TY - THES A1 - Dunsing, Valentin T1 - Fluorescence fluctuation spectroscopy techniques to quantify molecular interactions and dynamics in complex biological systems N2 - Living cells rely on transport and interaction of biomolecules to perform their diverse functions. A powerful toolbox to study these highly dynamic processes in the native environment is provided by fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) techniques. In more detail, FFS takes advantage of the inherent dynamics present in biological systems, such as diffusion, to infer molecular parameters from fluctuations of the signal emitted by an ensemble of fluorescently tagged molecules. In particular, two parameters are accessible: the concentration of molecules and their transit times through the observation volume. In addition, molecular interactions can be measured by analyzing the average signal emitted per molecule - the molecular brightness - and the cross-correlation of signals detected from differently tagged species. In the present work, several FFS techniques were implemented and applied in different biological contexts. In particular, scanning fluorescence correlation spectroscopy (sFCS) was performed to measure protein dynamics and interactions at the plasma membrane (PM) of cells, and number and brightness (N&B) analysis to spatially map molecular aggregation. To account for technical limitations and sample related artifacts, e.g. detector noise, photobleaching, or background signal, several correction schemes were explored. In addition, sFCS was combined with spectral detection and higher moment analysis of the photon count distribution to resolve multiple species at the PM. Using scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy and cross-correlation N&B, the interactions of amyloid precursor-like protein 1 (APLP1), a synaptic membrane protein, were investigated. It is shown for the first time directly in living cells, that APLP1 undergoes specific interactions at cell-cell contacts. It is further demonstrated that zinc ions induce formation of large APLP1 clusters that enrich at contact sites and bind to clusters on the opposing cell. Altogether, these results provide direct evidence that APLP1 is a zinc ion dependent neuronal adhesion protein. In the context of APLP1, discrepancies of oligomeric state estimates were observed, which were attributed to non-fluorescent states of the chosen red fluorescent protein (FP) tag mCardinal (mCard). Therefore, multiple FPs and their performance in FFS based measurements of protein interactions were systematically evaluated. The study revealed superior properties of monomeric enhanced green fluorescent protein (mEGFP) and mCherry2. Furthermore, a simple correction scheme allowed unbiased in situ measurements of protein oligomerization by quantifying non-fluorescent state fractions of FP tags. The procedure was experimentally confirmed for biologically relevant protein complexes consisting of up to 12 monomers. In the last part of this work, fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and single particle tracking (SPT) were used to characterize diffusive transport dynamics in a bacterial biofilm model. Biofilms are surface adherent bacterial communities, whose structural organization is provided by extracellular polymeric substances (EPS) that form a viscous polymer hydrogel. The presented study revealed a probe size and polymer concentration dependent (anomalous) diffusion hindrance in a reconstituted EPS matrix system caused by polymer chain entanglement at physiological concentrations. This result indicates a meshwork-like organization of the biofilm matrix that allows free diffusion of small particles, but strongly hinders diffusion of larger particles such as bacteriophages. Finally, it is shown that depolymerization of the matrix by phage derived enzymes rapidly facilitated free diffusion. In the context of phage infections, such enzymes may provide a key to evade trapping in the biofilm matrix and promote efficient infection of bacteria. In combination with phage application, matrix depolymerizing enzymes may open up novel antimicrobial strategies against multiresistant bacterial strains, as a promising, more specific alternative to conventional antibiotics. N2 - Die Funktion lebender Zellen basiert auf Transport und Interaktion von Biomolekülen. Zur genauen Untersuchung dieser dynamischen Prozesse in lebenden Zellen eignen sich Fluoreszenzfluktuationsspektroskopieverfahren (FFS). Diese nutzen durch Diffusion oder andere Prozesse auftretende Fluktuationen, um Größen auf molekularer Skala durch statistische Analyse des Signals fluoreszenzmarkierter Moleküle zu ermitteln. Insbesondere können die Konzentration der Moleküle und ihre mittlere Verweildauer im Beobachtungsvolumen quantifiziert werden. Außerdem lassen sich molekulare Interaktionen anhand des mittleren Signals pro Molekül, der sogenannten molekularen Helligkeit, und der Kreuzkorrelation der Signale verschieden markierter Moleküle untersuchen. