TY  - GEN
A1  - Grafe, Marianne
A1  - Batsios, Petros
A1  - Meyer, Irene
A1  - Lisin, Daria
A1  - Baumann, Otto
A1  - Goldberg, Martin W.
A1  - Gräf, Ralph
T1  - Supramolecular Structures of the Dictyostelium Lamin NE81
T2  - Potsprint der Universität Potsdam Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe
N2  - Nuclear lamins are nucleus-specific intermediate filaments (IF) found at the inner nuclear membrane (INM) of the nuclear envelope (NE). Together with nuclear envelope transmembrane proteins, they form the nuclear lamina and are crucial for gene regulation and mechanical robustness of the nucleus and the whole cell. Recently, we characterized Dictyostelium NE81 as an evolutionarily conserved lamin-like protein, both on the sequence and functional level. Here, we show on the structural level that the Dictyostelium NE81 is also capable of assembling into filaments, just as metazoan lamin filament assemblies. Using field-emission scanning electron microscopy, we show that NE81 expressed in Xenopous oocytes forms filamentous structures with an overall appearance highly reminiscent of Xenopus lamin B2. The in vitro assembly properties of recombinant His-tagged NE81 purified from Dictyostelium extracts are very similar to those of metazoan lamins.
Super-resolution stimulated emission depletion (STED) and expansion microscopy (ExM), as well as transmission electron microscopy of negatively stained purified NE81, demonstrated its capability of forming filamentous structures under low-ionic-strength conditions. These results recommend Dictyostelium as a non-mammalian model organism with a well-characterized nuclear envelope involving all relevant protein components known in animal cells.
T3  - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 682 
KW  - lamin
KW  - NE81
KW  - Dictyostelium
KW  - nuclear envelope
KW  - nuclear lamina
KW  - expansion microscopy
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-425976
SN  - 1866-8372
IS  - 682
ER  - 
TY  - GEN
A1  - Batsios, Petros
A1  - Ren, Xiang
A1  - Baumann, Otto
A1  - Larochelle, Denis A.
A1  - Gräf, Ralph
T1  - Src1 is a Protein of the Inner Nuclear Membrane Interacting with the Dictyostelium Lamin NE81
N2  - The nuclear envelope (NE) consists of the outer and inner nuclear membrane (INM), whereby the latter is bound to the nuclear lamina. Src1 is a Dictyostelium homologue of the helix-extension-helix family of proteins, which also includes the human lamin-binding protein MAN1. Both endogenous Src1 and GFP-Src1 are localized to the NE during the entire cell cycle. Immuno-electron microscopy and light microscopy after differential detergent treatment indicated that Src1 resides in the INM. FRAP experiments with GFP-Src1 cells suggested that at least a fraction of the protein could be stably engaged in forming the nuclear lamina together with the Dictyostelium lamin NE81. Both a BioID proximity assay and mis-localization of soluble, truncated mRFP-Src1 at cytosolic clusters consisting of an intentionally mis-localized mutant of GFP-NE81 confirmed an interaction of Src1 and NE81. Expression GFP-Src11–646, a fragment C-terminally truncated after the first transmembrane domain, disrupted interaction of nuclear membranes with the nuclear lamina, as cells formed protrusions of the NE that were dependent on cytoskeletal pulling forces. Protrusions were dependent on intact microtubules but not actin filaments. Our results indicate that Src1 is required for integrity of the NE and highlight Dictyostelium as a promising model for the evolution of nuclear architecture.
T3  - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 263 
KW  - Dictyostelium
KW  - HeH-protein
KW  - LEM-domain protein
KW  - lamin
KW  - nuclear lamina
KW  - nucleolus
KW  - nucleus
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-97033
ER  - 
TY  - THES
A1  - Barbosa Pfannes, Eva Katharina
T1  - Probing the regulatory mechanisms of the actomyosin system in motile cells
T1  - Erforschung von Regulationsmechanismen des Aktomyosinsystems in bewegliche Zellen
N2  - Actin-based directional motility is important for embryonic development, wound healing, immune responses, and development of tissues. Actin and myosin are essential players in this process that can be subdivided into protrusion, adhesion, and traction. Protrusion is the forward movement of the membrane at the leading edge of the cell. Adhesion is required to enable movement along a substrate, and traction finally leads to the forward movement of the entire cell body, including its organelles. While actin polymerization is the main driving force in cell protrusions, myosin motors lead to the contraction of the cell body. The goal of this work was to study the regulatory mechanisms of the motile machinery by selecting a representative key player for each stage of the signaling process: the regulation of Arp2/3 activity by WASP (actin system), the role of cGMP in myosin II assembly (myosin system), and the influence of phosphoinositide signaling (upstream receptor pathway). The model organism chosen for this work was the social ameba Dictyostelium discoideum, due to the well-established knowledge of its cytoskeletal machinery, the easy handling, and the high motility of its vegetative and starvation developed cells. First, I focused on the dynamics of the actin cytoskeleton by modulating the activity of one of its key players, the Arp2/3 complex. This was achieved using the carbazole derivative Wiskostatin, an inhibitor of the Arp2/3 activator WASP. Cells treated with Wiskostatin adopted a round shape, with no of few pseudopodia. With the help of a microfluidic cell squeezer device, I could show that Wiskostatin treated cells display a reduced mechanical stability, comparable to cells treated with the actin disrupting agent Latrunculin A. Furthermore, the WASP inhibited cells adhere stronger to a surface and show a reduced motility and chemotactic performance. However, the overall F-actin content in the cells was not changed. Confocal microscopy and TIRF microscopy imaging showed that the cells maintained an intact actin cortex. Localized dynamic patches of increased actin polymerization were observed that, however, did not lead to membrane deformation. This indicated that the mechanisms of actin-driven force generation were impaired in Wiskostatin treated cells. It is concluded that in these cells, an altered architecture of the cortical network leads to a reduced overall stiffness of the cell, which is insufficient to support the force generation required for membrane deformation and pseudopod formation. Second, the role of cGMP in myosin II dynamics was investigated. Cyclic GMP is known to regulate the association of myosin II with the cytoskeleton. In Dictyostelium, intracellular cGMP levels increase when cells are exposed to chemoattractants, but also in response to osmotic stress. To study the influence of cyclic GMP on actin and myosin II dynamics, I used the laser-induced photoactivation of a DMACM-caged-Br-cGMP to locally release cGMP inside the cell. My results show that cGMP directly activates the myosin II machinery, but is also able to induce an actin response independently of cAMP receptor activation and signaling. The actin response was observed in both vegetative and developed cells. Possible explanations include cGMP-induced actin polymerization through VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein) or through binding of cGMP to cyclic nucleotide-dependent kinases. Finally, I investigated the role of phosphoinositide signaling using the Polyphosphoinositide-Binding Peptide (PBP10) that binds preferentially to PIP2. Phosphoinositides can recruit actin-binding proteins to defined subcellular sites and alter their activity. Neutrophils, as well as developed Dictyostelium cells produce PIP3 in the plasma membrane at their leading edge in response to an external chemotactic gradient. Although not essential for chemotaxis, phosphoinositides are proposed to act as an internal compass in the cell. When treated with the peptide PBP10, cells became round, with fewer or no pseudopods. PH-CRAC translocation to the membrane still occurs, even at low cAMP stimuli, but cell motility (random and directional) was reduced. My data revealed that the decrease in the pool of available PIP2 in the cell is sufficient to impair cell motility, but enough PIP2 remains so that PIP3 is formed in response to chemoattractant stimuli. My data thus highlights how sensitive cell motility and morphology are to changes in the phosphoinositide signaling. In summary, I have analyzed representative regulatory mechanisms that govern key parts of the motile machinery and characterized their impact on cellular properties including mechanical stability, adhesion and chemotaxis.
