@phdthesis{GonzalezDuran2023,
  author    = {Gonzalez Duran, Enrique},
  title     = {Genetic control of intracellular gene transfer by DNA repair in N. tabacum},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {XII, 127, XLI},
  year      = {2023},
  abstract  = {Mitochondria and plastids are organelles with an endosymbiotic origin. During evolution, many genes are lost from the organellar genomes and get integrated in the nuclear genome, in what is known as intracellular/endosymbiotic gene transfer (IGT/EGT). IGT has been reproduced experimentally in Nicotiana tabacum at a gene transfer rate (GTR) of 1 event in 5 million cells, but, despite its centrality to eukaryotic evolution, there are no genetic factors known to influence the frequency of IGT in higher eukaryotes. The focus of this work was to determine the role of different DNA repair pathways of double strand break repair (DSBR) in the integration step of organellar DNA in the nuclear genome during IGT. Here, a CRISPR/Cas9 mutagenesis strategy was implemented in N. tabacum, with the aim of generating mutants in nuclear genes without expected visible phenotypes. This strategy led to the generation of a collection of independent mutants in the LIG4 (necessary for non-homologous end joining, NHEJ) and POLQ genes (necessary for microhomology mediated end joining, MMEJ). Targeting of other DSBR genes (KU70, KU80, RPA1C) generated mutants with unexpectedly strong developmental phenotypes.. These factors have telomeric roles, hinting towards a possible relationship between telomere length, and strength of developmental disruption upon loss of telomere structure in plants. The mutants were made in a genetic background encoding a plastid-encoded IGT reporter, that confers kanamycin resistance upon transfer to the nucleus. Through large scale independent experiments, increased IGT from the chloroplast to the nucleus was observed in lig4 mutants, as well as lines encoding a POLQ gene with a defective polymerase domain (polqΔPol). This shows that NHEJ or MMEJ have a double-sided relationship with IGT: while transferred genes may integrate using either pathway, the presence of both pathways suppresses IGT in wild-type somatic cells, thus demonstrating for the first time the extent on which nuclear genes control IGT frequency in plants. The IGT frequency increases in the mutants are likely mediated by increased availability of double strand breaks for integration. Additionally, kinetic analysis reveals that gene transfer (GT) events accumulate linearly as a function of time spent under antibiotic selection in the experiment, demonstrating that, contrary to what was previously thought, there is no such thing as a single GTR in somatic IGT experiments. Furthermore, IGT in tissue culture experiments appears to be the result of a "race against the clock" for integration in the nuclear genome, that starts when the organellar DNA arrives to the nucleus granting transient antibiotic resistance. GT events and escapes of kanamycin selection may be two possible outcomes from this race: those instances where the organellar DNA gets to integrate are recovered as GT events, and in those cases where timely integration fails, antibiotic resistance cannot be sustained, and end up considered as escapes. In the mutants, increased opportunities for integration in the nuclear genome change the overall ratio between IGT and escape events. The resources generated here are promising starting points for future research: (1) the mutant collection, for the further study of processes that depend on DNA repair in plants (2) the collection of GT lines obtained from these experiments, for the study of the effect of DSBR pathways over integration patterns and stability of transferred genes and (3) the developed CRISPR/Cas9 workflow for mutant generation, to make N. tabacum meet its potential as an attractive model for answering complex biological questions.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Moeser2021,
