TY - THES A1 - Barbirz, Stefanie T1 - Konservierte Struktur bei genetischer Mosaizität : die Tailspike Proteine dreier Phagen der Familie Podviridae T1 - Tailspike proteins of three Podoviridae : genetic mosaics with conserved hreedimensional structure N2 - Die Tailspike Proteine (TSP) der Bakteriophagen P22, Sf6 und HK620 dienen der Erkennung von Kohlenhydratstrukturen auf ihren gram-negativen Wirtsbakterien und zeigen, von den ersten 110 Aminosäuren des N-Terminus abgesehen, keine Sequenzübereinstimmung. Mit Röntgenkristallstrukturanalyse konnte gezeigt werden, dass HK620TSP und Sf6TSP ebenfalls zu einer parallelen, rechtsgängigen beta-Helix falten, wie dies schon für P22TSP bekannt war. Die Kohlenhydratbindestelle ist bei Sf6TSP im Vergleich zu P22TSP zwischen die Untereinheiten verschoben. N2 - The bacteriophages P22, Sf6 and HK620 need their tailspike proteins (TSP) for recognition of surface carbohydrates on their gram-negative host bacteria. Sequence identity is completely lacking in their C-terminal 500 to 600 amino acids. The three TSP have the same fold, an oligomeric parallel beta-helix, as shown by crystal structure analyses of HK620TSP and Sf6TSP. Compared with P22TSP, the carbohydrate binding site of Sf6TSP is located at the interface between two monomers and not on a single monomer. KW - Bakteriophagen KW - Skleroproteine KW - Helix KW - Lipopolysaccharide KW - parallele beta-Helix KW - genetisches Mosaik KW - Tailspike KW - Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkung KW - parallel beta-helix KW - genetic mosaicism KW - tailspike KW - carbohydrate binding site Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-6885 ER - TY - THES A1 - Olszewska, Agata T1 - Forming magnetic chain with the help of biological organisms T1 - Die Bildung magnetischer Kettenstrukturen mit Hilfe biologischer Organismen N2 - Magnetite nanoparticles and their assembly comprise a new area of development for new technologies. The magnetic particles can interact and assemble in chains or networks. Magnetotactic bacteria are one of the most interesting microorganisms, in which the assembly of nanoparticles occurs. These microorganisms are a heterogeneous group of gram negative prokaryotes, which all show the production of special magnetic organelles called magnetosomes, consisting of a magnetic nanoparticle, either magnetite (Fe3O4) or greigite (Fe3S4), embedded in a membrane. The chain is assembled along an actin-like scaffold made of MamK protein, which makes the magnetosomes to arrange in mechanically stable chains. The chains work as a compass needle in order to allow cells to orient and swim along the magnetic field of the Earth. The formation of magnetosomes is known to be controlled at the molecular level. The physico–chemical conditions of the surrounding environment also influence biomineralization. The work presented in this manuscript aims to understand how such external conditions, in particular the extracellular oxidation reduction potential (ORP) influence magnetite formation in the strain Magnetospirillum magneticum AMB-1. A controlled cultivation of the microorganism was developed in a bioreactor and the formation of magnetosomes was characterized. Different techniques have been applied in order to characterize the amount of iron taken up by the bacteria and in consequence the size of magnetosomes produced at different ORP conditions. By comparison of iron uptake, morphology of bacteria, size and amount of magnetosomes per cell at different ORP, the formation of magnetosomes was inhibited at ORP 0 mV, whereas reduced conditions, ORP – 500 mV facilitate biomineralization process. Self-assembly of magnetosomes occurring in magnetotactic bacteria became an inspiration to learn from nature and to construct nanoparticles assemblies by using the bacteriophage M13 as a template. The M13 bacteriophage is an 800 nm long filament with encapsulated single-stranded DNA that has been recently used as a scaffold for nanoparticle assembly. I constructed two types of assemblies based on bacteriophages and magnetic