TY - GEN A1 - He, Hai A1 - Noor, Elad A1 - Ramos-Parra, Perla A. A1 - García-Valencia, Liliana E. A1 - Patterson, Jenelle A. A1 - Díaz de la Garza, Rocío I. A1 - Hanson, Andrew D. A1 - Bar-Even, Arren T1 - In Vivo Rate of Formaldehyde Condensation with Tetrahydrofolate T2 - Postprints der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe N2 - Formaldehyde is a highly reactive compound that participates in multiple spontaneous reactions, but these are mostly deleterious and damage cellular components. In contrast, the spontaneous condensation of formaldehyde with tetrahydrofolate (THF) has been proposed to contribute to the assimilation of this intermediate during growth on C1 carbon sources such as methanol. However, the in vivo rate of this condensation reaction is unknown and its possible contribution to growth remains elusive. Here, we used microbial platforms to assess the rate of this condensation in the cellular environment. We constructed Escherichia coli strains lacking the enzymes that naturally produce 5,10-methylene-THF. These strains were able to grow on minimal medium only when equipped with a sarcosine (N-methyl-glycine) oxidation pathway that sustained a high cellular concentration of formaldehyde, which spontaneously reacts with THF to produce 5,10-methylene-THF. We used flux balance analysis to derive the rate of the spontaneous condensation from the observed growth rate. According to this, we calculated that a microorganism obtaining its entire biomass via the spontaneous condensation of formaldehyde with THF would have a doubling time of more than three weeks. Hence, this spontaneous reaction is unlikely to serve as an effective route for formaldehyde assimilation. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 998 KW - one-carbon metabolism KW - spontaneous reaction KW - auxotrophy KW - serine cycle KW - phenotypic phase plane Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-476472 SN - 1866-8372 IS - 998 ER - TY - THES A1 - He, Hai T1 - Exploring and engineering formaldehyde assimilation N2 - Increasing concerns regarding the environmental impact of our chemical production have shifted attention towards possibilities for sustainable biotechnology. One-carbon (C1) compounds, including methane, methanol, formate and CO, are promising feedstocks for future bioindustry. CO2 is another interesting feedstock, as it can also be transformed using renewable energy to other C1 feedstocks for use. While formaldehyde is not suitable as a feedstock due to its high toxicity, it is a central intermediate in the process of C1 assimilation. This thesis explores formaldehyde metabolism and aims to engineer formaldehyde assimilation in the model organism Escherichia coli for the future C1-based bioindustry. The first chapter of the thesis aims to establish growth of E. coli on formaldehyde via the most efficient naturally occurring route, the ribulose monophosphate pathway. Linear variants of the pathway were constructed in multiple-gene knockouts strains, coupling E. coli growth to the activities of the key enzymes of the pathway. Formaldehyde-dependent growth was achieved in rationally designed strains. In the final strain, the synthetic pathway provides the cell with almost all biomass and energy requirements. In the second chapter, taking advantage of the unique feature of its reactivity, formaldehyde assimilation via condensation with glycine and pyruvate by two promiscuous aldolases was explored. Facilitated by these two reactions, the newly designed homoserine cycle is expected to support higher yields of a wide array of products than its counterparts. By dividing the pathway into segments and coupling them to the growth of dedicated strains, all pathway reactions were demonstrated to be sufficiently active. The work paves a way for future implementation of a highly efficient route for C1 feedstocks into commodity chemicals. In the third chapter, the in vivo rate of the spontaneous formaldehyde tetrahydrofolate condensation to methylene-tetrahydrofolate was assessed in order to evaluate its applicability as a biotechnological process. Tested within an E. coli strain deleted in essential genes for native methylene-tetrahydrofolate biosynthesis, the reaction was shown to support the production of this essential intermediate. However, only low growth rates were observed and only at high formaldehyde concentrations. Computational analysis dependent on in vivo evidence from this strain deduced the slow rate of this spontaneous reaction, thus ruling out its substantial contribution to growth on C1 feedstocks. The reactivity of formaldehyde makes it highly toxic. In the last chapter, the formation of thioproline, the condensation product of cysteine and formaldehyde, was confirmed to contribute this toxicity effect. Xaa-Pro aminopeptidase (PepP), which genetically links with folate