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene FFS Methoden etabliert und zur Erforschung biologischer Prozesse genutzt. Um Dynamiken und Bindungsvorgänge an der Zellmembran zu untersuchen, wurde Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) unter Nutzung eines linearen Scanwegs (sFCS) verwendet. Außerdem wurde die Oligomerisierung von Proteinen mittels Number&Brightness (N&B) Analyse räumlich aufgelöst. Verschiedene Korrekturverfahren wurden validiert und angewandt, um die erhobenen Daten von Störquellen wie Bleichen der Fluorophore oder Hintergrundsignalen zu bereinigen sowie instrumentelle Größen wie Detektionsrauschen zu kalibrieren. Darüber hinaus konnten durch spektral aufgelöste Aufnahme des Fluoreszenzsignals sowie Analyse höherer statistischer Momente mehrere Molekülpopulationen gleichzeitig detektiert werden. Mittels Zweifarben-sFCS und -N&B wurde anschließend das Amyloidvorläuferprotein APLP1 untersucht, welches an Synapsen, den Kontaktstellen von Neuronen, lokalisiert. Mit dem verwendeten Ansatz konnte zum ersten Mal direkt in lebenden Zellen nachgewiesen werden, dass APLP1 spezifische Bindungen an Zellkontaktstellen eingeht. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Zinkionen eine Anreicherung und verstärkte Interaktion von APLP1 induzieren. Diese Beobachtungen unterstützen die Hypothese, dass APLP1 die Adhäsion benachbarter Zellen vermittelt und diese Funktion konzentrationsabhängig durch Zinkionen reguliert wird. Zur Untersuchung von APLP1 wurde es genetisch mit Fluoreszenzproteinen wie dem rot fluoreszierenden Protein mCardinal fusioniert. Bei der Bestimmung des Oligomerisierungszustands von APLP1 ergaben sich unter Verwendung verschiedener Fluorophore unterschiedliche Ergebnisse. Diese deuteten darauf hin, dass ein Teil der mCardinal Proteine nicht fluoreszierte. Um zu einem tieferen Verständnis dieses Phänomens und dessen Einfluss auf Interaktionsmessungen zu gelangen, wurden häufig verwendete Fluoreszenzproteine systematisch evaluiert. Auf diese Weise konnten zwei Proteine identifiziert werden, grün fluoreszierendes mEGFP und rot fluoreszierendes mCherry2, die den geringsten Anteil an nicht fluoreszierenden Zuständen aufweisen und sich deshalb am besten für Interaktionsmessungen eignen. Mittels eines einfachen Korrekturschemas basierend auf der experimentellen Bestimmung des nicht fluoreszierenden Anteils konnten genaue Messungen des Oligomerisierungszustandes von Proteinen in lebenden Zellen vorgenommen werden, was für biologisch relevante Proteine mit bis zu 12 Untereinheiten erfolgreich gezeigt werden konnte. Im letzten Teil der Arbeit wurden Diffusionsvorgänge in bakteriellen Biofilmen untersucht. Biofilme werden von Bakterienkolonien gebildet, die auf Oberflächen wachsen und beispielsweise zur Verbreitung multiresistenter Keime in Krankenhäusern beitragen. Bei der Bildung von Biofilmen spielen Polymere, die von Bakterien produziert werden, eine entscheidende Rolle. Diese füllen die Zwischenräume im Biofilm mit einer Art Gel, der sogenannten Biofilmmatrix. Anhand von FCS und Einzelpartikelverfolgung konnte gezeigt werden, dass Diffusion von Partikeln in einem rekonstituierten Gel stark von deren Größe sowie der Konzentration der Polymere abhängt. Das untersuchte System bestand hierbei aus langkettigen Zuckermolekülen, die von Biofilmen aufgereinigt wurden und als Modellsystem für die Biofilmmatrix dienten. Im physiologischen Konzentrationsbereich bildete sich ein Polymernetzwerk aus, durch das sich kleine Teilchen frei bewegen konnten, größere Partikel wie z.B. Bakteriophagen jedoch stark verlangsamt wurden. Dies lässt vermuten, dass die Biofilmmatrix die Funktion eines größenabhängigen Filters aufweist. Zersetzung der Polymere mittels Enzymen, die natürlich in Bakteriophagen vorkommen, führte zu freier Diffusion auch größerer Partikel. Die gewonnen Ergebnisse