nanoparticles. A chain – like assembly was first formed where magnetite nanoparticles are attached along the phage filament. A sperm – like construct was also built with a magnetic head and a tail formed by phage filament. The controlled assembly of magnetite nanoparticles on the phage template was possible due to two different mechanism of nanoparticle assembly. The first one was based on the electrostatic interactions between positively charged polyethylenimine coated magnetite nanoparticles and negatively charged phages. The second phage –nanoparticle assembly was achieved by bioengineered recognition sites. A mCherry protein is displayed on the phage and is was used as a linker to a red binding nanobody (RBP) that is fused to the one of the proteins surrounding the magnetite crystal of a magnetosome. Both assemblies were actuated in water by an external magnetic field showing their swimming behavior and potentially enabling further usage of such structures for medical applications. The speed of the phage - nanoparticles assemblies are relatively slow when compared to those of microswimmers previously published. However, only the largest phage-magnetite assemblies could be imaged and it is therefore still unclear how fast these structures can be in their smaller version. N2 - Magnetit-Nanopartikel (Fe3O4) und deren Anordnungen umfassen einen neuen Bereich in der Entwicklung neuer Technologien. Diese magnetischen Teilcheninteragieren miteinander und unter bestimmten Umständen lassen sie sich in Ketten anordnen. Magnetotaktische Bakterien stellen eine Gruppeinteressanter Mikroorganismen dar, in welchen ebendiese kettenförmige Anordnung von Nanopartikeln vorkommt. Diese Mikroorgansimen gehören zu einer heterogenen Gruppe an Gram negativen Prokaryoten, welche die Produktion von speziellen magnetischen Organellen, den sogenannten Magnetosomen, aufweist. Die Magnetosomen bestehen entweder aus Magnetit- oder Greigit (Fe3S4)- Nanopartikeln, welche in einer Membran eingebettet sind. Die Kette ist entlang eines Aktin ähnlichen Gerüstes angeordnet, welches aus dem Protein MamK besteht und dafür verantwortlich ist, dass sich die Magnetosomen in mechanisch stabilen Ketten arrangieren können. Diese Ketten fungieren als Kompass Nadeln und ermöglichen es den Zellen sich entlang des Magnetfeldes der Erde zuorientieren. Es ist bekannt, dass die Bildung der Magnetosomen auf molekularer Ebene kontrolliert wird. Die physiko-chemischen Bedingungen der direkten Umgebung beeinflussen die Biomineralisierung. Die in diesem Manuskript vorgestellte Arbeit setzt sich zum Ziel, die äußeren Bedingungen, im Speziellen der Einfluss des extrazellulären Oxidations- und Reduktions-Potentials (ORP) auf die Magnetit Bildung im Bakterienstamm Magnetospirillum magneticum AMB-1 besser zu verstehen. Eine kontrollierte Anzucht des Mikroorganismus wurde im Bioreaktor entwickelt und die Magnetosomenbildung wurden charakterisiert. Unter verschiedenen ORP-Bedingungen wurde untersucht, wieviel Eisen von den Bakterien aufgenommen wird und welche Auswirkungen das auf die Zahl und Größe der Magnetosomen hat. Untersucht man die Parameter Eisenaufnahme, Morphologie der Bakterien, Größe und Menge der Magnetosomen pro Zelle kommt man zu dem Schluss, dass die Magnetosomenbildung bei einem ORP von 0 mV inhibiert wird, wobei reduzierende Bedingungen bei einem ORP von -500 mV den Biomineralisationsprozess fördern. Inspiriert von der Fähigkeit der Selbstorganisation von Magnetosomen in MTB wurde versucht Nanopartikel-Anordnungen mit Hilfe des Bakteriophagen M13 als Vorlage zu konstruieren. Der Bakteriophage M13 ist ein 800 nm langes Filament mit eingekapselter einzelsträngiger DNA und wurde schon zuvor als Gerüst für Nanopartikel-Konstrukte verwendet. Ich habe zwei Typen von Anordnungen basierend auf Bakteriophagen und magnetischen Nanopartikeln konstruiert. Es wurde eine kettenartige Struktur, an der magnetische Nanopartikel entlang eines Phagenfilamentes angebracht sind und ein spermienähnliches Konstrukt mit einem magnetischen Kopf und einem Phagenfilament als