N2  - Das Ziel der Arbeit war es, die regulatorischen Mechanismen der Zellmotilität zu untersuchen. Dazu habe ich für jedes Stadium dieses Prozesses einen repräsentativen regulatorischen Schritt ausgewählt und genauer untersucht: Die Regelung des Arp2/3 Komplexes durch WASP (Aktinsystem), die Rolle von cGMP in der Myosin II-Regulation (Myosinsystem) und der Einfluss von Phosphoinositiden im intrazellulären Signalprozess (Rezeptor-Signalweg). Die soziale Amöbe Dictyostelium discoideum wurde als Modellorganismus für diese Arbeiten gewählt. Gründe für diese Wahl waren die bereits vorliegenden detaillierten Kenntnisse über das Zytoskelett dieser Zellen, ihre einfache Handhabbarkeit im Labor, und die hohe Motilität der Zellen im vegetativen und entwickelten Zustand. Als Erstes analysierte ich die Dynamik des Aktin-Zytoskeletts durch Modulation der Aktivität des Arp2/3-Komplexes. Dafür benutzte ich das Carbazol-Derivat Wiskostatin, ein Inhibitor des Arp2/3-Aktivators WASP. Zellen, die mit Wiskostatin behandelt wurden, zeigten eine runde Form mit wenigen oder keinen Pseudopodien. Mit Hilfe des mikrofluidischen cell squeezer device konnte ich zeigen, dass Wiskostatin-behandelte Zellen eine geringere mechanische Stabilität aufweisen, vergleichbar mit Zellen unter dem Einfluss des Aktin-depolymerisierenden Wirkstoffes Latrunculin A. Darüber hinaus zeigen Wiskostatin behandelten Zellen eine erhöhte Substratadhäsion und eine verringerte Motilität und chemotaktische Effizienz. Der F-Aktingehalt der Zelle insgesamt blieb jedoch unverändert. Konfokal- und TIRF-mikroskopische Aufnahmen zeigten, dass die Zellen einen intakten Aktinkortex aufweisen. Es konnten lokalisierte dynamische Regionen erhöhter Aktinpolymerisation beobachtet werden, die jedoch nicht zur Ausbildung von Membrandeformationen führten. Daraus kann man rückschließen, dass die Mechanismen der Krafterzeugung im Aktin-Zytoskelett in WASP-inhibierten Zellen beeinträchtigt sind. Vermutlich liegt in diesen Zellen eine veränderte Mikroarchitektur des kortikalen Netzwerks vor, die zu einer verminderten Steifigkeit der Zelle führt, so dass die zur Bildung von Pseudopodien erforderlichen Kräfte nicht entfaltet werden können. Als Zweites wurde die Rolle von cGMP in der Myosin II-Dynamik untersucht. Es ist bekannt, dass cGMP die Assoziation von Myosin II mit dem Zytoskelett reguliert. In Dictyostelium steigt die intrazelluläre Konzentration von cGMP in Gegenwart von chemoattraktiven Lockstoffen sowie in Antwort auf osmotischen Stress. Um den Einfluss von cGMP auf die Aktin und Myosin II -Dynamik zu untersuchen, benutzte ich laserinduzierte Photoaktivierung von DMACM-caged-Br-cGMP, um cGMP lokal innerhalb der Zelle freizusetzen. Meine Ergebnisse zeigten, dass intrazelluläres cGMP direkt zur Aktivierung von Myosin II führt, jedoch auch Aktinantworten unabhängig vom cAMP-Rezeptorsignalweg induzieren kann. Die Aktinreaktion wurde sowohl in vegetativen als auch in entwickelten Zellen beobachtet. Eine mögliche Erklärung könnte die cGMP-induzierte Aktinpolymerisation über VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein) sein oder über die Bindung von cGMP an Nukleotid-abhängige Proteinkinasen. Als dritten Punkt meiner Arbeit untersuchte ich die Rolle der Phosphoinositide mit Hilfe des Phosphoinositide-bindenden Proteins PBP10, das bevorzugt an PIP2 bindet. Phosphoinositiden können Aktin-bindende Proteine zu definierten subzellulären Orten rekrutieren und ihre Aktivität verändern. Sowohl Neutrophile als auch entwickelte Dictyostelium Zellen produzieren PIP3 in der Plasmamembran an ihrer leading edge in Antwort auf externe Gradienten chemischer Lockstoffe. Obwohl Zellen auch ohne PIP3 chemotaktisches Verhalten zeigen, werden Phosphoinositide im Allgemeinen mit dem inneren chemotaktischen Kompass der Zelle in Verbindung gebracht. Mit dem Peptid PBP10 behandelte Zellen nahmen eine runde Form an, mit wenigen oder keinen Pseudopodien. PH-CRAC -Translokation zur Membran konnte in PBP10-behandelten Zellen selbst bei geringen cAMP-Stimuli weiterhin beobachtet werden. Ungerichtete wie auch gerichtete Zellmotiliät waren jedoch beeinträchtigt. Meine Daten zeigen, dass die Abnahme des PIP2-Pools in der Zelle durch PBP10 ausreicht, um die Zellmotilität zu beeinträchtigen, dass jedoch genug PIP2 erhalten bleibt um in Folge einer Rezeptorstimulation PIP3 zu produzieren. Die Ergebnisse demonstrieren daher, wie empfindlich Zellmotilität und -morphologie gegenüber Modifikationen im Phosphoinositid-Signalweg sind. Zusammenfassend habe ich mehrere repräsentative Beispiele für regulatorische Mechanismen der Zellmotilität untersucht und deren Auswirkung auf Eigenschaften der Zelle wie mechanische Stabilität, Zelladhäsion und Chemotaxis charakterisiert.
