TY - THES A1 - Marschan, Xenia T1 - Mikroarray-basierte Detektion von mRNA aus Zellen mittels On-Chip-PCR T1 - Microarray based detection of cellular mRNA by On-Chip-PCR N2 - Bei konventionellen Mikroarray-Experimenten zur Genexpressionsanalyse wird fluoreszenz- oder radioaktiv-markierte cDNA oder RNA mit immobilisierten Proben hybridisiert. Für ein gut detektierbares und auswertbares Ergebnis werden jedoch pro Array mindestens 15 - 20 µg Hybridisierungstarget benötigt. Dazu müssen entweder 15 - 20 µg RNA direkt durch Reverse Transkription in markierte cDNA umgeschrieben werden oder bei Vorhandensein von weniger Startmaterial die RNA amplifiziert werden (Standard- Affymetrix-Protokolle, Klur et al. 2004). Oft sind damit zeit- und kostenintensive Probenpräparationen verbunden und das Ergebnis ist nicht immer reproduzierbar. Obwohl es inzwischen einige Protokolle gibt, die dieses Problem zu lösen versuchen (Zhang et al. 2001, Iscove et al. 2002, McClintick et al. 2003, Stirewalt et al. 2004), eine optimale, leicht handbare und reproduzierbare Methode gibt es weiterhin nicht, weshalb in dieser Arbeit ein weiterer Lösungsansatz gesucht wurde. In der vorgestellten Arbeit werden zwei einfache Methoden beschrieben, mit denen Gene aus geringen RNA-Mengen nachgewiesen werden können: erstens die On Chip- RT-PCR mit cDNA als Matrize und zweitens diese Methode als One-Step-Reaktion mit RNA als Matrize. Beide Methoden beruhen auf dem Prinzip der PCR an immobilisierten Primern auf einer Chipoberfläche. Diese Möglichkeit der exponentiellen Amplifikation ist reproduzierbar und sensitiv. In Experimenten zur Etablierung des On-Chip-PCR-Systems wurden für die Immobilisierung der Primer verschiedene Kopplungsmethoden verwendet. Die affine Kopplung über Biotin- Streptavidin erwies sich als geeignet. Die On-Chip-Reaktion an kovalent gebundenen Primern wurde für amino-modifizierte Primer auf Epoxy-Oberflächen sowie für EDC-Kopplung auf silanisierten Oberflächen gezeigt. Für die letztgenannte Methode wurde die On-Chip-PCR optimiert, dass Spottingkonzentrationen der Primer von 5 - 10µM schon ausreichend sind. Der Einsatz von fluoreszenz-markierten Primern während der PCR ermöglicht eine unmittelbare Auswertung nach der Synthese ohne zusätzliche Detektionsschritte. In dieser Arbeit konnte außerdem mit der vorgestellten Methode der simultane Nachweis zweier Gene gezeigt werden. Die Methode kann noch als Multiplex-Analyse ausgebaut werden, um so mehrere Gene in gleichzeitig einem Ansatz nachweisen zu können. Die Ergebnisse der Versuche mit Matrizen aus unterschiedlichen Zelltypen deuten darauf hin, dass die On-Chip-RT-PCR eine weitere optimale Methode für den Nachweis von gering exprimierten Genen bietet. N2 - The detection of low quantities of mRNA is often difficult and methods like microarray analysis require large amount of starting material or have to be amplified before application. The reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) is often the chosen method to detect specific RNA sequences on account of its high sensitivity. The solid phase amplification technology by On-Chip-PCR provides a combination of amplification of rare target material and its on chip detection in one step. In this report a novel application for the On-Chip-PCR technology is described. It was suitable to identify mRNA sequences and genes, respectively. For this approach we amplified cDNA sequences using immobilized specific primers and fluorescent labeled primers. They were used for genes coding subunits of the mouse muscle acetylcholine receptor (Chrna1, Chrnb1, Chrnd) and the genes coding for myogenin (Myog), muscle creatine kinase (Ckmm) and Atpase (Atp2a2). The cDNA templates were synthesized before the On-Chip application by Reverse Transcription from mRNA. For this application only at most 500 pg of total-RNA preparation was sufficient for detectable results and no pre-amplification steps were needed. Furthermore the handling of RT-PCR could be minimized by using a One-step- RT-PCR protocol. This method used immobilized primers on glassy supports detecting specific mRNA sequences from 5 pg or less of total RNA preparations. Moreover to the detection of low quantities of RNA preparation, low abundant genes could be detected by this method. KW - Polymerase-Kettenreaktion KW - Microarray KW - Messenger-RNS KW - Genexpression KW - On-Chip-PCR KW - mRNA KW - Reverse Transkription KW - RT-PCR KW - On-Chip-PCR KW - mRNA KW - Reverse Transcription KW - RT-PCR Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5457 ER - TY - THES A1 - Hammer, Paul T1 - Transkriptomweite Untersuchungen von Prostata-Krebszelllinien im Kontext medizinischer Strahlentherapie T1 - Transcriptome-wide studies of prostate cancer cell lines in the context of medical radiation N2 - Die Strahlentherapie ist neben der Chemotherapie und einer operativen Entfernung die stärkste Waffe für die Bekämpfung bösartiger Tumore in der Krebsmedizin. Nach Herz-Kreislauf-Erkrankungen ist Krebs die zweithäufigste Todesursache in der westlichen Welt, wobei Prostatakrebs heutzutage die häufigste, männliche Krebserkrankung darstellt. Trotz technologischer Fortschritte der radiologischen Verfahren kann es noch viele Jahre nach einer Radiotherapie zu einem Rezidiv kommen, was zum Teil auf die hohe Resistenzfähigkeit einzelner, entarteter Zellen des lokal vorkommenden Tumors zurückgeführt werden kann. Obwohl die moderne Strahlenbiologie viele Aspekte der Resistenzmechanismen näher beleuchtet hat, bleiben Fragestellungen, speziell über das zeitliche Ansprechen eines Tumors auf ionisierende Strahlung, größtenteils unbeantwortet, da systemweite Untersuchungen nur begrenzt vorliegen. Als Zellmodelle wurden vier Prostata-Krebszelllinien (PC3, DuCaP, DU-145, RWPE-1) mit unterschiedlichen Strahlungsempfindlichkeiten kultiviert und auf ihre Überlebensfähigkeit nach ionisierender Bestrahlung durch einen Trypanblau- und MTT-Vitalitätstest geprüft. Die proliferative Kapazität wurde mit einem Koloniebildungstest bestimmt. Die PC3 Zelllinie, als Strahlungsresistente, und die DuCaP Zelllinie, als Strahlungssensitive, zeigten dabei die größten Differenzen bezüglich der Strahlungsempfindlichkeit. Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurden die beiden Zelllinien ausgewählt, um anhand ihrer transkriptomweiten Genexpressionen, eine Identifizierung potentieller Marker für die Prognose der Effizienz einer Strahlentherapie zu ermöglichen. Weiterhin wurde mit der PC3 Zelllinie ein Zeitreihenexperiment durchgeführt, wobei zu 8 verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 1 Gy die mRNA mittels einer Hochdurchsatz-Sequenzierung quantifiziert wurde, um das dynamisch zeitversetzte Genexpressionsverhalten auf Resistenzmechanismen untersuchen zu können. Durch das Setzen eines Fold Change Grenzwertes in Verbindung mit einem P-Wert < 0,01 konnten aus 10.966 aktiven Genen 730 signifikant differentiell exprimierte Gene bestimmt werden, von denen 305 stärker in der PC3 und 425 stärker in der DuCaP Zelllinie exprimiert werden. Innerhalb dieser 730 Gene sind viele stressassoziierte Gene wiederzufinden, wie bspw. die beiden Transmembranproteingene CA9 und CA12. Durch Berechnung eines Netzwerk-Scores konnten aus den GO- und KEGG-Datenbanken interessante Kategorien und Netzwerke abgeleitet werden, wobei insbesondere die GO-Kategorien Aldehyd-Dehydrogenase [NAD(P)+] Aktivität (GO:0004030) und der KEGG-Stoffwechselweg der O-Glykan Biosynthese (hsa00512) als relevante Netzwerke auffällig wurden. Durch eine weitere Interaktionsanalyse konnten zwei vielversprechende Netzwerke mit den Transkriptionsfaktoren JUN und FOS als zentrale Elemente identifiziert werden. Zum besseren Verständnis des dynamisch zeitversetzten Ansprechens der strahlungsresistenten PC3 Zelllinie auf ionisierende Strahlung, konnten anhand der 10.840 exprimierten Gene und ihrer Expressionsprofile über 8 Zeitpunkte interessante Einblicke erzielt werden. Während es innerhalb von 30 min (00:00 - 00:30) nach Bestrahlung zu einer schnellen Runterregulierung der globalen Genexpression kommt, folgen in den drei darauffolgenden Zeitabschnitten (00:30 - 01:03; 01:03 - 02:12; 02:12 - 04:38) spezifische Expressionserhöhungen, die eine Aktivierung schützender Netzwerke, wie die Hochregulierung der DNA-Reparatursysteme oder die Arretierung des Zellzyklus, auslösen. In den abschließenden drei Zeitbereichen (04:38 - 09:43; 09:43 - 20:25; 20:25 - 42:35) liegt wiederum eine Ausgewogenheit zwischen Induzierung und Supprimierung vor, wobei die absoluten Genexpressionsveränderungen ansteigen. Beim Vergleich der Genexpressionen kurz vor der Bestrahlung mit dem letzten Zeitpunkt (00:00 - 42:53) liegen mit 2.670 die meisten verändert exprimierten Gene vor, was einer massiven, systemweiten Genexpressionsänderung entspricht. Signalwege wie die ATM-Regulierung des Zellzyklus und der Apoptose, des NRF2-Signalwegs nach oxidativer Stresseinwirkung und die DNA-Reparaturmechanismen der homologen Rekombination, des nicht-homologen End Joinings, der MisMatch-, der Basen-Exzision- und der Strang-Exzision-Reparatur spielen bei der zellulären Antwort eine