TY - THES A1 - Fuchs, Iris Judith T1 - Untersuchungen zur chemischen Transformation von intestinalen Epithelzellen der Ratte und des Menschen durch 2-Hydroxyamino-1-methyl-6-phenylimidazo(4,5-b)pyridin T1 - Investigations to chemical transformation of rat and human intestinal epithelial cells by 2-hydroxyamino-1-methyl-6-phenylimidazo(4,5-b)pyridine N2 - Die Zahl der Kolonkarzinome in den westlichen Industrieländern steigt in den letzten Jahren stetig an. Zu den Verbindungen, die mit der Zubereitung der Nahrung entstehen, mit ihr aufgenommen werden und die Kolonkanzerogenese möglicherweise begünstigen, gehört das heterozyklische aromatische PhIP, das bei der Erhitzung proteinreicher Nahrungsmittel entsteht. Neben zahlreichen Fütterungsversuchen an Nagern existieren auch Zellkulturmodelle zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der PhIP-induzierten Kolonkanzerogenese. Die chemische Transformation von Zellen sollte durch wiederholte Exposition gegenüber dem hydroxylierten Metaboliten des Kanzerogens (N2-OH-PhIP) erzielt werden. Es wurden IEC-18-Zellen der Ratte und HCEC-Zellen des Menschen zur Untersuchung verwendet. Die Behandlung der IEC-18-Zellen führt nach 25 Behandlungszyklen mit Konzentrationen von 5 bis 20 µM nicht zur Transformation der Zellen. Die Anwesenheit von N2-OH-PhIP führt zu einer zehnfach erhöhten Induktion der GST-Aktivität, insbesondere der Untereinheiten GST-A1, -A3, -Pi und -T2, die für die effiziente Detoxifizierung des N-Acetoxy-Metaboliten vom N2-OH-PhIP verantwortlich sind. Bereits nach drei Behandlungen mit 1,5 µM N2-OH-PhIP konnte eine maligne Transformation der HCEC-Zellen erzielt werden. Die Zellen zeigten die charakteristischen Zeichen der Transformation: veränderte Wachstumseigenschaften wie klonales dreidimensionales Zellwachstum („pilling up“), Hemmung der Zell-Zell-Kontaktinhibierung, verkürzte Populationsverdopplungszeiten und tumorigene und metastasierende Eigenschaften. Außerdem exprimierten die N2-OH-PhIP-exponierten humanen Kolonzellen mit steigender Anzahl der Behandlungen größere Mengen des trunkierten APC-Proteins. Die bekannten PhIP-spezifischen Mutationen im APC-Gen resultieren in der Expression eines trunkierten Proteinproduktes und werden als frühe Ereignisse in der Kolonkanzerogenese betrachtet. Die zusammenfassende Betrachtung aller Ergebnisse zeigt, dass die IEC-18-Zelllinie zur chemischen Transformation durch N2-OH-PhIP ungeeignet ist. Dagegen wurde erstmalig eine vollständige chemische Transformation von Humandickdarmepithelzellen in vitro durch Exposition der humanen Kolonepithelzelllinie HCEC gegenüber dem Kolonkarzinogen N2-OH-PhIP erzielt. N2 - In the last few years a strong increase in the incidence of colorectal cancer has been observed. As to the specific components in processed food responsible for the induction of colon cancerogenesis , it has been suggested that heterocyclic aromatic amines (HAA), e.g. the most abundant HAA 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP), which is formed in protein rich food, when it is cooked at high temperatures or over an open flame, might be involved in this process. Whereas a number of in vivo-models to study PhIP-mediated colon carcinogenesis are known, only a limited number of cell culture systems to study the HAA-mediated transformation of intestinal epithelial cells do in fact exist. In the present study IEC-18 cells (rat intestinal epithelial cells) and HCEC cells (human colon epithelial cells) were incubated with N2-OH-PhIP, the N-hydroxylated metabolite of PhIP. The IEC-18 cells could not be transformed despite 25 treatment cycles with 5 to 20 µM N2-OH-PhIP. This might be due to the fact that GST activity as well as the expression of the GST -A1, -A3, -Pi and -T2 units, which are responsible for the detoxication of the N-acetoxy derivative of PhIP were strongly induced by N2-OH-PhIP. In contrast, HCEC cells were malignantly transformed when exposed three times to 1.5 µM N2-OH-PhIP. The chemically-treated cells showed a reduced population doubling time, they lost cell-cell contact inhibition and started pilling up. Furthermore, if HCEC cells were injected subcutaneously into SCID mice tumors developed at the site of injection in all animals tested. The transformed HCEC cells also express high amounts of truncated APC protein, which in vivo appears at an early stage of colon