KW  - Dictyostelium
KW  - Aktomyosin
KW  - Wiskostatin
KW  - cGMP
KW  - PBP10
KW  - Dictyostelium
KW  - actomyosin
KW  - Wiskostatin
KW  - cGMP
KW  - PBP10
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-57812
ER  - 
TY  - GEN
A1  - Mitic, Kristina
A1  - Grafe, Marianne
A1  - Batsios, Petros
A1  - Meyer, Irene
T1  - Partial Disassembly of the Nuclear Pore Complex Proteins during Semi-Closed Mitosis in Dictyostelium discoideum
T2  - Postprints der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe
N2  - Dictyostelium cells undergo a semi-closed mitosis, during which the nuclear envelope (NE) persists; however, free diffusion between the cytoplasm and the nucleus takes place. To permit the formation of the mitotic spindle, the nuclear envelope must be permeabilized in order to allow diffusion of tubulin dimers and spindle assembly factors into the nucleus. In Aspergillus, free diffusion of proteins between the cytoplasm and the nucleus is achieved by a partial disassembly of the nuclear pore complexes (NPCs) prior to spindle assembly. In order to determine whether this is also the case in Dictyostelium, we analysed components of the NPC by immunofluorescence microscopy and live cell imaging and studied their behaviour during interphase and mitosis. We observed that the NPCs are absent from the contact area of the nucleoli and that some nucleoporins also localize to the centrosome and the spindle poles. In addition, we could show that, during mitosis, the central FG protein NUP62, two inner ring components and Gle1 depart from the NPCs, while all other tested NUPs remained at the NE. This leads to the conclusion that indeed a partial disassembly of the NPCs takes place, which contributes to permeabilisation of the NE during semi-closed mitosis.
T3  - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 1233 
KW  - nuclear pore complex
KW  - nucleoporins
KW  - semi-closed mitosis
KW  - centrosome
KW  - Dictyostelium
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-545341
SN  - 1866-8372
IS  - 3
ER  - 
TY  - THES
A1  - Krüger, Anne
T1  - Molekulare Charakterisierung von NE81 und CP75, zwei kernhüllen- und centrosomassoziierten Proteinen in Dictyostelium discoideum
T1  - Molecular characterization of NE81 and CP75, two nuclear envelope and centrosome associated proteins in Dictyostelium discoideum
N2  - Lamine bilden zusammen mit laminassoziierten Proteinen die nukleäre Lamina. Diese ist notwendig für die mechanische Stabilität von Zellen, die Organisation des Chromatins, der Genexpression, dem Fortgang des Zellzyklus und der Zellmigration. Die vielfältigen Funktionen der Lamine werden durch die Pathogenese von Laminopathien belegt. Zu diesen Erkrankungen, welche ihre Ursache in Mutationen innerhalb der laminkodierenden Gene, oder der Gene laminassoziierter bzw. laminprozessierender Proteine haben, zählen unter anderem das „Hutchinson-Gilford Progerie Syndrom“, die „Emery-Dreifuss“ Muskeldystrophie und die dilatierte Kardiomyopathie. Trotz der fundamentalen Bedeutung der Lamine, wurden diese bisher nur in Metazoen und nicht in einzelligen Organismen detektiert. Der amöbide Organismus Dictyostelium discoideum ist ein haploider Eukaryot, der häufig als Modellorganismus in den verschiedensten Bereichen der Zellbiologie eingesetzt wird. Mit der Entdeckung von NE81, einem Protein das mit der inneren Kernhülle von Dictyostelium discoideum assoziiert ist, wurde erstmals ein Protein identifiziert, dass man aufgrund seiner Eigenschaften als laminähnliches Protein in einem niederen Eukaryoten bezeichnen kann. Diese Merkmale umfassen die Existenz lamintypischer Sequenzen, wie die CDK1-Phosphorylierungsstelle, direkt gefolgt von einer zentralen „Rod“-Domäne, sowie eine typische NLS und die hoch konservierte CaaX-Box. Für die Etablierung des NE81 als „primitives“ Lamin, wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Experimente durchgeführt, die strukturelle und funktionelle Gemeinsamkeiten zu den Laminen in anderen Organismen aufzeigen konnten. Die Herstellung eines polyklonalen Antikörpers ermöglichte die Verifizierung der subzellulären Lokalisation des NE81 durch Elektronenmikroskopie und gab Einblicke in das Verhalten des endogenen Proteins innerhalb des Zellzyklus. Mit der Generierung von NE81-Nullmutanten konnte demonstriert werden, dass NE81 eine wichtige Rolle bei der nukleären Integrität und der Chromatinorganisation von Zellen spielt. Des Weiteren führte die Expression von zwei CaaX-Box deletierten NE81 - Varianten dazu, den Einfluss des Proteins auf die mechanische Stabilität der Zellen nachweisen zu können. Auch die Bedeutung der hochkonservierten CaaX-Box für die Lokalisation des Proteins wurde durch die erhaltenen Ergebnisse deutlich. Mit der Durchführung von FRAP-Experimente konnte außerdem die strukturgebende Funktion von NE81 innerhalb des Zellkerns bekräftigt werden. Zusätzlich wurde im Rahmen dieser Arbeit damit begonnen, den Einfluss der Isoprenylcysteincarboxylmethyltransferase auf die Lokalisation des Proteins aufzuklären. Die Entdeckung eines laminähnlichen Proteins in einem einzelligen Organismus, der an der Schwelle zu den Metazoen steht, ist für die evolutionäre Betrachtung der Entwicklung der sozialen Amöbe und für die Erforschung der molekularen Basis von Laminopathien in einem einfachen Modellorganismus sehr interessant. Die Arbeit mit Dictyostelium discoideum könnte daher Wege aufzeigen, dass Studium der Laminopathien am Tiermodell drastisch zu reduzieren. In den letzten Jahren hat die Erforschung unbekannter Bestandteile des Centrosoms in Dictyostelium discoideum große Fortschritte gemacht. Eine zu diesem Zwecke von unserer Arbeitsgruppe durchgeführte Proteomstudie, führte zur Identifizierung weiterer, potentiell centrosomaler Kandidatenproteine. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung eines solchen Kandidatenproteins, dem CP75. Es konnte gezeigt werden, dass CP75 einen echten, centrosomalen Bestandteil darstellt, der mikrotubuli-unabhängig mit der Core Struktur des Zellorganells assoziiert ist. Weiterhin wurde deutlich, dass die Lokalisation am Centrosom in Abhängigkeit vom Zellzyklus erfolgt und CP75 vermutlich mit CP39, einem weiteren centrosomalen Core Protein, interagiert.
N2  - Lamins build the nuclear lamina together with lamin-associated proteins. The latter is required for mechanical stabilization of cells, chromatin organization, gene expression, cell cycle progression and cell migration. This became evident by the pathogenesis of laminopathies. Laminopathies are diseases which arise from mutations in genes encoding lamins, lamin-associated-or lamin-processing proteins. Prominent examples are the „Hutchinson-Gilford progeria syndrome“, the „Emery-Dreifuss“muscular dystrophy and dilated cardiomyopathy. Despite their universal importance, lamins have only been found in metazoans, but not in unicellular organisms so far. The amoeboid organism Dictyostelium discoideum is a haploid eukaryote widely used in different fields of cell biology. With the discovery of NE81, a protein associated with the inner nuclear membrane of Dictyostelium discoideum, for the first time a protein was identified, whose properties jutify denomination as a lamin-like protein in a lower eukaryote. This is based on the presence of lamin-typical sequences such as a CDK1 phosphorylation consensus sequence, followed by a central rod domain, a typical nuclear localization sequence and the highly conserved CaaX box. For the verification of NE81 as a primitive lamin, various different experiments were conducted in the frame of this work, which revealed structural and functional similarities to lamins of other organisms. Analysis of the behavior of the endogenous protein in cell cycle and the verification of the subcellular localization with electron microscopy was done with the generation of a polyclonal antibody. With a NE81 null mutant, it could be shown, that NE81 plays an important role in nuclear integrity and chromatin organization. The expression of two CaaX-box deleted protein variants confirmed the influence of NE81 on the mechanical stability of cells. These results furthermore underlined the importance of the presence of the highly conserved CaaX-box. FRAP-experiments further emphasized the structural function of NE81 in the nucleus. Furthermore, first steps were undertaken to determine the influence of the Isoprenylcysteinecarboxylmethyltransferase on the localization of NE81. In the light of evolution the discovery of a lamin-like protein in a unicellular organism is very interesting and could provide a simple experimental system for studies of the molecular basis of laminopathies. Hence, the study on laminopathies in animal models could be reduced dramatically. The identification of unknown centrosomal components in Dictyostelium discoideum has made significant proceedings in the last years. A proteomic approach which was accomplished for this purpose, yielded several potential centrosomal candidate proteins. The second part of this work focuses on the characterization of one of these proteins, CP75. It could be shown that CP75 is a genuine, centrosomal component, which is associated with the centrosomal core structure independently of microtubules. Furthermore, it could be demonstrated, that the localization of CP75 is cell cycle-dependent and that it presumably interacts with the core protein CP39.