  author    = {M{\"o}ser, Christin},
  title     = {Modular DNA constructs for oligovalent bio-enhancement and functional screening},
  doi       = {10.25932/publishup-50728},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-507289},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {XIV, 148},
  year      = {2021},
  abstract  = {Deoxyribonucleic acid (DNA) nanostructures enable the attachment of functional molecules to nearly any unique location on their underlying structure. Due to their single-base-pair structural resolution, several ligands can be spatially arranged and closely controlled according to the geometry of their desired target, resulting in optimized binding and/or signaling interactions. This dissertation covers three main projects. All of them use variations of functionalized DNA nanostructures that act as platform for oligovalent presentation of ligands. The purpose of this work was to evaluate the ability of DNA nanostructures to precisely display different types of functional molecules and to consequently enhance their efficacy according to the concept of multivalency. Moreover, functionalized DNA structures were examined for their suitability in functional screening assays. The developed DNA-based compound ligands were used to target structures in different biological systems. One part of this dissertation attempted to bind pathogens with small modified DNA nanostructures. Pathogens like viruses and bacteria are known for their multivalent attachment to host cells membranes. By blocking their receptors for recognition and/or fusion with their targeted host in an oligovalent manner, the objective was to impede their ability to adhere to and invade cells. For influenza A, only enhanced binding of oligovalent peptide-DNA constructs compared to the monovalent peptide could be observed, whereas in the case of respiratory syncytial virus (RSV), binding as well as blocking of the target receptors led to an increased inhibition of infection in vitro. In the final part, the ability of chimeric DNA-peptide constructs to bind to and activate signaling receptors on the surface of cells was investigated. Specific binding of DNA trimers, conjugated with up to three peptides, to EphA2 receptor expressing cells was evaluated in flow cytometry experiments. Subsequently, their ability to activate these receptors via phosphorylation was assessed. EphA2 phosphorylation was significantly increased by DNA trimers carrying three peptides compared to monovalent peptide. As a result of activation, cells underwent characteristic morphological changes, where they "round up" and retract their periphery. The results obtained in this work comprehensively prove the capability of DNA nanostructures to serve as stable, biocompatible, controllable platforms for the oligovalent presentation of functional ligands. Functionalized DNA nanostructures were used to enhance biological effects and as tool for functional screening of bio-activity. This work demonstrates that modified DNA structures have the potential to improve drug development and to unravel the activation of signaling pathways.},
  language  = {en}
}
@misc{BeermannWestburyHofreiteretal.2018,
  author    = {Beermann, Jan and Westbury, Michael V. and Hofreiter, Michael and Hilgers, Leon and Deister, Fabian and Neumann, Hermann and Raupach, Michael J.},
  title     = {Cryptic species in a well-known habitat},
  series = {Postprints der Universit{\"a}t Potsdam : Mathematisch Naturwissenschaftliche Reihe},
  journal   = {Postprints der Universit{\"a}t Potsdam : Mathematisch Naturwissenschaftliche Reihe},
  number    = {1059},
  issn      = {1866-8372},
  doi       = {10.25932/publishup-46079},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-460792},
  pages     = {28},
  year      = {2018},
