsistent but species-specific effects on survival and biomass production. The results of this study highlight that DNA methylation did not make a substantial contribution to local adaptation in the non-native as well as native species studied. In summary, my work showed that DNA methylation plays a negligible role in both adaptive trait variation along climatic gradients and local adaptation in non-native plant species that either exhibit a high degree of genetic variation or rely mainly on sexual reproduction with low clonal propagation. I was able to show that the adaptive success of these non-native plant species can hardly be explained by DNA methylation, but could be a possible consequence of multiple introductions, dispersal corridors and meta-population dynamics. Similarly, my results illustrate that the use of plant species that do not predominantly reproduce clonally and are not model plants is essential to characterize the effect size of epigenetic mechanisms in an ecological-evolutionary context. N2 - Die zunehmende Eintragung nicht-heimischer Pflanzenarten kann eine Gefahr für die lokale Artenvielfalt darstellen. Die Grundlagen einer erfolgreichen pflanzlichen Ausbreitung sind jedoch nicht abschließend geklärt, zumal sich diese Arten innerhalb kurzer Zeit an das neue Verbreitungsgebiet anpassen können trotz anfänglich reduzierter genetischer Vielfalt der Startpopulationen. In diesem Kontext gilt DNA-Methylierung als vielversprechend, um erfolgreiche Anpassungsmechanismen im neuen Lebensraum zu erklären. Bei der DNA-Methylierung handelt es sich um eine vererbbare Variation der Genaktivität, ohne dass die zugrundeliegende genetische Erbinformation verändert wird. Damit gehört DNA-Methylierung zu den sogenannten epigenetischen Mechanismen, wurde jedoch vorwiegend bei sich klonal vermehrenden Pflanzenarten oder genetischen Modellpflanzen untersucht. Ein Verständnis dieses epigenetischen Mechanismus im Zusammenhang mit nicht-einheimischen, sich vorwiegend sexuell reproduzierenden Pflanzenarten erweitert das Wissen in der Biodiversitätsforschung zur Interaktion zwischen Pflanzen und ihrem Lebensraum und kann, darauf aufbauend, präzisere Maßnahmen in der Naturschutzbiologie ermöglichen. Für meine Studien kombinierte ich die chemische DNA-Demethylierung von im Freiland gesammeltem Samenmaterial sich vorwiegend sexuell fortpflanzender Arten und die Aufzucht unter gemeinsamen klimatischen Bedingungen, um DNA-Methylierung im ökologisch-evolutionären Kontext zu untersuchen. Der Kontrast von chemisch behandelten (demethylierten) Pflanzen, deren Methylierungsvariation nun künstlich verringert war, und unbehandelten Kontrollpflanzen derselben Art ermöglichte mir die Auswirkung dieses Mechanismus auf adaptive Merkmalsvariationen und lokale Anpassung zu studieren. Vor diesem experimentellen Hintergrund führte ich drei Studien durch, um die Auswirkung von DNA-Methylierung bei nicht-einheimischen Pflanzenarten entlang eines klimatischen Gradienten und zwischen zwei klimatisch unterschiedlichen Regionen zu untersuchen. Die erste Studie konzentrierte sich auf adaptive Merkmalsveränderungen bei Nachkommen von zwei invasiven, mehrjährigen Goldrutenarten, Solidago canadensis sensu latu und S. gigantea AITON, entlang eines Klimagradienten von mehr als 1000 km Länge in Zentraleuropa. Ich fand graduelle Unterschiede im Blühzeitpunkt, in der Pflanzenhöhe und der Biomasse bei der zeitlich länger etablierten S. canadensis, bei S. gigantea jedoch nur in der Anzahl der nachwachsenden Triebe. Während S. canadensis keinerlei Populationsstruktur aufwies, konnte ich bei S. gigantea drei genetische Gruppen entlang dieses Klimagradienten identifizieren. Überraschenderweise zeigten demethylierte Pflanzen beider Arten keine Veränderung in der überwiegenden Anzahl der untersuchten Merkmale. In der darauffolgenden zweiten Studie konzentrierte ich mich auf die länger etablierte Goldrutenart S. canadensis und verwendete molekulare Analysen, um räumliche epigenetische und genetische Populationunterschiede aus den Exemplaren der vorhergehenden Studie abzuleiten. Ich fand schwache genetische aber keine epigenetische räumliche Variation zwischen den Populationen. Zusätzlich konnte ich einen genetischen und einen epigenetischen Marker identifizieren, welcher potentiell unter Selektion stehen könnte. Allerdings bestätigten die Ergebnisse dieser Studie erneut, dass DNA-Methylierung bei S. canadensis kaum in die Anpassung an das neue Verbreitungsgebiet involviert zu sein scheint. Schließlich führte ich eine dritte Studie durch, in welcher ich Samen kurzlebiger Pflanzenarten reziprok zwischen zwei klimatisch unterschiedlichen Regionen in Deutschland transplantierte, um lokale Anpassung auf Ebene der Pflanzenfamilien zu untersuchen. Zu diesem Zweck nutze ich vier Pflanzenfamilien (Amaranthaceae, Asteraceae, Plantaginaceae, Solanaceae), wobei ich hier auch zwischen nicht-heimischen und heimischen Pflanzenarten verglich. Beide Regionen lagen mehr als 600 Kilometer voneinander entfernt und wiesen entweder ein gemäßigt-ozeanisches oder gemäßigt-kontinentales Klima auf. In dieser Studie zeigte sich für einige—sowohl nicht-einheimische als auch einhimische—Arten eine Fehlanpassung an die eigenen lokalen Bedingungen. In demethylierten Individuen der untersuchten Pflanzenarten wirkte sich die DNA-Methylierung widersprüchlich, aber artspezifisch auf das Überleben und die Biomasseproduktion aus. Die Ergebnisse dieser Studie unterstreichen, dass DNA-Methylierung einen vernachlässigbaren Beitrag zur lokalen Anpassung bei den untersuchten nicht-heimischen, aber auch einheimischen Arten leistete. Zusammenfassend konnte ich mit dieser Arbeit festellen, dass DNA-Methylierung bei nicht-einheimischen Pflanzenarten eine untergeordnete Rolle sowohl bei der adaptiven Merkmalsvariation entlang von Klimagradienten als auch der lokalen Anpassung an klimatisch unterschiedliche Regionen spielt, wenn diese Pflanzenarten eine hohe genetische Vielfalt aufweisen und sich hauptsächlich sexuell vermehren. Ich konnte zeigen, dass der Anpassungserfolg dieser nicht-einheimischen Pflanzenarten kaum durch DNA-Methylierung erklärbar ist, sondern vielmehr eine mögliche Folge mehrfacher Eintragungen, von Ausbreitungskorridoren und Meta-Populationsdynamiken sein könnte. Die Ergebnisse dieser Studien verdeutlichen ebenso, dass die Verwendung von Pflanzenarten, die sich nicht überwiegend klonal vermehren und keine genetischen Modellpflanzen sind, unerlässlich ist, um die Effektstärke epigenetischer Mechanismen im ökologisch-evolutionären Kontext zu charakterisieren. KW - common-garden experiment KW - reciprocal transplant experiment KW - epigenetics KW - cytosine methylation KW - zebularine KW - adaptive differentiation KW - local adaptation KW - microsatellites KW - Solidago canadensis KW - Solidago gigantea KW - Amaranthus retroflexus KW - Chenopodium album KW - Erigeron canadensis KW - Erigeron annuus KW - Lactuca serriola KW - Senecio vulgaris KW - Sonchus oleraceus KW - Tripleurospermum inodorum KW - Veronica persica KW - Plantago major KW - Datura stramonium KW - Solanum nigrum KW - latitudinal clines KW - population structure KW - invasive KW - ruderal KW - non-native KW - Central Europe KW - Germany KW - AFLP KW - MSAP KW - spatial autocorrelation KW - genome scan KW - Gemeinschaftsgarten-Experiment KW - reziprokes Transplantationsexperiment KW - Epigenetik KW - Cytosin-Methylierung KW - Zebularin KW - adaptive Differenzierung KW - lokale Anpassung KW - Mikrosatelliten KW - Breitengrad KW - Ökokline KW - Populationsstruktur KW - invasiv KW - ruderal KW - nicht-einheimisch KW - Mitteleuropa KW - Deutschland KW - AFLP KW - MSAP KW - räumliche Autokorrelation KW - Genom-Scan Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-568844 ER - TY - THES A1 - Ziege, Ricardo T1 - Growth dynamics and mechanical properties of E. coli biofilms T1 - Wachstumsdynamik und mechanische Eigenschaften von E. coli Biofilmen N2 - Biofilms are complex living materials that form as bacteria get embedded in a matrix of self-produced protein and polysaccharide fibres. The formation of a network of extracellular biopolymer fibres contributes to the cohesion of the biofilm by promoting cell-cell attachment and by mediating biofilm-substrate interactions. This sessile mode of bacteria growth has been well studied by microbiologists to prevent the detrimental effects of biofilms in medical and industrial settings. Indeed, biofilms are associated with increased antibiotic resistance in bacterial infections, and they can also cause clogging of pipelines or promote bio-corrosion. However, biofilms also gained interest from biophysics due to their ability to form complex morphological patterns during growth. Recently, the emerging field of engineered living materials investigates biofilm mechanical properties at multiple length scales and leverages the tools of synthetic biology to tune the functions of their constitutive biopolymers. This doctoral thesis aims at clarifying how the morphogenesis of Escherichia coli (E. coli) biofilms is influenced by their growth dynamics and mechanical properties. To address this question, I used methods from cell mechanics and materials science. I first studied how biological activity in biofilms gives rise to non-uniform growth patterns. In a second study, I investigated how E. coli biofilm morphogenesis and its mechanical properties adapt to an environmental stimulus, namely the water content of their substrate. Finally, I estimated how the mechanical properties of E. coli biofilms are altered when the bacteria express different extracellular biopolymers. On nutritive hydrogels, micron-sized E. coli cells can build centimetre-large biofilms. During this process, bacterial proliferation and matrix production introduce mechanical stresses in the biofilm, which release through the formation of macroscopic wrinkles and delaminated buckles. To relate these biological and mechanical phenomena, I used time-lapse fluorescence imaging to track cell and matrix surface densities through the early and late stages of E. coli biofilm growth. Colocalization of high cell and matrix densities at the periphery precede the onset of mechanical instabilities at this annular region. Early growth is detected at this outer annulus, which was analysed by adding fluorescent microspheres to the bacterial inoculum. But only when high rates of matrix production are present in the biofilm centre, does overall biofilm spreading initiate along the solid-air interface. By tracking larger fluorescent particles for a long time, I could distinguish several kinematic stages of E. coli biofilm expansion and observed a transition from non-linear to linear velocity profiles, which precedes the emergence of wrinkles at the biofilm periphery. Decomposing particle velocities to their radial and circumferential components revealed a last kinematic stage, where biofilm movement is mostly directed towards the radial delaminated buckles, which verticalize. The resulting compressive strains computed in these regions were observed to substantially deform the underlying agar substrates. The co-localization of higher cell and matrix densities towards an annular region and the succession of several kinematic stages are thus expected to promote the emergence of mechanical instabilities at the biofilm periphery. These experimental findings are predicted to advance future modelling approaches of biofilm morphogenesis. E. coli biofilm morphogenesis is further anticipated to depend on external stimuli from the environment. To clarify how the water could be used to tune biofilm material properties, we quantified E. coli biofilm growth, wrinkling dynamics and rigidity as a function of the water content of the nutritive substrates. Time-lapse microscopy and computational image analysis revealed that substrates with high water content promote biofilm spreading kinetics, while substrates with low water content promote biofilm wrinkling. The wrinkles observed on biofilm cross-sections appeared more bent on substrates with high water content, while they tended to be more vertical on substrates with low water content. Both wet and dry biomass, accumulated over 4 days of culture, were larger in biofilms cultured on substrates with high water content, despite extra porosity within the matrix layer. Finally, the micro-indentation analysis revealed that substrates with low water content supported the formation of stiffer biofilms. This study shows that E. coli biofilms respond to the water content of their substrate, which might be used for tuning their material properties in view of further applications. Biofilm material properties further depend on the composition and structure of the matrix of extracellular proteins and polysaccharides. In particular, E. coli biofilms were suggested to present tissue-like elasticity due to a dense fibre network consisting of amyloid curli and phosphoethanolamine-modified cellulose. To understand the contribution of these components to the emergent mechanical properties of E. coli biofilms, we performed micro-indentation on biofilms grown from bacteria of several strains. Besides showing higher dry masses, larger spreading diameters and slightly reduced water contents, biofilms expressing both main matrix components also presented high rigidities in the range of several hundred kPa, similar to biofilms containing only curli fibres. In contrast, a lack of amyloid curli fibres provides much higher adhesive energies and more viscoelastic fluid-like material behaviour. Therefore, the combination of amyloid curli and phosphoethanolamine-modified cellulose fibres implies the formation of a composite material whereby the amyloid curli fibres provide rigidity to E. coli biofilms, whereas the phosphoethanolamine-modified cellulose rather acts as a glue. These findings motivate further studies involving purified versions of these protein and polysaccharide components to better understand how their interactions benefit biofilm functions. All three studies depict different aspects of biofilm morphogenesis, which are interrelated. The first work reveals the correlation between non-uniform biological activities and the emergence of mechanical instabilities in the biofilm. The second work acknowledges the adaptive nature of E. coli biofilm morphogenesis and its mechanical properties to an environmental stimulus, namely water. Finally, the last study reveals the complementary role of the individual matrix components in the formation of a stable biofilm material, which not only forms complex morphologies but also functions as a protective shield for the bacteria it contains. Our experimental findings on E. coli biofilm morphogenesis and their mechanical properties can have further implications for fundamental and applied biofilm research fields. N2 - Biofilme sind komplexe lebende Materialien, die sich bilden, wenn Bakterien in eine Matrix aus selbstproduzierten Protein- und Polysaccharidfasern eingebettet werden. Die Bildung eines Netzwerks aus extrazellulären Biopolymerfasern trägt zum Zusammenhalt des Biofilms bei, indem sie die Zell-Zell-Anhaftung fördert und die Wechselwirkungen zwischen Biofilm und Substrat vermittelt. Diese sessile Form des Bakterienwachstums wurde von Mikrobiologen eingehend untersucht, um die schädlichen Auswirkungen von Biofilmen in der Medizin und Industrie zu verhindern. Biofilme werden nämlich mit einer erhöhten Antibiotikaresistenz bei bakteriellen Infektionen in Verbindung gebracht, und sie können auch zur Verstopfung von Rohrleitungen führen oder Biokorrosion fördern. Biofilme sind jedoch auch für die Biophysik von Interesse, da sie während ihres Wachstums komplexe morphologische Muster bilden können. In jüngster Zeit werden auf dem aufstrebenden Gebiet der künstlich hergestellten lebenden Materialien die mechanischen Eigenschaften von Biofilmen auf verschiedenen Längenskalen untersucht und die Werkzeuge der synthetischen Biologie genutzt, um die Funktionen ihrer konstitutiven Biopolymere zu beeinflussen. In dieser Doktorarbeit soll geklärt werden, wie die Morphogenese von Escherichia coli (E. coli)-Biofilmen durch deren Wachstumsdynamik und mechanische Eigenschaften beeinflusst wird. Um dieser Frage nachzugehen, habe ich Methoden aus der Zellmechanik und der Materialwissenschaft verwendet. Zunächst habe ich untersucht, wie die biologische Aktivität in Biofilmen zu ungleichmäßigen Wachstumsmustern führt. In einer zweiten Studie untersuchte ich, wie sich die Morphogenese von E. coli-Biofilmen und ihre mechanischen Eigenschaften an einen Umweltstimulus, nämlich den Wassergehalt des Substrats, anpassen. Schließlich habe ich abgeschätzt, wie sich die mechanischen Eigenschaften von E. coli-Biofilmen verändern, wenn die Bakterien verschiedene extrazelluläre Biopolymere exprimieren. Auf nährstoffhaltigen Hydrogelen können mikrometergroße E. coli-Zellen zentimetergroße Biofilme bilden. Während dieses Prozesses führen die bakterielle Vermehrung und die Matrixproduktion zu mechanischen Spannungen im Biofilm, die sich durch die Bildung von makroskopischen Falten und delaminierten Knicken entladen. Um diese biologischen und mechanischen Phänomene miteinander in Beziehung zu setzen, habe ich mit Hilfe von Zeitraffer-Fluoreszenzaufnahmen die Zell- und Matrixoberflächendichte in den frühen und späten Phasen des E. coli-Biofilmwachstums verfolgt. Die Kolokalisierung hoher Zell- und Matrixdichten an der Peripherie geht dem Auftreten mechanischer Instabilitäten in diesem ringförmigen Bereich voraus. An diesem äußeren Ring wird ein frühes Wachstum festgestellt, das durch Zugabe von fluoreszierenden Mikrokugeln zum bakteriellen Inokulum analysiert wurde. Aber nur wenn im Zentrum des Biofilms hohe Raten der Matrixproduktion vorhanden sind, beginnt die Ausbreitung des gesamten Biofilms entlang der Feststoff-Luft-Grenzfläche. Indem ich größere fluoreszierende Partikel über einen längeren Zeitraum verfolgte, konnte ich mehrere kinematische Stadien der E. coli-Biofilmexpansion unterscheiden und einen Übergang von nichtlinearen zu linearen Geschwindigkeitsprofilen beobachten, der dem Auftreten von Falten an der Biofilmperipherie vorausgeht. Die Zerlegung der Partikelgeschwindigkeiten in ihre radialen und umlaufenden Komponenten ergab ein letztes kinematisches Stadium, in dem die Bewegung des Biofilms hauptsächlich auf die radialen delaminierten Knicke gerichtet ist, die sich vertikalisieren. Die in diesen Regionen berechneten Druckspannungen verformen die darunter liegenden Agarsubstrate erheblich. Die gleichzeitige Ansammlung höherer Zell- und Matrixdichten in einer ringförmigen Region und die Abfolge mehrerer kinematischer Stadien dürften somit das Entstehen mechanischer Instabilitäten an der Biofilm-Peripherie fördern. Diese experimentellen Ergebnisse werden voraussichtlich zukünftige Modellierungsansätze der Biofilmmorphogenese voranbringen. Die Morphogenese des E. coli-Biofilms wird voraussichtlich auch von externen Stimuli aus der Umwelt abhängen. Um zu klären, wie das Wasser zur Einstellung der Materialeigenschaften von Biofilmen genutzt werden könnte, haben wir das Wachstum, die Faltenbildung und die Steifigkeit von E. coli-Biofilmen in Abhängigkeit vom Wassergehalt der Nährsubstrate quantifiziert. Zeitraffermikroskopie und computergestützte Bildanalyse zeigten, dass Substrate mit hohem Wassergehalt die Ausbreitungskinetik des Biofilms fördern, während Substrate mit niedrigem Wassergehalt die Faltenbildung des Biofilms begünstigen. Die auf Biofilm-Querschnitten beobachteten Falten erschienen auf Substraten mit hohem Wassergehalt stärker gebogen, während sie auf Substraten mit niedrigem Wassergehalt eher vertikal verliefen. Sowohl die feuchte als auch die trockene Biomasse, die während der 4-tägigen Kultur akkumuliert wurde, war in Biofilmen, die auf Substraten mit hohem Wassergehalt gezüchtet wurden, größer, trotz der zusätzlichen Porosität innerhalb der Matrixschicht. Schließlich ergab die Mikroindentationsanalyse, dass Substrate mit niedrigem Wassergehalt die Bildung von steiferen Biofilmen begünstigten. Diese Studie zeigt, dass E. coli-Biofilme auf den Wassergehalt ihres Substrats reagieren, was für die Abstimmung ihrer Materialeigenschaften im Hinblick auf weitere Anwendungen genutzt werden könnte. Die Materialeigenschaften von Biofilmen hängen außerdem von der Zusammensetzung und Struktur der Matrix aus extrazellulären Proteinen und Polysacchariden ab. Insbesondere wurde vermutet, dass E. coli-Biofilme aufgrund eines dichten Fasernetzwerks aus Amyloid-Curli und Phosphoethanolamin-modifizierter Cellulose eine gewebeähnliche Elastizität aufweisen. Um den Beitrag dieser Komponenten zu den entstehenden mechanischen Eigenschaften von E. coli-Biofilmen zu verstehen, führten wir an Biofilmen, die aus Bakterien verschiedener Stämme gewachsen waren, Mikroeindrücke durch. Biofilme, die beide Hauptmatrixkomponenten enthalten, wiesen nicht nur eine höhere Trockenmasse, einen größeren Ausbreitungsdurchmesser und einen leicht verringerten Wassergehalt auf, sondern auch eine hohe Steifigkeit im Bereich von mehreren hundert kPa, ähnlich wie Biofilme, die nur Curli-Fasern enthalten. Das Fehlen von Amyloid-Curli-Fasern führt dagegen zu deutlich höheren Adhäsionsenergien und einem viskoelastischeren, flüssigkeitsähnlichen Materialverhalten. Die Kombination von Amyloid-Curli-Fasern und Phosphoethanolamin-modifizierten Cellulosefasern impliziert daher die Bildung eines Verbundmaterials, bei dem die Amyloid-Curli-Fasern den E. coli-Biofilmen Steifigkeit verleihen, während die Phosphoethanolamin-modifizierte Cellulose eher als Klebstoff wirkt. Diese Ergebnisse motivieren zu weiteren Studien mit gereinigten Versionen dieser Protein- und Polysaccharidkomponenten, um besser zu verstehen, wie ihre Interaktionen die Funktionen des Biofilms unterstützen. Alle drei Studien zeigen verschiedene Aspekte der Biofilm-Morphogenese, die miteinander verbunden sind. Die erste Arbeit zeigt den Zusammenhang zwischen ungleichmäßigen biologischen Aktivitäten und dem Auftreten mechanischer Instabilitäten im Biofilm auf. Die zweite Arbeit bestätigt die Anpassungsfähigkeit der Morphogenese des E. coli-Biofilms und seiner mechanischen Eigenschaften an einen Umweltreiz, nämlich Wasser. Die letzte Studie schließlich zeigt die komplementäre Rolle der einzelnen Matrixkomponenten bei der Bildung eines stabilen Biofilmmaterials, das nicht nur komplexe Morphologien bildet, sondern auch als Schutzschild für die darin enthaltenen Bakterien fungiert. Unsere experimentellen Erkenntnisse über die Morphogenese von E. coli-Biofilmen und ihre mechanischen Eigenschaften können weitere Auswirkungen auf grundlegende und angewandte Biofilm-Forschungsbereiche haben. KW - biofilm KW - E. coli KW - living materials KW - mechanobiology KW - E. coli KW - Biofilm KW - lebende Materialien KW - Mechanobiologie Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-559869 ER - TY - THES A1 - Oberkofler, Vicky T1 - Molecular basis of HS memory in Arabidopsis thaliana T1 - Die molekulare Basis des Hitzestress-Gedächtnisses in Arabidopsis thaliana N2 - Plants can be primed to survive the exposure to a severe heat stress (HS) by prior exposure to a mild HS. The information about the priming stimulus is maintained by the plant for several days. This maintenance of acquired thermotolerance, or HS memory, is genetically separable from the acquisition of thermotolerance itself and several specific regulatory factors have been identified in recent years. On the molecular level, HS memory correlates with two types of transcriptional memory, type I and type II, that characterize a partially overlapping subset of HS-inducible genes. Type I transcriptional memory or sustained induction refers to the sustained transcriptional induction above non-stressed expression levels of a gene for a prolonged time period after the end of the stress exposure. Type II transcriptional memory refers to an altered transcriptional response of a gene after repeated exposure to a stress of similar duration and intensity. In particular, enhanced re-induction refers to a transcriptional pattern in which a gene is induced to a significantly higher degree after the second stress exposure than after the first. This thesis describes the functional characterization of a novel positive transcriptional regulator of type I transcriptional memory, the heat shock transcription factor HSFA3, and compares it to HSFA2, a known positive regulator of type I and type II transcriptional memory. It investigates type I transcriptional memory and its dependence on HSFA2 and HSFA3 for the first time on a genome-wide level, and gives insight on the formation of heteromeric HSF complexes in response to HS. This thesis confirms the tight correlation between transcriptional memory and H3K4 hyper-methylation, reported here in a case study that aimed to reduce H3K4 hyper-methylation of the type II transcriptional memory gene APX2 by CRISPR/dCas9-mediated epigenome editing. Finally, this thesis gives insight into the requirements for a heat shock transcription factor to function as a positive regulator of transcriptional memory, both in terms of its expression profile and protein abundance after HS and the contribution of individual functional domains. In summary, this thesis contributes to a more detailed understanding of the molecular processes underlying transcriptional memory and therefore HS memory, in Arabidopsis thaliana. N2 - Pflanzen können darauf vorbereitet werden, einen schweren Hitzestress (HS) zu überleben, indem sie zuvor einem leichten HS ausgesetzt werden. Die Information über den Priming-Stimulus wird von der Pflanze mehrere Tage lang aufrechterhalten. Diese Aufrechterhaltung der erworbenen Thermotoleranz, das so genannte HS-Gedächtnis, ist genetisch vom Erwerb der Thermotoleranz selbst trennbar, und in den letzten Jahren wurden mehrere spezifische Regulierungsfaktoren identifiziert. Auf molekularer Ebene korreliert das HS-Gedächtnis mit zwei Arten von Transkriptionsgedächtnis, Typ I und Typ II, die eine sich teilweise überschneidende Untergruppe von HS-induzierbaren Genen charakterisieren. Das Transkriptionsgedächtnis vom Typ I oder die anhaltende Induktion bezieht sich auf die anhaltende Transkriptionsinduktion eines Gens über das Niveau der Expression im ungestressten Zustand hinaus über einen längeren Zeitraum nach dem Ende der Stressbelastung. Das Transkriptionsgedächtnis des Typs II bezieht sich auf eine veränderte Transkriptionsreaktion eines Gens nach wiederholter Exposition gegenüber einem Hitzestress von ähnlicher Dauer und Intensität. Insbesondere bezieht sich dabei die verstärkte Re-Induktion auf ein Transkriptionsmuster, bei dem ein Gen nach der zweiten Stressexposition in deutlich höherem Maße induziert wird als nach der ersten. Diese Arbeit beschreibt die funktionelle