KW  - Kernhülle
KW  - Lamin
KW  - Dictyostelium
KW  - Centrosom
KW  - nuclear envelope
KW  - lamin
KW  - Dictyostelium
KW  - centrosome
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-53915
ER  - 
TY  - THES
A1  - Peter, Tatjana
T1  - Molekulare Charakterisierung von CP75, einem neuen centrosomalen Protein in Dictyostelium discoideum
T1  - Molecular characterization of CP75, a novel Dictyostelium centrosome protein
N2  - Das Centrosom ist ein Zellkern-assoziiertes Organell, das nicht von einer Membran umschlossen ist. Es spielt eine wichtige Rolle in vielen Mikrotubuli- abhängigen Prozessen wie Organellenpositionierung, Zellpolarität oder die Organisation der mitotischen Spindel. Das Centrosom von Dictyostelium besteht aus einer dreischichtigen Core-Struktur umgeben von einer Corona, die Mikrotubuli-nukleierende Komplexe enthält. Die Verdoppelung des Centrosoms in Dictyostelium findet zu Beginn der Mitose statt. In der Prophase vergrößert sich die geschichtete Core-Struktur und die Corona löst sich auf. Anschließend trennen sich die beiden äußeren Lagen der Core-Struktur und bilden in der Metaphase die beiden Spindelpole, die in der Telophase zu zwei vollständigen Centrosomen heranreifen. Das durch eine Proteom-Analyse identifizierte Protein CP75 lokalisiert am Centrosom abhängig von den Mitosephasen. Es dissoziiert von der Core-Struktur in der Prometaphase und erscheint an den Spindelpolen in der Telophase wieder. Dieses Verhalten korreliert mit dem Verhalten der mittleren Lage der Core-Struktur in der Mitose, was darauf hinweist, dass CP75 eine Komponente dieser Schicht sein könnte. Die FRAP-Experimente am Interphase- Centrosom zeigen, dass GFP-CP75 dort nicht mobil ist. Das deutet darauf hin, dass das Protein wichtige Funktionen im Strukturerhalt der centrosomalen Core- Struktur übernehmen könnte. Sowohl die C- als auch die N-terminale Domäne von CP75 enthalten centrosomale Targeting-Domäne. Als GFP-Fusionsproteine (GFP-CP75-N und -C) lokalisieren die beiden Fragmente am Centrosom in der Interphase. Während GFP-CP75-C in der Mitose am Centrosom verbleibt, verschwindet GFP-CP75-N in der Metaphase und kehrt erst in der späten Telophase zurück. GFP-CP75-C und GFP-CP75O/E kolokalisieren mit F-Aktin am Zellcortex, zeigen aber keine Interaktion mit Aktin mit der BioID-Methode. Die N-terminale Domäne von CP75 enthält eine potentielle Plk1- Phosphorylierungssequenz. Die Überexpression der nichtphosphorylierbaren Punktmutante (GFP-CP75-Plk-S143A) ruft verschiedene Phänotypen wie verlängerte oder überzählige Centrosomen, vergrößerte Zellkerne und Anreicherung von detyrosinierten Mikrotubuli hervor. Die ähnlichen Phänotypen konnten auch bei GFP-CP75-N und CP75-RNAi beobachtet werden. Der
Phänotyp der detyrosinierten Mikrotubuli bringt erstmals den Beweis dafür, dass I
in Dictyostelium posttranslationale Modifikation an Tubulinen stattfindet. Außerdem zeigten CP75-RNAi-Zellen Defekte in der Organisation der mitotischen Spindel. Mittels BioID-Methode konnten drei potentielle Interaktionspartner von CP75 identifiziert werden. Diese drei Proteine CP39, CP91 und Cep192 sind ebenfalls Bestandteile des Centrosoms.
N2  - The centrosome is a nonmembranous, nucleus-associated organelle. It plays crucial roles in a variety of mucrotubule-dependent processes, such as organelle positioning, cell polarization and mitotic spindle organization. The Dictyostelium centrosome consists of a core structure with three major layers, surrounded by a corona containing micrutubule-nucleation complexes. Dictyostelium centrosome replication starts at the onset of mitosis. In prophase, the core structure enlarges and the corona disappears. Afterwards, the core structure splits and the outer layers form two spindle poles maturating to two new, complete centrosomes in telophase. CP75 is one of nine novel proteins identified in a centrosomal proteome analysis. Endogenous CP75 localizes to the centrosome in a cell cycle- dependent manner. It dissociates from the core structure in early prometaphase and reappears at spindle poles in telophase. Since this pattern fits to the disappearance and reappearance of the central layer of the core structure, this indicates that CP75 is a constituent of this layer. During interphase FRAP experiments reveal that GFP-CP75 exhibits no mobility at the centrosome. This indicates a role in structural maintenance of the centrosomal core. Both the C- and N-terminal domains of CP75 contain a centrosomal targeting domain. Fused to GFP (GFP-CP75-N and -C) both fragments localized to the centrosome in interphase, but only GFP-CP75-N disappears from the centrosome during mitosis. GFP-CP75-C and GFP-CP75O/E also colocalized with F-actin at the cell cortex. But it shows no direct interaction with actin in BioID. The N-terminal domain of CP75 contains Plk1 phosphorylation sites. Overexpression of phosphorylation site-defficient mutant of GFP-CP75 (GFP-CP75-Plk-S143A) causes different phenotypes like enlarged and disrupted nuclei, enlarged and supernumerary centrosomes and detyrosinated microtubules. A very similar phenotype was observed upon overexpression of GFP-CP75-N and upon knockdown of CP75 expression by RNAi. The phenotype of detyrosinated microtubules for the first time shows that posttranslational modification of Tubulin takes place in Dictyostelium. Live cell imaging showed that lack of CP75 caused defect in spindle formation. CP75 interacts in BioID with CP39, CP91 and Cep192, three other components of the centrosome.
