@phdthesis{Fiedler2010,
  author    = {Fiedler, Christian},
  title     = {Die Strukturbildung der beta-Helix in der Pektatlyase Pel-15},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-47250},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2010},
  abstract  = {Pektatlyase (Pel-15) aus dem alkalophilen Bodenbakterium Bacillus spec. KSM-P15 ist mit 197 Aminos{\"a}uren eines der kleinsten, bekannten β-3-Solenoidproteine. Sie spaltet Polygalakturons{\"a}urederivate in einem Ca2+-abh{\"a}ngigen β-Eliminierungsprozess. Wie bei allen Proteinen dieser Enzymfamilie ist auch die Polypeptidkette von Pel-15 zu einer einstr{\"a}ngigen, rechtsg{\"a}ngigen, parallelen β-Helix aufgewunden. In diesem Strukturmotiv enth{\"a}lt jede Windung drei β-Str{\"a}nge, die jeweils durch flexible Schleifenbereiche miteinander verbunden sind. Insgesamt acht Windungen stapeln sich in Pel-15 {\"u}bereinander und bilden entlang der Helixachse fl{\"a}chige, parallele β-Faltbl{\"a}tter aus. Im Bereich dieser β-Faltbl{\"a}tter existiert ein ausgedehntes Netzwerk von Wasserstoffbr{\"u}ckenbindungen, durch das der hydrophobe Kern, der sich im Inneren der β-Helix befindet, vom umgebenden L{\"o}sungsmittel abgeschirmt wird. Besondere Abschlussstrukturen an beiden Enden der β-Helix, wie sie typischerweise bei anderen Ver-tretern dieser Strukturklasse ausgepr{\"a}gt werden, sind in Pel-15 nicht zu beobachten. Stattdessen sind die terminalen Bereiche der β-Helix {\"u}ber Salzbr{\"u}cken und hydrophobe Seitenkettenkontakte stabilisiert. In der vorliegenden Dissertation wurde die Pektatlyase Pel-15 hinsichtlich ihres Faltungsgleichgewichtes, ihrer enzymatischen Aktivit{\"a}t und der Kinetik ihrer Strukturbildung charakterisiert. In eine evolution{\"a}r konservierte Helixwindung wurden destabilisierende Mutationen eingef{\"u}hrt, und deren Auswirkungen mittels spektroskopischer Methoden analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass Pel-15 in Gegenwart des Denaturierungsmittels Guanidiniumhydrochlorid einen hyperfluoreszenten Gleichgewichtsustand (HF) populiert, der nach Messungen von Faltungs- und Entfaltungskinetiken ein konformationelles Ensemble aus den Zust{\"a}nden HFslow und HFfast darstellt. Diese HF-Zust{\"a}nde sind durch eine hohe Aktivierungsbarriere voneinander getrennt. In R{\"u}ckfaltungsexperimenten populieren nur etwa 80 \% der faltenden Molek{\"u}le den Zwischenzustand HFslow, der mit einer Zeitkonstante von ca. 100 s zu HFfast weiterreagiert. Die Denaturierungsmittelabh{\"a}ngigkeit dieser Reaktion ist sehr gering, was eine trans-/cis-Prolylisomerisierung als geschwindigkeitslimitierenden Schritt nahelegt. Die Existenz eines cis-Peptides in der nativen Struktur macht es erforderlich, den denaturierten Zustand als ein Ensemble kinetisch separierter Konformationen, kurz: DSE, zu betrachten, das durch die Spezies Ufast und Uslow populiert wird. Nach dem in dieser Arbeit aufgestellten „Minimalmodell der Pel-15 Faltung" stehen die HF-Spezies (HFslow, HFfast) mit den Konformationen des DSE in einem thermodynamischen Kreisprozess. Das Modell positioniert HFfast und die native Konformation N auf die „native Seite" der Aktivierungsbarriere und tr{\"a}gt damit der Tatsache Rechnung, dass die Gleichgewichtseinstellung zwischen diesen Spezies zu schnell ist, um mit manuellen Techniken erfasst zu werden. Die hochaffine Bindung von Ca2+ (Kd = 10 μM) verschiebt sich das Faltungsgleichgewicht bereits in Gegenwart von 1 mM CaCl2 soweit auf die Seite des nativen Zustandes, das HFfast nicht l{\"a}nger nachweisbar ist. Entgegen anf{\"a}nglicher Vermutungen kommt einer lokalen, evolution{\"a}r konservierten Disulfidbr{\"u}cke im Zentrum der β-Helix eine wichtige Stabilisierungsfunktion zu. Die Disulfidbr{\"u}cke befindet sich in einem kurzen Schleifenbereich der β-Helix nahe dem aktiven Zentrum. Obwohl ihr Austausch gegen die Reste Val und Ala die freie Stabilisierungsenthalpie des Proteins um ca. 10 kJ/mol reduziert, l{\"a}sst die Struktur im Bereich der Mutationsstelle keine gravierende Ver{\"a}nderung erkennen. Auch die katalytisch relevante Ca2+-Bindungsaffinit{\"a}t bleibt unbeeinflusst; dennoch zeigen Enzymaktivit{\"a}tstests f{\"u}r VA-Mutanten eine Reduktion der enzymatischen Aktivit{\"a}t um fast 50 \% an. Die evolution{\"a}r konservierte Helixwindung im Allgemeinen und die in ihr enthaltene Disulfidbr{\"u}cke im Besonderen m{\"u}ssen nach den vorliegenden Ergebnissen also eine zentrale Funktion sowohl f{\"u}r die Struktur des katalytischen Zentrums als auch f{\"u}r die Strukturbildung der β-Helix w{\"a}hrend der Faltungsreaktion besitzen. Die Ergebnisse dieser Arbeit finden in mehreren Punkten Anklang an Faltungseigenschaften, die f{\"u}r andere β -Helixproteine beschrieben wurden. Vor allem aber pr{\"a}destinieren sie Pel-15 als ein neues, β-helikales Modellprotein. Aufgrund seiner einfachen Topologie, seiner niedrigen Windungszahl und seiner hohen thermodynamischen Stabilit{\"a}t ist Pel-15 sehr gut geeignet, die Determinanten von Stabilit{\"a}t und Strukturbildung des parallelen β-Helix-Motivs in einer Aufl{\"o}sung zu studieren, die aufgrund der Komplexit{\"a}t bestehender β-helikaler Modellsysteme bislang nicht zur Verf{\"u}gung stand.},
  language  = {de}
}