Charakterisierung eines neuartigen positiven Transkriptionsregulators des Typ-I-Transkriptionsgedächtnisses, des Hitzeschock-Transkriptionsfaktors HSFA3, und vergleicht ihn mit HSFA2, einem bekannten positiven Regulator des Typ-I- und Typ-II-Transkriptionsgedächtnisses. Die Arbeit untersucht das Typ-I-Transkriptionsgedächtnis und seine Abhängigkeit von HSFA2 und HSFA3 zum ersten Mal auf genomweiter Ebene und gibt Einblick in die Bildung heteromerer HSF-Komplexe als Reaktion auf HS. Diese Arbeit bestätigt den engen Zusammenhang zwischen transkriptionellem Gedächtnis und H3K4-Hypermethylierung, über den hier in einer Fallstudie berichtet wird, die darauf abzielt, die H3K4-Hypermethylierung des Typ-II-Transkriptionsgedächtnisgens APX2 durch CRISPR/dCas9-vermitteltes Epigenom-Editing zu reduzieren. Schließlich gibt diese Arbeit einen Einblick in die Anforderungen, die ein Hitzeschock-Transkriptionsfaktor erfüllen muss, damit er als positiver Regulator des Transkriptionsgedächtnisses fungieren kann, und zwar sowohl in Bezug auf sein Expressionsprofil und seine Proteinabundanz nach HS als auch in Bezug auf den Beitrag seiner einzelnen funktionellen Domänen. Zusammenfassend trägt diese Arbeit zu einem genaueren Verständnis der molekularen Prozesse bei, die dem Transkriptionsgedächtnis und damit dem HS-Gedächtnis in Arabidopsis thaliana zugrunde liegen. KW - Arabidopsis thaliana KW - abiotic stress KW - heat stress memory KW - transcription factors KW - HSF KW - epigenome editing KW - histone methylation KW - H3K4me KW - Arabidopsis thaliana KW - H3K4me KW - Hitzeschock-Transkriptionsfaktor KW - abiotischer Stress KW - Epigenom Editierung KW - Hitzestress-Gedächtnis KW - Histon Methylierung KW - Transkriptionsfaktoren Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-569544 ER - TY - THES A1 - Demin, Paul T1 - Blaulicht-aktivierbares Proteinexpressionssystem in Saccharomyces cerevisiae T1 - Blue light-inducible protein expression system in Saccharomyces cerevisiae N2 - Synthetische Transkriptionsfaktoren bestehen wie natürliche Transkriptionsfaktoren aus einer DNA-Bindedomäne, die sich spezifisch an die Bindestellensequenz vor dem Ziel-Gen anlagert, und einer Aktivierungsdomäne, die die Transkriptionsmaschinerie rekrutiert, sodass das Zielgen exprimiert wird. Der Unterschied zu den natürlichen Transkriptionsfaktoren ist, sowohl dass die DNA-Bindedomäne als auch die Aktivierungsdomäne wirtsfremd sein können und dadurch künstliche Stoffwechselwege im Wirt, größtenteils chemisch, induziert werden können. Optogenetische synthetische Transkriptionsfaktoren, die hier entwickelt wurden, gehen einen Schritt weiter. Dabei ist die DNA-Bindedomäne nicht mehr an die Aktivierungsdomäne, sondern mit dem Blaulicht-Photorezeptor CRY2 gekoppelt. Die Aktivierungsdomäne wurde mit dem Interaktionspartner CIB1 fusioniert. Unter Blaulichtbestrahlung dimerisieren CRY2 und CIB1 und damit einhergehend die beiden Domänen, sodass ein funktionsfähiger Transkriptionsfaktor entsteht. Dieses System wurde in die Saccharomyces cerevisiae genomisch integriert. Verifiziert wurde das konstruierte System mit Hilfe des Reporters yEGFP, welcher durchflusszytometrisch detektiert werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass die yEGFP Expression variabel gestaltet werden kann, indem unterschiedlich lange Blaulichtimpulse ausgesendet wurden, die DNA-Bindedomäne, die Aktivierungsdomäne oder die Anzahl der Bindestellen, an dem sich die DNA-Bindedomäne anlagert, verändert wurden. Um das System für industrielle Anwendungen attraktiv zu gestalten, wurde das System vom Deepwell-Maßstab auf Photobioreaktor-Maßstab hochskaliert. Außerdem erwies sich das Blaulichtsystem sowohl im Laborstamm YPH500 als auch im industriell oft verwendeten Hefestamm CEN.PK als funktional. Des Weiteren konnte ein industrierelevante Protein ebenso mit Hilfe des verifizierten Systems exprimiert werden. Schlussendlich konnte in dieser Arbeit das etablierte Blaulicht-System erfolgreich mit einem Rotlichtsystem kombiniert werden, was zuvor noch nicht beschrieben wurde. N2 - Like natural transcription factors, synthetic transcription factors consist of a DNA-binding domain that attaches specifically to the binding site sequence in front of the target gene, and an activation domain that recruits the transcription machinery so that the target gene is expressed. The difference to natural transcription factors is that both the DNA binding domain and the activation domain can be host foreign and artificial metabolic pathways, mostly chemically, can be induced in the host. In this work, new optogenetic synthetic transcription factors were developed so that chemical induction becomes obsolete. The DNA binding domain is no longer linked to the activation domain but to the blue light photoreceptor CRY2. The activation domain was fused to the interaction partner CIB1. Upon blue light irradiation, CRY2 and CIB1 dimerize and thus the two domains, resulting in a functional transcription factor. Six different prokaryotic DNA-binding domains and a total of two different activation domains, viral and fungal, were recombined with CRY2 and CIB1, respectively, and genomically integrated into the eukaryotic cell factory Saccharomyces cerevisiae. Since the blue light dimerization is based on the chromophore FAD, which the yeast can synthesize itself, only the blue light had to be switched on for the induction. The constructed system was verified with the help of the reporter yEGFP, which could be detected by flow cytometry. It could be shown that the yEGFP expression could be made variable by emitting blue light pulses of different lengths, changing the DNA binding domain, the activation domain or the copy number of binding sites at which the DNA binding domain attaches. To make the system attractive for industrial applications, the system was scaled up from deepwell scale to photobioreactor scale. In addition, the blue light system proved to be functional both in the laboratory strain YPH500 and in the yeast strain CEN.PK, which is often used industrially. Furthermore, the industrially relevant protein VP1 could also be expressed using the verified system. Due to its great flexibility, the blue light system established here was christened/named FLIRT (Flexible Blue Light Induced Transcription). Finally, in this work, the established flirt system could be successfully combined with a red light system, which has not been described before. KW - Synthetische Biologie KW - Hefe KW - Saccharomyces cerevisiae KW - Blaulicht KW - Transkriptionsfaktoren KW - Bioreaktor KW - bioreactor KW - blue light KW - budding yeast KW - Saccharomyces cerevisiae KW - synthetic biology KW - transcription factors Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-559696 ER - TY - THES A1 - Schulte, Luise T1 - Dynamics of Larix (Mill.) species in Siberia during the last 50,000 years inferred from sedimentary ancient DNA T1 - Die Dynamik sibirischer Lärchenarten (Larix Mill.) während der der letzten 50.000 Jahre, untersucht mittels sedimentärer alter DNA N2 - The deciduous needle tree larch (Larix Mill.) covers more than 80% of the Asian boreal forests. Only a few Larix species constitute the vast forests and these species differ markedly in their ecological traits, most importantly in their ability to grow on and stabilize underlying permafrost. The pronounced dominance of the summergreen larches makes the Asian boreal forests unique, as the rest of the northern hemisphere boreal forests is almost exclusively dominated by evergreen needle-leaf forests. Global warming is impacting the whole world but is especially pronounced in the arctic and boreal regions. Although adapted to extreme climatic conditions, larch forests are sensitive to varying climatic conditions. By their sheer size, changes in Asian larch forests as range shifts or changes in species composition and the resulting vegetation-climate feedbacks are of global relevance. It is however still uncertain if larch forests will persist under the ongoing warming climate or if they will be replaced by evergreen forests. It is therefore of great importance to understand how these ecosystems will react to future climate warmings and if they will maintain their dominance. One step in the better understanding of larch dynamics is to study how the vast dominant forests developed and why they only established in northern Asia. A second step is to study how the species reacted to past changes in the climate. The first objective of this thesis was to review and identify factors promoting Asian larch dominance. I achieved this by synthesizing and comparing reported larch occurrences and influencing components on the northern hemisphere continents in the present and in the past. The second objective was to find a possibility to directly study past Larix populations in Siberia and specifically their genetic variation, enabling the study of geographic movements. For this, I established chloroplast enrichment by hybridization capture from sedimentary ancient DNA (sedaDNA) isolated from lake sediment records. The third objective was to use the established method to track past larch populations, their glacial refugia during the Last Glacial Maximum (LGM) around 21,000 years before present (ka BP), and their post-glacial migration patterns. To study larch promoting factors, I compared the present state of larch species ranges, areas of dominance, their bioclimatic niches, and the distribution on different extents and thaw depths of permafrost. The species comparison showed that the bioclimatic niches greatly overlap between the American and Asian species and that it is only in the extremely continental climates in which only the Asian larch species can persist. I revealed that the area of dominance is strongly connected to permafrost extent but less linked to permafrost seasonal thaw depths. Comparisons of the paleorecord of larch between the continents suggest differences in the recolonization history. Outside of northern Asia and Alaska, glacial refugial populations of larch were confined to the southern regions and thus recolonization could only occur as migration from south to north. Alaskan larch populations could not establish wide-range dominant forest which could be related to their own genetically depletion as separated refugial population. In Asia, it is still unclear whether or not the northern refugial populations contributed and enhanced the postglacial colonization or whether they were replaced by populations invading from the south in the course of climate warming. Asian larch dominance is thus promoted partly by adaptions to extremely continental climates and by adaptations to grow on continuous permafrost but could be also connected to differences in glacial survival and recolonization history of Larix species. Except for extremely rare macrofossil findings of fossilized cones, traditional methods to study past vegetation are not able to distinguish between larch species or populations. Within the scope of this thesis, I therefore established a method to retrieve genetic information of past larch populations to distinguish between species. Using the Larix chloroplast genome as target, I successfully applied the method of DNA target enrichment by hybridization capture on sedaDNA samples from lake records and showed that it is able to distinguish between larch species. I then used the method on samples from lake records from across Siberia dating back up to 50 ka BP. The results allowed me to address the question of glacial survival and post-glacial recolonization mode in Siberian larch species. The analyzed pattern showed that LGM refugia were almost exclusively constituted by L. gmelinii, even in sites of current L. sibirica distribution. For included study sites, L. sibirica migrated into its extant northern distribution area only in the Holocene. Consequently, the post-glacial recolonization of L. sibirica was not enhanced by northern glacial refugia. In case of sites in extant distribution area of L. gmelinii, the absence of a genetic turn-over point to a continuous population rather than an invasion of southern refugia. The results suggest that climate has a strong influence on the distribution of Larix species and that species may also respond differently to future climate warming. Because species differ in their ecological characteristics, species distribution is also relevant with respect to further feedbacks between vegetation and climate. With this thesis, I give an overview of present and past larch occurrences and evaluate which factors promote their dominance. Furthermore, I provide the tools to study past Larix species and give first important insights into the glacial history of Larix populations. N2 - Der sommergrüne Nadelbaum Lärche (Larix Mill.) bedeckt mehr als 80 % der Fläche der borealen Wälder Asiens. Nur wenige Lärchenarten bilden ausgedehnte Wälder und diese Arten unterscheiden sich deutlich in ihren ökologischen Eigenschaften, vor allem in ihrer Fähigkeit, auf Permafrost zu wachsen und diesen zu stabilisieren. Die ausgeprägte Dominanz der sommergrünen Lärchen macht die asiatischen borealen Wälder einzigartig, da der Rest der borealen Wälder der Nordhalbkugel fast ausschließlich von immergrünen Nadelwäldern dominiert wird. Die Klimaerwärmung wirkt sich auf die ganze Welt aus, ist aber in den arktischen und borealen Regionen besonders ausgeprägt. Obwohl die Lärchenwälder an extreme klimatische Bedingungen angepasst sind, reagieren sie empfindlich auf klimatische Schwankungen. Aufgrund ihrer schieren Größe sind Veränderungen in asiatischen Lärchenwäldern, wie z. B. Verschiebungen des Verbreitungsgebiets oder Veränderungen in der Artenzusammensetzung und die daraus resultierenden Rückkopplungen zwischen Vegetation und Klima, von globaler Bedeutung. Es ist jedoch noch ungewiss, ob die Lärchenwälder unter der fortschreitenden Klimaerwärmung bestehen bleiben oder durch immergrüne Wälder ersetzt werden. Es ist daher von großer Bedeutung zu verstehen, wie diese Ökosysteme auf die künftige Klimaerwärmung reagieren werden und ob sie ihre Dominanz behalten werden. Ein Schritt zum besseren Verständnis der Lärchendynamik besteht darin, zu untersuchen, wie die riesigen dominanten Wälder von heute entstanden sind und warum sie sich nur in Nordasien etabliert haben. In einem zweiten Schritt soll untersucht werden, wie die Art auf vergangene Klimaveränderungen reagiert hat. Das erste Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Faktoren zu ermitteln, die die Dominanz der asiatischen Lärche begünstigen. Dies erreichte ich, indem ich die dokumentierten Lärchenvorkommen und die sie beeinflussenden Komponenten auf den Kontinenten der nördlichen Hemisphäre in der Gegenwart und in der Vergangenheit gesammelt und verglichen habe. Das zweite Ziel bestand darin, eine Möglichkeit zu finden, frühere Lärchenpopulationen in Sibirien und insbesondere ihre genetische Variation direkt zu studieren, um geografische Bewegungen untersuchen zu können. Dafür etablierte ich die Methode der Anreicherung von Chloroplasten durch Hybridisierung von alter sedimentärer DNA (sedaDNA) isoliert aus Seesedimenten. Das dritte Ziel bestand darin, die etablierte Methode zu nutzen, um vergangene Lärchenpopulationen, ihre eiszeitlichen Refugien während des letzten glazialen Maximums (LGM) um ca. 21.000 Jahre vor der Gegenwart (ka BP) und ihre nacheiszeitlichen Migrationsmuster zu verfolgen. Um die Faktoren zu untersuchen, die die Ausbreitung der Lärche begünstigen, verglich ich den gegenwärtigen Stand der Verbreitungsgebiete der Lärchenarten, die Gebiete, in denen sie vorherrschen, ihre bioklimatischen Nischen und die Verteilung auf verschiedene Ausdehnungen und Auftautiefen des Permafrosts. Der Artenvergleich zeigte, dass sich die bioklimatischen Nischen der amerikanischen und asiatischen Arten stark überschneiden und dass nur in den extrem kontinentalen Klimazonen ausschließlich die asiatischen Lärchenarten überleben können. Es zeigte sich, dass das Verbreitungsgebiet stark mit der Permafrostausdehnung zusammenhängt, aber weniger mit der saisonalen Auftautiefe des Permafrosts. Der Vergleich vergangener Lärchenvorkommen zwischen den Kontinenten deutet auf Unterschiede in der Rekolonisationsgeschichte hin. Außerhalb Nordasiens und Alaskas waren die eiszeitlichen Lärchenpopulationen auf die südlichen Regionen beschränkt, so dass die Wiederbesiedlung nur als Wanderung von Süden nach Norden erfolgen konnte. Die Lärchenpopulationen in Alaska konnten keinen weiträumig dominanten Wald etablieren, was mit ihrer eigenen genetischen Verarmung als abgeschiedene Refugialpopulation zusammenhängen könnte. In Asien ist noch unklar, ob die nördlichen Refugialpopulationen zur nacheiszeitlichen Besiedlung beigetragen und diese verstärkt haben oder ob sie im Zuge der Klimaerwärmung durch von Süden eindringende Populationen ersetzt wurden. Die Dominanz der asiatischen Lärche wird also zum Teil durch Anpassungen an das extrem kontinentale Klima und durch Anpassungen an das Wachstum auf kontinuierlichem Permafrost begünstigt, könnte aber auch mit Unterschieden in der glazialen Überlebens- und Rekolonisationsgeschichte der Larix-Arten zusammenhängen. Abgesehen von den äußerst seltenen Makrofossilienfunden versteinerter Zapfen sind die herkömmlichen Methoden zur Untersuchung der vergangenen Vegetation nicht in der Lage, zwischen Lärchenarten oder -populationen zu unterscheiden. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich daher eine Methode zur Gewinnung genetischer Informationen früherer Lärchenpopulationen entwickelt, um zwischen den Arten zu unterscheiden. Unter Verwendung des Larix-Chloroplastengenoms habe ich die Methode der DNA-Anreicherung durch Hybridisierung erfolgreich auf sedaDNA-Proben aus See-sedimentbohrkernen angewandt und gezeigt, dass die Methode erlaubt zwischen Lärchenarten zu unterscheiden. Anschließend wendete ich die Methode auf Proben aus Seen in ganz Sibirien an, die bis zu 50 ka BP zurückreichen. Anhand der Ergebnisse konnte ich zur Beantwortung der Frage beitragen, welche sibirische Lärchenarten während des LGM überlebten und wie die postglaziale Wiederbesiedlung stattfand. Das analysierte Muster zeigte, dass die LGM-Refugien fast ausschließlich von L. gmelinii gebildet wurden, selbst an Orten, an denen heute L. sibirica verbreitet ist. In den untersuchten Gebieten ist L. sibirica erst im Holozän in ihr heutiges nördliches Verbreitungsgebiet eingewandert. Folglich wurde die nacheiszeitliche Wiederbesiedlung von L. sibirica nicht durch nördliche eiszeitliche Refugien gefördert. Im Falle der Standorte im heutigen Verbreitungsgebiet von L. gmelinii deutet das Fehlen eines Wechsels genetischer Variation eher auf eine kontinuierliche Population als auf eine Invasion aus südlichen Refugien hin. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Klima einen starken Einfluss auf die Verbreitung von Larix-Arten hat und die Arten auch auf zukünftige Klimaerwärmung unterschiedlich reagieren könnten. Da die Arten sich in ihren ökologischen Eigenschaften unterscheiden, ist eine Änderung in der Verbreitung der Arten auch im Hinblick auf weitere Rückkopplungen zwischen Vegetation und Klima relevant. In dieser Arbeit gebe ich einen Überblick über die heutigen und früheren Lärchenvorkommen und bewerte, welche Faktoren ihre Dominanz begünstigen. Darüber hinaus stelle ich eine Methode zur Untersuchung vergangener Lärchenarten bereit und gebe erste wichtige Einblicke in ihre glaziale Geschichte. KW - ancient DNA KW - ancient sedimentary DNA KW - Larix KW - larch KW - glacial refugia KW - postglacial recolonization KW - phylogeography KW - hybridization capture KW - target enrichment KW - shotgun sequencing KW - chloroplast KW - Siberia KW - Larix KW - Sibirien KW - alte DNA KW - alte sedimentäre DNA KW - Chloroplast KW - glaziale Refugien KW - Lärche KW - Phylogeographie KW - nacheiszeitliche Wiederbesiedlung KW - Shotgun Sequenzierung Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-558782 ER - TY - THES A1 - Tegtmeier, Laura T1 - Functional analysis of ENTH domain proteins T1 - Funktionelle Analyse der ENTH Proteinen N2 - In plant cells, subcellular transport of cargo proteins relies to a large extent on post-Golgi transport pathways, many of which are mediated by clathrin-coated vesicles (CCVs). Vesicle formation is facilitated by different factors like accessory proteins and adaptor protein complexes (APs), the latter serving as a bridge between cargo proteins and the coat protein clathrin. One type of accessory proteins is defined by a conserved EPSIN N-TERMINAL HOMOLOGY (ENTH) domain and interacts with APs and clathrin via motifs in the C-terminal part. In Arabidopsis thaliana, there are three closely related ENTH domain proteins (EPSIN1, 2 and 3) and one highly conserved but phylogenetically distant outlier, termed MODIFIED TRANSPORT TO THE VACUOLE1 (MTV1). In case of the trans-Golgi network (TGN) located MTV1, clathrin association and a role in vacuolar transport have been shown previously (Sauer et al. 2013). In contrast, for EPSIN1 and EPSIN2 limited functional and localization data were available; and EPSIN3 remained completely uncharacterized prior to this study (Song et al. 2006; Lee et al. 2007). The molecular details of ENTH domain proteins in plants are still unknown. In order to systematically characterize all four ENTH proteins in planta, we first investigated expression and subcellular localization by analysis of stable reporter lines under their endogenous promotors. Although all four genes are ubiquitously expressed, their subcellular distribution differs markedly. EPSIN1 and MTV1 are located at the TGN, whereas EPSIN2 and EPSIN3 are associated with the plasma membrane (PM) and the cell plate. To examine potential functional redundancy, we isolated knockout T-DNA mutant lines and created all higher order mutant combinations. The clearest evidence for functional redundancy was observed in the epsin1 mtv1 double mutant, which is a dwarf displaying overall growth reduction. These findings are in line with the TGN localization of both MTV1 and EPS1. In contrast, loss of EPSIN2 and EPSIN3 does not result in a growth phenotype compared to wild type, however, a triple knockout of EPSIN1, EPSIN2 and EPSIN3 shows partially sterile plants. We focused mainly on the epsin1 mtv1 double mutant and addressed the functional role of these two genes in clathrin-mediated vesicle transport by comprehensive molecular, biochemical, and genetic analyses. Our results demonstrate that EPSIN1 and MTV1 promote vacuolar transport and secretion of a subset of cargo. However, they do not seem to be involved in endocytosis and recycling. Importantly, employing high-resolution imaging, genetic and biochemical experiments probing the relationship of the AP complexes, we found that EPSIN1/AP1 and MTV1/AP4 define two spatially and molecularly distinct subdomains of the TGN. The AP4 complex is essential for MTV1 recruitment to the TGN, whereas EPSIN1 is independent of AP4 but presumably acts in an AP1-dependent framework. Our findings suggest that this ENTH/AP pairing preference is conserved between animals and plants. N2 - In pflanzlichen Zellen hängt der Transport von Proteinen von vielen dem Golgi-Apparat nachfolgenden Transportwegen ab, welche zum Großteil durch Clathrin-bedeckte Vesikel (CCV) vermittelt werden. Die Vesikelbildung wird durch verschiedene Helferproteine und Adapterproteinkomplexe (AP) ermöglicht. Letztere dienen als Brücke zwischen den Transportproteinen und dem Hüllprotein Clathrin. Eine Gruppe von Hilfsproteinen interagiert mit APs und Clathrin mittels des C-Terminus und ist durch eine konservierte EPSIN N-TERMINAL HOMOLOGY (ENTH)-Domäne definiert. In Arabidopsis thaliana wurden drei eng verwandte ENTH-Domänenproteine (EPSIN1, 2 und 3) sowie ein stark konservierter phylogenetischer Außenseiter MODIFIED TRANSPORT TO THE VACUOLE1 (MTV1), gefunden. Im Falle des im trans-Golgi Netzwerk (TGN) lokalisierten MTV1 wurde die Assoziation mit Clathrin und eine Rolle im vakuolären Transport nachgewiesen (Sauer et al. 2013). Im Vergleich dazu gab es für EPSIN1 und EPSIN2 nur limitierte Daten und EPSIN3 war bisher unerforscht (Song et al. 2006; Lee et al. 2007). Die Funktionen der ENTH-Domänenproteine in Pflanzen blieben unklar. Um die vier ENTH-Proteine in planta zu charakterisieren, untersuchten wir zunächst deren Expression sowie subzelluläre Lokalisation anhand stabiler Reporterlinien, welche Fusionsproteine vom jeweils endogenen Promotor exprimierten. Obwohl unsere Ergebnisse zeigten, dass alle ENTH-Domänenproteine ubiquitär exprimiert wurden, war die subzelluläre Verteilung deutlich unterschiedlich. EPSIN1 und MTV1 lokalisierten am TGN, während EPSIN2 und EPSIN3 in der Nähe der Plasmamembran (PM) und der Zellplatte zu finden waren. Um eine mögliche funktionelle Redundanz zu untersuchen, nutzten wir komplette Funktionsverlust-Mutanten und erzeugten daraus Mutanten höherer Ordnung. Deutliche Hinweise auf funktionelle Redundanz ergab die epsin1 mtv1-Doppelmutante, die eine starke Wachstumsreduktion aufwies, was zur Lokalisierung beider Proteine am TGN passte. Im Gegensatz dazu verursachte der Verlust von EPSIN2 und EPSIN3 keinen vom Wildtyp abweichenden Phänotyp, jedoch zeigte die epsin1 epsin2 epsin3-Dreifachmutante partielle Sterilität. Wir fokussierten uns daher hauptsächlich auf epsin1 mtv1 und untersuchten die funktionelle Rolle im Clathrin-vermittelten Vesikeltransport durch vergleichende molekulare, biochemische und genetische Analysen. EPSIN1 und MTV1 unterstützten den vakuolären und sekretorischen Transport, waren aber nicht an Endozytose oder Recycling beteiligt. Durch hochauflösende Mikroskopie, genetische und biochemische Analysen der Beziehung zwischen verschiedenen AP-Komplexen und EPSIN1/MTV1 konnten wir zeigen, dass EPSIN1/AP1 und MTV1/AP4 zwei räumlich und molekular distinkte Subdomänen des TGNs definierten. AP4 war essenziell für die MTV1- jedoch nicht die EPSIN1-Rekrutierung zum TGN und EPSIN1 assoziierte bevorzugt mit AP1. Ähnliche Beobachtungen an EPSIN1- und MTV1-Homologen in tierischen Zellen legen eine evolutionär konservierte Paarung von AP-Komplexen und ENTH-Proteinen nahe. KW - vesicle transport KW - trans-Golgi network KW - trans-Golgi Netzwerk KW - clathrin-coated vesicles KW - Clathrin-bedeckte Vesikel KW - ENTH domain proteins KW - ENTH-Domänenproteine Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-570049 ER - TY - THES A1 - Kath, Nadja Jeanette T1 - Functional traits determine biomass dynamics, coexistence and energetics in plankton food webs N2 - Plankton food webs are the basis of marine and limnetic ecosystems. Especially aquatic ecosystems of high biodiversity provide important ecosystem services for humankind as providers of food, coastal protection, climate regulation, and tourism. Understanding the