KW  - Dictyostelium
KW  - Centrosom
KW  - CP75
KW  - dictyostelium
KW  - centrosome
KW  - CP75
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-96472
ER  - 
TY  - THES
A1  - Putzler, Sascha
T1  - Molekulare Charakterisierung des Centrosom-assoziierten Proteins CP91 in Dictyostelium discoideum
T1  - Molecular characterization of the centrosome-associated protein CP91 in Dictyostelium discoideum
N2  - Das Dictyostelium-Centrosom ist ein Modell für acentrioläre Centrosomen. Es besteht aus einer dreischichtigen Kernstruktur und ist von einer Corona umgeben, welche Nukleationskomplexe für Mikrotubuli beinhaltet. Die Verdoppelung der Kernstruktur wird einmal pro Zellzyklus am Übergang der G2 zur M-Phase gestartet. Durch eine Proteomanalyse isolierter Centrosomen konnte CP91 identifiziert werden, ein 91 kDa großes Coiled-Coil Protein, das in der centrosomalen Kernstruktur lokalisiert. GFP-CP91 zeigte fast keine Mobilität in FRAP-Experimenten während der Interphase, was darauf hindeutet, dass es sich bei CP91 um eine Strukturkomponente des Centrosoms handelt. In der Mitose hingegen dissoziieren das GFP-CP91 als auch das endogene CP91 ab und fehlen an den Spindelpolen von der späten Prophase bis zur Anaphase. Dieses Verhalten korreliert mit dem Verschwinden der zentralen Schicht der Kernstruktur zu Beginn der Centrosomenverdopplung. Somit ist CP91 mit großer Wahrscheinlichkeit ein Bestandteil dieser Schicht. CP91-Fragmente der N-terminalen bzw. C-terminalen Domäne (GFP-CP91 N-Terminus, GFP-CP91 C-Terminus) lokalisieren als GFP-Fusionsproteine exprimiert auch am Centrosom, zeigen aber nicht die gleiche mitotische Verteilung des Volllängenproteins. Das CP91-Fragment der zentralen Coiled-Coil Domäne (GFP-CP91cc) lokalisiert als GFP-Fusionsprotein exprimiert, als ein diffuser cytosolische Cluster, in der Nähe des Centrosoms. Es zeigt eine partiell ähnliche mitotische Verteilung wie das Volllängenprotein. Dies lässt eine regulatorische Domäne innerhalb der Coiled-Coil Domäne vermuten. Die Expression der GFP-Fusionsproteine unterdrückt die Expression des endogenen CP91 und bringt überzählige Centrosomen hervor. Dies war auch eine markante Eigenschaft nach der Unterexpression von CP91 durch RNAi. Zusätzlich zeigte sich in CP91-RNAi Zellen eine stark erhöhte Ploidie verursacht durch schwere Defekte in der Chromosomensegregation verbunden mit einer erhöhten Zellgröße und Defekten im Abschnürungsprozess während der Cytokinese. Die Unterexpression von CP91 durch RNAi hatte auch einen direkten Einfluss auf die Menge an den centrosomalen Proteinen CP39, CP55 und CEP192 und dem Centromerprotein Cenp68 in der Interphase. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass CP91 eine zentrale centrosomale Kernkomponente ist und für den Zusammenhalt der beiden äußeren Schichten der Kernstruktur benötigt wird. Zudem spielt CP91 eine wichtige Rolle für eine ordnungsgemäße Centrosomenbiogenese und, unabhängig davon, bei dem Abschnürungsprozess der Tochterzellen während der Cytokinese.
N2  - The Dictyostelium centrosome is a model for acentriolar centrosomes and it consists of a three-layered core structure surrounded by a corona harboring microtubule nucleation complexes. Its core structure duplicates once per cell cycle at the G2/M transition. Through proteomic analysis of isolated centrosomes we have identified CP91, a 91-kDa coiled coil protein that was localized at the centrosomal core structure. While GFP-CP91 showed almost no mobility in FRAP experiments during interphase, both GFP-CP91 and endogenous CP91 dissociated during mitosis and were absent from spindle poles from late prophase to anaphase. Since this behavior correlates with the disappearance of the central layer upon centrosome duplication, CP91 is a putative component of this layer. When expressed as GFP-fusions, CP91 fragments corresponding to the N-terminal and C-terminal domain (GFP-CP91N, and GFP-CP91C respectively) also localized to the centrosome but did not show the mitotic redistribution of the full length protein. The CP91 fragment corresponding to the central coiled coil domain (GFP-CP91cc) localized as a diffuse cluster close to the centrosome and did show a partially similar mitotic redistribution of the full length protein suggesting a regulatory role of the coiled coil domain. Expression of all GFP-fusion proteins suppressed expression of endogenous CP91 and elicited supernumerary centrosomes. This was also very prominent upon depletion of CP91 by RNAi. CP91-RNAi cells exhibited heavily increased ploidy due to severe defects in chromosome segregation along with increased cell size and defects in the abscission process during cytokinesis. Additionally, depletion of CP91 by RNAi had an immediate impact on the amount of the centrosomal core components CP39, CP55 and CEP192 and the centromere protein Cenp68 in interphase cells. Our results indicate that CP91 is a central centrosomal core component required for centrosomal integrity, proper centrosome biogenesis and, independently, for abscission during cytokinesis.
KW  - Centrosom
KW  - Dictyostelium
KW  - Mikrotubuli
KW  - Mitose
KW  - Zellkern
KW  - centrosome
KW  - dictyostelium
KW  - microtubules
KW  - mitosis
KW  - nucleus
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-394689
ER  - 
TY  - GEN
A1  - Grafe, Marianne
A1  - Hofmann, Phillip
A1  - Batsios, Petros
A1  - Meyer, Irene
A1  - Gräf, Ralph
T1  - In vivo assembly of a Dictyostelium lamin mutant induced by light, mechanical stress, and pH
T2  - Postprints der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe
N2  - We expressed Dictyostelium lamin (NE81) lacking both a functional nuclear localization signal and a CAAX-box for C-terminal lipid modification. This lamin mutant assembled into supramolecular, three-dimensional clusters in the cytosol that disassembled at the onset of mitosis and re-assembled in late telophase, thus mimicking the behavior of the endogenous protein. As disassembly is regulated by CDK1-mediated phosphorylation at serine 122, we generated a phosphomimetic S122E mutant called GFP-NE81-S122E-∆NLS∆CLIM. Surprisingly, during imaging, the fusion protein assembled into cytosolic clusters, similar to the protein lacking the phosphomimetic mutation. Clusters disassembled again in the darkness. Assembly could be induced with blue but not green or near ultraviolet light, and it was independent of the fusion tag. Assembly similarly occurred upon cell flattening. Earlier reports and own observations suggested that both blue light and cell flattening could result in a decrease of intracellular pH. Indeed, keeping the cells at low pH also reversibly induced cluster formation. Our results indicate that lamin assembly can be induced by various stress factors and that these are transduced via intracellular acidification. Although these effects have been shown in a phosphomimetic CDK1 mutant of the Dictyostelium lamin, they are likely relevant also for wild-type lamin.