  abstract  = {Taxonomy plays a central role in biological sciences. It provides a communication system for scientists as it aims to enable correct identification of the studied organisms. As a consequence, species descriptions should seek to include as much available information as possible at species level to follow an integrative concept of 'taxonomics'. Here, we describe the cryptic species Epimeria frankei sp. nov. from the North Sea, and also redescribe its sister species, Epimeria cornigera. The morphological information obtained is substantiated by DNA barcodes and complete nuclear 18S rRNA gene sequences. In addition, we provide, for the first time, full mitochondrial genome data as part of a metazoan species description for a holotype, as well as the neotype. This study represents the first successful implementation of the recently proposed concept of taxonomics, using data from high-throughput technologies for integrative taxonomic studies, allowing the highest level of confidence for both biodiversity and ecological research.},
  language  = {en}
}
@article{LauxErmilovaPannwitzetal.2018,
  author    = {Laux, Eva-Maria and Ermilova, Elena and Pannwitz, Daniel and Gibbons, Jessica and H{\"o}lzel, Ralph and Bier, Frank Fabian},
  title     = {Dielectric Spectroscopy of Biomolecules up to 110 GHz},
  series = {Frequenz},
  volume    = {72},
  journal   = {Frequenz},
  number    = {3-4},
  publisher = {De Gruyter},
  address   = {Berlin},
  issn      = {0016-1136},
  doi       = {10.1515/freq-2018-0010},
  pages     = {135 -- 140},
  year      = {2018},
  abstract  = {Radio-frequency fields in the GHz range are increasingly applied in biotechnology and medicine. In order to fully exploit both their potential and their risks detailed information about the dielectric properties of biological material is needed. For this purpose a measuring system is presented that allows the acquisition of complex dielectric spectra over 4 frequency decade up to 110 GHz. Routines for calibration and for data evaluation according to physicochemical interaction models have been developed. The frequency dependent permittivity and dielectric loss of some proteins and nucleic acids, the main classes of biomolecules, and of their sub-units have been determined. Dielectric spectra are presented for the amino acid alanine, the proteins lysozyme and haemoglobin, the nucleotides AMP and ATP, and for the plasmid pET-21, which has been produced by bacterial culture. Characterisation of a variety of biomolecules is envisaged, as is the application to studies on protein structure and function.},
  language  = {en}
}
@article{LauxBierHoelzel2018,
  author    = {Laux, Eva-Maria and Bier, Frank Fabian and H{\"o}lzel, Ralph},
  title     = {Dielectrophoretic Stretching of DNA},
  series = {DNA Nanotechnology},
  journal   = {DNA Nanotechnology},
  edition   = {2},
  publisher = {Humana Press Inc.},
  address   = {New York},
  isbn      = {978-1-4939-8582-1},
  issn      = {1064-3745},
  doi       = {10.1007/978-1-4939-8582-1_14},
  pages     = {199 -- 208},
  year      = {2018},
  abstract  = {The spatial control of DNA and of self-assembled DNA constructs is a prerequisite for the preparation of DNA-based nanostructures and microstructures and a useful tool for studies on single DNA molecules. Here we describe a protocol for the accumulation of dissolved lambda-DNA molecules between planar microelectrodes by the action of inhomogeneous radiofrequency electric fields. The resulting AC electrokinetic forces stretch the DNA molecules and align them parallel to the electric field. The electrode preparation from off-the-shelf electronic components is explained, and a detailed description of the electronic setup is given. The experimental procedure is controlled in real-time by fluorescence microscopy.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Fischbach2017,
  author    = {Fischbach, Jens},
  title     = {Isothermale Amplifikationsmethoden f{\"u}r den DNA- und Pyrophosphat-abh{\"a}ngigen Pathogennachweis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-406072},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {viii, 125},
  year      = {2017},