Schwanz, entwickelt. Um eine kontrollierte Anordnung von Magnetit-Nanopartikeln an den Phagen zu ermöglichen, wurden zwei verschiedene Ansätze verfolgt. Der erste basierte auf elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen den mit positiv geladenem Polyethylenimin dekorierten Magnetit-Nanopartikeln und den negativ geladenen Phagen. Das zweite Phagen-Nanopartikel-Konstrukt wurde mit Hilfe von biologisch veränderten Erkennungsseiten hergestellt. Die Phagen weisen ein mCherry Protein auf, welches als Verbindungsstück für den red binding nanobody (RBP) verwendet wurde. Dieser wurde mit einem der Proteine fusioniert, welches die Magnetit Kristalle der Magnetosomen umhüllt. Beide Konstrukte wurden mit Hilfe eines externen Magnetfeldes im Wasser angeregt, wobei sich ihr Schwimmverhalten und das Potential für medizinische Anwendungen dieser Strukturen zeigten. Die Geschwindigkeit der Phagen-Nanopartikel-Konstrukte war im Vergleich zu den bisher veröffentlichten Mikroschwimmern relativ langsam. Es konnten jedoch nur die größten Phagen-Magnetit-Konstrukte visualisiert werden, wodurch die Geschwindigkeit der kleineren Versionen dieser Strukturen noch unklar bleibt. KW - nanoparticles KW - phages KW - nanoparticles assembly KW - magnetotactic bacteria KW - Nanopartikel KW - magnetotaktische Bakterien KW - magnetite Ketter KW - Bakteriophagen Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-89767 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Andreas T1 - Charakterisierung der Lipopolysaccharid-Bindungseigenschaften von Adhäsionsproteinen aus Salmonella-Bakteriophagen T1 - Characterization of lipopolysaccharide-binding properties of adhesion proteins from Salmonella-bacteriophages N2 - Die Interaktionen von komplexen Kohlenhydraten und Proteinen sind ubiquitär. Sie spielen wichtige Rollen in vielen physiologischen Prozessen wie Zelladhäsion, Signaltransduktion sowie bei viralen Infektionen. Die molekularen Grundlagen der Interaktion sind noch nicht komplett verstanden. Ein Modellsystem für Kohlenhydrat-Protein-Interaktionen besteht aus Adhäsionsproteinen (Tailspikes) von Bakteriophagen, die komplexe Kohlenhydrate auf bakteriellen Oberflächen (O-Antigen) erkennen. Das Tailspike-Protein (TSP), das in dieser Arbeit betrachtet wurde, stammt aus dem Bakteriophagen 9NA (9NATSP). 9NATSP weist eine hohe strukturelle Homologie zum gut charakterisierten TSP des Phagen P22 (P22TSP) auf, bei einer niedriger sequenzieller Ähnlichkeit. Die Substratspezifitäten beider Tailspikes sind ähnlich mit Ausnahme der Toleranz gegenüber den glucosylierten Formen des O-Antigens. Die Struktur der beiden Tailspikes ist bekannt, sodass sie ein geeignetes System für vergleichende Bindungsstudien darstellen, um die strukturellen Grundlagen für die Unterschiede der Spezifität zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der ELISA-like tailspike adsorption assay (ELITA) etabliert, um Binderpaare aus TSPs und O-Antigen zu identifizieren. Dabei wurden 9NATSP und P22TSP als Sonden eingesetzt, deren Bindung an die intakten, an die Mikrotiterplatte adsorbierten Bakterien getestet wurde. Beim Test einer Sammlung aus 44 Salmonella-Stämmen wurden Stämme identifiziert, die bindendes O-Antigen exprimieren. Gleichzeitig wurden Unterschiede in der Bindung der beiden TSPs an Salmonella-Stämme mit gleichem O-Serotyp beobachtet. Die Ergebnisse der ELITA-Messung wurden qualitativ durch eine FACS-basierte Bindungsmessung bestätigt. Zusätzlich ermöglichte die FACS-Messung bei Stämmen, die teilweise modifizierte O-Antigene herstellen, den Anteil an Zellen mit und ohne Modifikation zu erfassen. Die Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-basierten Interaktionsmessungen wurden eingesetzt, um Bindungsaffinitäten für eine TSP-O-Antigen Kombination zu quantifizieren. Dafür wurden zwei Methoden getestet, um die Oligosaccharide auf einem SPR-Chip zu immobilisieren. Zum einen wurden die enzymatisch hergestellten O-Antigenfragmente mit einem bifunktionalen Oxaminadapter derivatisiert, der eine primäre Aminogruppe für die Immobilisierung