metabolism, was shown to hydrolyze thioproline-containing peptides. Deleting pepP increased strain sensitivity to formaldehyde, pointing towards the toxicity of thioproline-containing peptides and the importance of their removal. The characterization in this study could be useful in handling this toxic intermediate. Overall, this thesis identified challenges related to formaldehyde metabolism and provided novel solutions towards a future bioindustry based on sustainable C1 feedstocks in which formaldehyde serves as a key intermediate. N2 - Die zunehmende Besorgnis über die Auswirkungen der chemischen Produktion auf die Umwelt hat den Fokus auf die Vorzüge der nachhaltigen Biotechnologie gelenkt. Ein-Kohlenstoff-Verbindungen (C1), wie Methan, Methanol, Formiat und CO, sind vielversprechende Ausgangsstoffe für eine künftige biobasierte Industrie. Darüber hinaus ist CO2 ein weiterer interessanter Rohstoff, da es ebenfalls mit erneuerbarer Energie in andere C1-Verbindungen umgewandelt werden kann. Formaldehyd ist zwar aufgrund seiner Toxizität und Reaktivität nicht als Kohlestoffquelle geeignet, stellt aber ein zentrales Intermediat der C1-Assimilation dar. In dieser Arbeit wurde der Formaldehyd-Stoffwechsel untersucht, um Formaldehyd-Assimilations-Wege im Modellorganismus Escherichia coli für die zukünftige C1-basierte Bioindustrie zu entwickeln. Das erste Kapitel dieser Arbeit zielt darauf ab, das Wachstum von E. coli auf Formaldehyd über den energetisch effizientesten natürlich vorkommenden Weg, den Ribulose-Monophosphat-Weg (RuMP-Weg), zu etablieren. Durch Gendeletionen wurden lineare Varianten des RuMPWeges in E. coli Stämmen konstruiert, um das Wachstum mit der Aktivität der Schlüsselenzyme der Formaldehyd-Assimiliation zu verbinden. So konnte auf Formaldehydabhängiges Wachstum in diesen Stämmen getestet werden. Im finalen Stamm wurde nahezu die gesamte Biomasse und der Energiebedarf der E. coli Zellen über den RuMP-Weg bereitgestellt. Im zweiten Kapitel wurde unter Ausnutzung der einzigartigen Reaktivität des Formaldehyds die Aktivitäten zweier promiskuitiver Aldolasen für die Kondensation von Formaldehyd mit Glycin oder Pyruvat in vivo untersucht. Diese beiden Reaktionen dienen als Schlüsselreaktionen des neu gestalteten Homoserin-Zyklus, der verglichen mit anderen bekannten Assimilierungswegen höhere Ausbeuten einer breiten Palette von Produkten ermöglichen kann. Durch die Unterteilung des Stoffwechselweges in Segmente und deren Selektion in auxotrophen E. coli Stämmen wurde gezeigt, dass alle Reaktionen des Pfades ausreichend aktiv sind. Diese Arbeit ebnet den Weg für die zukünftige Nutzung des Homoserin-Zyklus als hocheffiziente Route für die Umwandlung von C1-Rohstoffen in grundlegende Chemikalien. Im dritten Kapitel wurde die in vivo-Rate der spontanen Kondensation von Formaldehyd mit Tetrahydrofolat zu Methylen-Tetrahydrofolat untersucht, um ihr Potential als Formaldehyd Assimilierungs-Reaktion in einem biotechnologischen Prozess zu bewerten. Die Reaktion wurde in einem E. coli-Stamm getestet, in welchem essentielle Gene für die native Methylen-Tetrahydrofolat-Biosynthese entfernt wurden. Es konnte gezeigt werden, dass die spontane Reaktion die Produktion dieses wesentlichen Zwischenprodukts ermöglicht. Die erreichten Wachstumsraten waren jedoch gering und nur bei hohen Formaldehydkonzentrationen zu beobachten. Eine Computer-gestützte Analyse basierend auf in vivo-Erkenntnissen über diesen Stamm ergab eine langsame Reaktionsgeschwindigkeit dieser spontanen Reaktion und schloss somit ihren wesentlichen Beitrag zum Wachstum auf C1-Einsatzmaterial aus. Seine Reaktivität macht Formaldehyd hochtoxisch. Im letzten Kapitel wurde bestätigt, dass die Bildung von Thioprolin, dem Kondensationsprodukt von Cystein und Formaldehyd, zu dieser Toxizitätswirkung beiträgt. Es wurde gezeigt, dass die Xaa-Pro-Aminopeptidase (PepP), die genetisch mit dem Folat-Stoffwechsel verbunden ist, thioprolinhaltige Peptide hydrolysiert. Die Deletion von PepP erhöhte die Empfindlichkeit des Stammes gegenüber Formaldehyd, was auf die Toxizität der Thioprolin-haltigen Peptide und die Bedeutung ihrer Entfernung hinweist. Diese Studie kann für den Umgang mit der Toxizität von Formaldehyd nützlich sein. Insgesamt identifizierte diese Arbeit Herausforderungen im Zusammenhang mit dem Formaldehyd-Stoffwechsel und lieferte neue Lösungen für eine C1-basierte Bioindustrie, in der Formaldehyd als wichtiges Zwischenprodukt dient. T2 - Erforschung und Entwicklung der Formaldehyd-Assimilierung KW - formaldehyde assimilation KW - ribulose monophosphate pathway KW - metabolic engineering KW - serine cycle KW - auxotrophy KW - methylotrophy KW - Auxotrophie KW - Serin-Zyklus KW - Ribulose-Monophosphat-Weg KW - Methylotrophie KW - metabolisches Engineering KW - Formaldehyd-Assimilierung Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-473867 ER -