  abstract  = {Hintergrund: Etablierte Protein- und Nukleins{\"a}ure-basierte Methoden f{\"u}r den spezifischen Pathogennachweis sind nur unter standardisierten Laborbedingungen von geschultem Personal durchf{\"u}hrbar und daher mit einem hohen Zeit- und Kostenaufwand verbunden. In der Nukleins{\"a}ure-basierten Diagnostik kann durch die Einf{\"u}hrung der isothermalen Amplifikation eine schnelle und kosteng{\"u}nstige Alternative zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden. Die Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) bietet aufgrund der hohen Amplifikationseffizienz vielf{\"a}ltige Detektionsm{\"o}glichkeiten, die sowohl f{\"u}r Schnelltest- als auch f{\"u}r Monitoring-Anwendungen geeignet sind. Ein wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung der Anwendbarkeit der LAMP und die Entwicklung einer neuen Methode f{\"u}r den einfachen, schnellen und g{\"u}nstigen Nachweis von Pathogenen mittels alternativer DNA- oder Pyrophosphat-abh{\"a}ngiger Detektionsverfahren. Hier wurden zun{\"a}chst direkte und indirekte Detektionsmethoden untersucht und darauf aufbauend ein Verfahren entwickelt, mit dem neue Metallionen-abh{\"a}ngige Fluoreszenzfarbstoffe f{\"u}r die selektive Detektion von Pyrophosphat in der LAMP und anderen enzymatischen Reaktionen identifiziert werden k{\"o}nnen. Als Alternative f{\"u}r die DNA-basierte Detektion in der digitalen LAMP sollten die zuvor etablierten Farbstoffe f{\"u}r den Pyrophosphatnachweis in einer Emulsion getestet werden. Abschließend wurde ein neuer Reaktionsmechanismus f{\"u}r die effiziente Generierung hochmolekularer DNA unter isothermalen Bedingungen als Alternative zur LAMP entwickelt. Ergebnisse: F{\"u}r den Nachweis RNA- und DNA-basierter Phythopathogene konnte die Echtzeit- und Endpunktdetektion mit verschiedenen Farbstoffen in einem geschlossenen System etabliert werden. Hier wurde Berberin als DNA-interkalierender Fluoreszenzfarbstoff mit vergleichbarer Sensitivit{\"a}t zu SYBR Green und EvaGreen erfolgreich in der LAMP mit Echtzeitdetektion eingesetzt. Ein Vorteil von Berberin gegen{\"u}ber den anderen Farbstoffen ist die Toleranz der DNA-Polymerase auch bei hohen Farbstoffkonzentrationen. Berberin kann daher auch in der geschlossenen LAMP-Reaktion ohne zus{\"a}tzliche Anpassung der Reaktionsbedingungen f{\"u}r die Endpunktdetektion verwendet werden. Dar{\"u}ber hinaus konnte Hydroxynaphtholblau (HNB), das f{\"u}r den kolorimetrischen Endpunktnachweis bekannt ist, erstmals auch f{\"u}r die fluorimetrische Detektion der LAMP in Echtzeit eingesetzt werden. Zus{\"a}tzlich konnten in der Arbeit weitere Metallionen-abh{\"a}ngige Farbstoffe zur indirekten Detektion der LAMP {\"u}ber das Pyrophosphat identifiziert werden. Daf{\"u}r wurde eine iterative Methode entwickelt, mit der potenzielle Farbstoffe hinsichtlich ihrer Enzymkompatibilit{\"a}t und ihrer spektralen Eigenschaften bei An- oder Abwesenheit von Manganionen selektiert werden k{\"o}nnen. Mithilfe eines kombinatorischen Screenings im Mikrotiterplattenformat konnte die komplexe Konzentrationsabh{\"a}ngigkeit zwischen den einzelnen Komponenten f{\"u}r einen fluorimetrischen Verdr{\"a}ngungsnachweis untersucht werden. Durch die Visualisierung des Signal-Rausch-Verh{\"a}ltnis' als Intensit{\"a}tsmatrix (heatmap) konnten zun{\"a}chst Alizarinrot S und Tetrazyklin unter simulierten Reaktionsbedingungen selektiert werden. In der anschließenden enzymatischen LAMP-Reaktion konnte insbesondere Alizarinrot S als g{\"u}nstiger, nicht-toxischer und robuster Fluoreszenzfarbstoff identifiziert werden und zeigte eine Pyrophosphat-abh{\"a}ngige Zunahme der Fluoreszenzintensit{\"a}t. Die zuvor etablierten Farbstoffe (HNB, Calcein und Alizarinrot S) konnten anschließend erfolgreich f{\"u}r die indirekte, fluorimetrische Detektion von Pyrophosphat in einer LAMP-optimierten Emulsion eingesetzt werden. Die Stabilit{\"a}t und Homogenit{\"a}t der generierten Emulsion wurde durch den Zusatz des Emulgators Poloxamer 188 verbessert. Durch die fluoreszenzmikroskopische