tragende Rolle. Äußerst interessant sind weiterhin die hohen Aktivitäten RNA-gesteuerter Ereignisse, insbesondere von small nucleolar RNAs und Pseudouridin-Prozessen. Demnach scheinen diese RNA-modifizierenden Netzwerke einen bisher unbekannten funktionalen und schützenden Einfluss auf das Zellüberleben nach ionisierender Bestrahlung zu haben. All diese schützenden Netzwerke mit ihren zeitspezifischen Interaktionen sind essentiell für das Zellüberleben nach Einwirkung von oxidativem Stress und zeigen ein komplexes aber im Einklang befindliches Zusammenspiel vieler Einzelkomponenten zu einem systemweit ablaufenden Programm. N2 - The use of radiotherapy in addition to chemotherapy and surgical removal is the most powerful instrument in the fight against malignant tumors in cancer medicine. After cardiovascular diseases, cancer is the second leading cause of death in the western world, in which prostate cancer is the most frequent male cancer. Despite continuous technological improvements in radiological instruments and prognosis, it may occur a recurrence up to many years after radiotherapy due to a high resistance capability of individual malignant cells of the locally occurring tumor. Although modern radiation biology has studied many aspects of the resistance mechanisms, questions are largely unanswered especially in regards to prognostic terms and time response of tumor cells to ionizing radiation. As cellular models four prostate cancer cell lines with different radiation sensitivities (PC3, DuCaP, DU-145, RWPE-1) were cultured and tested for their ability to survive after exposure to ionizing radiation by a trypane blue and MTT viability assay. The proliferative capacity of the four cell lines was determined using a colony formation assay. The PC3 cell line (radiation-resistant) and the DuCaP cell line (radiation-sensitive) showed the maximal differences in terms of radiation sensitivity. Based on these results the two cell lines were selected to allow identification of potential prognostic marker for predicting the effectiveness of radiation therapy via their transcriptome-wide gene expression. Furthermore, a time series experiment with the radiation-resistant PC3 cell line was performed. At 8 different time points, during the period from 00:00 - 42:53 (hh:mm) after exposure with 1 Gy, the mRNA was quantified by next generation sequencing to investigate the dynamic behavior of time-delayed gene expression and to discover resistance mechanisms. Of 10,966 expressed genes 730 were significant differentially expressed, determined by setting a fold change threshold in conjunction with a P-value < 0.01. Of those 305 were more strongly expressed in PC3 cell line and 425 were more strongly expressed in the DuCaP cell line. Within these 730 genes many known stress-associated genes could be found, such as the two trans-membrane protein genes CA9 and CA12, which are associated with increased radiation resistance. By calculating a network score interesting networks were derived by the GO and KEGG databases. In particular the GO categories aldehyde dehydrogenase [NAD(P)+] activity (GO:0004030) as well as the KEGG pathway of O-glycan biosynthesis (hsa00512) seems to be remarkably relevant. An interaction analysis revealed two promising networks with the transcription factors JUN and FOS as central elements. High expression of the JUN network would be stand as indicator for radiation resistance whereas a high expression of the FOS network is equated with radiation sensitivity. Interesting insights could be achieved by analyzing the 10,840 expressed genes of the PC3 cell line and its expression profile over the 8 time points. Shortly after irradiation (00:00 - 00:30) a transcriptome-wide down-regulation occurred, within the next three, short time periods (00:30 - 01:03; 01:03 - 02:12; 02:12 - 04:38) a predominant increase of gene expression and the activation of protective networks followed, such as the up-regulation of DNA repair systems or the arresting of cell cycle. In the ensuing three time periods (4:38 - 09:43; 09:43 - 20:25; 20:25 - 42:35) a balance between gene induction and suppression was present and the absolute gene expression change was increased. When comparing the gene expression prior to irradiation with the last time point (00:00 - 42:53) 2,670 genes were differentially expressed, suggesting a massive and system-wide change of gene expression. Signaling pathways such as the ATM-regulated cell cycle and apoptosis, the Nrf2 pathway after oxidative stress exposure, the DNA repair mechanisms of