dynamics of biomass and coexistence in these food webs is a first step to understanding the ecosystems. It also lays the foundation for the development of management strategies for the maintenance of the marine and freshwater biodiversity despite anthropogenic influences. Natural food webs are highly complex, and thus often equally complex methods are needed to analyse and understand them well. Models can help to do so as they depict simplified parts of reality. In the attempt to get a broader understanding of the complex food webs, diverse methods are used to investigate different questions. In my first project, we compared the energetics of a food chain in two versions of an allometric trophic network model. In particular, we solved the problem of unrealistically high trophic transfer efficiencies (up to 70%) by accounting for both basal respiration and activity respiration, which decreased the trophic transfer efficiency to realistic values of ≤30%. Next in my second project I turned to plankton food webs and especially phytoplankton traits. Investigating a long-term data set from Lake Constance we found evidence for a trade-off between defence and growth rate in this natural phytoplankton community. I continued working with this data set in my third project focusing on ciliates, the main grazer of phytoplankton in spring. Boosted regression trees revealed that temperature and predators have the highest influence on net growth rates of ciliates. We finally investigated in my fourth project a food web model inspired by ciliates to explore the coexistence of plastic competitors and to study the new concept of maladaptive switching, which revealed some drawbacks of plasticity: faster adaptation led to higher maladaptive switching towards undefended phenotypes which reduced autotroph biomass and coexistence and increased consumer biomass. It became obvious that even well-established models should be critically questioned as it is important not to forget reality on the way to a simplistic model. The results showed furthermore that long-term data sets are necessary as they can help to disentangle complex natural processes. Last, one should keep in mind that the interplay between models and experiments/ field data can deliver fruitful insights about our complex world. N2 - Plankton-Nahrungsnetze sind die Grundlage mariner und limnischer Ökosysteme. Besonders die aquatischen Ökosysteme mit hoher Biodiversität erbringen wichtige Ökosystemdienstleistungen für uns Menschen wie beispielsweise die Bereitstellung von Nahrung, Küstenschutz, Klimaregulation sowie Tourismus. Die Dynamiken und die Koexistenz der Arten in diesen Ökosystemen zu verstehen, ist ein erster Schritt für die Entwicklung von Möglichkeiten zum Schutz ihrer Biodiversität. Aufgrund der hohen Komplexität natürlicher Nahrungsnetze braucht es oft ebenso komplexe Methoden um sie zu analysieren und zu verstehen. Modelle können dabei unterstützen, da sie Teile der Realität vereinfacht abbilden. In meiner Dissertation arbeitete ich mit verschiedenen Nahrungsnetzmodellen, um die Dynamiken in Nahrungsnetzen zu verstehen. In meinem ersten Projekt haben wir die Energieflüsse einer Nahrungskette in zwei Versionen eines allometrisch skalierten Nahrungsnetzmodells untersucht. Wenn nur die klassische basale Respiration einbezogen wird, steigt die trophische Transfereffizienz auf bis zu unrealistische 70 %. Durch die Einbeziehung der aktivitätsbezogenen Respiration sank die trophische Transfereffizienz auf realistische Werte von maximal 30 %. Danach wandte ich mich in meinem zweiten Projekt Plankton-Nahrungsnetzen und den Eigenschaften des Phytoplanktons zu. Bei der Untersuchung eines Langzeitdatensatzes von 21 Jahren aus dem Bodensee fanden wir einen Beweis für einen Trade-off zwischen Verteidigung und Wachstumsrate in einer natürlichen Phytoplankton-gemeinschaft. In diesem Datensatz konzentrierte ich mich anschließend in meinem dritten Projket auf Ciliaten, welche die wichtigsten Fraßfeinde von Phytoplankton im Frühjahr darstellen. Die Methode der boosted regression trees zeigte, dass Temperatur und Räuber den größten Einfluss auf die Nettowachstumsraten der Ciliaten haben. Schließlich nutzten wir in meinem vierten Projekt ein von Ciliaten inspiriertes Nahrungsnetzmodell, um die Koexistenz von Konkurrenten mit veränderlichen Eigenschaften und das neue Konzept des maladaptive switching zu untersuchen, welches Nachteile der Plastizität zeigt: höhere Wechselraten zwischen den Phänotypen führten zu höherem maladaptive switching in Richtung der unverteidigten Phänotypen, was die Biomasse und Koexistenz der Autotrophen reduziert und die Biomasse des Konsumenten erhöht. Es wurde offensichtlich, dass auch etablierte Modelle kritisch hinterfragt werden müssen, da es wichtig ist, die Realität auf dem Weg zu einem einfachen Modell nicht zu vergessen. Meine Ergebnisse zeigten des Weiteren, wie wichtig Langzeitdatensätze sind, da sie helfen können, komplexe natürliche Prozesse zu beleuchten. Dieses Wechselspiel zwischen Modellen und Daten aus Experimenten oder Felduntersuchungen kann fruchtbare Ergebnisse liefern und zu einem größeren Verständnis unserer komplexen Welt beitragen. KW - functional traits KW - plankton food web KW - coexistence KW - modelling KW - Modellierung KW - Planktonnahrungsnetz KW - Koexistenz Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-551239 ER - TY - THES A1 - Pitzen, Valentin T1 - Weitergeführte funktionelle Charakterisierung des centrosomalen Proteins Cep192 und Untersuchung der Topologie des Centrosoms in Dictyostelium Amöben T1 - Functional Characterization of the Centrosomal Protein Cep192 and Investigation of the Topology of the Centrosome in Dictyostelium amoeba N2 - Das Centrosom von Dictyostelium ist acentriolär aufgebaut, misst ca. 500 nm und besteht aus einer dreischichten Core-Struktur mit umgebender Corona, an der Mikrotubuli nukleieren. In dieser Arbeit wurden das centrosomale Protein Cep192 und mögliche Interaktionspartner am Centrosom eingehend untersucht. Die einleitende Lokalisationsuntersuchung von Cep192 ergab, dass es während der gesamten Mitose an den Spindelpolen lokalisiert und im Vergleich zu den anderen Strukturproteinen der Core-Struktur am stärksten exprimiert ist. Die dauerhafte Lokalisation an den Spindelpolen während der Mitose wird für Proteine angenommen, die in den beiden identisch aufgebauten äußeren Core-Schichten lokalisieren, die das mitotische Centrosom formen. Ein Knockdown von Cep192 führte zur Ausbildung von überzähligen Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOC) sowie zu einer leicht erhöhten Ploidie. Deshalb wird eine Destabilisierung des Centrosoms durch die verminderte Cep192-Expression angenommen. An Cep192 wurden zwei kleine Tags, der SpotH6- und BioH6-Tag, etabliert, die mit kleinen fluoreszierenden Nachweiskonjugaten markiert werden konnten. Mit den so getagten Proteinen konnte die hochauflösende Expansion Microscopy für das Centrosom optimiert werden und die Core-Struktur erstmals proteinspezifisch in der Fluoreszenzmikroskopie dargestellt werden. Cep192 lokalisiert dabei in den äußeren Core-Schichten. Die kombinierte Markierung von Cep192 und den centrosomalen Proteinen CP39 und CP91 in der Expansion Microscopy erlaubte die Darstellung des dreischichtigen Aufbaus der centrosomalen Core-Struktur, wobei CP39 und CP91 zwischen Cep192 in der inneren Core-Schicht lokalisieren. Auch die Corona wurde in der Expansion Microscopy untersucht: Das Corona-Protein CDK5RAP2 lokalisiert in räumlicher Nähe zu Cep192 in der inneren Corona. Ein Vergleich der Corona-Proteine CDK5RAP2, CP148 und CP224 in der Expansion Microscopy ergab unterscheidbare Sublokalisationen der Proteine innerhalb der Corona und relativ zur Core-Struktur. In Biotinylierungsassays mit den centrosomalen Core-Proteinen CP39 und CP91 sowie des Corona-Proteins CDK5RAP2 konnte Cep192 als möglicher Interaktionspartner identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die wichtige Funktion des Proteins Cep192 im Dictyostelium-Centrosom und ermöglichen durch die Kombination aus Biotinylierungsassays und Expansion Microscopy der untersuchten Proteine ein verbessertes Verständnis der Topologie des Centrosoms. N2 - The Dictyostelium centrosome contains no centrioles and has a diameter of approx. 500 nm. It consists of a three layered core structure and a surrounding corona, which nucleates microtubules. This work focusses on the centrosomal protein Cep192 and potential interactors at the centrosome. Localization studies showed, that Cep192 is a permanent resident at the spindle poles during mitosis and that, compared to other centrosomal core proteins, Cep192 is expressed at the highest level. The permanent residence at the spindle poles throughout mitosis is assumed for proteins which localize to the outer core layers, which form the mitotic centrosome. A knockdown of Cep192 resulted in supernumerary microtubule organizing centers (MTOC) and a slightly higher ploidy. Due to the phenotype, a destabilization of the centrosome caused by the reduced Cep192 expression is assumed. Cep192 was fused to the newly established short tags BioH6 and SpotH6, which are recognized by small fluorescently labelled probes. The tagged proteins were used for superresolution expansion microscopy. Superresolution expansion microscopy was optimized for the centrosome and allowed the protein specific resolving of the core structure for the first time. Cep192 localizes to the outer core layers. Combination of tagged proteins nicely mirrored all three core layers. CP39 and CP91 localize inbetween Cep192 in the inner core layer. Corona proteins were included in the expansion microscopy: the corona protein CDK5RAP2 comes into close proximity of Cep192 and localizes to the inner corona. A comparison with CP148 and CP224, two other corona proteins, revealed a distinct localization of the proteins within the corona and relatively to the core structure. Applied biotinylase assays with the core proteins CP39 and CP91, as well with the corona protein CDK5RAP2 revealed Cep192 as a possible interaction partner of all three proteins. The results of this work show the important function of Cep192 at the Dictyostelium centrosome and through the biotinylase assay and expansion microscopy data shed a light on the refined Dictyostelium centrosome topology. KW - Centrosom KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - expansion microscopy KW - Cep192 KW - CDK5RAP2 KW - fluorescence microscopy KW - Cep192 KW - CDK5RAP2 Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-548891 ER - TY - THES A1 - Fischer, Axel T1 - Investigating the impact of genomic compartments contributing to non-Mendelian inheritance based on high throughput sequencing data T1 - Untersuchungen zum Einfluss genomischer Kompartimente auf Nicht-Mendelsche Vererbung unter Nutzung von Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten N2 - More than a century ago the phenomenon of non-Mendelian inheritance (NMI), defined as any type of inheritance pattern in which traits do not segregate in accordance with Mendel’s laws, was first reported. In the plant kingdom three genomic compartments, the nucleus, chloroplast, and mitochondrion, can participate in such a phenomenon. High-throughput sequencing (HTS) proved to be a key technology to investigate NMI phenomena by assembling and/or resequencing entire genomes. However, generation, analysis and interpretation of such datasets remain challenging by the multi-layered biological complexity. To advance our knowledge in the field of NMI, I conducted three studies involving different HTS technologies and implemented two new algorithms to analyze them. In the first study I implemented a novel post-assembly pipeline, called Semi-Automated Graph-Based Assembly Curator (SAGBAC), which visualizes non-graph-based assemblies as graphs, identifies recombinogenic repeat pairs (RRPs), and reconstructs plant mitochondrial genomes (PMG) in a semiautomated workflow. We applied this pipeline to assemblies of three Oenothera species resulting in a spatially folded and circularized model. This model was confirmed by PCR and Southern blot analyses and was used to predict a defined set of 70 PMG isoforms. With Illumina Mate Pair and PacBio RSII data, the stoichiometry of the RRPs was determined quantitatively differing up to three-fold. In the second study I developed a post-multiple sequence alignment algorithm, called correlation mapping (CM), which correlates segment-wise numbers of nucleotide changes to a numeric ascertainable phenotype. We applied this algorithm to 14 wild type and 18 mutagenized plastome assemblies within the Oenothera genus and identified two genes, accD and ycf2 that may cause the competitive behavior of plastid genotypes as plastids can be biparental inherited in Oenothera. Moreover, lipid composition of the plastid envelope membrane is affected by polymorphisms within these two genes. For the third study, I programmed a pipeline to investigate a NMI phenomenon, known as paramutation, in tomato by analyzing DNA and bisulfite sequencing data as well as microarray data. We identified the responsible gene (Solyc02g0005200) and were able to fully repress its caused phenotype by heterologous complementation with a paramutation insensitive transgene of the Arabidopsis thaliana orthologue. Additionally, a suppressor mutant shows a globally altered DNA methylation pattern and carries a large deletion leading to a gene fusion involving a histone deacetylase. In conclusion, my developed and implemented algorithms and data analysis pipelines are suitable to investigate NMI and led to novel insights about such phenomena by reconstructing PMGs (SAGBAC) as a requirement to study mitochondria-associated phenotypes, by identifying genes (CM) causing interplastidial competition as well by applying a DNA/Bisulfite-seq analysis pipeline to shed light in a transgenerational epigenetic inheritance phenomenon. N2 - Vor mehr als einem Jahrhundert wurde über das Phänomen der Nicht-Mendelschen Vererbung (NMI), welche als jede Art von Vererbungsmuster definiert wird, in denen Eigenschaften nicht nach dem Mendelschen Gesetzen segregieren, zum ersten Mal berichtet. Im Pflanzenkönigreich können drei Zellkompartimente mit ihrem eigenen Erbgut, Nukleus, Chloroplast, und Mitochondrium, an einem solchen Phänomen beteiligt sein. Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien (HTS) stellen nachweislich eine Schlüsseltechnologie dar, um NMI Phänomene durch die Assemblierung und/oder Resequenzierung von ganzen Genomen zu untersuchen. Jedoch bleibt die Generierung, Analyse sowie die Interpretation solcher Datensätze durch die vielschichtige biologische Komplexität weiterhin eine Herausforderung. Um unser Wissen über NMI zu erweitern habe ich drei Studien durchgeführt in denen unterschiedliche HTS Technologien involviert waren und zwei neue Algorithmen implementiert um sie zu analysieren. In der ersten Studie habe ich eine neue Postassemblierungspipeline mit dem Namen Semi-Automated Graph-Based Assembly Curator (SAGBAC) entwickelt, welche nicht Graphen-basierte Genomassemblierungen als Graphen visualisiert, rekombinierende Repeatpaare (RRP) identifiziert, und pflanzliche mitochondrielle Genome (PMG) in einem halb-automatisierten Prozess rekonstruiert. Wir haben diese Pipeline auf Assemblierungen von drei Oenothera Spezies angewandt, was in gefalteten zirkularisierten Modellen resultierte. Dieses Modell wurde durch PCR und Southern Blot Analysen bestätigt, sowie verwendet, um einen definierten Satz von 70 PMG Isoformen vorherzusagen. Mit Illumina Mate Pair und PacBio RSII Daten wurde die Stöchiometrie der RRPs quantitativ bestimmt, die sich bis zu dreifach unterscheiden. In der zweiten Studie habe ich einen post-Multiples Sequenzalignment Algorithmus mit dem Namen Correlation Mapping (CM) entwickelt, der eine segmentweise Anzahl von Nukleotidaustauschen mit numerisch erfassbaren Phänotypen korreliert. Wir haben diesen Algorithmus auf 14 Wildtypen und 18 mutagenisierte Plastomassemblierungen aus der Gattung Oenothera angewandt und konnten zwei Gene, accD und ycf2 identifizieren, welche für das kompetitive Verhalten von Plastid Genotypen verantwortlich ist. Weiterhin wird die Lipidkomposition der Plastid-Hüllmembranen durch Polymorphismen in den beiden Genen beeinflusst. Für die dritte Studie habe ich eine Pipeline programmiert, um ein NMI Phänomen, bekannt als Paramutation, in der Tomate mit Hilfe von DNA- und Bisulfitsequenzierungsdaten sowie Microarray Daten zu analysieren. Wir haben das verantwortliche Gen (Solyc02g005200) identifiziert und waren in der Lage den verursachenden Phänotyp durch eine heterologe Komplementation eines paramutationsinsensitiven Transgens des Orthologs aus Arabidopsis thaliana vollständig zu unterdrücken. Weiterhin konnten wir zeigen, dass eine Suppressormutante ein global verändertes DNA-Methylierungsmuster aufweist und es durch eine große Deletion zu einer Genfusion gekommen ist, an der eine Histon-Deacetylase beteiligt ist. Zusammenfassend sind meine entwickelten und implementierten Algorithmen und Datenanalysen geeignet, um NMI zu untersuchen und haben wie folgt zu neuen Einsichten über solche Phänomene verholfen: (a) durch die Rekonstruktion von PMGs (SAGBAC) als Voraussetzung um Mitochondrien-assoziierte Phänotypen zu studieren, (b) durch die Identifizierung von Genen (CM), welche interplastidäre Kompetition auslösen sowie (c) durch Anwendung einer DNA-/Bisulfit-seq Analysepipeline zur Beantwortung der Ursache eines transgenerational epigenetischen Vererbungsphänomens. KW - non-Mendelian inheritance KW - de novo assembly KW - mitochondria KW - chloroplasts KW - paramutation KW - next generation sequencing KW - bisulfite sequencing KW - plant research KW - Bisulfit Sequenzierung KW - Chloroplasten KW - De novo Assemblierung KW - Mitochondrien KW - Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation KW - nicht-Mendelsche Vererbung KW - Paramutation KW - Pflanzenforschung Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-549001 ER - TY - THES A1 - Esmaeeli Moghaddam Tabalvandani, Mariam T1 - ROS Generation in Human Aldehyde Oxidase And the Effects of ROS and Reactive Sulfhydryl on the Activity of the Enzyme T1 - ROS-Erzeugung in Humane Aldehydoxidase und die Auswirkungen von ROS und reaktivem Sulfhydryl auf die Aktivität des Enzyms N2 - Aldehyde oxidases (AOXs) (E.C. 1.2.3.1) are molybdoflavo-enzymes belonging to the xanthine oxidase (XO) family. AOXs in mammals contain one molybdenum cofactor (Moco), one flavin adenine dinucleotide (FAD) and two [2Fe-2S] clusters, the presence of which is essential for the activity of the enzyme. Human aldehyde oxidase (hAOX1) is a cytosolic enzyme mainly expressed in the liver. hAOX1is involved in the metabolism of xenobiotics. It oxidizes aldehydes to their corresponding carboxylic acids and hydroxylates N-heterocyclic compounds. Since these functional groups are widely present in therapeutics, understanding the behaviour of hAOX1 has important implications in medicine. During the catalytic cycle of hAOX1, the substrate is oxidized at Moco and electrons are internally transferred to FAD via the FeS clusters. An electron acceptor juxtaposed to the FAD receives the electrons and re-oxidizes the enzyme for the next catalytic cycle. Molecular oxygen is the endogenous electron acceptor of hAOX1 and in doing so it is reduced and produces reactive oxygen species (ROS) including hydrogen peroxide (H2O2) and superoxide (O2.-). The production of ROS has patho-physiological importance, as ROS can have a wide range of effects on cell components including the enzyme itself. In this thesis, we have shown that hAOX1 loses its activity over multiple cycles of catalysis due to endogenous ROS production and have identified a cysteine rich motif that protects hAOX1 from the ROS damaging effects. We have also shown that a sulfido ligand, which is bound at Moco and is essential for the catalytic activity of the enzyme, is vulnerable during turnover. The ROS produced during the course of the reaction are also able to remove this sulfido ligand from Moco. ROS, in addition, oxidize particular cysteine residues. The combined effects of ROS on the sulfido ligand and on specific cysteine residues in the enzyme result in its inactivation. Furthermore, we report that small reducing agents containing reactive sulfhydryl groups, in a selective manner, inactivate some of the mammalian AOXs by modifying the sulfido ligand at Moco. The mechanism of ROS production by hAOX1 is another scope that has been investigated as part of the work in this thesis. We have shown that the ratio of type of ROS, i.e. hydrogen peroxide (H2O2) and superoxide (O2.-), produced by hAOX1 is determined by a particular position on a flexible loop that locates in close proximity of FAD. The size of the cavity at the ROS producing site, i.e. the N5 position of the FAD isoalloxazine ring, kinetically affects the amount of each type of ROS generated by hAOX1. Taken together, hAOX1 is an enzyme with emerging importance in pharmacological and medical studies, not only due to its involvement in drug metabolism, but also due to ROS production which has physiological and pathological implications. N2 - Aldehyd-Oxidasen (AOXs) (E.C. 1.2.3.1) sind Molybdo-Flavo-Enzyme aus der Familie der Xanthin-Oxidasen (XO). AOXs in Säugetieren enthalten einen Molybdän-Cofaktor (Moco), ein Flavin-Adenosin-Dinukleotid (FAD) und zwei [2Fe-2S]-Cluster, deren Anwesenheit für die Aktivität des Enzyms essentiell ist. Die Humane Aldehyd-Oxidase (hAOX1) ist ein zytosolisches Enzym, das hauptsächlich in der Leber exprimiert wird und am Stoffwechsel von Xenobiotika beteiligt ist. hAOX1 oxidiert Aldehyde zu ihren entsprechenden Carbonsäuren und hydroxyliert N-heterocyclische Verbindungen. Da diese funktionellen Gruppen in Therapeutika weit verbreitet sind, hat das Verständnis des Verhaltens von hAOX1 wichtige Auswirkungen auf medizinische Studien. Während des Katalysezyklus von hAOX1 wird das Substrat an Moco oxidiert und die Elektronen werden über die FeS-Cluster intern auf FAD übertragen. Ein Elektronenakzeptor am FAD nimmt die Elektronen auf und re-oxidiert das Enzym für den nächsten Katalysezyklus. Molekularer Sauerstoff ist der endogene Elektronenakzeptor von hAOX1, der reduziert wird und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) einschließlich Wasserstoffperoxid (H2O2) und Superoxid (O2.-) produziert. Die Produktion von ROS hat pathophysiologische Bedeutung mit weitreichenden Auswirkungen auf die Zellbestandteile und das Enzym selbst. In der vorliegenden Arbeit haben wir gezeigt, dass hAOX1 aufgrund der endogenen ROS-Produktion seine Aktivität über mehrere Katalysezyklen verliert und haben ein Cystein-reiches Motiv identifiziert, das hAOX1 vor den ROS-schädigenden Wirkungen schützt. Wir haben auch gezeigt, dass ein an Moco gebundener und für die katalytische Aktivität des Enzyms essentieller Sulfidoligand unter reduzierenden Bedingungen anfällig ist. Die im Verlauf der Reaktion entstehenden ROS sind in der Lage, diesen Sulfidoliganden aus dem Moco zu entfernen. ROS oxidieren auch bestimmte Cysteinreste. Die kombinierten Effekte von ROS auf den Sulfidoliganden und Cysteine führen zu einer Inaktivierung des Enzyms. Darüber hinaus berichten wir, dass Reduktionsmittel, die eine reaktive Sulfhydrylgruppe enthalten, selektiv einige der Säuger-AOX inaktivieren, indem sie den Sulfidoliganden beim Moco modifizieren. Der Mechanismus der ROS-Produktion durch hAOX1 ist ein weiterer Bereich, der im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde. Wir haben gezeigt, dass die Art von ROS, d. h. Wasserstoffperoxid (H2O2) und Superoxid (O2.