deuten darauf hin, dass solche Enzyme für Phagen eine Schlüsselfunktion besitzen, um Biofilme besser durchdringen und somit Bakterien effizienter infizieren zu können. In Kombination mit Bakteriophagen könnten (zielgerichtet optimierte) Enzyme dieser Art eine vielversprechende, spezifischere Alternative zu konventionellen Antibiotika bei der Bekämpfung multiresistenter Keime darstellen. T2 - Fluoreszenzfluktuationsspektroskopieverfahren zur Bestimmung molekularer Interaktionen und Dynamiken in komplexen biologischen Systemen KW - Fluorescence fluctuation spectroscopy KW - Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie KW - Cell-cell adhesion KW - Zell-zell Adhäsion KW - fluorescent proteins KW - Fluoreszenzproteine KW - biofilms KW - Biofilme Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-478494 ER - TY - THES A1 - Leiser, Rico T1 - Biogeochemical processes governing microplastic transport in freshwater reservoirs N2 - The presented study investigated the influence of microbial and biogeochemical processes on the physical transport related properties and the fate of microplastics in freshwater reservoirs. The overarching goal was to elucidate the mechanisms leading to sedimentation and deposition of microplastics in such environments. This is of importance, as large amounts of initially buoyant microplastics are found in reservoir sediments worldwide. However, the transport processes which lead to microplastics accumulation in sediments, were up to now understudied. The impact of biofilm formation on the density and subsequent sedimentation of microplastics was investigated in the eutrophic Bautzen reservoirs (Chapter 2). Biofilms are complex microbial communities fixed to submerged surfaces through a slimy organic film. The mineral calcite was detected in the biofilms, which led to the sinking of the overgrown microplastic particles. The calcite was of biogenic origin, most likely precipitated by sessile cyanobacteria within the biofilms. Biofilm formation was also studied in the mesotrophic Malter reservoir. Unlike in Bautzen reservoir, biofilm formation did not govern the sedimentation of different microplastics in Malter reservoir (Chapter 3). Instead autumnal lake mixing led to the formation of sinking aggregates of microplastics and iron colloids. Such colloids form when anoxic, iron-rich water from the hypolimnion mixes with the oxygenated epilimnetic waters. The colloids bind organic material from the lake water, which leads to the formation of large and sinking iron-organo flocs. Hence, iron-organo floc formation and their influence on the buoyancy or burial of microplastics into sediments of Bautzen reservoir was studied in laboratory experiments (Chapter 4). Microplastics of different shapes (fiber, fragment, sphere) and sizes were readily incorporated into sinking iron-organo flocs. By this initially buoyant polyethylene microplastics were transported on top of sediments from Bautzen reservoir. Shortly after deposition, the microplastic bearing flocs started to subside and transported the pollutants into deeper sediment layers. The microplastics were not released from the sediments within two months of laboratory incubation. The stability of floc microplastic deposition was further investigated employing experiments with the iron reducing model organism Shewanella oneidensis (Chapter 5). It was shown, that reduction or re-mineralization of the iron minerals did not affect the integrity of the iron-organo flocs. The organic matrix was stable under iron reducing conditions. Hence, no incorporated microplastics were released from the flocs. As similar processes are likely to take place in natural sediments, this might explain the previous described low microplastic release from the sediments. This thesis introduced different mechanisms leading to the sedimentation of initially buoyant microplastics and to their subsequent deposition in freshwater reservoirs. Novel processes such as the aggregation with iron-organo flocs were identified and the understudied issue of biofilm densification through biogenic mineral formation was further investigated. The findings might have implications for the fate of microplastics within the river-reservoir system and outline the role of freshwater reservoirs as important accumulation zone for microplastics. Microplastics deposited in the sediments of reservoirs might not be transported further by through flowing river. Hence