Analyse der Emulsion war eine eindeutige Diskriminierung der positiven und negativen Tr{\"o}pfchen vor allem bei Einsatz von Calcein und Alizarinrot S m{\"o}glich. Aufgrund des komplexen Primer-Designs und der hohen Wahrscheinlichkeit unspezifischer Amplifikation in der LAMP wurde eine neue Bst DNA-Polymerase-abh{\"a}ngige isothermale Amplifikationsreaktion entwickelt. Durch die Integration einer spezifischen Linkerstruktur (abasische Stelle oder Hexaethylenglykol) zwischen zwei Primersequenzen konnte ein bifunktioneller Primer die effiziente Regenerierung der Primerbindungsstellen gew{\"a}hrleisten. Der neue Primer induziert nach der spezifischen Hybridisierung auf dem Templat die R{\"u}ckfaltung zu einer Haarnadelstruktur und blockiert gleichzeitig die Polymeraseaktivit{\"a}t am Gegenstrang, wodurch eine autozyklische Amplifikation trotz konstanter Reaktionstemperatur m{\"o}glich ist. Die Effizienz der „Hinge-initiated Primer dependent Amplification" (HIP) konnte abschließend durch die Verk{\"u}rzung der Distanz zwischen einem modifizierten Hinge-Primer und einem PCR-{\"a}hnlichen Primer verbessert werden. Schlussfolgerung: Die LAMP hat sich aufgrund der hohen Robustheit und Effizienz zu einer leistungsf{\"a}higen Alternative f{\"u}r die klassische PCR in der molekularbiologischen Diagnostik entwickelt. Unterschiedliche Detektionsverfahren verbessern die Leistungsf{\"a}higkeit der qualitativen und quantitativen LAMP f{\"u}r die Feldanwendungen und f{\"u}r die Diagnostik, da die neuen DNA- und Pyrophosphat-abh{\"a}ngigen Nachweismethoden in einer geschlossenen Reaktion eingesetzt werden k{\"o}nnen und so eine einfache Pathogendiagnostik erm{\"o}glichen. Die gezeigten Methoden k{\"o}nnen dar{\"u}ber hinaus zu einer Kostensenkung und Zeitersparnis gegen{\"u}ber den herk{\"o}mmlichen Methoden beitragen. Ein attraktives Ziel stellt die Weiterentwicklung der HIP f{\"u}r den Pathogennachweis als Alternative zur LAMP dar. Hierbei k{\"o}nnen die neuen LAMP-Detektionsverfahren ebenfalls Anwendung finden. Die Verwendung von Bst DNA-Polymerase-abh{\"a}ngigen Reaktionen erm{\"o}glicht dar{\"u}ber hinaus die Integration einer robusten isothermalen Amplifikation in mikrofluidische Systeme. Durch die Kombination der Probenvorbereitung, Amplifikation und Detektion sind zuk{\"u}nftige Anwendungen mit kurzer Analysezeit und geringem apparativen Aufwand insbesondere in der Pathogendiagnostik m{\"o}glich.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Wettstein2015,
  author    = {Wettstein, Christoph},
  title     = {Cytochrome c-DNA and cytochrome c-enzyme interactions for the construction of analytical signal chains},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-78367},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {120},
  year      = {2015},
  abstract  = {Electron transfer (ET) reactions play a crucial role in the metabolic pathways of all organisms. In biotechnological approaches, the redox properties of the protein cytochrome c (cyt c), which acts as an electron shuttle in the respiratory chain, was utilized to engineer ET chains on electrode surfaces. With the help of the biopolymer DNA, the redox protein assembles into electro active multilayer (ML) systems, providing a biocompatible matrix for the entrapment of proteins. In this study the characteristics of the cyt c and DNA interaction were defined on the molecular level for the first time and the binding sites of DNA on cyt c were identified. Persistent cyt c/DNA complexes were formed in solution under the assembly conditions of ML architectures, i.e. pH 5.0 and low ionic strength. At pH 7.0, no agglomerates were formed, permitting the characterization of the NMR spectroscopy. Using transverse relaxation-optimized spectroscopy (TROSY)-heteronuclear single quantum coherence (HSQC) experiments, DNAs' binding sites on the protein were identified. In particular, negatively charged AA residues, which are known interaction sites in cyt c/protein binding were identified as the main contact points