cancerogenesis. Taken together, it has been shown that IEC-18 cells are not suitable for chemical transformation studies with the HAA metabolite N2-OH-PhIP. For the first time it has been shown that the HAA metabolite N2-OH-PhIP is indeed able to malignantly transform human colon epithelial cells in vitro. KW - maligne Transformation KW - Kolonkrebs KW - heterozyklische aromatische Amine KW - intestinale Epithelzellen KW - colorectal cancer KW - heterocyclic aromatic amines KW - intestinal epithelial cells KW - malignant transformation Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-11807 ER - TY - THES A1 - Bertz, Martin T1 - Funktion von Selenoproteinen  während der kolorektalen Karzinogenese T1 - The role of selenoproteins in colorectal carcinogenesis N2 - Kolorektalkrebs (CRC) ist die dritthäufigste Tumorerkrankung weltweit. Neben dem Alter spielt auch die Ernährung eine wichtige Rolle bei der Entstehung der Krankheit. Eine vermutlich krebspräventive Wirkung wird dabei dem Spurenelement Selen zugeschrieben, das fast ausschließlich über Lebensmittel aufgenommen wird. So hängt beispielsweise ein niedriger Selenstatus mit dem Risiko, im Laufe des Lebens an CRC zu erkranken, zusammen. Seine Funktionen vermittelt Selen dabei überwiegend durch Selenoproteine, in denen es in Form von Selenocystein eingebaut wird. Zu den bisher am besten untersuchten Selenoproteinen mit möglicher Funktion während CRC zählen die Glutathionperoxidasen (GPXen). Die Mitglieder dieser Familie tragen aufgrund ihrer Hydroperoxid-reduzierenden Eigenschaften entscheidend zum Schutz der Zellen vor oxidativem Stress bei. Dies kann je nach Art und Stadium des Tumors entweder krebshemmend oder -fördernd wirken, da auch transformierte Zellen von dieser Schutzfunktion profitieren. In dieser Arbeit wurde die GPX2 in HT29-Darmkrebszellen mithilfe stabil-transfizierter shRNA herunterreguliert, um die Funktion des Enzyms vor allem in Hinblick auf regulierte Signalwege zu untersuchen. Ein Knockdowns (KD) der strukturell ähnlichen GPX1 kam ebenfalls zum Einsatz, um gezielt Isoform-spezifische Funktionen unterscheiden zu können. Anhand eines PCR-Arrays wurden Signalwege identifiziert, die auf einen Einfluss der beiden Proteine im Zellwachstum hindeuteten. Anschließende Untersuchungen ließen auf einen verminderten Differenzierungsstatus in den GPX1- und GPX2-KDs aufgrund einer geringeren Aktivität der Alkalischen Phosphatase schließen. Zudem war die Zellviabilität im Neutralrot-Assay (NRU) bei Fehlen der GPX1 bzw. GPX2 im Vergleich zur Kontrolle reduziert. Die Ergebnisse des PCR-Arrays, und speziell für die GPX2 frühere Untersuchungen der Arbeitsgruppe, wiesen weiterhin auf eine Rolle der beiden Proteine in der entzündungsgetriebenen Karzinogenese hin. Daher wurden auch mögliche Interaktionen mit dem NFκB-Signalweg analysiert. Eine Stimulation der Zellen mit dem proinflammatorischen Zytokin IL1β ging mit einer verstärkten Aktivierung der MAP-Kinasen ERK1/2 in den Zellen mit GPX1- bzw. GPX2-KD einher. Die gleichzeitige Behandlung mit dem Antioxidans NAC führte nicht zur Rücknahme der Effekte in den KDs, sodass möglicherweise nicht nur die antioxidativen Eigenschaften der Enzyme bei der Interaktion mit diesen Signalwegsproteinen relevant sind. Weiterhin wurden Analysen zum Substratspektrum der GPX2 in HCT116-Zellen mit einer Überexpression des Proteins durchgeführt. Dabei zeigte sich mittels NRU-Assay und DNA-Laddering, dass die GPX2 besonders vor den proapoptotischen Effekten einer Behandlung mit den Lipidhydroperoxiden HPODE und HPETE schützt. Im Gegensatz zur GPX2 lässt sich Selenoprotein H (SELENOH) stärker durch die alimentäre Selenzufuhr beeinflussen. Einer möglichen Nutzung als Biomarker oder gar als Ansatzpunkt bei der Prävention bzw. Behandlung von CRC steht allerdings unvollständiges Wissen über die Funktion des Proteins gegenüber. Zur genaueren Charakterisierung von SELENOH wurden daher stabil-transfizierte KD-Klone in HT29- und Caco2-Zellen hergestellt und zunächst auf ihre Tumorigenität untersucht. Zellen mit SELENOH-KD bildeten mehr und größere Kolonien im Soft Agar und zeigten ein erhöhtes Proliferations- und Migrationspotenzial im Vergleich zur Kontrolle. Ein Xenograft in Nacktmäusen resultierte zudem in einer stärkeren Tumorbildung nach Injektion von KD-Zellen. Untersuchungen zur Beteiligung von SELENOH an der Zellzyklusregulation