-), die von hAOX1 produziert wird, durch eine bestimmte Position auf einem flexiblen Loop bestimmt wird, die sich in der Nähe von FAD befindet. Es scheint, dass die Größe der Kavität an der ROS-produzierenden Stelle, d. h. die N5-Position des FAD-Isoalloxazin-Rings, die Menge jedes ROS-Typs, der von hAOX1 erzeugt wird, kinetisch beeinflusst. Zusammenfassend ist hAOX1 ein Enzym mit zunehmender Bedeutung in pharmakologischen und medizinischen Studien, nicht nur aufgrund seiner Beteiligung am Arzneimittelstoffwechsel, sondern auch aufgrund der ROS-Produktion, die physiologische und pathologische Auswirkungen hat. KW - human aldehyde oxidase KW - reactive oxygen species (ROS) KW - Aldehydoxidase KW - reaktive Sauerstoffspezies (ROS) Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-534600 ER - TY - THES A1 - Gerling, Marten Tobias T1 - A microfluidic system for high-precision image-based live cell sorting using dielectrophoretic forces T1 - Ein mikrofluidisches System zur hochpräzisen und bildgestützten Sortierung lebender Zellen mittels dielektrophoretischer Kräfte N2 - An important goal in biotechnology and (bio-) medical research is the isolation of single cells from a heterogeneous cell population. These specialised cells are of great interest for bioproduction, diagnostics, drug development, (cancer) therapy and research. To tackle emerging questions, an ever finer differentiation between target cells and non-target cells is required. This precise differentiation is a challenge for a growing number of available methods. Since the physiological properties of the cells are closely linked to their morphology, it is beneficial to include their appearance in the sorting decision. For established methods, this represents a non addressable parameter, requiring new methods for the identification and isolation of target cells. Consequently, a variety of new flow-based methods have been developed and presented in recent years utilising 2D imaging data to identify target cells within a sample. As these methods aim for high throughput, the devices developed typically require highly complex fluid handling techniques, making them expensive while offering limited image quality. In this work, a new continuous flow system for image-based cell sorting was developed that uses dielectrophoresis to precisely handle cells in a microchannel. Dielectrophoretic forces are exerted by inhomogeneous alternating electric fields on polarisable particles (here: cells). In the present system, the electric fields can be switched on and off precisely and quickly by a signal generator. In addition to the resulting simple and effective cell handling, the system is characterised by the outstanding quality of the image data generated and its compatibility with standard microscopes. These aspects result in low complexity, making it both affordable and user-friendly. With the developed cell sorting system, cells could be sorted reliably and efficiently according to their cytosolic staining as well as morphological properties at different optical magnifications. The achieved purity of the target cell population was up to 95% and about 85% of the sorted cells could be recovered from the system. Good agreement was achieved between the results obtained and theoretical considerations. The achieved throughput of the system was up to 12,000 cells per hour. Cell viability studies indicated a high biocompatibility of the system. The results presented demonstrate the potential of image-based cell sorting using dielectrophoresis. The outstanding image quality and highly precise yet gentle handling of the cells set the system apart from other technologies. This results in enormous potential for processing valuable and sensitive cell samples. N2 - Ein wichtiges Ziel in der Biotechnologie und (bio-) medizinischen Forschung ist die Isolation von Einzelzellen aus einer heterogenen Zellpopulation. Aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften sind diese Zellen für die Bioproduktion, Diagnostik, Arzneimittelentwicklung, (Krebs-) Therapie und Forschung von großem Interesse. Um neue Fragestellungen angehen zu können, ist eine immer feinere Differenzierung zwischen Zielzellen und Nicht-Zielzellen erforderlich. Diese präzise Differenzierung stellt eine Herausforderung für eine wachsende Zahl verfügbarer Methoden dar. Da die physiologischen Eigenschaften der Zellen eng mit ihrer Morphologie verknüpft sind, ist es sinnvoll ihr Erscheinungsbild mit in die Sortierentscheidung einzubeziehen. Für etablierte Methoden stellt dies jedoch einen nicht adressierbaren Parameter dar, weshalb neue Methoden zur Identifikation und Isolation der Zielzellen benötigt werden. Folglich wurde in den letzten Jahren eine Vielzahl neuer durchflussbasierter Methoden entwickelt und vorgestellt, die 2D-Bilddaten zur Identifikation der Zielzellen innerhalb einer Probe heranziehen. Da diese Methoden auf hohe Durchsätze abzielen, erfordern die entwickelten Geräte in der Regel hochkomplexe Techniken zur Handhabung der Flüssigkeiten, was sie teuer macht und gleichzeitig zu einer begrenzten Bildqualität führt. In dieser Arbeit wurde ein neues durchflussbasiertes System zur bildbasierten Zellsortierung entwickelt, das Dielektrophorese zur präzisen Handhabung der Zellen in einem Mikrokanal verwendet. Dielektrophoretische Kräfte werden von inhomogenen elektrischen Wechselfeldern auf polarisierbare Partikel (hier: Zellen) ausgeübt. Bei dem vorliegenden System können die elektrischen Felder durch einen Signalgenerator präzise und schnell ein- und ausgeschaltet werden. Neben der daraus resultierenden einfachen und effektiven Handhabung der Zellen zeichnet sich das System durch die hervorragende Qualität der erzeugten Bilddaten und die Kompatibilität mit Standardmikroskopen aus. Diese Aspekte führen zu einer geringen Komplexität, die es sowohl erschwinglich als auch benutzerfreundlich macht. Mit dem entwickelten System zur Zellsortierung konnten Zellen sowohl auf Basis einer zytosolischen Färbung als auch auf Basis morphologischer Eigenschaften bei verschiedenen optischen Vergrößerungen zuverlässig und effizient sortiert werden. Die erreichte Reinheit der Zielzellpopulation betrug bis zu 95% wobei etwa 85% der sortierten Zellen aus dem System zurückgewonnen werden konnten. Dabei wurde eine gute Übereinstimmung der ermittelten Ergebnisse mit theoretischen Überlegungen erreicht. Der erreichte Durchsatz des Systems betrug bis zu 12.000 Zellen pro Stunde. Untersuchungen der Zellvitalität deuteten darauf hin, dass das System eine hohe Biokompatibilität aufweist. Die vorgestellten Ergebnisse demonstrieren das Potenzial der bildbasierten Zellsortierung mittels Dielektrophorese. Die herausragende Bildqualität und hochpräzise aber dennoch zellschonende Handhabung der Zellen grenzen das System von anderen Technologien ab. Daraus ergibt sich ein enormes Potenzial für die Verarbeitung wertvoller und sensibler Zellproben. KW - microfluidics KW - cell sorting KW - dielectrophoresis KW - Zellsortierung KW - Dielektrophorese KW - Mikrofluidik Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-587421 ER - TY - THES A1 - Heinsohn, Natascha T1 - Development of a fiber-based sensor for the molecular detection of pathogens using Legionella as an example T1 - Entwicklung eines Faser-basierten Sensors zur molekularen Detektion von Pathogenen am Beispiel von Legionellen N2 - Fiber-based microfluidics has undergone many innovative developments in recent years, with exciting examples of portable, cost-effective and easy-to-use detection systems already being used in diagnostic and analytical applications. In water samples, Legionella are a serious risk as human pathogens. Infection occurs through inhalation of aerosols containing Legionella cells and can cause severe pneumonia and may even be fatal. In case of Legionella contamination of water-bearing systems or Legionella infection, it is essential to find the source of the contamination as quickly as possible to prevent further infections. In drinking, industrial and wastewater monitoring, the culture-based method is still the most commonly used technique to detect Legionella contamination. In order to improve the laboratory-dependent determination, the long analysis times of 10-14 days as well as the inaccuracy of the measured values in colony forming units (CFU), new innovative ideas are needed. In all areas of application, for example in public, commercial or private facilities, rapid and precise analysis is required, ideally on site. In this PhD thesis, all necessary single steps for a rapid DNA-based detection of Legionella were developed and characterized on a fiber-based miniaturized platform. In the first step, a fast, simple and device-independent chemical lysis of the bacteria and extraction of genomic DNA was established. Subsequently, different materials were investigated with respect to their non-specific DNA retention. Glass fiber filters proved to be particularly suitable, as they allow recovery of the DNA sample from the fiber material in combination with dedicated buffers and exhibit low autofluorescence, which was important for fluorescence-based readout. A fiber-based electrophoresis unit was developed to migrate different oligonucleotides within a fiber matrix by application of an electric field. A particular advantage over lateral flow assays is the targeted movement, even after the fiber is saturated with liquid. For this purpose, the entire process of fiber selection, fiber chip patterning, combination with printed electrodes, and testing of retention and migration of different DNA samples (single-stranded, double-stranded and genomic DNA) was performed. DNA could be pulled across the fiber chip in an electric field of 24 V/cm within 5 minutes, remained intact and could be used for subsequent detection assays e.g., polymerase chain reaction (PCR) or fluorescence in situ hybridization (FISH). Fiber electrophoresis could also be used to separate DNA from other components e.g., proteins or cell lysates or to pull DNA through multiple layers of the glass microfiber. In this way, different fragments experienced a moderate, size-dependent separation. Furthermore, this arrangement offers the possibility that different detection reactions could take place in different layers at a later time. Electric current and potential measurements were collected to investigate the local distribution of the sample during migration. While an increase in current signal at high concentrations indicated the presence of DNA samples, initial experiments with methylene blue stained DNA showed a temporal sequence of signals, indicating sample migration along the chip. For the specific detection of a Legionella DNA, a FISH-based detection with a molecular beacon probe was tested on the glass microfiber. A specific region within the 16S rRNA gene of Legionella spp. served as a target. For this detection, suitable reaction conditions and a readout unit had to be set up first. Subsequently, the sensitivity of the probe was tested with the reverse complementary target sequence and the specificity with several DNA fragments that differed from the target sequence. Compared to other DNA sequences of similar length also found in Legionella pneumophila, only the target DNA was specifically detected on the glass microfiber. If a single base exchange is present or if two bases are changed, the probe can no longer distinguish between the DNA targets and non-targets. An analysis with this specificity can be achieved with other methods such as melting point determination, as was also briefly indicated here. The molecular beacon probe could be dried on the glass microfiber and stored at room temperature for more than three months, after which it was still capable of detecting the target sequence. Finally, the feasibility of fiber-based FISH detection for genomic Legionella DNA was tested. Without further processing, the probe was unable to detect its target sequence in the complex genomic DNA. However, after selecting and application of appropriate restriction enzymes, specific detection of Legionella DNA against other aquatic pathogens with similar fragment patterns as Acinetobacter haemolyticus was possible. N2 - Die faserbasierte Mikrofluidik hat in den letzten Jahren viele innovative Entwicklungen erfahren, mit spannenden Beispielen für portable, kostengünstige und einfach zu bedienende Nachweissysteme die bereits in diagnostischen und analytischen Fragestellungen Anwendung finden. In Wasserproben sind Legionellen als Humanpathogene ein ernstzunehmendes Risiko. Eine Infektion erfolgt über das Einatmen legionellenhaltiger Aerosole und kann schwerwiegende Pneumonien hervorrufen oder sogar tödlich verlaufen. Im Falle einer Legionellenkontamination von Wasserführenden Systemen beziehungsweise einer Legionellen-assoziierten Infektion ist es maßbeglich die Quelle der Kontamination möglichst schnell zu finden, um weitere Infektionen zu vermeiden. In der Überwachung von Trink- Prozess- und Abwasser ist die kulturbasierte Methode immer noch die am häufigsten verwendete Technik, um einen Legionellenbefall nachzuweisen. Um Alternativen zu einer laborabhängigen Bestimmung mit ihren langen Analysezeiten von 10-14 Tagen und der ungenauen Messwertausgabe in koloniebildenden Einheiten (KBE) zu finden, bedarf es neuer innovativer Ideen. In allen Anwendungsbereichen, zum Beispiel in öffentlichen, gewerblichen oder privaten Einrichtungen, ist eine schnelle und präzise Analyse erforderlich, idealerweise vor Ort. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden alle notwendigen Einzelschritte für einen schnellen DNA-basierten Nachweis von Legionellen auf einer faserbasierten, miniaturisierten Plattform entwickelt und charakterisiert. Im ersten Schritt wurde eine schnelle, einfache und geräteunabhängige chemische Lyse der Bakterien und Extraktion der genomischen DNA etabliert. Daraufhin wurden verschiedene Materialien hinsichtlich Ihres unspezifischen DNA-Rückhalts untersucht. Glasfaserfilter erwiesen sich als besonders geeignet, da sie in Kombination mit den geeigneten Puffern eine Rückgewinnung der DNA-Probe aus dem Fasermaterial ermöglichen und für eine fluoreszenzbasierte Auslese eine geringe Autofluoreszenz aufweisen. Eine faserbasierte Elektrophoreseeinheit wurde entwickelt, um durch Anlegen eines elektrischen Feldes verschiedene Oligonukleotide innerhalb einer Fasermatrix zu bewegen. Ein besonderer Vorteil gegenüber Lateral-Flow-Tests ist die Möglichkeit der gezielten Bewegung, auch nachdem die Faser mit Flüssigkeit gesättigt ist. Hierfür wurde der gesamte Prozess der Faserauswahl, der Strukturierung der Faserchips, der Kombination mit gedruckten Elektroden und der Prüfung der Retention und Migration verschiedener DNA-Proben (einzelsträngige, doppelsträngige und genomische DNA) bearbeitet. Die DNA konnte in einem elektrischen Feld von 24 V/cm innerhalb von 5 Minuten über den Faserchip gezogen werden, blieb dabei intakt und konnte für nachfolgende Detektionsnachweise z.B. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) oder Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) genutzt werden. Die Faserelektrophorese konnte außerdem zur Separation der DNA von anderen Komponenten z.B. Proteinen oder Zelllysaten verwendet werden oder um DNA durch mehrere Lagen der Glasfaser zu steuern. Dabei erfuhren verschiedene Fragmente einen moderaten, größenabhängigen Trenneffekt. Außerdem bietet diese Anordnung die Möglichkeit, dass unterschiedliche Nachweisreaktionen zu einem späteren Zeitpunkt in verschiedenen Schichten stattfinden könnten. Strom- und Potentialmessungen wurden erhoben, um die lokale Verteilung der Probe während der Migration zu untersuchen. Während ein Anstieg des Stromsignals bei hohen Konzentrationen die Anwesenheit von DNA-Proben anzeigte, konnten nach ersten Experimenten mit Methylenblau-gefärbter DNA zeitlich aufeinanderfolgende Signale detektiert werden und somit prinzipiell eine Probenmigration nachgewiesen werden. Für den spezifischen Nachweis der Legionellen-DNA wurde ein FISH-basierter Nachweis mit einer molekularen Sonde auf der Glasmikrofaser getestet. Als Ziel für die Sonde diente eine bestimmte Region innerhalb des 16S rRNA-Gens von Legionellen. Für diesen Nachweis mussten zunächst geeignete Reaktionsbedingungen und eine Ausleseeinheit bestimmt werden. Anschließend wurde die Sensitivität der Sonde mit der umgekehrt komplementären Zielsequenz und die Spezifität mit verschiedenen DNA-Fragmenten, die sich von der Zielsequenz unterschieden, getestet. Im Vergleich zu abweichenden DNA-Sequenzen ähnlicher Länge, die auch in Legionella pneumophila vorkommen, wurde nur die Ziel-DNA spezifisch auf der Glasmikrofaser erkannt. Liegt ein einzelner Basenaustausch vor oder werden zwei Basen geändert, so kann die Sonde nicht mehr zwischen der Ziel-DNA und den abweichenden DNA-Fragmenten unterscheiden. Eine Detektion mit dieser Genauigkeit ist mit anderen Methoden wie z.B. der Schmelzpunktbestimmung möglich, wie hier prinzipiell demonstriert wurde. Es wurde ferner gezeigt, dass die Sonde auf der Glasmikrofaser eingetrocknet und über drei Monate bei Raumtemperatur gelagert werden kann und danach immer noch in der Lage ist, die Zielsequenz nachzuweisen. Schließlich wurde die Anwendbarkeit des faserbasierten FISH-Nachweises auch für genomische Legionellen-DNA getestet. Ohne weitere Prozessierung war die Sonde nicht in der Lage ihre Zielsequenz in der komplexen genomischen DNA zu erkennen. Nach der Auswahl und Anwendung geeigneter Restriktionsenzyme war eine spezifische Detektion der Legionellen-DNA gegenüber anderen Wasserkeimen mit ähnlichem Fragmentmuster wie Acinetobacter haemolyticus möglich. KW - Sensor KW - paper-based KW - Legionellen KW - Legionella KW - papier-basiert KW - sensor KW - Detektionssystem KW - detection system KW - Glasfaser KW - glass fiber Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-566833 ER - TY - THES A1 - Drago, Claudia T1 - Microplastics in the environment: Assessing the ingestion and effect of microplastics on freshwater rotifers in an environmental scenario T1 - Mikroplastik in der Umwelt: Bewertung der Aufnahme und Effekte von Mikroplastik auf Süßwasser-Rotatorien N2 - Microplastics in the environments are estimated to increase in the near future due to increasing consumption of plastic product and also due to further fragmentation in small pieces. The fate and effects of MP once released into the freshwater environment are still scarcely studied, compared to the marine environment. In order to understand possible effect and interaction of MPs in freshwater environment, planktonic zooplankton organisms are very useful for their crucial trophic role. In particular freshwater rotifers are one of the most abundant organisms and they are the interface between primary producers and secondary consumers. The aim of my thesis was to investigate the ingestion and the effect of MPs in rotifers from a more natural scenario and to individuate processes such as the aggregation of MPs, the food dilution effect and the increasing concentrations of MPs that could influence the final outcome of MPs in the environment. In fact, in a near natural scenario MPs interaction with bacteria and algae, aggregations together with the size and concentration are considered drivers of ingestion and effect. The aggregation of MPs makes smaller MPs more available for rotifers and larger MPs less ingested. The negative effect caused by the ingestion of MPs was modulated by their size but also by the quantity and the quality of food that cause variable responses. In fact, rotifers in the environment are subjected to food limitation and the presence of MPs could exacerbate this condition and decrease the population and the reproduction input. Finally, in a scenario incorporating an entire zooplanktonic community, MPs were ingested by most individuals taking into account their feeding mode but also the concentration of MPs, which was found to be essential for the availability of MPs. This study highlights the importance to investigate MPs from a more environmental perspective, this in fact could provide an alternative and realistic view of effect of MPs in the ecosystem. N2 - Das allgegenwärtige Vorhandensein in der Umwelt, der rasche Anstieg und die Langlebigkeit haben Plastik zu einem großen Umweltproblem gemacht. Die zunehmende Konzentration von Plastik durch weitere Fragmentierung in Süßgewässern und die daraus resultierenden Konsequenzen auf Ökosystemebenen werden noch immer unterschätzt. Die Auswirkungen von MP auf planktonische Organismen wie den Rotatorien sind noch nicht hinreichend untersucht worden. Ein negativer Effekt könnte Folgen auf höhere trophische Ebenen haben. In dieser Studie wird untersucht, wie natürliche Faktoren die Aufnahme und Wirkung von Mikroplastik (MP) auf Rotatorien verändern können. Natürliche Faktoren, wie zum Beispiel durch Bakterien aggregierte MP, unterschiedliche Algennahrung, sowie verschiedene aquatische Tierarten, wurden genutzt, um Umweltbedingungen im Labor zu imitieren. Die Aufnahmerate von MP, von MP in Verbindung mit Algennahrung und von aggregiertem MP wurde untersucht (Kapitel 2). Durch die Aggregation von MP sind kleinere MP für Rotatorien besser verfügbar und größere MP werden weniger aufgenommen. Die Auswirkungen des MPs wurden in meiner Studie in Abhängigkeit von der Nahrungszufuhr, z. B. von der Algenkonzentration, aber auch von der Art der Algen untersucht. Darüber hinaus wurden Polyamidfragmente und Siliziumdioxidkügelchen verwendet, um mögliche Partikeleffekte oder negative Reaktionen im Zusammenhang mit der Art und Form des Plastiks zu verstehen. Zwei verwandte Brachyonidenarten wurden dabei untersucht. Die Wirkung von MP auf B. calyciflorus und B. fernandoi wurde in Kombination mit verschiedenen Konzentrationen und Arten von Futter getestet. Ziel dieser Studie (Kapitel 3) war es, eine Beziehung zwischen den MP-Konzentrationen und der Qualität der Nahrung herzustellen. Darüber hinaus wurden die beiden Arten miteinander verglichen, um mögliche Unterschiede in der Reaktion auf MP festzustellen. Es wurden subletale Reaktionen, wie die Fortpflanzung, die Populationswachstumsrate und das Überleben untersucht, wobei eine schädliche Auswirkung in Form einer Verringerung der Populationsgröße durch geringere Fortpflanzung festgestellt wurde. In einem komplexeren und naturnahen Szenario, wurde ein Mikrokosmos-Experiment durchgeführt, bei dem vier verschiedene Zooplanktongruppen, bestehend aus Rotatorien, Cladoceren, Copepoden und Ostracoden, drei verschiedenen MP-Größen ausgesetzt wurden (Kapitel 4). Die wichtigsten Einflussfaktoren, wie die MP-Konzentration, die Größe und die Art der Nahrungsaufnahme, wurden berücksichtigt, um festzustellen, welche Gruppe anfälliger für die MP-Aufnahme ist. Die MP-Konzentration und die Art der Futteraufnahme beeinflussten die Aufnahme von MP stärker als die Größe. Bei hoher Konzentration nahmen trotz der Größenpräferenz und der Art der Futteraufnahme mehr Individuen das MP auf. Im Gegensatz dazu konnte die Aufnahme von MP bei niedriger Konzentration vermieden werden. Diese Studie verdeutlicht, dass Umweltfaktoren sowie die MP-Konzentration und die Art der Futteraufnahme eine wichtige Rolle bei der Untersuchung von MP spielen. KW - microplastics KW - rotifer KW - ingestion KW - effect KW - Effekt KW - Aufnahme KW - Mikroplastik KW - Rotatorien Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-573356 ER - TY - THES A1 - Shevtsova, Iuliia T1 - Recent and future vegetation change in the treeline region of Chukotka (NE Russia) inferred from field data, satellite data and modelling N2 - Vegetation change at high latitudes is one of the central issues nowadays with respect to ongoing climate changes and triggered potential feedback. At high latitude ecosystems, the expected changes include boreal treeline advance, compositional, phenological, physiological (plants), biomass (phytomass) and productivity changes. However, the rate and the extent of the changes under climate change are yet poorly understood and projections are necessary for effective adaptive strategies and forehanded minimisation of the possible negative feedbacks. The vegetation itself and environmental conditions, which are playing a great role in its development and distribution are diverse throughout the Subarctic to the Arctic. Among the least investigated areas is central Chukotka in North-Eastern Siberia, Russia. Chukotka has mountainous terrain and a wide variety of vegetation types on the gradient from treeless tundra to northern taiga forests. The treeline there in contrast to subarctic North America and north-western and central Siberia is represented by a deciduous conifer, Larix cajanderi Mayr. The vegetation varies from prostrate lichen Dryas octopetala L. tundra to open graminoid (hummock and non-hummock) tundra to tall Pinus pumila (Pall.) Regel shrublands to sparse and dense larch forests. Hence, this thesis presents investigations on recent compositional and above-ground biomass (AGB) changes, as well as potential future changes in AGB in central Chukotka. The aim is to assess how tundra-taiga vegetation develops under changing climate conditions particularly in Fareast Russia, central Chukotka. Therefore, three main research questions were considered: 1) What changes in vegetation composition have recently occurred in central Chukotka? 2) How have the above-ground biomass AGB rates and distribution changed in central Chukotka? 3) What are the spatial dynamics and rates of tree AGB change in the upcoming millennia in the northern tundra-taiga of central Chukotka? Remote sensing provides information on the spatial and temporal variability of vegetation. I used Landsat satellite data together with field data (foliage projective cover and AGB) from two expeditions in 2016 and 2018 to Chukotka to upscale vegetation types and AGB for the study area. More specifically, I used Landsat spectral indices (Normalised Difference Vegetation Index (NDVI), Normalised Difference Water Index (NDWI) and Normalised Difference Snow Index (NDSI)) and constrained ordination (Redundancy analysis, RDA) for further k-means-based land-cover classification and general additive model (GAM)-based AGB maps for 2000/2001/2002 and 2016/2017. I also used Tandem-X DEM data for a topographical correction of the Landsat satellite data and to derive slope, aspect, and Topographical Wetness Index (TWI) data for forecasting AGB. Firstly, in 2016, taxa-specific projective cover data were collected during a Russian-German expedition. I processed the field data and coupled them with Landsat spectral Indices in the RDA model that was used for k-means classification. I could establish four meaningful land-cover classes: (1) larch closed-canopy forest, (2) forest tundra and shrub tundra, (3) graminoid tundra and (4) prostrate herb tundra and barren areas, and accordingly, I produced the land cover maps for 2000/2001/2002 and 2016/20017. Changes in land-cover classes between the beginning of the century (2000/2001/2002) and the present time (2016/2017) were estimated and interpreted as recent compositional changes in central Chukotka. The transition from graminoid tundra to forest tundra and shrub tundra was interpreted as shrubification and amounts to a 20% area increase in the tundra-taiga zone and 40% area increase in the northern taiga. Major contributors of shrubification are alder, dwarf birch and some species of the heather family. Land-cover change from the forest tundra and shrub tundra class to the larch closed-canopy forest class is interpreted as tree infilling and is notable in the northern taiga. We find almost no land-cover changes in the present treeless tundra. Secondly, total AGB state and change were investigated for the same areas. In addition to the total vegetation AGB, I provided estimations for the different taxa present at the field sites. As an outcome, AGB in the study region of central Chukotka ranged from 0 kg m-2 at barren areas to 16 kg m-2 in closed-canopy forests with the larch trees contributing the highest. A comparison of changes in AGB within the investigated period from 2000 to 2016 shows that the greatest changes (up to 1.25 kg m 2 yr 1) occurred in the northern taiga and in areas where land cover changed to larch closed-canopy forest. Our estimations indicate a general increase in total AGB throughout the investigated tundra-taiga and northern taiga, whereas the tundra showed no evidence of change in AGB within the 15 years from 2002 to 2017. In the third manuscript, potential future AGB changes were estimated based on the results of simulations of the individual-based spatially explicit vegetation model LAVESI using different climate scenarios, depending on Representative Concentration Pathways (RCPs) RCP 2.6, RCP 4.5 and RCP 8.5 with or without cooling after 2300 CE. LAVESI-based AGB was simulated for the current state until 3000 CE for the northern tundra-taiga study area for larch species because we expect the most notable changes to occur will be associated with forest expansion in the treeline ecotone. The spatial distribution and current state of tree AGB was validated against AGB field data, AGB extracted from Landsat satellite data and a high spatial resolution image with distinctive trees visible. The simulation results are indicating differences in tree AGB dynamics plot wise, depending on the distance to the current treeline. The simulated tree AGB dynamics are in concordance with fundamental ecological (emigrational and successional) processes: tree stand formation in simulated results starts with seed dispersion, tree stand establishment, tree stand densification and episodic thinning. Our results suggest mostly densification of existing tree stands in the study region within the current century in the study region and a lagged forest expansion (up to 39% of total area in the RCP 8.5) under all considered climate scenarios without cooling in different local areas depending on the closeness to the current treeline. In scenarios with cooling air temperature after 2300 CE, forests stopped expanding at 2300 CE (up to 10%, RCP 8.5) and then gradually retreated to their pre-21st century position. The average tree AGB rates of increase are the strongest in the first 300 years of the 21st century. The rates depend on the RCP scenario, where the highest are as expected under RCP 8.5. Overall, this interdisciplinary thesis shows a successful integration of field data, satellite data and modelling for tracking recent and predicting future vegetation changes in mountainous subarctic regions. The obtained results are unique for the focus area in central Chukotka and overall, for mountainous high latitude ecosystems. N2 - Die Veränderung der Vegetation in den hohen Breiten ist heutzutage eines der zentralen Themen im Hinblick auf den anhaltenden Klimawandel und hat potenziell auslösende Rückkopplungen. In den Ökosystemen der hohen Breiten umfassen die erwarteten Veränderungen das Fortschreiten der borealen Baumgrenze, sowie kompositorische, phänologische, physiologische, Biomassen- (Phytomasse) und Produktivitätsveränderungen. Die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Veränderungen im Rahmen des Klimawandels sind jedoch noch wenig verstanden, und Projektionen sind für wirksame Anpassungsstrategien und eine vorausschauende Minimierung möglicher negativer Rückkopplungen erforderlich. Die Vegetation selbst und die Umweltbedingungen, die bei ihrer Entwicklung und Verbreitung eine große Rolle spielen, sind in der gesamten Subarktis bis zur Arktis unterschiedlich. Zu den am wenigsten untersuchten Gebieten gehört Zentral-Tschukotka, in Nordost-Sibirien, Russland. Tschukotka hat gebirgiges Terrain und eine weite Bandbreite von Vegetationstypen entlang des Gradienten von der baumlosen Tundra bis zu den nördlichen Taiga-Wäldern. Die Baumgrenze dort wird im Gegensatz zum subarktischen Nordamerika sowie Nordwest- und Mittelsibirien durch eine laubabwerfende Nadelbaumart, Larix cajanderi Mayr, aufgebaut. Die Vegetation variiert von Tundra mit Flechten und Dryas octopetala L. über offene graminoide (Horstgras und nicht Horstgras) Tundra und hohe Pinus pumila (Pall.) Regel Strauchlandschaften zu lockeren Lärchenbeständen bis zu dichten Lärchenwäldern. Somit werden in meiner Dissertation Untersuchungen zu den jüngsten Veränderungen der Vegetationszusammensetzung und der oberirdischen Biomasse (aus dem Englischen above-ground biomass, bzw. AGB), sowie zu potenziellen zukünftigen Veränderungen der AGB vorgestellt. Das Ziel meiner Arbeit ist es abzuschätzen, wie sich die Tundra-Taiga-Vegetation unter Klimawandel entwickelt, insbesondere in Fernost Russland, Zentral-Tschukotka. Daher wurden drei Hauptforschungsfragen berücksichtigt: 1) Welche Veränderungen in der Vegetationszusammensetzung sind in den letzten Jahrzehnten in Zentral-Tschukotka aufgetreten? 