bereitstellt. Ein Versuch, diese Oligosaccharidfragmente zu immobilisieren, war jedoch nicht erfolgreich. Dagegen wurde das nicht derivatisierte Polysaccharid, bestehend aus repetitivem O-Antigen und einem konservierten Kernsaccharid, erfolgreich auf einem SPR-Chip immobilisiert. Die Immobilisierung wurde durch Interaktionsmessungen mit P22TSP bestätigt. Durch die Immobilisierung des Polysaccharids sind somit quantitative SPR-Bindungsmessungen mit einem polydispersen Interaktionspartner möglich. Eine Auswahl von Salmonella-Stämmen mit einer ausgeprägt unterschiedlichen Bindung von 9NATSP und P22TSP im ELITA-Testsystem wurde hinsichtlich der Zusammensetzung des O-Antigens mittels HPLC, Kapillargelelektrophorese und MALDI-MS analysiert. Dabei wurden nicht-stöchiometrische Modifikationen der O-Antigene wie Acetylierung und Glucosylierung detektiert. Das Ausmaß der Glucosylierung korrelierte negativ mit der Effizienz der Bindung und des Verdaus durch die beiden TSPs, wobei der negative Effekt bei 9NATSP weniger stark ausgeprägt war als bei P22TSP. Dies stimmt mit den Literaturdaten zu Infektivitätsstudien mit 9NA und P22 überein, die mit Stämmen mit vergleichbaren O-Antigenvarianten durchgeführt wurden. Die Korrelation zwischen der Glucosylierung und Bindungseffizienz konnte strukturell interpretiert werden. Auf Grundlage der O-Antigenanalysen sowie der Ergebnisse der ELITA- und FACS-Bindungstests wurden die Salmonella-Stämme Brancaster und Kalamu identifiziert, die annähernd quantitativ glucosyliertes O-Antigen exprimieren. Damit eignen sich diese Stämme für weiterführende Studien, um die Zusammenhänge zwischen der Spezifität und der Organisation der Bindestellen der beiden TSPs zu untersuchen. N2 - Interactions between complex carbohydrates and proteins are ubiquitous. They play a major role in plenty of physiological processes as cell adhesion, signal transduction, as well as viral infections. The molecular details of the interaction are not completely understood. A model system for protein-carbohydrate interactions consists of adhesion proteins (Tailspikes) of bacteriophages, which recognize complex carbohydrates on the bacterial surface (O-antigen). A Tailspike primary used in this work originates from the bacteriophage 9NA (9NATSP). 9NATSP shows a remarkable structural similarity to the extensively studied TSP of the bacteriophage P22 (P22TSP), showing a low sequential similarity. Since structures of both TSP's are known, they provide an appropriate system for comparative interaction studies. An ELISA-like Tailspike-adsorbtion assay (ELITA) was established in this work which allows identification of binding pairs consisting of TSP's and O-antigens. In this approach 9NATSP and P22TSP were used as probes. Their binding to intact bacteria adsorbed to a multi-well plate was tested. In a collection of 44 Salmonella-strains a set of strains was identified which express a binding O-antigen. Additionally different binding efficiencies were observed among the strains of the same O-serotype. Binding data of the ELITA were qualitatively resembled in a FACS-based binding test. Additionally FACS-measurements allowed estimation of the extent of non-stoichiometric modifications of the O-antigens in strains expressing modified O-antigen variants. The surface plasmone resonance (SPR) interaction-measurements were used to quantify affinities of TSP-O-antigen binding. For this, two carbohydrate immobilization strategies were tested. An O-antigen fragment, produced by enzymatic digestion, was derivatized by a bi-functional Oxamine-spacer. The spacer provides a primary amine-functionality for the immobilization. Despite the successful derivatization, sufficient amount of the O-antigen fragment could not be immobilized. Oppositely, the non-derivatized whole polysaccharide was successfully immobilized. The immobilization was confirmed by SPR-measurements with P22TSP. This approach allows quantitative measurements with polysaccharide as ligand, despite of its polydisperse characteristics. A set of Salmonella-strains with a distinctively