T3  - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 1213 
KW  - lamin
KW  - NE81
KW  - Dictyostelium
KW  - nuclear envelope
KW  - nuclear lamina
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-525075
SN  - 1866-8372
IS  - 8
ER  - 
TY  - THES
A1  - Samereier, Matthias
T1  - Functional analyses of microtubule and centrosome-associated proteins in Dictyostelium discoideum
T1  - Funktionelle Analyse von Mikrotubuli- und Centrosom-assoziierten Proteinen in Dictyostelium discoideum
N2  - Understanding the role of microtubule-associated proteins is the key to understand the complex mechanisms regulating microtubule dynamics. This study employs the model system Dictyostelium discoideum to elucidate the role of the microtubule-associated protein TACC (Transforming acidic coiled-coil) in promoting microtubule growth and stability. Dictyostelium TACC was localized at the centrosome throughout the entire cell cycle. The protein was also detected at microtubule plus ends, however, unexpectedly only during interphase but not during mitosis. The same cell cycle-dependent localization pattern was observed for CP224, the Dictyostelium XMAP215 homologue. These ubiquitous MAPs have been found to interact with TACC proteins directly and are known to act as microtubule polymerases and nucleators. This work shows for the first time in vivo that both a TACC and XMAP215 family protein can differentially localize to microtubule plus ends during interphase and mitosis. RNAi knockdown mutants revealed that TACC promotes microtubule growth during interphase and is essential for proper formation of astral microtubules in mitosis. In many organisms, impaired microtubule stability upon TACC depletion was explained by the failure to efficiently recruit the TACC-binding XMAP215 protein to centrosomes or spindle poles. By contrast, fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) analyses conducted in this study demonstrate that in Dictyostelium recruitment of CP224 to centrosomes or spindle poles is not perturbed in the absence of TACC. Instead, CP224 could no longer be detected at the tips of microtubules in TACC mutant cells. This finding demonstrates for the first time in vivo that a TACC protein is essential for the association of an XMAP215 protein with microtubule plus ends. The GFP-TACC strains generated in this work also turned out to be a valuable tool to study the unusual microtubule dynamics in Dictyostelium. Here, microtubules exhibit a high degree of lateral bending movements but, in contrast most other organisms, they do not obviously undergo any growth or shrinkage events during interphase. Despite of that they are affected by microtubuledepolymerizing drugs such as thiabendazole or nocodazol which are thought to act solely on dynamic microtubules. Employing 5D-fluorescence live cell microscopy and FRAP analyses this study suggests Dictyostelium microtubules to be dynamic only in the periphery, while they are stable at the centrosome. In the recent years, the identification of yet unknown components of the Dictyostelium centrosome has made tremendous progress. A proteomic approach previously conducted by our group disclosed several uncharacterized candidate proteins, which remained to be verified as genuine centrosomal components. The second part of this study focuses on the investigation of three such candidate proteins, Cenp68, CP103 and the putative spindle assembly checkpoint protein Mad1. While a GFP-CP103 fusion protein could clearly be localized to isolated centrosomes that are free of microtubules, Cenp68 and Mad1 were found to associate with the centromeres and kinetochores, respectively. The investigation of Cenp68 included the generation of a polyclonal anti-Cenp68 antibody, the screening for interacting proteins and the generation of knockout mutants which, however, did not display any obvious phenotype. Yet, Cenp68 has turned out as a very useful marker to study centromere dynamics during the entire cell cycle. During mitosis, GFP-Mad1 localization strongly resembled the behavior of other Mad1 proteins, suggesting the existence of a yet uncharacterized spindle assembly checkpoint in Dictyostelium.
N2  - Die Kenntnis der Funktion von Mikrotubuli-assoziierenden Proteinen (MAPs) ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Mikrotubuli-Dynamik und deren Regulation. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle des Mikrotubuli-assoziierenden Proteins TACC (Transforming acidic coiled-coil), welches in vielen Organismen an der Stabilisierung und dem Wachstum von Mikrotubuli beteiligt ist, im Modellorganismus Dictyostelium discoideum untersucht. Das Dictyostelium TACC Protein konnte während des gesamten Zellzyklus am Centrosom nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde es an den Mikrotubuli-Plus-Enden vorgefunden, überraschenderweise jedoch ausschließlich während der Interphase. Die gleiche Zellzyklusabhängige Lokalisation wurde für CP224 beobachtet, einem Homologen der XMAP215 Proteine in Dictyostelium. Diese ubiquitären MAPs sind konservierte, direkte Interaktionspartner der TACC Proteine und spielen eine zentrale Rolle bei der Nukleation und der Polymerisation von Mikrotubuli. Durch diese Arbeit konnte erstmals in vivo gezeigt werden, dass TACC und XMAP215 Proteine während der Interphase und Mitose unterschiedlich stark mit Mikrotubuli-Plus-Enden assoziiert sein können. Durch Untersuchungen an Knockdown-Mutanten wurde ersichtlich, dass Dictyostelium TACC eine Rolle beim Mikrotubuli-Wachstum während der Interphase spielt und über weite Strecken der Mitose essentiell für die Ausbildung von astralen Mikrotubuli ist. In anderen Organismen konnte als Ursache instabiler Mikrotubuli in TACC Mutanten häufig unzureichendes Rekrutieren des jeweiligen XMAP215 Proteins an das Centrosom ausgemacht werden. Um entsprechende Auswirkungen auf die Lokalisation von CP224 durch den Knockdown von TACC in Dictyostelium zu untersuchen, wurden Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP) Experimente durchgeführt. Diese ergaben, dass CP224 auch in Abwesenheit von TACC in vollem Umfang an die Centrosomen und Spindelpole rekrutiert wird. Anders als im Wildtyp, konnte in TACC Mutanten allerdings kein CP224 an den Mikrotubuli-Plus-Enden nachgewiesen werden. Somit konnte erstmals in vivo gezeigt werden, dass ein TACC Protein essentiell für die Assoziation eines XMAP215 Proteins mit den Mikrotubuli-Plus-Enden ist. Im Laufe der genannten Experimente stellte sich heraus, dass sich die GFP-TACC Stämme aufgrund ihrer markierten Plus-Enden sehr gut für Untersuchungen zur ungewöhnlichen Mikrotubuli-Dynamik in Dictyostelium eignen. Zwar weisen Mikrotubuli hier über die gesamte Länge ausgeprägte Krümmungs- und Seitwärtsbewegungen auf, es können jedoch im Vergleich zu anderen Organismen während der Interphase kaum Wachstums- oder Verkürzungsvorgänge beobachtet werden. Dennoch können Dictyostelium Mikrotubuli unter Verwendung von Agenzien wie Thiabendazol oder Nocodazol, welche ausschließlich auf dynamische Mikrotubuli wirken, signifikant verkürzt werden. Durch FRAP Experimente und Einsatz von 5D Fluoreszenz-Mikroskopie an lebenden Zellen konnte in dieser Arbeit erstmalig nachgewiesen werden, dass Dictyostelium Mikrotubuli nur in der Zellperipherie, nicht aber im pericentrosomalen Bereich dynamisch sind. Die Identifikation bislang unbekannter Bestandteile des Dictyostelium Centrosoms erfuhr in den vergangenen Jahren große Fortschritte. Ein von unserer Gruppe durchgeführter Proteomics-Ansatz brachte eine Vielzahl potentiell centrosomaler Proteine zu Tage, von welchen bereits viele am Centrosom nachgewiesen werden konnten. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung dreier noch unbekannter Proteine aus dem Proteomics-Ansatz, Cenp68, CP103 und dem Dictyostelium Homologen des Spindle Assembly Checkpunkt Proteins Mad1. Hierbei zeigte sich, dass lediglich CP103 Bestandteil isolierter, Mikrotubuli-freier Centrosomen ist, während Cenp68 an die Centromere und Mad1 an die Kinetochoren lokalisieren. Die Charakterisierung von Cenp68 umfasste außerdem die Herstellung eines polyklonalen anti-Cenp68 Antikörpers, das Suchen nach Interaktionspartnern und die Erzeugung eines Cenp68 Knockout-Stammes. Letzterer wies jedoch keinen offensichtlichen Phänotyp auf. Das Verhalten des Dictyostelium Mad1 Proteins während der Mitose stimmte in großen Teilen mit dem anderer Mad1 Proteine überein, was auf die Existenz eines bislang unerforschten Spindle Assembly Chekpunkts in Dictyostelium hinweisen könnte.