homologous recombination, the non-homologous end joining, the mismatch repair, base-excision repair and strand-excision repair play a major role. Very interesting are the high activity of RNA-driven events, especially activities of small nucleolar RNAs and pseudouridine processes. This suggests that these RNA-modifying networks could have a hitherto unknown functional and protective effect on cell survival after exposure to ionizing radiation. All these protective networks and their time-specific interactions are essential for the survival of cells after exposure to oxidative stress and show a complex but consistent interaction of many individual components to a system-wide running program. KW - Strahlenbiologie KW - Sequenzierung KW - Resistenzmechanismen KW - Genexpression KW - Prostatakrebs KW - radiation biology KW - next generation sequencing KW - prostate cancer KW - resistance mechanisms KW - gene expression Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-63190 ER - TY - THES A1 - Daub, Carsten Oliver T1 - Analysis of integrated transcriptomics and metabolomics data : a systems biology approach N2 - Moderne Hochdurchsatzmethoden erlauben die Messung einer Vielzahl von komplementären Daten und implizieren die Existenz von regulativen Netzwerken auf einem systembiologischen Niveau. Ein üblicher Ansatz zur Rekonstruktion solcher Netzwerke stellt die Clusteranalyse dar, die auf einem Ähnlichkeitsmaß beruht. Wir verwenden das informationstheoretische Konzept der wechselseitigen Information, das ursprünglich für diskrete Daten definiert ist, als Ähnlichkeitsmaß und schlagen eine Erweiterung eines für gewöhnlich für die Anwendung auf kontinuierliche biologische Daten verwendeten Algorithmus vor. Wir vergleichen unseren Ansatz mit bereits existierenden Algorithmen. Wir entwickeln ein geschwindigkeitsoptimiertes Computerprogramm für die Anwendung der wechselseitigen Information auf große Datensätze. Weiterhin konstruieren und implementieren wir einen web-basierten Dienst fuer die Analyse von integrierten Daten, die durch unterschiedliche Messmethoden gemessen wurden. Die Anwendung auf biologische Daten zeigt biologisch relevante Gruppierungen, und rekonstruierte Signalnetzwerke zeigen Übereinstimmungen mit physiologischen Erkenntnissen. N2 - Recent high-throughput technologies enable the acquisition of a variety of complementary data and imply regulatory networks on the systems biology level. A common approach to the reconstruction of such networks is the cluster analysis which is based on a similarity measure. We use the information theoretic concept of the mutual information, that has been originally defined for discrete data, as a measure of similarity and propose an extension to a commonly applied algorithm for its calculation from continuous biological data. We compare our approach to previously existing algorithms. We develop a performance optimised software package for the application of the mutual information to large-scale datasets. Furthermore, we design and implement a web-based service for the analysis of integrated data measured with different technologies. Application to biological data reveals biologically relevant groupings and reconstructed signalling networks show agreements with physiological findings. KW - Transinformation KW - wechselseitige Information KW - Ähnlichkeitsmaß KW - Genexpression KW - mutual information KW - distance measure KW - gene expression Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001251 ER - TY - THES A1 - Boeuf, Stéphane T1 - Comparative study of gene expression during the differentiation of white and brown preadipocytes N2 - Einleitung Säugetiere haben zwei verschiedene Arten von Fettgewebe: das weiße Fettgewebe, welches vorwiegend zur Lipidspeicherung dient, und das braune Fettgewebe, welches sich durch seine Fähigkeit zur zitterfreien Thermogenese auszeichnet. Weiße und braune Adipozyten sind beide mesodermalen Ursprungs. Die Mechanismen, die zur Entwicklung von Vorläuferzellen in den weißen oder braunen Fettzellphenotyp führen, sind jedoch unbekannt. Durch verschiedene experimentelle Ansätze konnte gezeigt werden, daß diese Adipocyten vermutlich durch die Differenzierung zweier Typen unterschiedlicher Vorläuferzellen entstehen: weiße und braune Preadipozyten. Von dieser Hypothese ausgehend, war das Ziel dieser Studie, die Genexpression weißer und brauner Preadipozyten auf Unterschiede systematisch zu analysieren. Methoden Die zu vergleichenden Zellen wurden aus primären Zellkulturen weißer und brauner Preadipozyten des dsungarischen