of cyt c and DNA. Moreover, the sophisticated task of arranging proteins on electrode surfaces to create functional ET chains was addressed. Therefore, two different enzyme types, the flavin dependent fructose dehydrogenase (FDH) and the pyrroloquinoline quinone dependent glucose dehydrogenase (PQQ-GDH), were tested as reaction partners of freely diffusing cyt c and cyt c immobilized on electrodes in mono- and MLs. The characterisation of the ET processes was performed by means of electrochemistry and the protein deposition was monitored by microgravimetric measurements. FDH and PQQ-GDH were found to be generally suitable for combination with the cyt c/DNA ML system, since both enzymes interact with cyt c in solution and in the immobilized state. The immobilization of FDH and cyt c was achieved with the enzyme on top of a cyt c monolayer electrode without the help of a polyelectrolyte. Combining FDH with the cyt c/DNA ML system did not succeed, yet. However, the basic conditions for this protein-protein interaction were defined. PQQ-GDH was successfully coupled with the ML system, demonstrating that that the cyt c/DNA ML system provides a suitable interface for enzymes and that the creation of signal chains, based on the idea of co-immobilized proteins is feasible. Future work may be directed to the investigation of cyt c/DNA interaction under the precise conditions of ML assembly. Therefore, solid state NMR or X-ray crystallography may be required. Based on the results of this study, the combination of FDH with the ML system should be addressed. Moreover, alternative types of enzymes may be tested as catalytic component of the ML assembly, aiming on the development of innovative biosensor applications.},
  language  = {en}
}
@article{LiCorriganYangetal.2015,
  author    = {Li, Chenhong and Corrigan, Shannon and Yang, Lei and Straube, Nicolas and Harris, Mark and Hofreiter, Michael and White, William T. and Naylor, Gavin J. P.},
  title     = {DNA capture reveals transoceanic gene flow in endangered river sharks},
  series = {Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America},
  volume    = {112},
  journal   = {Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America},
  number    = {43},
  publisher = {National Acad. of Sciences},
  address   = {Washington},
  issn      = {0027-8424},
  doi       = {10.1073/pnas.1508735112},
  pages     = {13302 -- 13307},
  year      = {2015},
  abstract  = {For over a hundred years, the "river sharks" of the genus Glyphis were only known from the type specimens of species that had been collected in the 19th century. They were widely considered extinct until populations of Glyphis-like sharks were rediscovered in remote regions of Borneo and Northern Australia at the end of the 20th century. However, the genetic affinities between the newly discovered Glyphis-like populations and the poorly preserved, original museum-type specimens have never been established. Here, we present the first (to our knowledge) fully resolved, complete phylogeny of Glyphis that includes both archival-type specimens and modern material. We used a sensitive DNA hybridization capture method to obtain complete mitochondrial genomes from all of our samples and show that three of the five described river shark species are probably conspecific and widely distributed in Southeast Asia. Furthermore we show that there has been recent gene flow between locations that are separated by large oceanic expanses. Our data strongly suggest marine dispersal in these species, overturning the widely held notion that river sharks are restricted to freshwater. It seems that species in the genus Glyphis are euryhaline with an ecology similar to the bull shark, in which adult individuals live in the ocean while the young grow up in river habitats with reduced predation pressure. Finally, we discovered a previously unidentified species within the genus Glyphis that is deeply divergent from all other lineages, underscoring the current lack of knowledge about the biodiversity and ecology of these mysterious sharks.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Breitenstein2012,