deuten auf eine hemmende Rolle des Proteins in der G1/S-Phase hin. Die weiterhin beobachtete Hochregulation von SELENOH in humanen Adenokarzinomen und präkanzerösem Mausgewebe lässt sich möglicherweise mit der postulierten Schutzfunktion vor oxidativen Zell- und DNA-Schäden erklären. In gesunden Darmepithelzellen war das Protein vorrangig am Kryptengrund lokalisiert, was zu einer potenziellen Rolle während der gastrointestinalen Differenzierung passt. N2 - Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer worldwide. In addition to age, diet also plays an important role in the onset of the disease. The trace element selenium, which is absorbed almost exclusively from food, has been accredited with a cancer-preventive effect. For instance, a low selenium status is associated with the risk of developing CRC. The biological functions of selenium are predominantly mediated by selenoproteins, in which the element is incorporated in the form of selenocysteine. Glutathione peroxidases (GPXs) are among the most studied selenoproteins with potential functions during CRC. The members of this family are crucial for protecting cells from oxidative stress due to their hydroperoxide- reducing properties. These properties can either be anti- or procarcinogenic, depending on the type and stage of the tumor, since transformed cells may also benefit from this protection. In the course of this thesis, GPX2 was downregulated in HT29 colon cancer cells using stably transfected shRNA to investigate the proteins’ function, with particular respect to potentially regulated signaling pathways. A knockdown (KD) of the structurally similar GPX1 was also utilised to discriminate between isoform-specific effects. Signaling pathways related to cell growth were shown to be influenced by the KDs in a PCR array. Subsequent studies revealed a decreased differentiation status (lower activity of the enzyme alkaline phosphatase) in cells lacking GPX1 or GPX2. In addition, cell viability was reduced in the absence of either protein compared to the control when testing the neutral red uptake (NRU). Results of the PCR array as well as earlier findings of our research group suggested a role of both GPX1 and GPX2 in inflammation-driven carcinogenesis. Therefore, potential interactions with the NFκB signaling pathway were analyzed. Treatment using the proinflammatory cytokine IL1β was accompanied by an increased activation of the MAP kinases ERK1/2 in cells with a KD of GPX1 and GPX2, respectively. Concomitant administration of the antioxidant NAC did not reverse the observed effects, indicating that maybe not only the antioxidant properties of the enzymes were relevant for the interaction with these signaling proteins. Also, the substrate spectrum of GPX2 was analysed in HCT116 cells overexpressing the enzyme. By means of NRU assay and DNA laddering it was shown that GPX2 preferably protected cancer cells against the proapoptotic effects of the lipid hydroperoxides HPODE and HPETE. In contrast to GPX2, selenoprotein H (SELENOH) might be more easily influenced by the selenium content in the diet. Due to incomplete knowledge about the function of the protein, a prospective use as a biomarker or even as a target in the prevention or treatment of CRC has not been feasible. Therefore, stably transfected SELENOH-KD clones in HT29 and Caco2 cells were created to further characterise the protein. Interestingly, SELENOH-KD cells formed more and larger colonies in soft agar assay and showed increased proliferation as well as migration potential compared to control cells. Injecting tumour cells into nude mice resulted in larger tumour growth with the protein being knocked down. SELENOH was further shown to regulate the cell cycle by potentially inhibiting the transition from G1 to S phase. The observed upregulation of SELENOH in human adenocarcinomas and precancerous mouse tissue was consistent with the postulated role of the protein in protecting cells from oxidative DNA damage. In healthy intestinal epithelial cells, the protein was located predominantly at the crypt base, suggesting a function during gastrointestinal differentiation. KW - GPX KW - Selen KW - SELENOH KW - CRC KW - Darmkrebs KW - glutathione peroxidase KW - selenium KW - SELENOH KW - CRC KW - colorectal cancer Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-427808 ER -