KW  - Dictyostelium
KW  - Mikrotubuli
KW  - TACC
KW  - Centrosom
KW  - Centromere
KW  - Dictyostelium
KW  - Microtubules
KW  - TACC
KW  - Centrosome
KW  - Centromeres
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-52835
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kuhnert, Oliver
T1  - Charakterisierung der neuen centrosomalen Proteine CP148 und CP55 in Dictyostelium discoideum
T1  - Characterization of the new centrosomal proteins CP148 and CP55 in Dictyostelium discoideum
N2  - Das im Cytosol liegende Dictyostelium Centrosom ist aus einer geschichteten Core-Region aufgebaut, die von einer Mikrotubuli-nukleierenden Corona umgeben ist. Zudem ist es über eine spezifische Verbindung eng an den Kern geknüpft und durch die Kernmembran hindurch mit den geclusterten Centromeren verbunden. Beim G2/M Übergang dissoziiert die Corona vom Centrosom und der Core verdoppelt sich so dass zwei Spindelpole entstehen. CP55 und CP148 wurden in einer Proteom-Analyse des Centrosoms identifiziert. CP148 ist ein neues coiled-coil Protein der centrosomalen Corona. Es zeigt eine zellzyklusabhängige An- und Abwesenheit am Centrosom, die mit der Dissoziation der Corona in der Prophase und ihrer Neubildung in der Telophase korreliert. Während der Telophase erschienen in GFP-CP148 exprimierenden Zellen viele, kleine GFP-CP148-Foci im Cytoplasma, die zum Teil miteinander fusionierten und zum Centrosom wanderten. Daraus resultierte eine hypertrophe Corona in Zellen mit starker GFP-CP148 Überexpression. Ein Knockdown von CP148 durch RNAi führte zu einem Verlust der Corona und einem ungeordneten Interphase Mikrotubuli-Cytoskelett. Die Bildung der mitotischen Spindel und der astralen Mikrotubuli blieb davon unbeeinflusst. Das bedeutet, dass die Mikrotubuli-Nukleationskomplexe während der Interphase und Mitose über verschiedene Wege mit dem Core assoziiert sind. Des Weiteren bewirkte der Knockdown eine Dispersion der Centromere sowie eine veränderte Sun1 Lokalisation in der Kernhülle. Somit spielt CP148 ebenso eine Rolle in der Centrosomen-Centromer-Verbindung. Zusammengefasst ist CP148 ein essentielles Protein für die Bildung und Organisation der Corona, welche wiederum für die Centrosom/Centromer Verbindung benötigt wird. CP55 wurde als Protein der Core-Region identifiziert und verbleibt während des Zellzyklus am Centrosom. Dort besitzt es strukturelle Aufgaben, da die Mehrheit der GFP-CP55 Moleküle in der Interphase keine Mobilität zeigten. Die GFP-CP55 Überexpression führte zur Bildung von überzähligen Centrosomen mit der üblichen Ausstattung an Markerproteinen der Corona und des Cores. CP55 Knockout-Zellen waren durch eine erhöhte Ploidie, eine weniger strukturierte und leicht vergrößerte Corona sowie zusätzliche cytosolische Mikrotubuli-organisierende Zentren charakterisiert. Letztere entstanden in der Telophase und enthielten nur Corona- aber keine Core-Proteine. In CP55 k/o Zellen erfolgte die Rekrutierung des Corona-Organisators CP148 an den Spindelpol bereits in der frühen Metaphase anstatt, wie üblich, erst in der Telophase. Außerdem zeigten die Knockout-Zellen Wachstumsdefekte, deren Grund vermutlich Schwierigkeiten bei der Centrosomenverdopplung in der Prophase durch das Fehlen von CP55 waren. Darüber hinaus konnten die Knockout-Zellen phagozytiertes Material nicht verwerten, obwohl der Vorgang der Phagozytose nicht beeinträchtigt war. Dieser Defekt kann dem im CP55 k/o auftretenden dispergierten Golgi-Apparat zugeschrieben werden.
N2  - The Dictyostelium centrosome consists of a layered core structure surrounded by a microtubule-nucleating corona. A tight linkage through the nuclear envelope connects the cytosolic centrosome with the clustered centromeres within the nuclear matrix. At G2/M the corona dissociates, and the core structure duplicates yielding two spindle poles. The two proteins CP148 and CP55 were discovered in a proteomic analysis of Dictyostelium centrosomes. CP148 is a novel coiled-coil protein of the centrosomal corona. GFP-CP148 exhibited cell cycle dependent presence and absence at the centrosome, which correlates with dissociation of the corona in prophase and its reformation in late telophase. During telophase, GFP-CP148 formed cytosolic foci, which coalesced and joined the centrosome. This explains the hypertrophic appearance of the corona upon strong overexpression of GFP-CP148. Depletion of CP148 by RNAi caused virtual loss of the corona and disorganization of interphase microtubules. Surprisingly, formation of the mitotic spindle and astral microtubules was unaffected. Thus, microtubule nucleation complexes associate with centrosomal core components through different means during interphase and mitosis. Furthermore, CP148 RNAi caused dispersal of centromeres and altered Sun1 distribution at the nuclear envelope, suggesting a role of CP148 in the linkage between centrosomes and centromeres. Taken together, CP148 is an essential factor for the formation of the centrosomal corona, which in turn is required for centrosome/centromere linkage. As CP148, CP55 was also identified in a centrosomal proteome analysis. It is a component of the centrosomal core structure, and persists at the centrosome throughout the entire cell cycle. FRAP experiments revealed the majority of centrosomal GFP-CP55 is immobile indicating a structural task of CP55 at the centrosome. GFP-CP55 overexpression elicits supernumerary centrosomes containing the usual set of corona and core marker proteins. The CP55 null mutant is characterized by increased ploidy, a less structured, slightly enlarged corona, and by supernumerary, cytosolic MTOCs, containing only corona proteins and lacking a core structure. Live cell imaging showed that supernumerary MTOCs arise in telophase. Lack of CP55 also caused premature recruitment of the corona organizer CP148 to mitotic spindle poles, already in metaphase instead of telophase. Forces transmitted through astral microtubules may expel prematurely acquired or loosely attached corona fragments into the cytosol, where they act as independent MTOCs. CP55null cells were also impaired in growth, most probably due to difficulties in centrosome splitting during prophase. Furthermore, although they were still capable of phagocytosis, they appeared unable to utilize phagocytosed nutrients. This inability may be attributed to their disorganized Golgi apparatus.