2) Wie haben sich die AGB-Raten und die Verteilung der oberirdischen Biomasse in Zentral-Tschukotka verändert? 3) Wie sind die räumlichen Dynamiken und Änderungsraten der Baum-AGB in dem kommenden Jahrtausend in der nördlichen Tundra-Taiga in Zentral-Tschukotka? Fernerkundung liefert Informationen über die räumliche und zeitliche Vegetationsvariabilität. Ich habe Landsat-Satellitendaten zusammen mit Felddaten (Projektive Vegetationsbedeckung und AGB) von zwei Expeditionen in den Jahren 2016 und 2018 nach Tschukotka verwendet, um Vegetationstypen und AGB für das Untersuchungsgebiet räumlich abzubilden. Insbesondere habe ich die Landsat-Spektralindizes (Normalized Difference Vegetation Index (NDVI), Normalized Difference Water Index (NDWI) und Normalized Difference Snow Index (NDSI)) und eine Ordination mit Randbedingungen (Redundanzanalyse, RDA) verwendet, um eine Land-Klassifizierung mittels der k-means Methode zu entwickeln, und AGB-Karten mittels des General Additive Model (GAM) für 2000/2001/2002 und 2016/2017 zu erstellen. Außerdem verwendete ich Tandem-X-DEM-Daten, um die Landsat-Satellitendaten topografisch zu korrigieren und um die Hangneigung-, Hangaspekt- und TWI- (Topographical Wetness Index) Daten für die Vorhersage von AGB abzuleiten. Auf einer russisch-deutschen Expedition im Jahr 2016 wurden Vegetationsdaten erhoben. Ich prozessierte die Felddaten zu taxaspezifischen-projektiven Vegetationsbedeckungsdaten. Ich habe die taxaspezifisch-projektive Vegetationsbedeckung mit Landsat-Spektralindizes im RDA-Modell gekoppelt, das für die k-means-Klassifizierung verwendet wurde. Ich konnte vier repräsentative Landbedeckungsklassen einrichten: (1) Lärchen-Wald mit geschlossenem Blätterdach, (2) Waldtundra und Strauch-Tundra, (3) graminoide Tundra und (4) Kräutertundra und vegetationsarme Gebiete. Dementsprechend prozessierte ich dann die Landbedeckungskarten für 2000/2001/2002 und 2016/20017. Ich ermittelte die Änderungen der Landbedeckungsklassen zwischen dem Beginn des Jahrhunderts (2000/2001/2002) und der Gegenwart (2016/2017) und konnte sie als aktuelle Kompositionsänderungen in der Vegetation von Zentral-Tschukotka interpretieren. Die Transformation von der graminoiden Tundra zur Waldtundra oder zur Strauch-Tundra habe ich als Prozess der Strauchbildung interpretiert, die einer Flächenvergrößerung von 20% in der Tundra-Taiga Zone und einer Flächenvergrößerung von 40% in der nördlichen Taiga entspricht. Hauptakteure der Strauchung sind Erle, Zwergbirke und einige Arten der Heidekrautfamilie. Der Landbedeckungswechsel von der Waldtundra- und Strauch-Tundra-Klasse zur Klasse des Lärchen-Waldes mit geschlossenen Blätterdach wird als eine Verdichtung des Baumbestandes interpretiert und ist in der nördlichen Taiga bemerkenswert. In der heutigen baumlosen Tundra finden wir fast keine Landbedeckungsänderungen. Im zweiten Projekt bestimmte ich den Gesamt-AGB-Zustand und die gesamte AGB-Veränderung für dieselben Regionen in Zentral-Chukotka. Zusätzlich zur gesamten AGB lieferte ich Schätzungen für die verschiedenen Taxa, die an den Feldstandorten vorhanden sind. Als Ergebnis lag die AGB in der Untersuchungsregion von Zentral-Tschukotka zwischen 0 kg m-2 in vegetationsarmen Gebieten und 16 kg m-2 in den Wäldern mit geschlossenem Blätterdach mit dem größten Anteil von Lärchen. Ein Vergleich der Veränderungen der AGB im Untersuchungszeitraum von 2000 bis 2016 zeigt, dass die größten Veränderungen (bis zu 1,25 kg m-2 Jahr-1) in der nördlichen Taiga und in den Gebieten auftraten, in denen sich die Landbedeckung hin zu einen Lärchenwald mit geschlossenen Blätterdach änderte. Unsere Schätzungen deuten auf einen allgemeinen Anstieg der gesamten AGB in der untersuchten Tundra-Taiga und der nördlichen Taiga hin. Im Gegensatz zeigte die Tundra innerhalb der 15 Jahre von 2002 bis 2017 keine Hinweise auf eine Veränderung der AGB. Im dritten Projekt wurden potenzielle zukünftige Änderungen der oberirdischen Biomasse (AGB) basierend auf den Ergebnissen von Simulationen des individuell basierten räumlich expliziten Vegetationsmodells LAVESI unter Verwendung verschiedener Klimaszenarien, abhängig von RCP (Representative Concentration Pathways) 2.6, RCP 4.5 und RCP 8.5 (mit und ohne die Temperaturminderung nach den 2300 CE), geschätzt. Die LAVESI-basierte AGB wurde für den aktuellen Zustand bis 3000 CE für Lärchen-AGB simuliert, da wir davon ausgehen, dass die bemerkenswertesten Veränderungen im Baumgrenze-Ökoton mit einer Waldausdehnung zusammenhängen. Die räumliche Verteilung und der aktuelle Zustand der Baum-AGB wurden anhand von AGB-Felddaten, aus Landsat-Satellitendaten extrahierten AGB und einem Satellitenbild mit hoher räumlicher Auflösung und dadurch sichtbaren Einzelbäumen validiert. Die Simulationsergebnisse deuten auf Unterschiede in der Baum-AGB-Dynamik in Abhängigkeit von der Entfernung zur aktuellen Baumgrenze hin. Die simulierte Baum-AGB-Dynamik stimmt mit grundlegenden ökologischen (Auswanderungs- und Sukzessions-) Prozessen überein: die simulierte Baumbestandsentwicklung fängt mit Samenverbreitung an, Schaffung des Baumbestands, Baumbestand Verdichtung und episodische Verdünnung. Unsere Ergebnisse weisen auf eine Verdichtung des bestehenden Baumbestandes im Laufe dieses Jahrhunderts hin in der Untersuchungsregion, und auf eine zeitlich verzögerte Waldverbreitung (bis zu 39% der Fläche im RCP 8.5) unter allen betrachteten Klima-Szenarien ohne Abkühlung in verschiedenen lokalen Bereichen, abhängig von der Nähe zur heutigen Baumgrenze. In Szenarien mit Abkühlung nach 2300 CE beenden die Wälder ihre Ausbreitung um 2300 CE; bis zu 10%, RCP 8.5) um dann graduell zu ihrer vor 21. Jhd. Position zurückzuweichen. Die gemittelten Änderungsraten der Baum AGB sind am höchsten in den ersten 300 Jahren des 21. Jahrhunderts. Die Änderungsraten hängen ab von dem RCP Szenarium, mit den höchsten Änderungsraten unter RCP 8.5, wie zu erwarten war. Insgesamt zeigt diese interdisziplinäre Arbeit eine erfolgreiche Integration von Felddaten, Satellitendaten und Modellen zur Verfolgung der aktuellen und vorhergesagten zukünftigen Vegetationsänderungen in subarktischen Gebirgsregionen. Die erzielten Ergebnisse sind einzigartig für den Schwerpunktbereich in Zentral-Tschukotka und insgesamt für Gebirgsregionen in den hohen Breiten. T2 - Aktuelle und zukünftige Vegetationsveränderung in der Baumgrenzenregion von Chukotka (Nordost-Russland), abgeleitet aus Felddaten, Satellitendaten und Modellierung KW - plant ecology KW - vegetation change KW - Chukotka vegetation KW - above-ground biomass KW - land-cover classification KW - LAVESI KW - tree infilling KW - shrubification KW - subarctic vegetation change KW - treeline KW - tundra-taiga KW - Larix cajanderi KW - Vegetation von Tschukotka KW - oberirdische Biomasse KW - Klassifikation der Landbedeckung KW - Pflanzenökologie KW - Vegetationsveränderungen in der Subarktis KW - Waldausdehnung KW - Vegetationsveränderungen KW - Baumgrenze KW - Tundra-Taiga Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-548452 ER - TY - THES A1 - Sun, Xianlei T1 - Elasticity of fiber meshes derived from multiblock copolymers influences cell behaviors T1 - Elastizität von Fasergeweben abgeleitet Multiblockcopolymere beeinflussen das Zellverhalten. N2 - Objective: The behaviors of endothelial cells or mesenchymal stem cells are remarkably influenced by the mechanical properties of their surrounding microenvironments. Here, electrospun fiber meshes containing various mechanical characteristics were developed from polyetheresterurethane (PEEU) copolymers. The goal of this study was to explore how fiber mesh stiffness affected endothelial cell shape, growth, migration, and angiogenic potential of endothelial cells. Furthermore, the effects of the E-modulus of fiber meshes on human adipose-derived stem cells (hADSCs) osteogenic potential was investigated. Methods: Polyesteretherurethane (PEEU) polymers with various poly(p-dioxanone) (PPDO) to poly (ε-caprolactone) (PCL) weight percentages (40 wt.%, 50 wt.%, 60 wt.%, and 70 wt.%) were synthesized, termed PEEU40, PEEU50, PEEU60, and PEEU70, accordingly. The electrospinning method was used for the preparation of PEEU fiber meshes. The effects of PEEU fiber meshes with varying elasticities on the human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) shape, growth, migration and angiogenic potential were characterized. To determine how the E-modulus of fiber meshes affects the osteogenic potential of hADSCs, the cellular and nuclear morphologies and osteogenic differentiation abilities were evaluated. Results: With the increasing stiffness of PEEU fiber meshes, the aspect ratios of HUVECs cultivated on PEEU materials increased. HUVECs cultivated on high stiffness fiber meshes (4.5 ± 0.8 MPa) displayed a considerably greater proliferation rate and migratory velocity, in addition demonstrating increased tube formation capability, compared with those of the cells cultivated on lower stiffness fiber meshes (2.6 ± 0.8 MPa). Furthermore, in comparison to those cultivated on lower stiffness fiber meshes, hADSCs adhered to the highest stiffness fiber meshes PEEU70 had an elongated shape. The hADSCs grown on the softer PEEU40 fiber meshes showed a reduced nuclear aspect ratio (width to height) than those cultivated on the stiffer fiber meshes. Culturing hADSCs on stiffer fibers improved their osteogenic differentiation potential. Compared with cells cultured on PEEU40, osteocalcin expression and alkaline phosphatase (ALP) activity increased by 73 ± 10% and 43 ± 16%, respectively, in cells cultured on PEEU70. Conclusion: The mechanical characteristics of the substrate are crucial in the modulation of cell behaviors. These findings indicate that adjusting the elasticity of fiber meshes might be a useful method for controlling the blood vessels development and regeneration. Furthermore, the mechanical characteristics of PEEU fiber meshes might be modified to control the osteogenic potential of hADSCs. N2 - Ziel: Das Verhalten von Endothelzellen oder mesenchymalen Stammzellen wird erheblich von den mechanischen Eigenschaften der Mikroumgebung beeinflusst. Hier wurden elektrogesponnene Fasernetze mit unterschiedlicher Elastizität aus Polyetheresterurethan (PEEU) hergestellt. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss der Elastizität von Fasernetzen auf die Zellmorphologie, Proliferation, Migration und Angiogenese von Endothelzellen zu untersuchen. Außerdem war der Einfluss des E-Moduls von Fasersubstraten auf die Bindung an die Abstammungslinie von humanen Fettstammzellen (hADSCs) untersucht. Methoden: Polyesteretherurethane (PEEU) mit unterschiedlichen Poly(p-dioxanon) (PPDO) to Poly (ε-Caprolacton) （PCL）-Gewichtsverhältnissen (40:60, 50:50, 60:40, 70:30) wurden synthetisiert und als PEEU40, PEEU50, PEEU60 bzw. PEEU70 bezeichnet. Die Fasernetze wurden durch Elektrospinnen von PEEU hergestellt. Dann wurden humane Endothelzellen der Nabelschnurvene (HUVECs) auf diesen elektrogesponnenen Fasernetzen aus Polyetheresterurethan (PEEU) kultiviert, die sich in ihrer Elastizität unterscheiden. Zellmorphologie, Proliferation, Migration und Angiogenese von Endothelzellen auf den abbaubaren Substraten wurden charakterisiert. Für den Einfluss des E-Moduls von Fasersubstraten auf die Bindung an die Abstammungslinie von hADSCs-Zellen und die Kernmorphologie wurde die Fähigkeit zur osteogenen Differenzierung bewertet. Ergebnisse: Das Aspektverhältnis von HUVECs, die auf den Fasernetzen aus PEEU-Materialien kultiviert wurden, nahm mit zunehmender Steifheit der Materialien zu. HUVECs, die auf Fasernetzen mit hoher Steifheit (Young-Modul E = 4,5 ± 0,8 MPa) kultiviert wurden, zeigten eine höhere Proliferationsrate und eine signifikant schnellere Migrationsgeschwindigkeit sowie ein höheres Röhrenbildungsvermögen als die Zellen, die auf Fasernetzen mit niedriger Steifheit kultiviert wurden (E = 2,6 ± 0,8 MPa). Des Weiteren zeigten an steiferen PEEU70-Fasernetzen (PPDO: PCL = 70:30) gebundene hADSCs eine verlängerte Morphologie im Vergleich zu jenen, die auf weicheren Fasern kultiviert wurden. Das Kernaspektverhältnis (Breite gegen Länge eines Kerns) von hADSCs, die auf weicheren PEEU40-Fasern (PPDO: PCL = 40:60) kultiviert wurden, war niedriger als auf steiferen Fasern. Die osteogene Differenzierung von hADSCs wurde durch Kultivierung auf steiferen Fasern verstärkt. Im Vergleich zu PEEU40 wurde in Zellen auf PEEU70 eine 73 ± 10% ige Steigerung der Osteocalcin-Expression und eine 34 ± 16% ige Steigerung der Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) beobachtet. Schlussfolgerung: Die mechanischen Eigenschaften des Substrats spielen eine Schlüsselrolle bei der Modulation des Zellverhaltens. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Einstellen der Elastizität der Fasernetze eine potenzielle Strategie zur Modulation der Bildung oder Regeneration von Blutgefäßen sein könnte. Darüber hinaus könnte die Differenzierung von hADSCs durch die Anpassung der mechanischen Eigenschaften von elektrogesponnenen Fasern gestaltet werden. KW - PEEU KW - fiber mesh scaffolds KW - osteogenesis KW - angiogenesis KW - stiffness KW - hADSC KW - HUVEC KW - HUVEC KW - PEEU KW - Angiogenese KW - Gerüste aus Fasergeflecht KW - hADSC KW - Osteogenese KW - Steifheit Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-535285 ER - TY - THES A1 - Moradian, Hanieh T1 - Modulation of human macrophage activity by mRNA-mediated genetic engineering N2 - Macrophages play an integral role for the innate immune system. It is critically important for basic research and therapeutic applications to find approaches to potentially modulate their function as the first line of defense. Transient genetic engineering via delivery of synthetic mRNA can serve for such purposes as a robust, reliable and safe technology to modulate macrophage functions. However, a major drawback particularly in the transfection of sensitive immune cells such as macrophages is the immunogenicity of exogenous IVT-mRNAs. Consequently, the direct modulation of human macrophage activity by mRNA-mediated genetic engineering was the aim of this work. The synthetic mRNA can instruct macrophages to synthesize specific target proteins, which can steer macrophage activity in a tailored fashion. Thus, the focus of this dissertation was to identify parameters triggering unwanted immune activation of macrophages, and to find approaches to minimize such effects. When comparing different carrier types as well as mRNA chemistries, the latter had unequivocally a more pronounced impact on activation of human macrophages and monocytes. Exploratory investigations revealed that the choice of nucleoside chemistry, particularly of modified uridine, plays a crucial role for IVT-mRNA-induced immune activation, in a dose-dependent fashion. Additionally, the contribution of the various 5’ cap structures tested was only minor. Moreover, to address the technical aspects of the delivery of multiple genes as often mandatory for advanced gene delivery studies, two different strategies of payload design were investigated, namely “bicistronic” delivery and “monocistronic” co-delivery. The side-by-side comparison of mRNA co-delivery via a bicistronic design (two genes, one mRNA) with a monocistronic design (two gene, two mRNAs) unexpectedly revealed that, despite the intrinsic equimolar nature of the bicistronic approach, it was outperformed by the monocistronic approach in terms of reliable co-expression when quantified on the single cell level. Overall, the incorporation of chemical modifications into IVT-mRNA by using respective building blocks, primarily with the aim to minimize immune activation as exemplified in this thesis, has the potential to facilitate the selection of the proper mRNA chemistry to address specific biological and clinical challenges. The technological aspects of gene delivery evaluated and validated by the quantitative methods allowed us to shed light on crucial process parameters and mRNA design criteria, required for reliable co-expression schemes of IVT-mRNA delivery. N2 - Makrophagen spielen eine wesentliche Rolle für das angeborene (innate) Immunsystem. Sowohl für die Grundlagenforschung sowie als auch für therapeutische Anwendungen ist es von größter Wichtigkeit, Möglichkeiten zu finden, die Funktion von Makrophagen als erstem Abwehrmechanismus des Immunsystems zu modulieren. Transientes Genetic Engineering mittels synthetischer mRNA kann hierbei als robuste, zuverlässige und sichere Technologie zur Modulation des Zellverhaltens zu dienen. Eine besondere Herausforderung ist jedoch die Immunogenität exogener IVT-mRNAs, insbesondere für sensitive Immunzellen wie Makrophagen. Die direkte Modulation der Zellaktivität von humanen Makrophagen durch mRNA-vermitteltes Genetic Engineering ist das Ziel dieser Arbeit. Mit synthetischer mRNA lassen sich Makrophagen so instruieren, dass sie spezifische Zielproteine produzieren, um die Zellaktivität bedarfsgerecht zu steuern. Der Hauptfokus dieser Dissertation war die Identifikation der Parameter, die eine aus dem IVT-mRNA Transfer resultierende, unerwünschten Zellaktivierung bei Makrophagen auslösen und Ansätze zu finden, um diese zu minimieren. Beim Vergleich verschiedener Transfektionsagenzien und Nukleinsäurekompositionen der mRNA zeigte sich, dass letztere einen weitaus eindeutigeren Effekt auf die Zellaktivierung von humanen Makrophagen und Monozyten haben. Explorative Untersuchungen ergaben, dass die Wahl der Nukleosidchemie, insbesondere des modifizierten Uridins, eine entscheidende Rolle für diese dosisabhängige Immunaktivierung durch IVT-mRNA spielt. Im Vergleich dazu war der Einfluss der verschiedenen getesteten 5'-Cap-Strukturen nur geringfügig. Der Transfer mehrerer Gene in Zellen ist für komplexe Studien und Anwendungen oft zwingend erforderlich. Hierzu wurden die technischen Aspekte von zwei verschiedenen Strategien untersucht, nämlich die "bicistronische" Transfektion und die "monocistronische" Co-Transfektion. Der direkte Vergleich von mRNA-Co-Transfer über ein bicistronisches Design (zwei Gene, eine mRNA) mit einem monocistronischen Design (zwei Gene, zwei mRNAs) ergab überraschenderweise, dass trotz der intrinsischen äquimolaren Natur des bicistronischen Ansatzes dieser dem monocistronische Ansatz in Bezug auf eine zuverlässige Koexpression bei der Quantifizierung auf Einzelzellebene unterlegen war. Wie in dieser Arbeit gezeigt kann die Einbeziehung geeigneter chemischer Modifikationen in IVT-mRNA durch die Verwendung der entsprechenden Bausteine bei der Synthese zur Bewältigung spezifischer biologischer und klinischer Herausforderungen beitragen, in erster Linie durch die Minimierung der Immunaktivierung. Die Evaluation und Validierung technologischer Aspekte des Gentransfers durch quantitative Methoden ermöglichten uns auch entscheidende Prozessparameter und Kriterien für das mRNA-Design zu identifizieren, die für eine zuverlässige Co-Expression von Genen nach IVT-mRNA Transfektion erforderlich sind. T2 - Modulation der Aktivität humaner Makrophagen durch mRNA-vermittelte gentechnische Eingriffe KW - In vitro transcription technology KW - Messenger RNA (mRNA) KW - mRNA chemistry KW - primary human macrophages KW - macrophage activation KW - genetic engineering KW - innate immune response KW - co-delivery of multiple genes KW - co-transfection KW - In-vitro-Transkriptionstechnologie KW - Boten-RNA (mRNA) KW - simultane Einbringung multipler Gene KW - Co-Transfektion KW - Gentechnik KW - angeborene Immunantwort KW - mRNA-Chemie KW - Makrophagen-Aktivierung KW - primäre humane Makrophagen Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-548579 ER - TY - THES A1 - Ramm, Timo T1 - Entwicklung von Multiplex-Methoden zur Antikörper-Charakterisierung und Validierung N2 - Antikörper werden in verschiedensten Bereichen, sowohl zu therapeutischen als auch zu diagnostischen und forschungsorientierten Zwecken verwendet. Vor der Verwendung des Antikörpers bedarf es der Charakterisierung seiner Eigenschaften, in Bezug auf sein Epitop und sein Bindeverhalten gegenüber dem Paratop. Gleichzeitig muss, in Abhängigkeit des Einsatzes, der Antikörper, für den gewünschten Gebrauch, validiert werden. Zu diesem Zweck wurden in der vorliegenden Arbeit Bead-basierte, multiplexe Testsysteme entworfen, ausgetestet und etabliert mit dem Ziel, eine einfache Screeningmethode zu entwickeln, um eine hohe Anzahl an Proben beziehungsweise Analyten gleichzeitig bestimmen zu können. Dafür wurden drei verschiedene Herangehensweisen etabliert. So wurden ein phospho-PKA-Substrat Antikörper, welcher phosphorylierte Bindemotive der PKA der Form RRxpS erkennt, gleichzeitig mit einer Reihe an Peptide getestet, welche Punktmutationen im Vergleich zur Konsensussequenz enthielten, um den Einfluss einzelner Aminosäuren auf die Bindung des Antikörpers zu untersuchen. Es konnte im Multiplex gezeigt werden, dass die Unterschiede im Antikörperbindungsverhalten in Abhängigkeit der Aminosäure an verschiedenen P-Positionen detektierbar waren. Mit dem Bead-basierten Multiplexansatz konnten, durch Messungen von Konzentrationsreihen des Antikörpers, Bindungskinetiken aufgenommen und diese mit bereits etablierten Methoden verglichen werden. Des Weiteren wurden verschiedene Antikörper, welche essenzielle Bestandteile von Bead-basierten Testsystemen darstellten, validiert. Es wurden dabei verschiedene Antikörper, welche spezifisch THC und CBD erkennen ausgetestet und anschließend ein kompetitiver Assay zur Detektion von THC und CBD in humanem Serum etabliert, und die Nachweisgrenzen bestimmt. Ferner sollten Pferdeseren von Tieren, welche am Sommerekzem leiden, auf ihren IgE-Gehalt hin bestimmt werden. Dafür wurden relevante Proteine rekombinant hergestellt und durch Immobilisierung an Beads im Multiplex mit Serum inkubiert. Die spezifische Bindung des IgE an die Allergen sollte damit messbar gemacht werden können. Für die Gesamtvalidierung des Testsystems wurden zuvor sämtliche Einzelschritte einzeln validiert, um im Anschluss im multiplexen Screening zu vermessen. Die Nutzung von Bead-basierten Multiplexmessungen als eine Plattformtechnologie erleichtert die Charakterisierung von Antikörpern sowie ihre Validierung für verschiedene Testsysteme. N2 - Antibodies are widely used in different fields, which include therapeutic as well as diagnostic and research applications Before the antibody can be used, its properties must be characterized with regard to its epitope and its binding behavior to the paratope. At the same time, depending on the application, the antibody must be validated for its desired use. For this purpose, bead-based multiplex assay systems were designed, tested, and established with the aim of developing a simple screening method to simultaneously measure a high number of samples or analytes. Thus, a phospho-PKA-substrate antibody, which recognizes phosphorylated binding motifs of PKA with the RRxpS motif, was tested. A series of peptides containing point mutations as compared to consensus sequences were used to investigate the influence of individual amino acids on the binding of the antibody. In a multiplex approach it was shown that the differences in the antibody binding behavior were detectable at different P-positions depending on the amino acid. Furthermore, it was possible to measure binding kinetics by the bead-based multiplex approach using dilution series of the antibody, and to compare these with already established methods. In addition to that, different antibodies, which were applied as essential components of bead-based biosensor systems, were validated. On the one hand, different antibodies specifically recognizing THC and CBD were tested and subsequently a competitive assay for the detection of THC and CBD in human serum was established. The detection limits could be determined. On the other hand, the IgG level in horse sera from animals suffering from sweet itch were determined. For this purpose, relevant proteins were recombinantly expressed, immobilized on beads and incubated with serum in a multiplex approach. The specific binding of IgE to the allergen was measurable. For the overall validation of the test system, all individual steps were partially validated beforehand to allow for a measurement in the multiplex screening system. Thus, using the advantages of bead-based multiplex measurements, a platform for the characterization of antibodies as well as their validation in different test systems was demonstrated. KW - Antikörper KW - Multiplex KW - THC KW - Proteinkinase A KW - Sommerekzem KW - CBD KW - Bead KW - Antikörpercharakterisierung KW - Antikörpervalidierung KW - antibody KW - antibody characterization KW - antibody validation KW - THC KW - CBD KW - Proteinkinase A KW - summer eczema Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-561531 ER - TY - THES A1 - Schumann, Anne T1 - Development of GIPR antagonists for targeted radiotherapy in neuroendocrine neoplasms N2 - Die Theorie der zielgerichteten Radiotherapie basiert auf der Überexpression von spezifischen Rezeptoren auf der Oberfläche von entarteten Zellen. In präklinischen Studien konnte der Gastric inhibitory polypeptide receptor (GIPR) in besonders hoher Dichte in neuroendokrinen Neoplasien (NENs) identifiziert werden, wohingegen er in gesundem Gewebe kaum vorkommt (Waser 2012). Die Verwendung von Somatostatinrezeptor 2 (SSTR2) bindenden Molekülen, welche mit radioaktiven Isotopen verbunden sind, wird in der klinischen Praxis zur Diagnose und Therapie (Theranostik) von NEN´s eingesetzt, wodurch die Tumorzellen gezielt sichtbar gemacht oder zerstört werden können. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von Molekülen mit besonders hoher Affinität gegenüber dem GIPR zum Einsatz in der zielgerichteten Radiotherapie. Es sollte die Hypothese überprüft werden, ob ein neuartiger GIPR Antagonist bei der Detektion von GIPR-positiven Tumoren, bessere Ergebnisse als der GIPR Agonist GIP(1-30) generieren kann. (Reubi 2017). Darüber hinaus wurde auch ein direkter Vergleich mit dem SSTR2 Agonist DOTATATE und Antagonist JR11 für die Detektion von NENs angestellt. Die im Rahmen der Arbeit entwickelten neuen GIPR-bindenden Antagonisten sind nicht von GIP abgeleitet. Die Konjugation mit DOTA erlaubt die Komplexbildung mit diagnostischen (z.B. 111In) und therapeutischen Radionukliden (z.B. 177Lu). Unter der Vielzahl entwickelten Verbindungen, war das Molekül 3BP-3775 der vielversprechendste Kandidat für eine klinische Weiterentwicklung. Es zeigte sich ein hohe GIPR Affinität und langanhaltende Rezeptorbindung in vitro und darüber hinaus bei in vivo Versuchen eine starke und persistente Aufnahme in den Tumor. Die geringe Verteilung in den Nieren repräsentiert dabei die herausragenden Eigenschaften von 3BP-3775 im Gegensatz zu bereits publizierten Daten mit GIP abgeleiteten Verbindungen (Gourni 2014). Mit 177Lu-3BP-3775 konnte zum ersten Mal eine therapeutische Wirksamkeit eines GIPR-Binders nachgewiesen werden. Mittels in vitro Rezeptor Autoradiographie wurde zudem gezeigt, dass ein neu entwickelter GIPR Antagonist (111In-3BP-3626) eine 6-fach höhere Bindung an gastroenteropankreatische (GEP) und bronchiale NENs zeigt als der heute klinisch relevanteste SSTR2 Agonist DOTATATE. Zwar war die Bindung des SSTR2 Antagonist JR11 vergleichbar stark, jedoch wurde bei JR11 eine deutlich höhere Bindung in gesundem Gewebe detektiert, weshalb sich für 3BP-3626 ein zu favorisierendes Tumor-zu-Hintergrund Bindungsverhältnis errechnen ließ. Die Bindung des GIPR Agonisten 111In GIP(1 30) war in allen untersuchten Proben sehr gering. Anhand der Ergebnisse ergab sich folgende Reihenfolge bei der Beurteilung der untersuchten Verbindung und ihrer Fähigkeit NENs gezielt zu detektieren: 111In 3BP 3626 ~ 111In-JR11> 111In-DOTATATE > 111In-GIP(1-30). Die erfolgreiche Entwicklung von neuartigen Molekülen für zielgerichtete Anwendungen gegen den GIPR bildet das Kernstück der vorliegenden Arbeit. Die erzielten in vitro und in vivo Ergebnisse sind die Grundlage für die Weiterentwicklung des GIPR Antagonisten 3BP-3775 um dessen klinischen Einsatz in der Radiotherapie von GEP- und bronchialen NENs zu realisieren. N2 - Receptors predominantly expressed on tumor cells represent one of the key prerequisites of targeted radiotherapy. The gastric inhibitory polypeptide receptor (GIPR) has emerged as a promising target due to its substantial overexpression in neuroendocrine neoplasms (NENs) and virtual absence in healthy tissues (Waser 2012). So far, only radiolabeled peptides targeting the somatostatin receptor 2 (SSTR2) are approved for targeted radiotherapy of inoperable, metastatic NENs. The aim of this thesis was to develop highly affine GIPR tracers for targeted radiotherapy by continuous in vitro and in vivo characterization of peptide sequence modifications. It was hypothesized that a GIPR antagonist might increase the sensitivity to detect GIPR-positive tumors relative to the agonist GIP(1-30), as shown for SSTR2 tracers (Reubi 2017). Further comparison to the SSTR2 agonist and antagonist (DOTATATE, JR11) should allow compound ranking regarding their ability to detect NENs. The novel GIPR-targeting antagonists were conjugated to DOTA, enabling complexation of diagnostic (e. g. 111In) and therapeutic radionuclides (e. g. 177Lu). Among the high number of compounds screened, 3BP-3775 proved to be the most promising candidate for further preclinical and clinical development. High GIPR affinity and long receptor residence time in vitro were reflected in strong tumor uptake and retention in vivo. Low initial kidney accumulation and fast subsequent clearance represented a major advantage relative to previously described GIPR-targeting molecules (Gourni 2014). Furthermore, administration of 177Lu-3BP-3775 demonstrated for the first time strong therapeutic efficacy of a GIPR-targeting compound. In vitro receptor autoradiography with 111In-3BP-3626 (GIPR antagonist) demonstrated up to 6-fold higher signals in gastroenteropancreatic and bronchial NENs, relative to the clinically utilized SSTR2 agonist 111In-DOTATATE. Both receptor antagonists, however, revealed similar signal strength. In contrast to 111In-JR11, 111In-3BP-3626 showed no binding to non-target tissues, which led to higher tumor-to-background ratios for 111In-3BP-3626. Signal strength of the GIPR agonist 111In-GIP(1-30) was close to background in all investigated tumor samples. The ranking of compounds according to their ability to detect NENs based on autoradiographic signal intensities was determined to be: 111In-3BP-3626 ~ 111In-JR11> 111In-DOTATATE > 111In GIP(1-30). In summary, this thesis proposes the application of the GIPR antagonist 3BP-3775 for a targeted radiotherapy in GEP- and bronchial NENs. KW - Theranostic KW - Neuroendocrine tumors KW - targeted therapy KW - gastric inhibitory polypeptide receptor Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Qin, Miaojing T1 - The role of heat shock proteins (HSP23s and HSP70-4) for heat stress memory in plants N2 - Heat is a significant climatic condition that threatens crop growth and survival. Extreme temperature occurrences in nature are becoming more severe, more frequent and longer-lasting, all of which have deleterious repercussions for agricultural production. As a result, it is critical to learn more about the mechanisms that lead to increased heat tolerance in plants. To endure and survive, higher plants have evolved complex mechanisms to respond to various amounts of heat stress. Plants have a thermal tolerance that permits them to survive rapid and dramatic temperature rises for a limited time. Plants can also be primed to withstand heat stress (HS) that would otherwise be lethal by exposing them to short, moderate, and non-lethal HS (referred to as a priming stimulus) before being exposed to severe HS. A prepared acquired thermotolerance in primed plants can be maintained for a long time under optimal circumstances, implying that plants can store information during this period. Several studies have shown that acquired thermotolerance (thermopriming) refers to the increased resistance of cells, tissues, and organisms to elevated temperatures after prior heat exposure. Maintenance of acquired thermotolerance (thermomemory) is associated with the synthesis of specialized stress proteins involved in cellular protection and accelerated tissue repair, such as heat shock proteins (HSPs). Recent studies showed a main role of heat shock proteins for turnover of protein quality components, e.g. HSP21 in the chloroplast in the regulation of thermomemory. As an important organelle, mitochondrial function is critical for plant cell responses to heat. However, it is still unknown what the molecular and physiological involvement of HSPs is in mitochondrial function and thermomemory. In our study, we showed that thermopriming induces transcript and protein levels of two mitochondrial small heat shock proteins, HSP23.5 (AT5G51440) and HSP23.6 (AT4G25200), which last for 2-3 days throughout the thermomemory phase. The morphological analysis of HSP23.5/6 transgenic plants demonstrated HSP23.5/6 function redundantly in heat stress. We showed that hsp23.5/6 double knockout plants had abnormalities in thermomemory at the seedling stage, and that mature hsp23.5/6 4 plants are more sensitive to both basal thermotolerance and thermomemory. Heat treatment significantly impacted the respiration rate of hsp23.5/6 seedlings compared to WT, indicating mitochondrial dysfunction dependent on HSP23.5 and HSP23.6. In addition, we tested and confirmed the chaperone activity of HSP23.6 toward the model substrate protein malate dehydrogenase (MDH) in vitro, indicating that HSP23.6 potentially contributes to the maintenance of cellular viability. Furthermore, we discovered a novel HSP23.6 client protein, CIB22, a mitochondrial complex-I subunit protein. According to experimental data (BiFC and Co-IP), HSP23.6 and CIB22 interact in plant cells. We also identified a heat response phenotype in the cib22 mutant compared to WT, as well as CIB22 protein degradation in the hsp23.5/6 mutant when exposed to heat. Our findings suggest that the two mitochondrial-localized heat shock proteins play a role in thermotolerance, presumably by influencing mitochondrial function and structure. More broadly, to identify novel genetic components associated with thermomemory in plants, we performed proteome profiling for Arabidopsis WT (Col-0) seedlings during thermomemory. Multiple time point samples of priming and triggering with controls were collected and analyzed to reveal the dynamic proteome changes during the memory phase in Arabidopsis cells. Among the top memory-associated proteins, we discovered that HSP70-4 was significantly upregulated after priming and remains high (at least 2-fold) for the next four days. By morphologically analyzing their heat stress behaviors, we were able to verify that HSP70-4 is involved in plant heat stress response. More intriguingly, we discovered that following priming, HSP70-4-GFP creates cytosolic foci that persist for a few days into the recovery period. We propose that these foci are linked to SGs due to cycloheximide (CHX) repressing the GFP-foci signal when exposed to heat. These findings indicate an HSP70-4-mediated transcription and translation control link (module) during basal thermotolerance and thermomemory, as well as its potential role(s) in heat stress response. To summarize, our research provides new insight into the role of heat shock proteins in controlling heat stress tolerance and memory. N2 - Hitze ist eine bedeutende klimatische Bedingung, die das Wachstum und das Überleben von Pflanzen bedroht. Extreme Temperaturereignisse in der Natur werden gravierender, häufiger, länger anhaltend, was sich nachteilig auf die landwirtschaftliche Produktion auswirkt. Daher ist es wichtig, mehr über die Mechanismen zu erfahren, die zu einer erhöhten Hitzetoleranz bei Pflanzen führen. Um auszuhalten und zu überleben, haben höhere Pflanzen komplexe Mechanismen entwickelt, um auf verschiedene Intensitäten von Hitzestress zu reagieren. Pflanzen haben eine thermische Toleranz, die es ihnen ermöglicht, schnelle und dramatische Temperaturanstiege für eine begrenzte Zeit zu überleben. Pflanzen können auch darauf vorbereitet werden, Hitzestress (HS) zu widerstehen, der ansonsten tödlich wäre, indem man sie kurzen, moderaten und nicht-tödlichen HS (als Priming-Stimulus bezeichnet) aussetzt, bevor sie hohem HS ausgesetzt werden. Eine erworbene Thermotoleranz kann bei Pflanzen unter optimalen Bedingungen lange aufrechterhalten werden, was bedeutet, dass Pflanzen während dieser Zeit Informationen speichern können. Mehrere Studien haben gezeigt, dass sich erworbene Thermotoleranz (Thermopriming) auf die erhöhte Widerstandsfähigkeit von Zellen, Geweben und Organismen gegenüber erhöhten Temperaturen nach vorheriger Hitzeeinwirkung bezieht. Die Aufrechterhaltung der erworbenen Thermotoleranz (Thermomemory) ist mit der Synthese von speziellen Stressproteinen verbunden, die am Zellschutz und der beschleunigten Gewebereparatur beteiligt sind, wie z. B. Hitzeschockproteine (HSPs). Neuere Studien haben eine Beteiligung von Hitzeschockproteinen, z.B. HSP21, in Chloroplasten an der Regulation des Thermogedächtnisses belegt. Als wichtiges Organell ist die mitochondriale Funktion entscheidend für die Reaktion von Pflanzenzellen auf Hitze. Es ist jedoch noch unbekannt, wie die molekulare und physiologische Beteiligung von HSPs an der mitochondrialen Funktion im Thermogedächtnis erfolgt. In unserer Studie haben wir gezeigt, dass Thermopriming Transkript- und Proteinspiegel von zwei mitochondrialen kleinen Hitzeschockproteinen, HSP23.56 (AT5G51440) und HSP23.6 (AT4G25200), induziert, die während der Thermogedächtnisphase 2-3 Tage andauern. Die morphologische Analyse von HSP23.5/6-transgenen Pflanzen zeigte eine HSP23.5/6-Funktionsredundanz bei Hitzestress. Wir zeigten, dass hsp23.5/6-Doppel-Knockout-Pflanzen Anomalien im Thermogedächtnis im Keimlingsstadium aufwiesen und dass reife hsp23.5/6-Pflanzen sowohl mit basaler Thermotoleranz als auch mit Thermogedächtnis empfindlicher sind. Die Wärmebehandlung beeinflusste die Atmungsrate von hsp23.5/6-Keimlingen im Vergleich zu WT signifikant, was auf eine mitochondriale Dysfunktion in Abhängigkeit von HSP23.5 und HSP23.6 hinweist. Darüber hinaus haben wir die Chaperon-Aktivität von HSP23.6 gegenüber dem Modellsubstratprotein Malatdehydrogenase (MDH) in vitro getestet und bestätigt, was darauf hindeutet, dass HSP23.6 möglicherweise zur Aufrechterhaltung der zellulären Lebensfähigkeit beiträgt. Darüber hinaus entdeckten wir ein neues HSP23.6-Clientprotein, CIB22, ein mitochondriales Komplex-I-Untereinheitsprotein. Nach experimentellen Daten (BiFC und Co-IP) interagieren HSP23.6 und CIB22 in Pflanzenzellen. Wir identifizierten auch einen Hitzereaktionsphänotyp in der cib22-Mutante im Vergleich zu WT sowie einen CIB22-Proteinabbau in der hsp23.5/6-Mutante, wenn sie Hitze ausgesetzt wurde. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die beiden mitochondrial lokalisierten Hitzeschockproteine eine Rolle bei der Thermotoleranz spielen, vermutlich indem sie die mitochondriale Funktion und Struktur beeinflussen. Um neue genetische Komponenten zu identifizieren, die mit dem Thermogedächtnis in Pflanzen verbunden sind, haben wir weiterhin ein Proteom-Profiling von Arabidopsis WT (Col-0) -Keimlingen während des Thermogedächtnisses durchgeführt. Mehrere Zeitpunkte von Priming und Triggerung mit Kontrollen wurden gesammelt und analysiert, um dynamische Proteomänderungen während der Gedächtnisphase in Arabidopsis-Zellen aufzudecken. Unter den Top-gedächtnis-assoziierten Proteinen entdeckten wir, dass HSP70-4 nach dem Priming signifikant hochreguliert wurde und für die nächsten vier Tage auf hohem Niveau bleibt (mindestens 2-fach erhöht). Durch Analyse ihres Hitzestressverhaltens konnten wir verifizieren, dass HSP70-4 an der 7 Reaktion von Pflanzen auf Hitzestress beteiligt ist. Interessant ist, dass HSP70-4-GFP nach dem Priming zytosolische Foci erzeugt, die für einige Tage während der Erholungsphase bestehen bleiben. Wir schlagen vor, dass der Fokus mit SGs verbunden ist, da Cycloheximid (CHX) GFP-Foci-Signale unterdrückt, wenn sie der Hitze ausgesetzt werden. Diese Ergebnisse weisen auf eine HSP70-4-vermittelte Transkriptions- und Translationssteuerungsverbindung (Modul) während der basalen Thermotoleranz und des Thermogedächtnisses sowie auf ihre potenzielle(n) Rolle(n) bei der Reaktion auf Hitzestress hin. Zusammenfassend bietet unsere Forschung neue Einblicke in die Rolle von Hitzeschockproteinen bei der Kontrolle der Hitzestresstoleranz und des Gedächtnisses. Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Wang, Yang T1 - Role of the actin cytoskeleton in cellular morphogenesis at the shoot apical meristem of Arabidopsis thaliana N2 - The morphogenesis of sessile plants is mainly driven by directional cell growth and cell division. The organization of their cytoskeleton and the mechanical properties of the cell wall greatly influence morphogenetic events in plants. It is well known that cortical microtubules (CMTs) contribute to directional growth by regulating the deposition of the cellulose microfibrils, as major cell wall fortifying elements. More recent findings demonstrate that mechanical stresses existing in cells and tissues influence microtubule organization. Also, in dividing cells, mechanical stress directions contribute to the orientation of the new cell wall. In comparison to the microtubule cytoskeleton, the role of the actin cytoskeleton in regulating shoot meristem morphogenesis has not been extensively studied. This thesis focuses on the functional relevance of the actin cytoskeleton during cell and tissue scale morphogenesis in the shoot apical meristem (SAM) of Arabidopsis thaliana. Visualization of transcriptional reporters indicates that ACTIN2 and ACTIN7 are two highly expressed actin genes in the SAM. A link between the actin cytoskeleton and SAM development derives from the observation that the act2-1 act7-1 double mutant has abnormal cell shape and perturbed phyllotactic patterns. Live-cell imaging of the actin cytoskeleton further shows that its organization correlates with cell shape, which indicates a potential role of actin in influencing cellular morphogenesis. In this thesis, a detailed characterization of the act2-1 act7-1 mutant reveals that perturbation of actin leads to more rectangular cellular geometries with more 90° cell internal angles, and higher incidences of four-way junctions (four cell boundaries intersecting together). This observation deviates from the conventional tricellular junctions found in epidermal cells. Quantitative cellular-level growth data indicates that such differences in the act2-1 act7-1 mutant arise due to the reduced accuracy in the placement of the new cell wall, as well as its mechanical maturation. Changes in cellular morphology observed in the act2-1 act7-1 mutant result in cell packing defects that subsequently compromise the flow of information among cells in the SAM. N2 - Die Morphogenese sessiler Pflanzen wird hauptsächlich durch gerichtetes Zellwachstum und Zellteilung angetrieben. Die Organisation des Zytoskeletts und die mechanischen Eigenschaften der Zellwand haben großen Einfluss auf die morphogenetischen Vorgänge in Pflanzen. Es ist bekannt, dass kortikale Mikrotubuli (CMTs) zum gerichteten Wachstum beitragen, indem sie die Bildung von Zellulose-Mikrofibrillen als wichtige Elemente zur Stärkung der Zellwand regulieren. Neuere Erkenntnisse zeigen, dass mechanische Spannungen in den Zellen und Geweben die Organisation der Mikrotubuli beeinflussen. Bei der Zellteilung tragen auch die mechanischen Belastungsrichtungen zur Ausrichtung der neuen Zellwand bei. Im Vergleich zum Zytoskelett der Mikrotubuli ist die Rolle des Aktinzytoskeletts bei der Regulierung der Morphogenese des Sprossmeristems noch nicht umfassend untersucht worden. Diese Arbeit befasst sich mit der funktionellen Bedeutung des Aktinzytoskeletts bei der Zell- und Gewebemorphogenese im Sprossapikalmeristem (SAM) von Arabidopsis thaliana. Die Visualisierung von Transkriptionsreportern zeigt, dass ACTIN2 und ACTIN7 zwei stark exprimierte Aktingene im SAM sind. Eine Verknüpfung zwischen dem Aktinzytoskelett und der Entwicklung des SAMs ergibt sich aus der Beobachtung, dass die act2-1 act7-1 Doppelmutante eine abnorme Zellform und ein gestörtes phyllotaktisches Muster aufweist. Die Lebend-Zell Aufnahmen des Aktinzytoskeletts zeigt außerdem, dass seine Organisation mit der Zellform korreliert, was auf eine mögliche Rolle des Aktins bei der Beeinflussung der zellulären Morphogenese hinweist. In dieser Arbeit wird anhand einer detaillierten Charakterisierung der act2-1 act7-1 Mutante gezeigt, dass eine Störung des Aktins zu rechteckigeren Zellgeometrien mit mehr 90°-Zellinnenwinkeln und einem höheren Vorkommen von Vierfach-Verbindungen (vier sich kreuzende Zellgrenzen) führt. Diese Beobachtung weicht von den konventionellen trizellulären Verbindungen der Epidermiszellen ab. Quantitative Wachstumsdaten auf zellulärer Ebene deuten darauf hin, dass diese Unterschiede in der act2-1 act7-1 Mutante auf die geringere Präzision bei der Platzierung der neuen Zellwand sowie auf ihre mechanische Reifung zurückzuführen sind. Die bei der act2-1 act7-1 Mutante beobachteten Veränderungen der Zellmorphologie führen zu Defekten in der Zellanordnung, die in der weiteren Folge den Informationsfluss zwischen den Zellen im SAM beeinträchtigen. KW - Arabidopsis KW - shoot apical meristem KW - actin KW - cell division KW - cell shape KW - morphogenesis Y1 - 2022 U6 - https://doi.org/10.25932/publishup-55908 ER - TY - THES A1 - Welsch, Maryna T1 - Investigation of the stress tolerance regulatory network integration of the NAC transcription factor JUNGBRUNNEN1 (JUB1) T1 - Untersuchung des Stresstoleranz-Regulationsnetzwerks des NAC-Transkriptionsfaktors JUNGBRUNNEN1 (JUB1) N2 - The NAC transcription factor (TF) JUNGBRUNNEN1 (JUB1) is an important negative regulator of plant senescence, as well as of gibberellic acid (GA) and brassinosteroid (BR) biosynthesis in Arabidopsis thaliana. Overexpression of JUB1 promotes longevity and enhances tolerance to drought and other abiotic stresses. A similar role of JUB1 has been observed in other plant species, including tomato and banana. Our data show that JUB1 overexpressors (JUB1-OXs) accumulate higher levels of proline than WT plants under control conditions, during the onset of drought stress, and thereafter. We identified that overexpression of JUB1 induces key proline biosynthesis and suppresses key proline degradation genes. Furthermore, bZIP63, the transcription factor involved in proline metabolism, was identified as a novel downstream target of JUB1 by Yeast One-Hybrid (Y1H) analysis and Chromatin immunoprecipitation (ChIP). However, based on Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), direct binding of JUB1 to bZIP63 could not be confirmed. Our data indicate that JUB1-OX plants exhibit reduced stomatal conductance under control conditions. However, selective overexpression of JUB1 in guard cells did not improve drought stress tolerance in Arabidopsis. Moreover, the drought-tolerant phenotype of JUB1 overexpressors does not solely depend on the transcriptional control of the DREB2A gene. Thus, our data suggest that JUB1 confers tolerance to drought stress by regulating multiple components. Until today, none of the previous studies on JUB1´s regulatory network focused on identifying protein-protein interactions. We, therefore, performed a yeast two-hybrid screen (Y2H) which identified several protein interactors of JUB1, two of which are the calcium-binding proteins CaM1 and CaM4. Both proteins interact with JUB1 in the nucleus of Arabidopsis protoplasts. Moreover, JUB1 is expressed with CaM1 and CaM4 under the same conditions. Since CaM1.1 and CaM4.1 encode proteins with identical amino acid sequences, all further experiments were performed with constructs involving the CaM4 coding sequence. Our data show that JUB1 harbors multiple CaM-binding sites, which are localized in both the N-terminal and C-terminal regions of the protein. One of the CaM-binding sites, localized in the DNA-binding domain of JUB1, was identified as a functional CaM-binding site since its mutation strongly reduced the binding of CaM4 to JUB1. Furthermore, JUB1 transactivates expression of the stress-related gene DREB2A in mesophyll cells; this effect is significantly reduced when the calcium-binding protein CaM4 is expressed as well. Overexpression of both genes in Arabidopsis results in early senescence observed through lower chlorophyll content and an enhanced expression of senescence-associated genes (SAGs) when compared with single JUB1 overexpressors. Our data also show that JUB1 and CaM4 proteins interact in senescent leaves, which have increased Ca2+ levels when compared to young leaves. Collectively, our data indicate that JUB1 activity towards its downstream targets is fine-tuned by calcium-binding proteins during leaf senescence. N2 - Der NAC Transkriptionsfaktor (TF) JUNGBRUNNEN1 (JUB1) ist ein wichtiger negativer Regulator der Pflanzenseneszenz, Gibberellinsäure- (GA) und Brassinosteroid- (BR) Biosynthese in Arabidopsis thaliana. Die Überexpression von JUB1 fördert die Langlebigkeit und erhöht die Toleranz gegenüber Trockenheit und anderen abiotischen Belastungen. Bei anderen Pflanzenarten, einschließlich Tomaten und Bananen, wurde eine ähnliche Rolle von JUB1 beobachtet. Unsere Daten zeigen, dass JUB1 Überexpressionslinien im Vergleich zu WT-Pflanzen sowohl unter Kontrollbedingungen, als auch zu Beginn und während späterer Stadien von Trockenstress größere Mengen an Prolin akkumulieren. Wir haben festgestellt, dass die Überexpression von JUB1 die Schlüsselbiosynthese von Prolin induziert und Schlüsselgene für den Abbau von Prolin unterdrückt. Darüber hinaus wurde bZIP63, ein am Prolinstoffwechsel beteiligter Transkriptionsfaktor, mittels Yeast One-Hybrid-System (Y1H) und Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) als neues nachgeschaltetes Ziel von JUB1 identifiziert. Basierend auf dem Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) konnte die direkte Bindung von JUB1 an bZIP63 jedoch nicht bestätigt werden. Unsere Daten zeigen, dass JUB1-OXs unter Kontrollbedingungen eine niedrigere stomatale Leitfähigkeit aufweisen. Allerdings verbessert eine selektive Überexpression von JUB1 in den Schließzellen die Trockenstresstoleranz bei Arabidopsis nicht. Darüber hinaus hängt der trockenheitstolerante Phänotyp von JUB1 nicht allein von der transkriptionellen Kontrolle des DREB2A-Gens ab. Unsere Daten legen daher