different binding to 9NATSP and P22TSP in ELITA were characterized in terms of the content of their O-antigen by HPLC, capillary gel electrophoresis and MALDI-MS. Non-stoichiometric modifications of the O-antigens as acetylation and glucosylation were identified. The extent of glucosylation correlated negatively with the binding efficiencies to both TSP's, identifying 9NATSP as more susceptible to the glucosylation. That finding resembles with published data from early studies on the infectivity of bacteriophages 9NA and P22. Observed data could be interpreted in a structural context. The results of the O-antigen analysis as well as the results of ELITA and FACS-based interaction tests two Salmonella-strains, were identified, which produce almost completely glucosylated O-antigen: Salmonella Brancaster and Salmonella Kalamu. These strains are suitable for further studies to investigate the interdependence of the specificity and the structure of the binding sites of both TSP's. KW - Lipopolysaccharid KW - O-Antigen KW - nicht-stöchiometrische Modifikationen KW - Glycosylierung KW - Bakteriophagen KW - Adhäsionsproteine KW - Tailspike KW - Protein-Kohlenhydrat Interaktionen KW - lipopolysaccharide KW - O-antigen KW - non-stoichiometric modifications KW - glycosylation KW - bacteriophages KW - adhesion proteins KW - Tailspikes KW - protein-carbohydrate interactions Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-79529 ER - TY - THES A1 - Stephan, Mareike Sophia T1 - A bacterial mimetic system to study bacterial inactivation and infection N2 - The emerging threat of antibiotic-resistant bacteria has become a global challenge in the last decades, leading to a rising demand for alternative treatments for bacterial infections. One approach is to target the bacterial cell envelope, making understanding its biophysical properties crucial. Specifically, bacteriophages use the bacterial envelope as an entry point to initiate infection, and they are considered important building blocks of new antibiotic strategies against drug-resistant bacteria.. Depending on the structure of the cell wall, bacteria are classified as Gram-negative and Gram-positive. Gram-negative bacteria are equipped with a complex cell envelope composed of two lipid membranes enclosing a rigid peptidoglycan layer. The synthesis machinery of the Gram-negative cell envelope is the target of antimicrobial agents, including new physical sanitizing procedures addressing the outer membrane (OM). It is therefore very important to study the biophysical properties of the Gram-negative bacterial cell envelope. The high complexity of the Gram-negative OM sets the demand for a model system in which the contribution of individual components can be evaluated separately. In this respect, giant unilamellar vesicles (GUVs) are promising membrane systems to study membrane properties while controlling parameters such as membrane composition and surrounding medium conditions. The aim of this work was to develop methods and approaches for the preparation and characterization of a GUV-based membrane model that mimics the OM of the Gram-negative cell envelope. A major component of the OM is the lipopolysaccharide (LPS) on the outside of the OM heterobilayer. The vesicle model was designed to contain LPS in the outer leaflet and lipids in the inner leaflet. Furthermore, the interaction of the prepared LPS-GUVs with bacteriophages was tested. LPS containing GUVs were prepared by adapting the inverted emulsion technique to meet the challenging properties of LPS, namely their high self-aggregation rate in aqueous solutions. Notably, an additional emulsification step together with the adaption of solution conditions was employed to asymmetrically incorporate LPS containing long polysaccharide chains into the artificial membranes. GUV membrane asymmetry was verified with a fluorescence quenching assay. Since the necessary precautions for handling the quenching agent sodium dithionite are often underestimated and poorly described, important parameters were tested and identified to