the study might contribute to better risk assessment and transport balances of these anthropogenic contaminants. N2 - Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Einfluss mikrobiologischer und biogeochemischer Prozesse auf die physikalischen Transporteigenschaften und den Verbleib von Mikroplastik in Stauseen. Ein Schwerpunkt lag auf der Untersuchung von Mechanismen, welche die Sedimentation von Mikroplastik einleiten. Dies ist von hoher Relevanz, da große Mengen eigentlich schwimmfähigen Mikroplastiks in Stauseesedimenten gefunden werden, aber die Transportprozesse vom Wasser in das Sediment bislang unbekannt waren. In der eutrophen Talsperre Bautzen wurde der Einfluss der Biofilmbildung auf die Dichte und Sedimentation von Mikroplastik untersucht (Kapitel 2). Biofilme sind komplexe mikrobielle Lebensgemeinschaften, welche sich in Form schleimiger Filme auf im Wasser befindlichen Oberflächen bilden. Es konnte ein Zusammenhang zwischen der starken Dichtezunahme beziehungsweise dem Absinken der bewachsenen Partikel und dem Vorhandensein des Minerals Calcit innerhalb des aufwachsenden Biofilms festgestellt werden. Das Calcit war biogenen Ursprungs und wurde infolge der Photosynthese sessiler Cyanobakterien gebildet. In der mesotrophen Talsperre Malter wurde ebenfalls die Biofilmbildung auf Mikroplastik untersucht (Kapitel 3). Dort veränderte die Bildung von mikrobiellen Biofilmen das Sedimentationsverhalten von verschiedenen Mikroplastik-Polymeren nicht. Stattdessen wurde beobachtet, dass die Herbstzirkulation des Sees zur Bildung von Aggregaten aus Mikroplastik und mineralischen Eisenkolloiden führte. Diese Eisenkolloide bilden sich durch die Mischung von eisenreichen, sauerstofffreien Tiefenwasser mit sauerstoffhaltigem Oberflächenwasser. Die Kolloide verbinden sich mit organischem Material aus dem See und formen dadurch größere Flocken. Da die Bildung von eisenhaltigen Flocken ein für geschichtete Stauseen wichtiger Prozess ist, wurde ihr Einfluss auf die Schwimmfähigkeit von Mikroplastik und den darauffolgenden Einbau in die Sedimente untersucht (Kapitel 4). In Laborversuchen konnten verschiedene Formen (Fasern, Fragmente, Kugeln) und Größenklassen von Mikroplastik in die Flocken eingebaut werden. Da die Flocken im Wasser absinken, können sie zuvor schwimmfähiges Polyethylen-Mikroplastik zur Sedimentoberfläche transportieren. Dort angekommen, beginnen die Flocken zusammen mit dem Mikroplastik langsam in das Sediment einzusinken und transportieren es dadurch in tiefere Sedimentschichten. Im Labor konnte innerhalb von zwei Monaten keine signifikante Freisetzung des so transportierten Mikroplastiks aus den Sedimenten beobachtet werden. Die Transformation der Flocken und welchen Einfluss dies auf die Freisetzung von Mikroplastik hat, wurde in Versuchen mit dem eisenreduzierenden Modelorganismus Shewanella oneidensis untersucht (Kapitel 5). Hierbei zeigte sich, dass die Auflösung oder Umwandlung des Eisens beziehungsweise der Eisenminerale innerhalb der Flocken, nicht zur Zerstörung der Flocken führte. Die organische Matrix der Flocken blieb unverändert stabil und umschloss auch weiterhin das eingebaute Mikroplastik. Da im Sediment ähnliche Abbauprozesse ablaufen, gibt dies einen möglichen Hinweis darauf, warum abgelagertes Mikroplastik nicht mehr aus Sedimenten freigesetzt wird. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in Talsperren unterschiedliche Prozesse zum Absinken und zur Deposition von Mikroplastik führen. Es wurden neuartige Prozesse wie die Aggregation mit eisenhaltigen Flocken identifiziert und ungewöhnliche Aspekte wie die biogene Mineralbildung näher beleuchtet. Dadurch können wichtige Implikationen hinsichtlich des Transports von Mikroplastik in Fluss- Stausee-Systemen abgeleitet werden. Aufgrund der beschriebenen Sedimentationsprozesse sind Stauseen wichtige Akkumulationszonen für Mikroplastik. Im Stausee sedimentierendes Mikroplastik wird potentiell nicht vom aufgestauten Fluss weitertransportiert. Daher könnten die hier beschriebenen Prozesse zu einer Verbesserung von Risikoabschätzungen und Transportbilanzen dieser anthropogenen Belastung führen. KW - microplastics KW - reservoirs KW - calcite KW - iron KW - biofouling KW - sedimentation KW - polyethylene KW - biofilms KW - Mikroplastik KW - Stauhaltungen KW - Kalzit KW - Eisen KW - Sedimentation KW - Polyethylen KW - Biofilme Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-520240 ER -