nahe, dass JUB1 durch die Regulierung mehrerer Komponenten Toleranz gegenüber Trockenstress verleiht. Bis heute konzentrierte sich keine der bisherigen Studien zum regulatorischen Netzwerk von JUB1 auf die Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen. Wir führten deshalb einen Hefe-Zwei-Hybrid-Screen (Y2H) durch, der mehrere Protein-Interaktoren von JUB1 identifizierte, von denen zwei Calcium-bindende Proteine sind (CaM1 und CaM4). Beide Proteine interagieren mit JUB1 im Kern von Arabidopsis-Protoplasten. Darüber hinaus wird JUB1 mit den CaM1- und CaM4-Genen unter den gleichen Bedingungen exprimiert und kolokalisiert mit den Proteinen im Zellkern von Arabidopsis thaliana-Protoplasten. Unsere Daten zeigen, dass JUB1 mehrere CaM-Bindungsstellen aufweist, die sowohl in der N-terminalen, als auch in der C-terminalen Region des Proteins lokalisiert sind. Eine der CaM-Bindungsstellen, die in der DNA-Bindungsdomäne von JUB1 lokalisiert ist, wurde als funktionelle und aktive CaM-Bindungsstelle identifiziert, da ihre Mutation die Bindung von CaM4 an JUB1 stark reduzierte. Darüber hinaus transaktiviert JUB1 die Expression des stressbezogenen Gens DREB2A in Mesophyllzellen. Dieser Effekt wird deutlich reduziert, wenn auch das Calcium-bindende Protein CaM4 exprimiert wird. Die Überexpression beider Gene in Arabidopsis führt zum frühen Seneszenz-Phänotyp, der durch einen verminderten Chlorophyllgehalt und eine veränderte SAGs-Expression im Vergleich zu einzelnen JUB1-Überexpressoren beobachtet wird. Unsere Daten zeigen auch, dass JUB1- und CaM4-Proteine in den seneszenten Blättern, die im Vergleich zu jungen Blättern erhöhte Ca2+-spiegel aufweisen, interagieren. Zusammenfassend weisen unsere Daten darauf hin, dass während der Blattseneszenz die Aktivität von JUB1 gegenüber seinen nachgeschalteten Zielen durch die Calcium-bindenden Proteine fein abgestimmt wird. KW - transcription factor KW - senescence KW - calmodulin KW - JUB1 KW - CaM4 KW - drought stress KW - CaM4 KW - JUB1 KW - calmodulin KW - Trockenstress KW - Seneszenz KW - Transkriptionsfaktor Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-547310 ER - TY - THES A1 - Milles, Alexander T1 - Sources and consequences of intraspecific trait variation in movement behaviour T1 - Ursachen und Konsequenzen intraspezifischer Merkmalsvariation im Bewegungsverhalten N2 - Variation in traits permeates and affects all levels of biological organisation, from within individuals to between species. Yet, intraspecific trait variation (ITV) is not sufficiently represented in many ecological theories. Instead, species averages are often assumed. Especially ITV in behaviour has only recently attracted more attention as its pervasiveness and magnitude became evident. The surge in interest in ITV in behaviour was accompanied by a methodological and technological leap in the field of movement ecology. Many aspects of behaviour become visible via movement, allowing us to observe inter-individual differences in fundamental processes such as foraging, mate searching, predation or migration. ITV in movement behaviour may result from within-individual variability and consistent, repeatable among-individual differences. Yet, questions on why such among-individual differences occur in the first place and how they are integrated with life-history have remained open. Furthermore, consequences of ITV, especially of among-individual differences in movement behaviour, on populations and species communities are not sufficiently understood. In my thesis, I approach timely questions on the sources and consequences of ITV, particularly, in movement behaviour. After outlining fundamental concepts and the current state of knowledge, I approach these questions by using agent-based models to integrate concepts from behavioural and movement ecology and to develop novel perspectives. Modern coexistence theory is a central pillar of community ecology, yet, insufficiently considers ITV in behaviour. In chapter 2, I model a competitive two-species system of ground-dwelling, central-place foragers to investigate the consequences of among-individual differences in movement behaviour on species coexistence. I show that the simulated among-individual differences, which matched with empirical data, reduce fitness differences betweem species, i.e. provide an equalising coexistence mechanism. Furthermore, I explain this result mechanistically and, thus, resolve an apparent ambiguity of the consequences of ITV on species coexistence described in previous studies. In chapter 3, I turn the focus to sources of among-individual differences in movement behaviour and their potential integration with life-history. The pace-of-life syndrome (POLS) theory predicts that the covariation between among-individual differences in behaviour and life-history is mediated by a trade-off between early and late reproduction. This theory has generated attention but is also currently scrutinised. In chapter 3, I present a model which supports a recent conceptual development that suggests fluctuating density-dependent selection as a cause of the POLS. Yet, I also identified processes that may alter the association between movement behaviour and life-history across levels of biological organization. ITV can buffer populations, i.e. reduce their extinction risk. For instance, among-individual differences can mediate portfolio effects or increase evolvability and, thereby, facilitate rapid evolution which can alleviate extinction risk. In chapter 4, I review ITV, environmental heterogeneity, and density-dependent processes which constitute local buffer mechanisms. In the light of habitat isolation, which reduces connectivity between populations, local buffer mechanisms may become more relevant compared to dispersal-related regional buffer mechanisms. In this chapter, I argue that capacities, latencies, and interactions of local buffer mechanisms should motivate more process-based and holistic integration of local buffer mechanisms in theoretical and empirical studies. Recent perspectives propose to apply principles from movement and community ecology to study filamentous fungi. It is an open question whether and how the arrangement and geometry of microstructures select for certain movement traits, and, thus, facilitate coexistence-stabilising niche partitioning. As a coauthor of chapter 5, I developed an agent-based model of hyphal tips navigating in soil-like microstructures along a gradient of soil porosity. By measuring network properties, we identified changes in the optimal movement behaviours along the gradient. Our findings suggest that the soil architecture facilitates niche partitioning. The core chapters are framed by a general introduction and discussion. In the general introduction, I outline fundamental concepts of movement ecology and describe theory and open questions on sources and consequences of ITV in movement behaviour. In the general discussion, I consolidate the findings of the core chapters and critically discuss their respective value and, if applicable, their impact. Furthermore, I emphasise promising avenues for further research. N2 - Die Variation von Merkmalen durchdringt und beeinflusst alle Ebenen der biologischen Organisation, von Individuen bis hin zu Artgemeinschaften. Dennoch wird die intraspezifische Merkmalsvariation (ITV) in vielen ökologischen Theorien nicht ausreichend berücksichtigt. Stattdessen wird oft von Durchschnittswerten der Arten ausgegangen. Insbesondere ITV im Verhalten hat erst in jüngster Zeit mehr Aufmerksamkeit erfahren, als dessen Verbreitung und Ausmaß deutlich wurden. Der Anstieg des Interesses an ITV im Verhalten ging mit einem methodischen und technologischen Sprung auf dem Gebiet der Bewegungsökologie einher. Viele Aspekte des Verhaltens werden durch die Bewegung sichtbar und ermöglichen es uns, interindividuelle Unterschiede bei grundlegenden Prozessen wie Nahrungssuche, Partnersuche, Räuber-Beute-Beziehungen oder Migration zu beobachten. ITV im Bewegungsverhalten kann aus intraindividueller Variabilität und konsistenten, wiederholbaren Unterschieden zwischen einzelnen Individuen resultieren. Die Fragen, weshalb solche Unterschiede interindividuellen Unterschiede überhaupt auftreten und wie sie mit der Lebensgeschichte ("life-history") zusammenhängen, sind jedoch bislang ungeklärt. Darüber hinaus sind die Folgen von ITV, insbesondere von individuellen Unterschieden im Bewegungsverhalten, für Populationen und Artengemeinschaften nicht ausreichend bekannt. In meiner Dissertation gehe ich aktuellen Fragen zu den Quellen und Folgen von ITV, insbesondere im Bewegungsverhalten, nach. Nach einer Darstellung grundlegender Konzepte und des aktuellen Wissensstandes nähere ich mich diesen Fragen mit Hilfe agentenbasierter Modelle, um Konzepte aus der Verhaltens- und Bewegungsökologie zu integrieren und neue Perspektiven zu entwickeln. Die moderne Koexistenztheorie ist ein zentraler Pfeiler der Gemeinschaftsökologie, berücksichtigt aber ITV im Verhalten nur unzureichend. In Kapitel 2 modelliere ich ein System zweiter konkurrierender, bodenbewohnender Arten mit zentralisierten Streifgebieten, um die Folgen von Unterschieden im Bewegungsverhalten zwischen Individuen auf die Koexistenz der Arten zu untersuchen. Ich zeige, dass die simulierten interindividuellen Unterschiede, die mit empirischen Daten übereinstimmen, die Fitnessunterschiede zwischen den Arten verringern, d. h. einen ausgleichenden Koexistenzmechanismus darstellen. Darüber hinaus erkläre ich dieses Ergebnis mechanistisch und löse damit eine scheinbare Zweideutigkeit der in früheren Studien beschriebenen Folgen von ITV auf die Koexistenz von Arten auf. In Kapitel 3 richte ich den Fokus auf die Quellen individueller Unterschiede im Bewegungsverhalten und deren mögliche Integration in die Lebensgeschichte. Die Theorie des "pace-of-life" Syndroms (POLS) sagt voraus, dass die Kovariation zwischen individuellen Unterschieden im Verhalten und der Lebensgeschichte durch einen Zielkonflikt zwischen früher und später Reproduktion vermittelt wird. Diese Theorie hat viel Aufmerksamkeit erregt, wird aber derzeit auch kritisch betrachtet. In Kapitel 3 stelle ich ein Modell vor, das Hypothesen einer neuere konzeptionelle Entwicklung stützt, die eine fluktuierende, dichteabhängige Selektion als Ursache des POLS nahelegt. Ich habe jedoch auch Prozesse identifiziert, die den Zusammenhang zwischen Bewegungsverhalten und Lebensgeschichte auf verschiedenen Ebenen der biologischen Organisation verändern können. ITV kann Populationen puffern, d. h. ihr Aussterberisiko verringern. So können beispielsweise Unterschiede zwischen Individuen Portfolioeffekte vermitteln oder die Fähigkeit zur Anpassung erhöhen und damit etwa eine schnelle Evolution erleichtern, die das Aussterberisiko verringern kann. In Kapitel 4 gebe ich einen Überblick über ITV, Umweltheterogenität und dichteabhängige Prozesse, die lokale Puffermechanismen darstellen. Angesichts der Isolierung von Lebensräumen, die die Konnektivität zwischen Populationen verringert, können lokale Puffermechanismen im Vergleich zu ausbreitungsbedingten regionalen Puffermechanismen an Bedeutung gewinnen. In diesem Kapitel argumentiere ich, dass Kapazitäten, Latenzen und Interaktionen lokaler Puffermechanismen zu einer prozessbasierten und ganzheitlichen Integration lokaler Puffermechanismen in theoretischen und empirischen Studien motivieren sollten. Neuere konzeptionelle Einsichten legen nahe, dass Prinzipien aus der Bewegungs- und Gemeinschaftsökologie auf die Untersuchung filamentöser Pilze angewendet können. In diesem Zusammenhang ist es eine offene Frage, ob und wie die Anordnung und Geometrie von Mikrostrukturen für bestimmte Bewegungseigenschaften selektieren und damit eine koexistenzstabilisierende Nischenaufteilung erleichtern. Als Koautor von Kapitel 5 habe ich ein agentenbasiertes Modell der Hyphenspitzen entwickelt. In diesem Modell navigieren die Hyphenspitzen in bodenähnlichen Mikrostrukturen entlang eines Gradienten der Bodenporosität. Durch die Messung von Netzwerkeigenschaften konnten wir Veränderungen des optimalen Bewegungsverhaltens entlang des Gradienten feststellen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Bodenarchitektur eine ökologische Nische mit verschiedenen Bewegungsoptima darstellt. Die Hauptkapitel werden von einer allgemeinen Einführung und einer Diskussion eingerahmt. In der allgemeinen Einführung umreiße ich die grundlegenden Konzepte der Bewegungsökologie und beschreibe die Theorie und die offenen Fragen zu den Ursachen und Folgen von ITV im Bewegungsverhalten. In der allgemeinen Diskussion fasse ich die Ergebnisse der Kernkapitel zusammen und diskutiere kritisch ihren jeweiligen Wert und gegebenenfalls ihre Auswirkungen. Darüber hinaus zeige ich vielversprechende Wege für künftige Forschungsarbeiten auf. KW - ecology KW - movement ecology KW - agent-based model KW - intraspecific variation KW - species coexistence KW - pace-of-life syndrome KW - population persistence KW - Ökologie KW - Bewegungsökologie KW - Agentenbasierte Modelle KW - Intraspezifische Variation KW - Koexistenz KW - Pace-of-Life Syndrom KW - Populationspersistenz Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-565011 ER - TY - THES A1 - Kürschner, Tobias T1 - Disease transmission and persistence in dynamic landscapes T1 - Krankheitsübertragung und Persistenz in dynamischen Landschaft N2 - Infectious diseases are an increasing threat to biodiversity and human health. Therefore, developing a general understanding of the drivers shaping host-pathogen dynamics is of key importance in both ecological and epidemiological research. Disease dynamics are driven by a variety of interacting processes such as individual host behaviour, spatiotemporal resource availability or pathogen traits like virulence and transmission. External drivers such as global change may modify the system conditions and, thus, the disease dynamics. Despite their importance, many of these drivers are often simplified and aggregated in epidemiological models and the interactions among multiple drivers are neglected. In my thesis, I investigate disease dynamics using a mechanistic approach that includes both bottom-up effects - from landscape dynamics to individual movement behaviour - as well as top-down effects - from pathogen virulence on host density and contact rates. To this end, I extended an established spatially explicit individual-based model that simulates epidemiological and ecological processes stochastically, to incorporate a dynamic resource landscape that can be shifted away from the timing of host population-dynamics (chapter 2). I also added the evolution of pathogen virulence along a theoretical virulence-transmission trade-off (chapter 3). In chapter 2, I focus on bottom-up effects, specifically how a temporal shift of resource availability away from the timing of biological events of host-species - as expected under global change - scales up to host-pathogen interactions and disease dynamics. My results show that the formation of temporary disease hotspots in combination with directed individual movement acted as key drivers for pathogen persistence even under highly unfavourable conditions for the host. Even with drivers like global change further increasing the likelihood of unfavourable interactions between host species and their environment, pathogens can continue to persist with heir hosts. In chapter 3, I demonstrate that the top-down effect caused by pathogen-associated mortality on its host population can be mitigated by selection for lower virulent pathogen strains when host densities are reduced through mismatches between seasonal resource availability and host life-history events. I chapter 4, I combined parts of both theoretical models into a new model that includes individual host movement decisions and the evolution of pathogenic virulence to simulate pathogen outbreaks in realistic landscapes. I was able to match simulated patterns of pathogen spread to observed patterns from long-term outbreak data of classical swine fever in wild boar in Northern Germany. The observed disease course was best explained by a simulated high virulent strain, whereas sampling schemes and vaccination campaigns could explain differences in the age-distribution of infected hosts. My model helps to understand and disentangle how the combination of individual decision making and evolution of virulence can act as important drivers of pathogen spread and persistence. As I show across the chapters of this thesis, the interplay of both bottom-up and top-down processes is a key driver of disease dynamics in spatially structured host populations, as they ultimately shape host densities and contact rates among moving individuals. My findings are an important step towards a paradigm shift in disease ecology away from simplified assumptions towards the inclusion of mechanisms, such as complex multi-trophic interactions, and their feedbacks on pathogen spread and disease persistence. The mechanisms presented here should be at the core of realistic predictive and preventive epidemiological models. N2 - Infektionskrankheiten stellen eine zunehmende Bedrohung für die biologische Vielfalt und die menschliche Gesundheit dar. Daher ist es sowohl für die epidemiologische als auch für die ökologische Forschung von zentraler Bedeutung, ein allgemeines Verständnis der Mechanismen, die die Wirts-Pathogen-Dynamik beeinflussen, zu entwickeln. Die Krankheitsausbrüche werden durch eine Vielzahl von interagierenden Prozessen angetrieben, wie unter anderem individuellem Wirtsverhalten, Ressourcenverfügbarkeit oder Erregermerkmale wie Virulenz. Externe Faktoren wie der globale Wandel können grundlegende Veränderungen dieser Prozesse verursachen und sich damit auch auf Krankheitsdynamiken auswirken. Trotz ihrer Bedeutung für Krankheitsausbrüche werden viele dieser Faktoren in epidemiologischen Modellen oft vereinfacht und die Wechselwirkungen zwischen den Faktoren vernachlässigt. In Anbetracht dessen, ist es sowohl für die ökologische als auch für die epidemiologische Forschung von zentraler Bedeutung, ein allgemeines Verständnis dafür zu entwickeln, wie mehrere interagierende Prozesse Wirts-Pathogen-Interaktionen beeinflussen können. In meiner Dissertation untersuche ich die Krankheitsdynamik mittels eines mechanistischen Ansatzes, der sowohl Bottom-up-Effekte - von der Landschaftsdynamik bis zum individuellen Bewegungsverhalten - als auch Top-down-Effekte - von der Virulenz des Erregers auf die Wirtsdichte und die Kontaktraten - berücksichtigt. Zu diesem Zweck habe ich ein etabliertes, räumlich explizites, Individuen basiertes Modell, das epidemiologische und ökologische Prozesse stochastisch simuliert, um eine dynamische Ressourcenlandschaft erweitert, die zeitlich mit der Populationsdynamik der Wirte verschoben werden kann (Kapitel 2). Zusätzlich habe ich die Evolution der Virulenz von Krankheitserregern entlang eines theoretischen Verhältnisses zwischen Virulenz und Übertragung hinzugefügt (Kapitel 3). In Kapitel 2 konzentriere ich mich auf Bottom-up-Effekte, insbesondere auf die Frage, wie sich eine zeitliche Verschiebung der Ressourcenverfügbarkeit weg vom Zeitpunkt biologischer Ereignisse der Wirtsarten - wie sie im Rahmen des globalen Wandels erwartet wird - auf die Wirt-Pathogen-Interaktionen und Krankheitsdynamiken auswirkt. Meine Ergebnisse zeigen, dass die Bildung vorübergehender Krankheitsherde in Kombination mit gezielter individueller Wirtsbewegung als Schlüsselfaktoren für die Persistenz von Krankheitserregern selbst unter äußerst ungünstigen Bedingungen für den Wirt fungieren. Selbst wenn Faktoren wie der globale Wandel die Wahrscheinlichkeit ungünstiger Wechselwirkungen zwischen Wirtsarten und ihrer Umwelt weiter erhöhen, können Krankheitserreger weiterhin in ihren Wirten persistieren. In Kapitel 3 zeige ich, dass der Top-Down-Effekt, der durch die pathogen-assoziierte Mortalität verursacht wird, durch eine evolutionäre Selektion auf weniger virulente Erregerstämme abgeschwächt werden kann, wenn die Wirtsdichte durch eine zeitliche Verschiebung von saisonaler Ressourcenverfügbarkeit und dem Zeitpunkt von biologischen Ereignissen der Wirtsarten reduziert wird. In Kapitel 4 habe ich Teile der beiden theoretischen Modelle zu einem neuen Modell kombiniert, das individuelle Wirtsbewegungen und die Entwicklung der Virulenz von Krankheitserregern einbezieht, um Ausbrüche von Krankheitserregern in realistischen Landschaften zu simulieren. Es gelang mir, die simulierten Muster der Krankheitsausbreitung mit beobachteten Mustern von Langzeitausbrüchen der klassischen Schweinepest in Wildschweinen in Norddeutschland abzugleichen. Der beobachtete Krankheitsverlauf ließ sich am besten durch einen simulierten hochvirulenten Stamm erklären, während das Design der Probenentnahmen und Impfkampagnen Unterschiede in der Altersverteilung der infizierten Wirte erklären könnten. Mein Modell trägt dazu bei, zu verstehen, wie die Kombination aus individueller Bewegung und der Evolution von Virulenz als wichtige Treiber für die Ausbreitung und Persistenz des Erregers wirken können. Wie ich in den Kapiteln dieser Arbeit zeige, ist das Zusammenspiel von Bottom-up- und Top-down-Prozessen ein entscheidender Faktor für die Krankheitsdynamik in Wirtspopulationen, da sie letztlich die Wirtsdichte und den Kontakt zwischen sich bewegenden Individuen bestimmen. Meine Ergebnisse sind ein wichtiger Schritt auf dem Weg zu einem Paradigmenwechsel in der Krankheitsökologie, weg von vereinfachten Annahmen hin zur Einbeziehung von komplexen Interaktionen und deren Rückkopplungen auf die Ausbreitung und Persistenz von Krankheitserregern. Die hier vorgestellten Mechanismen sollten den Kern realistischer Vorhersage- und Präventivmodelle für die Epidemiologie bilden. KW - disease ecology KW - movement ecology KW - Krankheitsökologie KW - Bewegungsökologie Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-564689 ER - TY - THES A1 - Hu, Changqiong T1 - Characterization of the role of stress - responsive NAC transcription factors ANAC055 and ATAF1 Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Folikumah, Makafui Yao T1 - Stimuli-promoted in situ formation of hydrogels with thiol/thioester containing peptide precursors T1 - Stimuli-induzierte In-Situ-Bildung von Hydrogelen durch Peptid-Prekursor mit Thiol/Thioestergruppen N2 - Hydrogels are potential synthetic ECM-like substitutes since they provide functional and structural similarities compared to soft tissues. They can be prepared by crosslinking of macromolecules or by polymerizing suitable precursors. The crosslinks are not necessarily covalent bonds, but could also be formed by physical interactions such as π-π interactions, hydrophobic interactions, or H-bonding. On demand in situ forming hydrogels have garnered increased interest especially for biomedical applications over preformed gels due to the relative ease of in vivo delivery and filling of cavities. The thiol-Michael addition reaction provides a straightforward and robust strategy for in situ gel formation with its fast reaction kinetics and ability to proceed under physiological conditions. The incorporation of a trigger function into a crosslinking system becomes even more interesting since gelling can be controlled with stimulus of choice. The use of small molar mass crosslinker precursors with active groups orthogonal to thiol-Michael reaction type electrophile provides the opportunity to implement an on-demand in situ crosslinking without compromising the fast reaction kinetics. It was postulated that short peptide sequences due to the broad range structural-function relations available with the different constituent amino acids, can be exploited for the realisation of stimuli-promoted in situ covalent crosslinking and gelation applications. The advantages of this system over conventional polymer-polymer hydrogel systems are the ability tune and predict material property at the molecular level. The main aim of this work was to develop a simplified and biologically-friendly stimuli-promoted in situ crosslinking and hydrogelation system using peptide mimetics as latent crosslinkers. The approach aims at using a single thiodepsipeptide sequence to achieve separate pH- and enzyme-promoted gelation systems with little modification to the thiodepsipeptide sequence. The realization of this aim required the completion of three milestones. In the first place, after deciding on the thiol-Michael reaction as an effective in situ crosslinking strategy, a thiodepsipeptide, Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-NEtSH (TDP) with expected propensity towards pH-dependent thiol-thioester exchange (TTE) activation, was proposed as a suitable crosslinker precursor for pH-promoted gelation system. Prior to the synthesis of the proposed peptide-mimetic, knowledge of the thiol-Michael reactivity of the would-be activated thiol moiety SH-Leu, which is internally embedded in the thiodepsipeptide was required. In line with pKa requirements for a successful TTE, the reactivity of a more acidic thiol, SH-Phe was also investigated to aid the selection of the best thiol to be incorporated in the thioester bearing peptide based crosslinker precursor. Using ‘pseudo’ 2D-NMR investigations, it was found that only reactions involving SH-Leu yielded the expected thiol-Michael product, an observation that was attributed to the steric hindrance of the bulkier nature of SH-Phe. The fast reaction rates and complete acrylate/maleimide conversion obtained with SH-Leu at pH 7.2 and higher aided the direct elimination of SH-Phe as a potential thiol for the synthesis of the peptide mimetic. Based on the initial studies, for the pH-promoted gelation system, the proposed Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-NEtSH was kept unmodified. The subtle difference in pKa values between SH-Leu (thioester thiol) and the terminal cysteamine thiol from theoretical conditions should be enough to effect a ‘pseudo’ intramolecular TTE. In polar protic solvents and under basic aqueous conditions, TDP successfully undergoes a ‘pseudo’ intramolecular TTE reaction to yield an α,ω-dithiol tripeptide, HSLeu-Leu-Gly-NEtSH. The pH dependence of thiolate ion generation by the cysteamine thiol aided the incorporation of the needed stimulus (pH) for the overall success of TTE (activation step) – thiol-Michael addition (crosslinking) strategy. Secondly, with potential biomedical applications in focus, the susceptibility of TDP, like other thioesters, to intermolecular TTE reaction was probed with a group of thiols of varying thiol pKa values, since biological milieu characteristically contain peptide/protein thiols. L-cysteine, which is a biologically relevant thiol, and a small molecular weight thiol, methylthioglycolate both with