KW  - Dictyostelium
KW  - Centrosom
KW  - Mikrotubuli
KW  - Zellkern
KW  - Mitose
KW  - Dictyostelium
KW  - Centrosome
KW  - Microtubules
KW  - Nucleus
KW  - Mitosis
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-59949
ER  - 
TY  - THES
A1  - Grafe, Marianne Erika
T1  - Analysis of supramolecular assemblies of NE81, the first lamin protein in a non-metazoan organism
T1  - Analyse von supramolekularen Komplexen von NE81, dem ersten Lamin in einem nicht-metazoischen Organismus
N2  - Lamine sind Proteine an der inneren Kernhülle und bilden zusammen mit verbundenen Proteinen die nukleäre Lamina. Dieses Netzwerk sorgt für die Stabilität des Zellkerns und unterstützt die Organisation des Zell-Zytoskeletts. Zusätzlich sind Lamine und ihre verbundenen Proteine in viele Prozesse wie Genregulation und Zelldifferenzierung involviert. Bis 2012 war der Stand der Forschung, dass nur bei mehrzelligen Organismen eine nukleäre Lamina zu finden ist. NE81 ist das erste lamin-ähnliche Protein, das in einem nicht-mehrzelligen Organismus (Dictyostelium discoideum) entdeckt wurde. Es hat viele Eigenschaften und Strukturmerkmale mit Laminen gemeinsam. Dazu zählt der dreiteilige Aufbau des Proteins, eine Phosphorylierungsstelle für ein Zellzyklus-abhängiges Enzym, ein Kernlokalisationssignal, wodurch das Protein in den Kern transportiert wird, sowie eine C-terminale Sequenz zur Verankerung des Proteins in der Kernhülle. In dieser Arbeit wurden verschiedene Methoden zur vereinfachten Untersuchung von Laminstrukturen getestet, um zu zeigen, dass sich NE81 wie bereits bekannte Lamin-Proteine verhält und supramolekulare Netzwerke aus Laminfilamenten bildet. Zur Analyse der Struktur supramolekularer Anordnungen wurde das Protein durch Entfernen des Kernlokalisationssignals auf der äußeren Kernhülle von Dictyostelium gebildet. Die anschließende Untersuchung der Oberfläche der Kerne mit einem Rasterelektronenmikroskop zeigte, dass NE81 Strukturen in der Größe von Laminen bildet, allerdings nicht in regelmäßigen filamentösen Anordnungen. Um die Entstehung der Laminfilamente zu untersuchen, wurde lösliches NE81 aus Dictyostelium aufgereinigt und mit verschiedenen mikroskopischen Methoden untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass NE81 unter Niedrigsalz-Bedingungen dünne, fadenförmige Strukturen und Netzwerke ausbildet, die denen von Säugetier-Laminen sehr ähnlich sind. Die Mutation der Phosphorylierungsstelle von NE81 zu einer imitierenden dauerhaften Phosphorylierung von NE81 in der Zelle, zeigte zunächst ein gelöstes Protein, das überraschenderweise unter Blaulichtbestrahlung der Zelle wieder lamin-ähnliche Anordnungen formte.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass NE81 echte Laminstrukturen ausbilden kann und hebt Dictyostelium als Nicht-Säugetier-Modellorganismus mit einer gut charakterisierten Kernhülle, mit allen relevanten, aus tierischen Zellen bekannten Proteinen, hervor.
N2  - Nuclear lamins are nucleus-specific intermediate filaments forming a network located at the inner nuclear membrane of the nuclear envelope. They form the nuclear lamina together with proteins of the inner nuclear membrane regulating nuclear shape and gene expression, among others. The amoebozoan Dictyostelium NE81 protein is a suitable candidate for an evolutionary conserved lamin protein in this non-metazoan organism. It shares the domain organization of metazoan lamins and is fulfilling major lamin functions in Dictyostelium. Moreover, field-emission scanning electron microscopy (feSEM) images of NE81 expressed on Xenopus oocytes nuclei revealed filamentous structures with an overall appearance highly reminiscent to that of metazoan Xenopus lamin B2. For the classification as a lamin-like or a bona fide lamin protein, a better understanding of the supramolecular NE81 structure was necessary. Yet, NE81 carrying a large N-terminal GFP-tag turned out as unsuitable source for protein isolation and characterization; GFP-NE81 expressed in Dictyostelium NE81 knock-out cells exhibited an abnormal distribution, which is an indicator for an inaccurate assembly of GFP-tagged NE81. Hence, a shorter 8×HisMyc construct was the tag of choice to investi-gate formation and structure of NE81 assemblies. One strategy was the structural analysis of NE81 in situ at the outer nuclear membrane in Dictyostelium cells; NE81 without a func-tional nuclear localization signal (NLS) forms assemblies at the outer face of the nucleus. Ultrastructural feSEM pictures of NE81ΔNLS nuclei showed a few filaments of the expected size but no repetitive filamentous structures. The former strategy should also be established for metazoan lamins in order to facilitate their structural analysis. However, heterologously expressed Xenopus and C. elegans lamins showed no uniform localization at the outer nucle-ar envelope of Dictyostelium and hence, no further ultrastructural analysis was undertaken. For in vitro assembly experiments a Dictyostelium mutant was generated, expressing NE81 without the NLS and the membrane-anchoring isoprenylation site (HisMyc-NE81ΔNLSΔCLIM). The cytosolic NE81 clusters were soluble at high ionic strength and were purified from Dictyostelium extracts using Ni-NTA Agarose. Widefield immunofluorescence microscopy, super-resolution light microscopy and electron microscopy images of purified NE81 showed its capability to form filamentous structures at low ionic strength, as described previously for metazoan lamins. Introduction of a phosphomimetic point mutation (S122E) into the CDK1-consensus sequence of NE81 led to disassembled NE81 protein in vivo, which could be reversibly stimulated to form supramolecular assemblies by blue light exposure. 
The results of this work reveal that NE81 has to be considered a bona fide lamin, since it is able to form filamentous assemblies. Furthermore, they highlight Dictyostelium as a non-mammalian model organism with a well-characterized nuclear envelope containing all rele-vant protein components known in animal cells.
KW  - lamin
KW  - NE81
KW  - Dictyostelium
KW  - nuclear envelope
KW  - nuclear lamina
KW  - expansion microscopy
KW  - Lamin
KW  - NE81
KW  - Dictyostelium
KW  - Kernhülle
KW  - nukleäre Lamina
KW  - Expansions-Mikroskopie
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-441802
ER  -