obtain a stable and reproducible assay. In the context of varied LPS incorporation, a microscopy-based technique was introduced to determine the LPS content on individual GUVs and to directly compare vesicle properties and LPS coverage. Diffusion coefficient measurements in the obtained GUVs showed that increasing LPS concentrations in the membranes resulted in decreased diffusivity. Employing LPS-GUVs we could demonstrate that a Salmonella bacteriophage bound with high specificity to its LPS receptor when presented at the GUV surface, and that the number of bound bacteriophages scaled with the amount of presented LPS receptor. In addition to binding, the bacteriophages were able to eject their DNA into the vesicle lumen. LPS-GUVs thus provide a starting platform for bottom-up approaches for the generation of more complex membranes, in which the effects of individual components on the membrane properties and the interaction with antimicrobial agents such as bacteriophages could be explored. N2 - Die wachsende Bedrohung durch antibiotikaresistente Bakterien ist in den letzten Jahrzehnten zu einer globalen Herausforderung geworden, was zu einer steigenden Nachfrage nach alternativen Behandlungsmethoden für bakterielle Infektionen geführt hat. Ein Ansatz besteht darin, die bakterielle Zellhülle anzugreifen, weshalb das Verständnis ihrer biophysikalischen Eigenschaften entscheidend ist. Insbesondere Bakteriophagen, Viren, die Bakterien infizieren, nutzen die Bakterienhülle als ersten Angriffspunkt für die Infektion und gelten als wichtige Bausteine für neue Antibiotikastrategien gegen arzneimittelresistente Bakterien. Je nach Struktur der Zellwand werden Bakterien in gramnegative und grampositive Bakterien eingeteilt. Gramnegative Bakterien sind mit einer komplexen Zellhülle ausgestattet. Daher ist es sehr wichtig, ihre biophysikalischen Eigenschaften zu untersuchen. Die hohe Komplexität der äußeren Zellhülle, auch äußere Membran genannt, erfordert ein Modellsystem, in dem der Beitrag jeder einzelnen Komponente separat bewertet werden kann. In dieser Hinsicht sind Vesikel-basierte Modellsysteme sehr vielversprechend, da sie wichtige Eigenschaften der äußeren Membran simulieren können, aber in ihrer Komplexität stark reduziert und kontrollierbar sind. Ziel dieser Arbeit war es, Methoden und Ansätze für die Herstellung und Charakterisierung eines Vesikel-basierten Modells zu entwickeln, das die äußere Membran der gramnegativen bakteriellen Zellhülle nachahmt. Ein Hauptbestandteil der äußeren Membran ist Lipopolysaccharid (LPS), das asymmetrisch auf der Außenseite der äußeren Membran vorhanden ist. Das Vesikelmodell wurde so konzipiert, dass es außen LPS und innen Phospholipide enthält. Die Herstellung des beschriebenen Modellsystems erforderte einige Anpassungen, da die Hüllkomponente LPS eine hohe Tendenz zur Bildung von Selbstaggregaten aufweist. Durch die Einführung eines zusätzlichen Schrittes in das Standardprotokoll konnten Vesikel mit LPS-Inkorporation erzeugt werden. Es wurde sowohl die Menge als auch die asymmetrische Verteilung des LPS-Einbaus bestimmt. Mit Hilfe von Bakteriophagen sollte die biologische Wirkung des Modellsystems getestet werden. Es wurde gezeigt, dass Bakteriophagen, die spezifisch LPS erkennen und binden, nach Zugabe zum Modellsystem die Vesikel binden und ihr genetisches Material in das Vesikel-Innere injizieren. Die hier beschriebenen LPS-haltigen Vesikel können als Ausgangsplattform für Bottom-up-Ansätze zur Herstellung komplexerer Membranen verwendet werden. Mit diesen komplexeren, aber kontrollierbaren Systemen lassen sich die Auswirkungen einzelner Komponenten der bakteriellen Zellhülle auf die Eigenschaften der Zellhülle sowie ihre Wechselwirkung mit antimikrobiellen Wirkstoffen wie Bakteriophagen untersuchen. KW - Bakterien KW - Bakteriophagen KW - Zellmembran KW - Vesikel KW - Konfokale Mikroskopie KW - Lipopolysaccharid KW - gramnegativ KW - bacteria KW - bacteriophage KW - cell membrane KW - vesicle KW - confocal microscopy KW - lipopolysaccharide KW - gram-negative Y1 - 2023 ER -