relatively similar thiol pKa, values, led to an increase concentration of the dithiol crosslinker when reacted with TDP. In the presence of acidic thiols (p-NTP and 4MBA), a decrease in the dithiol concentration was observed, an observation that can be attributed to the inability of the TTE tetrahedral intermediate to dissociate into exchange products and is in line with pKa requirements for successful TTE reaction. These results additionally makes TDP more attractive and the potentially the first crosslinker precursor for applications in biologically relevant media. Finally, the ability of TDP to promote pH-sensitive in situ gel formation was probed with maleimide functionalized 4-arm polyethylene glycol polymers in tris-buffered media of varying pHs. When a 1:1 thiol: maleimide molar ratio was used, TDP-PEG4MAL hydrogels formed within 3, 12 and 24 hours at pH values of 8.5, 8.0 and 7.5 respectively. However, gelation times of 3, 5 and 30 mins were observed for the same pH trend when the thiol: maleimide molar was increased to 2:1. A direct correlation of thiol content with G’ of the gels at each pH could also be drawn by comparing gels with thiol: maleimide ratios of 1:1 to those with 2:1 thiol: maleimide mole ratios. This is supported by the fact that the storage modulus (G') is linearly dependent on the crosslinking density of the polymer. The values of initial G′ for all gels ranged between (200 – 5000 Pa), which falls in the range of elasticities of certain tissue microenvironments for example brain tissue 200 – 1000 Pa and adipose tissue (2500 – 3500 Pa). Knowledge so far gained from the study on the ability to design and tune the exchange reaction of thioester containing peptide mimetic will give those working in the field further insight into the development of new sequences tailored towards specific applications. TTE substrate design using peptide mimetic as presented in this work has revealed interesting new insights considering the state-of-the-art. Using the results obtained as reference, the strategy provides a possibility to extend the concept to the controlled delivery of active molecules needed for other robust and high yielding crosslinking reactions for biomedical applications. Application for this sequentially coupled functional system could be seen e.g. in the treatment of inflamed tissues associated with urinary tract like bladder infections for which pH levels above 7 were reported. By the inclusion of cell adhesion peptide motifs, the hydrogel network formed at this pH could act as a new support layer for the healing of damage epithelium as shown in interfacial gel formation experiments using TDP and PEG4MAL droplets. The versatility of the thiodepsipeptide sequence, Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-(TDPo) was extended for the design and synthesis of a MMP-sensitive 4-arm PEG-TDPo conjugate. The purported cleavage of TDPo at the Gly-SLeu bond yields active thiol units for subsequent reaction of orthogonal Michael acceptor moieties. One of the advantages of stimuli-promoted in situ crosslinking systems using short peptides should be the ease of design of required peptide molecules due to the predictability of peptide functions their sequence structure. Consequently the functionalisation of a 4-arm PEG core with the collagenase active TDPo sequence yielded an MMP-sensitive 4-arm thiodepsipeptide-PEG conjugate (PEG4TDPo) substrate. Cleavage studies using thiol flourometric assay in the presence of MMPs -2 and -9 confirmed the susceptibility of PEG4TDPo towards these enzymes. The resulting time-dependent increase in fluorescence intensity in the presence of thiol assay signifies the successful cleavage of TDPo at the Gly-SLeu bond as expected. It was observed that the cleavage studies with thiol flourometric assay introduces a sigmoid non-Michaelis-Menten type kinetic profile, hence making it difficult to accurately determine the enzyme cycling parameters, kcat and KM . Gelation studies with PEG4MAL at 10 % wt. concentrations revealed faster gelation with MMP-2 than MMP-9 with 28 and 40 min gelation times respectively. Possible contributions by hydrolytic cleavage of PEG4TDPo has resulted in the gelation of PEG4MAL blank samples but only after 60 minutes of reaction. From theoretical considerations, the simultaneous gelation reaction would be expected to more negatively impact the enzymatic than hydrolytic cleavage. The exact contributions from hydrolytic cleavage of PEG4TDPo would however require additional studies. In summary this new and simplified in situ crosslinking system using peptide-based crosslinker precursors with tuneable properties exhibited in situ crosslinking gelation kinetics on similar levels with already active dithiols reported. The advantageous on-demand functionality associated with its pH-sensitivity and physiological compatibility makes it a strong candidate worth further research as biomedical applications in general and on-demand material synthesis is concerned. Results from MMP-promoted gelation system unveils a simple but unexplored approach for in situ synthesis of covalently crosslinked soft materials, that could lead to the development of an alternative pathway in addressing cancer metastasis by making use of MMP overexpression as a trigger. This goal has so far not being reach with MMP inhibitors despite the extensive work this regard. N2 - Hydrogele sind synthetische, potenziell ECM-ähnliche Substituenten, die funktionelle und strukturelle Ähnlichkeiten mit Weichteilgeweben aufweisen. Sie können durch Vernetzung von Makromolekülen oder durch Polymerisation geeigneter Precursoren hergestellt werden. Die Vernetzungen müssen nicht unbedingt aus kovalenten Bindungen bestehen, sondern können auch durch physikalische Wechselwirkungen wie π-π-Wechselwirkungen, hydrophoben Wechselwirkungen oder Wasserstoff-Brückenbindungen entstehen. In-situ-Hydrogele, die on-demand gebildet werden, haben vor allem für biomedizinische Anwendungen gegenüber vorgefertigten Gelen zunehmend an Interesse gewonnen, da sie relativ einfach in-vivo eingebracht und somit Fehlstellen gefüllt werden können. Die Thiol-Michael-Additionsreaktion bietet mit ihrer schnellen Reaktionskinetik und ihrer Fähigkeit, unter physiologischen Bedingungen abzulaufen, eine unkomplizierte und robuste Strategie für die in-situ-Gelbildung. Der Einbau einer Triggerfunktion in ein Vernetzungssystem ist besonders interessant, da die Gelierung durch einen gewählten Stimulus gesteuert werden kann. Die Verwendung eines Precursors mit geringer Molmasse und aktiven Gruppen, die orthogonal zu den Elektrophilen des Thiol-Michael-Reaktionstyps sind, bietet die Möglichkeit, eine bedarfsgesteuerte in-situ-Vernetzung zu realisieren, ohne die schnelle Reaktionskinetik zu beeinträchtigen. Es wurde postuliert, dass kurze Peptidsequenzen aufgrund der weitreichenden Struktur-Funktions-Beziehungen, die mit den verschiedenen konstituierenden Aminosäuren zur Verfügung stehen, für die Realisierung von Stimulus-ausgelösten, in-situ kovalenten Vernetzungs- und Gelierungsanwendungen genutzt werden können. Die Vorteile dieses Systems gegenüber herkömmlichen Polymer-Polymer-Hydrogelsystemen liegen in der Möglichkeit, die Materialeigenschaften auf molekularer Ebene zu justieren und vorherzusagen. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines vereinfachten und biologisch-geeigneten, stimulierungsgeförderten in-situ-Vernetzungs- und Hydrogelierungssystems unter Verwendung von Peptidmimetika als latente Vernetzer. Der Ansatz zielt darauf ab, eine einzige Thiodepsipeptidsequenz zu verwenden, um getrennte pH- und enzymausgelöste Gelierungssysteme mit geringen Modifikationen der Thiodepsipeptidsequenz zu erreichen. Zur Verwirklichung dieses Ziels, mussten drei Meilensteine erreicht werden. Nach der Wahl der Thiol-Michael-Reaktion als in-situ-Vernetzungsstrategie, musste ein Thiodepsipeptid, Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-NEtSH (TDP) mit einer zu erwartenden Neigung zu einer pH-abhängigen Thiol-Thioester-Austausch-Aktivierung (TTE), als geeignetem Vernetzer-Precursor für das pH-unterstützte Gelierungssystem designt werden. Vor der Synthese dieses Peptid-Mimetikums war die Untersuchung der Thiol-Michael-Reaktivität der potenziell aktivierten Thiolkomponente SH-Leu erforderlich, die intern in das Thiodepsipeptid eingebettet ist. In Übereinstimmung mit den pKa-Anforderungen für eine erfolgreiche TTE wurde auch die Reaktivität eines saureren Thiols, SH-Phe, untersucht, um die Auswahl des besten Thiols zu ermöglichen, das in den Thioester-tragenden Peptid-basierten Vernetzer-Precursor eingebaut werden sollte. Pseudo-2D-NMR-Untersuchungen zeigten, dass nur Reaktionen mit SH-Leu das erwartete Thiol-Michael-Produkt ergaben, eine Beobachtung, die auf die sterische Hinderung durch die sperrige Natur von SH-Phe zurückzuführen ist. Wegen der schnellen Reaktionsgeschwindigkeiten und der vollständigen Acrylat/Maleimid-Umwandlung, die mit SH-Leu bei einem pH-Wert von 7,2 und höher erzielt wurde, kam SH-Phe als potenzielles Thiol für die Synthese des Peptidmimetikums nicht mehr infrage. Auf der Grundlage der ersten Studien wurde für das pH-basierte Gelierungssystem das vorgeschlagene Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-NEtSH unverändert beibehalten. Der geringe Unterschied in den pKa-Werten zwischen SH-Leu (Thioesterthiol) und dem terminalen Cysteaminthiol sollte ausreichen, um eine "pseudo"-intramolekulare TTE zu bewirken. In polaren protischen Lösungsmitteln und unter basischen wässrigen Bedingungen verläuft die "pseudo"-intramolekulare TTE-Reaktion bei TDP erfolgreich, bei der ein α,ω-Dithiol-Tripeptid, HSLeu-Leu-Gly-NEtSH, entsteht. Die pH-Abhängigkeit der Thiolat-Ionen-Generierung durch das Cysteamin-Thiol trug dazu bei, den notwendigen Stimulus (pH) für den Gesamterfolg der TTE (Aktivierungsschritt) - Thiol-Michael-Addition (Vernetzung) Strategie einzubauen. Zweitens wurde mit Blick auf potenzielle biomedizinische Anwendungen die Empfindlichkeit von TDP, wie auch anderer Thioester, für die intermolekulare TTE-Reaktion mit einer Gruppe von Thiolen mit unterschiedlichen Thiol-pKa-Werten untersucht, da biologische Milieus typischerweise Peptid-/Proteinthiole enthalten. L-Cystein, ein biologisch relevantes Thiol, und ein Thiol mit geringem Molekulargewicht, Methylthioglykolat, die beide relativ ähnliche Thiol-pKa-Werte besitzen, führten bei der Reaktion mit TDP zu einer erhöhten Konzentration des Dithiol-Vernetzers. In Gegenwart von sauren Thiolen (p-NTP und 4MBA) wurde eine Abnahme der Dithiolkonzentration beobachtet, eine Beobachtung, die auf die Unfähigkeit des tetraedrischen TTE-Zwischenprodukts in Austauschprodukte zu dissoziieren zurückgeführt werden kann und mit den pKa-Anforderungen für eine erfolgreiche TTE-Reaktion in Einklang steht. Diese Ergebnisse machen TDP noch attraktiver und zum potenziell ersten Vernetzer-Precursor für Anwendungen in biologisch relevanten Medien. Schließlich wurde die Fähigkeit von TDP, die pH-empfindliche in-situ-Gelbildung zu fördern, mit Maleimid-funktionalisierten 4-armigen Polyethylenglykolpolymeren in tris-gepufferten Medien mit unterschiedlichen pH-Werten untersucht. Bei einem Molverhältnis von 1:1 Thiol zu Maleimid bildeten sich TDP-PEG4MAL-Hydrogele innerhalb von 3, 12 und 24 Stunden bei pH-Werten von 8,5, 8,0 bzw. 7,5. Bei einer Erhöhung des Molverhältnisses von Thiol zu Maleimid auf 2:1 wurden jedoch Gelierzeiten von 3, 5 und 30 Minuten für denselben pH-Trend beobachtet. Ein direkter Zusammenhang zwischen dem Thiolgehalt und G' der Gele bei jedem pH-Wert konnte auch durch den Vergleich von Gelen mit einem Thiol/Maleimid-Molverhältnis von 1:1 mit solchen mit einem Thiol/Maleimid-Molverhältnis von 2:1 hergestellt werden. Dies wird durch die Tatsache unterstützt, dass der Speichermodulus (G') linear von der Vernetzungsdichte des Polymers abhängig ist. Die Werte des anfänglichen G′ für alle Gele lagen bei 200 - 5000 Pa, was in den Bereich der Elastizitäten bestimmter Gewebe-Mikroumgebungen fällt, z. B. Gehirngewebe (200 - 1000 Pa) und Fettgewebe (2500 - 3500 Pa). Die bisher aus der Studie gewonnenen Erkenntnisse über die Möglichkeit, die Austauschreaktion von Thioester-haltigen Peptidmimetika zu entwerfen und abzustimmen, geben weitere Einblicke in die Entwicklung neuer, auf spezifische Anwendungen zugeschnittener Sequenzen. Das Design von TTE-Substraten unter Verwendung von Peptidmimetika, wie es in dieser Arbeit vorgestellt wurde, hat interessante neue Erkenntnisse im Hinblick auf den Stand der Technik gebracht. Mit den erzielten Ergebnissen als Basis bietet die Strategie die Möglichkeit, das Konzept auf die kontrollierte Freisetzung aktiver Moleküle zu erweitern, die für andere robuste Vernetzungsreaktionen mit hohem Umsatz für biomedizinische Anwendungen benötigt werden. Dieses sequentiell gekoppelte funktionelle System könnte z. B. bei der Behandlung von entzündetem Gewebe im Zusammenhang mit Harnwegsinfektionen wie Blasenentzündungen eingesetzt werden, für die pH-Werte über 7 berichtet wurden. Durch die Einbeziehung von Zelladhäsionspeptidmotiven könnte das bei diesem pH-Wert gebildete Hydrogelnetz als neue Stützschicht für die Heilung von geschädigtem Epithel fungieren, wie in Experimenten zur Bildung von Grenzflächengelen mit TDP- und PEG4MAL-Tropfen gezeigt wurde. Die Vielseitigkeit der Thiodepsipeptidsequenz Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-(TDPo) wurde um Design und die Synthese eines MMP-empfindlichen 4-armigen PEG-TDPo-Konjugats erweitert. Die beabsichtigte Spaltung von TDPo an der Gly-SLeu-Bindung liefert aktive Thiol-Einheiten für die anschließende Reaktion orthogonaler Michael-Akzeptor-Einheiten. Einer der Vorteile stimulierungsgestützter in-situ-Vernetzungssysteme unter Verwendung kurzer Peptide dürfte darin liegen, dass sich die erforderlichen Peptidmoleküle aufgrund der Vorhersagbarkeit der Peptidfunktionen und ihrer Sequenzstruktur leicht entwerfen lassen. Die Funktionalisierung eines vierarmigen PEG-Kerns mit der kollagenaseaktiven TDPo-Sequenz führte zu einem MMP-empfindlichen vierarmigen Thiodepsipeptid-PEG-Konjugat (PEG4TDPo). Spaltungs-Studien unter Verwendung eines thiolfluorimetrischen Assays in Gegenwart der MMPs -2 und -9 bestätigten die Spaltbarkeit von PEG4TDPo durch diese Enzyme. Der daraus resultierende zeitabhängige Anstieg der Fluoreszenzintensität in Anwesenheit des Thiol-Assays deutet auf die erfolgreiche Spaltung von TDPo an der Gly-SLeu-Bindung hin. Es wurde festgestellt, dass die Spaltungsstudien mit dem thiol-fluorimetrischen Assay ein sigmoides, nicht-Michaelis-Menten-artiges kinetisches Profil ergeben, was eine genaue Bestimmung der Enzymzyklusparameter, kcat und KM, erschwert. Gelierungsstudien mit PEG4MAL in einer Konzentration von 10 Gew.-% ergaben eine schnellere Gelierung mit MMP-2 als mit MMP-9 mit Gelierungszeiten von 28 bzw. 40 Minuten. Eventuelle Beiträge durch hydrolytische Spaltung von PEG4TDPo an der Gelierung wurden an PEG4MAL-Blindproben untersucht und führten erst nach 60 Minuten Reaktionszeit zu einer Gelierung. Aus theoretischen Überlegungen heraus wäre zu erwarten, dass sich die gleichzeitige Gelierungsreaktion negativer auf die enzymatische als auf die hydrolytische Spaltung auswirkt. Genaues zum Beitrag der hydrolytischen Spaltung von PEG4TDPo bedürfte jedoch weiterer Untersuchungen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses neue in-situ-Vernetzungssystem, bei dem Peptid-basierte Vernetzungs-Precursor mit einstellbaren Eigenschaften verwendet werden, eine in-situ-Vernetzungs-Gelierungskinetik auf ähnlichem Niveau wie bei bereits berichteten aktiven Dithiole aufweist. Die vorteilhafte On-Demand-Funktionalität in Verbindung mit ihrer pH-Sensitivität und physiologischen Verträglichkeit macht sie zu einem interessanten Kandidaten für weitere Forschungen im Bereich biomedizinischer Anwendungen im Allgemeinen und der On-Demand-Materialsynthese. Die Ergebnisse des MMP-geförderten Gelierungssystems weisen einen einfachen, aber unerforschten Ansatz für die in-situ-Synthese kovalent vernetzter weicher Materialien, der zur Entwicklung eines alternativen Weges zur Bekämpfung der Krebsmetastasierung führen könnte, indem er die MMP-Überexpression als Auslöser nutzt. Mit MMP-Inhibitoren wurde dieses Ziel trotz umfangreicher Arbeiten in dieser Hinsicht bisher nicht erreicht. KW - hydrogels KW - stimuli KW - peptide KW - thioester KW - crosslinker KW - Hydrogele KW - Vernetzer KW - Peptid KW - Thioester KW - Stimuli Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-569713 ER - TY - THES A1 - Kahl, Sandra T1 - Evolutionary adaptive responses to rapid climate change in plants T1 - Evolutionäre Anpassungsstrategien von Pflanzen an den Klimawandel BT - a case study of the widely distributed species Silene vulgaris BT - ein Fallbeispiel der weit verbreiteten Art Silene vulgaris N2 - The ongoing climate change is altering the living conditions for many organisms on this planet at an unprecedented pace. Hence, it is crucial for the survival of species to adapt to these changing conditions. In this dissertation Silene vulgaris is used as a model organism to understand the adaption strategies of widely distributed plant species to the current climate change. Especially plant species that possess a wide geographic range are expected to have a high phenotypic plasticity or to show genetic differentiation in response to the different climate conditions they grow in. However, they are often underrepresented in research. In the greenhouse experiment presented in this thesis, I examined the phenotypic responses and plasticity in S. vulgaris to estimate its’ adaptation potential. Seeds from 25 wild European populations were collected along a latitudinal gradient and grown in a greenhouse under three different precipitation (65 mm, 75 mm, 90 mm) and two different temperature regimes (18°C, 21°C) that resembled a possible climate change scenario for central Europe. Afterwards different biomass and fecundity-related plant traits were measured. The treatments significantly influenced the plants but did not reveal a latitudinal difference in response to climate treatments for most plant traits. The number of flowers per individual however, showed a stronger plasticity in northern European populations (e.g., Swedish populations) where numbers decreased more drastically with increased temperature and decreased precipitation. To gain an even deeper understanding of the adaptation of S. vulgaris to climate change it is also important to reveal the underlying phylogeny of the sampled populations. Therefore, I analysed their population genetic structure through whole genome sequencing via ddRAD. The sequencing revealed three major genetic clusters in the S. vulgaris populations sampled in Europe: one cluster comprised Southern European populations, one cluster Western European populations and another cluster contained central European populations. A following analysis of experimental trait responses among the clusters to the climate-change scenario showed that the genetic clusters significantly differed in biomass-related traits and in the days to flowering. However, half of the traits showed parallel response patterns to the experimental climate-change scenario. In addition to the potential geographic and genetic adaptation differences to climate change this dissertation also deals with the response differences between the sexes in S. vulgaris. As a gynodioecious species populations of S. vulgaris consist of female and hermaphrodite individuals and the sexes can differ in their morphological traits which is known as sexual dimorphism. As climate change is becoming an important factor influencing plant morphology it remains unclear if and how different sexes may respond in sexually dimorphic species. To examine this question the sex of each individual plant was determined during the greenhouse experiment and the measured plant traits were analysed accordingly. In general, hermaphrodites had a higher number of flowers but a lower number of leaves than females. With regards to the climate change treatment, I found that hermaphrodites showed a milder negative response to higher temperatures in the number of flowers produced and in specific leaf area (SLA) compared to females. Synthesis – The significant treatment response in Silene vulgaris, independent of population origin in most traits suggests a high degree of universal phenotypic plasticity. Also, the three European intraspecific genetic lineages detected showed comparable parallel response patterns in half of the traits suggesting considerable phenotypic plasticity. Hence, plasticity might represent a possible adaptation strategy of this widely distributed species during ongoing and future climatic changes. The results on sexual dimorphism show that females and hermaphrodites are differing mainly in their number of flowers and females are affected more strongly by the experimental climate-change scenario. These results provide a solid knowledge basis on the sexual dimorphism in S. vulgaris under climate change, but further research is needed to determine the long-term impact on the breeding system for the species. In summary this dissertation provides a comprehensive insight into the adaptation mechanisms and consequences of a widely distributed and gynodioecious plant species and leverages our understanding of the impact of anthropogenic climate change on plants. N2 - Der derzeitige Klimawandel verändert die Lebensbedingungen für viele Tiere und Pflanzen auf unserem Planeten in nie da gewesenem Maße. Damit Arten überleben, ist es von besonderer Wichtigkeit, dass sich diese an die sich ändernden Klimabedingungen anpassen können. Die vorliegende Dissertation befasst sich mit der Modellpflanze Silene vulgaris und versucht zu ergründen, wie sich solch weit verbreitete Pflanzenarten an den Klimawandel anpassen. Dabei ist zu erwarten, dass sie eine hohe phänotypische Plastizität besitzen, durch die sie sich gut anpassen können oder, dass sie sich durch eine genetische Differenzierung als Antwort auf die vorherrschenden Umweltbedingungen auszeichnen. Im experimentellen Ansatz dieser Dissertation untersuchte ich daher die phänotypischen Anpassungen und die phänotypische Plastizität von S. vulgaris an ein mögliches Klimawandelszenario für Zentraleuropa. Dabei wurden die Samen von 25 europäischen Populationen gesammelt und in einem Gewächshausexperiment unter drei verschiedenen Niederschlagsbedingungen (65 mm, 75 mm, 90 mm) und zwei verschiedenen Temperaturbedingungen (18°C, 21°C) herangezogen. Im Anschluss wurden verschiedene Biomasse- und Fertilitätsmerkmale gemessen. Für ein tiefergehendes Verständnis der Anpassungsmöglichkeiten von S. vulgaris an den Klimawandel ist es zudem wichtig, auch die zugrundeliegende Phylogenie der Populationen zu verstehen. In diesem Zusammenhang nutzte ich eine genomweite Sequenziermethode mittels ddRAD. Die Bedingungen im Gewächshausexperiment beeinflussten die Pflanzen signifikant in ihren phänotypischen Merkmalen, jedoch ließ sich kein Unterschied zwischen Population unterschiedlicher Herkunft erkennen. Lediglich die Anzahl der Blüten zeigte eine größere Plastizität in nördlichen europäischen Populationen, wo sich die Blütenzahl stärker dezimierte unter höheren Temperaturen und stärkerer Trockenheit. Die populationsgenetische Analyse ergab drei distinkte phylogenetische Gruppen für die untersuchten europäischen Populationen von S. vulgaris: eine Gruppe beinhaltete südeuropäische Populationen aus Spanien und Südfrankreich, eine weitere Gruppe bestand aus den gesammelten Individuen der westfranzösischen Populationen, während die dritte Gruppe, die Populationen aus Mittel- und Nordeuropa enthielt. Diese genetischen Gruppen wurden anschließend ebenfalls der Merkmalsanalyse unter den Gewächshausbedingungen unterzogen. Dabei stellte sich heraus, dass sich die genetischen Gruppen in ihren phänotypischen Merkmalen unterschieden, jedoch eine ähnliche Anpassung ihrer Merkmale an die experimentellen Klimawandelbedingungen zeigten. Der dritte Aspekt dieser Dissertation befasste sich mit möglichen Anpassungsunterschieden zwischen den Geschlechtern in S. vulgaris. Als gynodiözische Art bestehen ihre Populationen sowohl aus weiblichen, also auch aus zwittrigen Individuen. Die phänotypischen Merkmale beider Geschlechter können sich dabei unterscheiden, was man als Sexualdimorphismus bezeichnet. Es ist bereits bekannt, dass sich Pflanzenmerkmale durch den anhaltenden Klimawandel bereits verändern, jedoch ist es nicht gut erforscht, ob und wie sich die unterschiedlichen Geschlechter bei einer sexuell dimorphen Art unter diesem Selektionsdruck verhalten. Während des Gewächshausexperiments wurden daher die Geschlechter der Individuen bestimmt und die phänotypischen Unterschiede zwischen weiblichen und zwittrigen Pflanzen analysiert. Allgemein lässt sich sagen, dass zwittrige Individuen mehr Blüten aber weniger Blätter hatten als weibliche. Im Hinblick auf die experimentellen Klimawandelbedingungen konnte ich zudem feststellen, dass Hermaphroditen in ihrer spezifischen Blattfläche und der Blütenanzahl weniger stark negativ auf höhere Temperaturen reagierten. Synthese – Die signifikanten Merkmalsanpassungen an die Gewächshausbedingungen waren unabhängig von der geographischen Herkunft oder genetischen Gruppe der Individuen. Dies lässt ein hohes Maß an universeller, phänotypischer Plastizität vermuten. Dementsprechend kann davon ausgegangen werden, dass phänotypische Plastizität ein möglicher Anpassungsmechanismus für diese weit verbreitete Art an den Klimawandel sein könnte. Im Hinblick auf den Sexualdimorphismus in S. vulgaris lässt sich sagen, dass sich beide Geschlechter vornehmlich in der Anzahl der Blüten unterscheiden und dass weibliche Pflanzen stärker von den Bedingungen des Gewächshausexperiments beeinflusst wurden. Diese Dissertation konnte damit erstmals darüber Aufschluss geben, wie sich S. vulgaris im Hinblick auf ihren Sexualdimorphismus unter Klimawandelbedingungen verhält. Weitere Forschung wird nun benötigt, um auch den Langzeiteffekt des Klimawandels auf das Fortpflanzungssystem dieser Art abschätzen zu können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorliegende Arbeit einen umfassenden Einblick in die Anpassungsmechanismen einer weit verbreiteten Pflanzenart an den anthropogenen Klimawandel gibt. Zudem bestärkt sie unser Verständnis der Auswirkungen, die sich daraus für eine gynodiözische Art, wie S. vulgaris ergeben. KW - Silene vulgaris KW - climate change KW - plant adaptation KW - Silene vulgaris KW - Klimawandel KW - Pflanzenanpassung Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-556483 ER - TY - THES A1 - Shen, Yawen T1 - Functional characterization of the gene regulatory network of C2H2-type zine finger protein ZAT8 in Arabidopsis thaliana Y1 - 2022 ER -