Zwerghamsters gewonnen. „Representational Difference Analysis“ wurde angewandt, um potentiell unterschiedlich exprimierte Gene zu isolieren. Die daraus resultierenden cDNA Fragmente von Kandidatengenen wurden mit Hilfe der Microarraytechnik untersucht. Die Expression dieser Gene wurde in braunen und weißen Fettzellen in verschiedenen Differenzierungsstadien und in braunem und weißem Fettgewebe verglichen. Ergebnisse 12 Gene, die in braunen und weißen Preadipozyten unterschiedlich exprimiert werden, konnten identifiziert werden. Drei Komplement Faktoren und eine Fettsäuren Desaturase werden in weißen Preadipozyten höher exprimiert; drei Struktur Gene (Fibronectin, Metargidin und a Actinin 4), drei Gene verbunden mit transkriptioneller Regulation (Necdin, Vigilin und das „small nuclear ribonucleoprotein polypeptide A“) sowie zwei Gene unbekannter Funktion werden in braunen Preadipozyten höher exprimiert. Mittels Clusteranalyse (oder Gruppenanalyse) wurden die gesamten Genexpressionsdaten charakterisiert. Dabei konnten die Gene in 4 typischen Expressionsmuster aufgeteilt werden: in weißen Preadipozyten höher exprimierte Gene, in braunen Preadipozyten höher exprimierte Gene, während der Differenzierung herunter regulierte Gene und während der Differenzierung hoch regulierte Gene. Schlußfolgerungen In dieser Studie konnte gezeigt werden, daß weiße und braune Preadipozyten aufgrund der Expression verschiedener Gene unterschieden werden können. Es wurden mehrere Kandidatengene zur Bestimmung weißer und brauner Preadipozyten identifiziert. Außerdem geht aus den Genexpressionsdaten hervor, daß funktionell unterschiedliche Gruppen von Genen eine wichtige Rolle bei der Differenzierung von weißen und braunen Preadipozyten spielen könnten, wie z.B. Gene des Komplementsystems und der extrazellulären Matrix. N2 - Introduction Mammals have two types of adipose tissue: the lipid storing white adipose tissue and the brown adipose tissue characterised by its capacity for non-shivering thermogenesis. White and brown adipocytes have the same origin in mesodermal stem cells. Yet nothing is known so far about the commitment of precursor cells to the white and brown adipose lineage. Several experimental approaches indicate that they originate from the differentiation of two distinct types of precursor cells, white and brown preadipocytes. Based on this hypothesis, the aim of this study was to analyse the gene expression of white and brown preadipocytes in a systematic approach. Experimental approach The white and brown preadipocytes to compare were obtained from primary cell cultures of preadipocytes from the Djungarian dwarf hamster. Representational difference analysis was used to isolate genes potentially differentially expressed between the two cell types. The thus obtained cDNA libraries were spotted on microarrays for a large scale gene expression analysis in cultured preadipocytes and adipocytes and in tissue samples. Results 4 genes with higher expression in white preadipocytes (3 members of the complement system and a fatty acid desaturase) and 8 with higher expression in brown preadipocytes were identified. From the latter 3 coded for structural proteins (fibronectin, metargidin and a actinin 4), 3 for proteins involved in transcriptional regulation (necdin, vigilin and the small nuclear ribonucleoprotein polypeptide A) and 2 are of unknown function. Cluster analysis was applied to the gene expression data in order to characterise them and led to the identification of four major typical expression profiles: genes up-regulated during differentiation, genes down-regulated during differentiation, genes higher expressed in white preadipocytes and genes higher expressed in brown preadipocytes. Conclusion This study shows that white and brown preadipocytes can be distinguished by different expression levels of several genes. These results draw attention to interesting candidate genes for the determination of white and brown preadipocytes (necdin, vigilin and others) and furthermore indicate that potential importance of several functional groups in the differentiation of white and brown preadipocytes, mainly the complement system and extracellular matrix. KW - Säugetiere ; Fettgewebe ; Zelldifferenzierung ; Genexpression KW - Preadipozyt KW - Adipozyt KW - Fettzelle KW - braunes Fettgewebe KW - Differenzierung KW - Genexpression KW - Microarray KW - preadipocyte KW - adipocyte KW - brown adipose tissue KW - differentiation KW - gene expression KW - microarray Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000542 ER -