  author    = {Breitenstein, Michael},
  title     = {Ortsaufgel{\"o}ster Aufbau von DNA-Nanostrukturen auf Glasoberfl{\"a}chen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-61857},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2012},
  abstract  = {Im Fokus dieser Arbeit stand der Aufbau einer auf DNA basierenden Nanostruktur. Der universelle Vier-Buchstaben-Code der DNA erm{\"o}glicht es, Bindungen auf molekularer Ebene zu adressieren. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften der DNA pr{\"a}destinieren dieses Makromolek{\"u}l f{\"u}r den Einsatz und die Verwendung als Konstruktionselement zum Aufbau von Nanostrukturen. Das Ziel dieser Arbeit war das Aufspannen eines DNA-Stranges zwischen zwei Fixpunkten. Hierf{\"u}r war es notwendig, eine Methode zu entwickeln, welche es erm{\"o}glicht, Funktionsmolek{\"u}le als Ankerelemente ortsaufgel{\"o}st auf eine Oberfl{\"a}che zu deponieren. Das Deponieren dieser Molek{\"u}le sollte dabei im unteren Mikrometermaßstab erfolgen, um den Abmaßen der DNA und der angestrebten Nanostruktur gerecht zu werden. Das eigens f{\"u}r diese Aufgabe entwickelte Verfahren zum ortsaufgel{\"o}sten Deponieren von Funktionsmolek{\"u}len nutzt das Bindungspaar Biotin-Neutravidin. Mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops (AFM) wurde eine zu einem „Stift" umfunktionierte Rasterkraftmikroskopspitze so mit der zu deponierenden „Tinte" beladen, dass das Absetzen von Neutravidin im unteren Mikrometermaßstab m{\"o}glich war. Dieses Neutravidinmolek{\"u}l {\"u}bernahm die Funktion als Bindeglied zwischen der biotinylierten Glasoberfl{\"a}che und dem eigentlichen Adressmolek{\"u}l. Das somit generierte Neutravidin-Feld konnte dann mit einem biotinylierten Adressmolek{\"u}l durch Inkubation funktionalisiert werden. Namensgebend f{\"u}r dieses Verfahren war die M{\"o}glichkeit, Neutravidin mehrmals zu deponieren und zu adressieren. Somit ließ sich sequenziell ein Mehrkomponenten-Feld aufbauen. Die Einschr{\"a}nkung, mit einem AFM nur eine Substanz deponieren zu k{\"o}nnen, wurde so umgangen. Ferner mußten Ankerelemente geschaffen werden, um die DNA an definierten Punkten immobilisieren zu k{\"o}nnen. Die Bearbeitung der DNA erfolgte mit molekularbiologischen Methoden und zielte darauf ab, einen DNA-Strang zu generieren, welcher an seinen beiden Enden komplement{\"a}re Adressequenzen enth{\"a}lt, um gezielt mit den oberfl{\"a}chenst{\"a}ndigen Ankerelementen binden zu k{\"o}nnen. Entsprechend der Geometrie der mit dem AFM erzeugten Fixpunkte und den oligonukleotidvermittelten Adressen kommt es zur Ausbildung einer definierten DNA-Struktur. Mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden wurde die aufgebaute DNA-Nanostruktur nachgewiesen. Der Nachweis der nanoskaligen Interaktion von DNA-bindenden Molek{\"u}len mit der generierten DNA-Struktur wurde durch die Bindung von PNA (peptide nucleic acid) an den DNA-Doppelstrang erbracht. Diese PNA-Bindung stellt ihrerseits ein funktionales Strukturelement im Nanometermaßstab dar und wird als Nanostrukturbaustein verstanden.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Gromelski2006,
  author    = {Gromelski, Sandra},
  title     = {Wechselwirkung zwischen Lipiden und DNA : auf dem Weg zum k{\"u}nstlichen Virus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-7629},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2006},
  abstract  = {Weltweit versuchen Wissenschaftler, k{\"u}nstliche Viren f{\"u}r den Gentransfer zu konstruieren, die nicht reproduktionsf{\"a}hig sind. Diese sollen die Vorteile der nat{\"u}rlichen Viren besitzen (effizienter Transport von genetischem Material), jedoch keine Antigene auf ihrer Oberfl{\"a}che tragen, die Immunreaktionen ausl{\"o}sen. Ziel dieses Projektes ist es, einen k{\"u}nstlichen Viruspartikel herzustellen, dessen Basis eine Polyelektrolytenhohlkugel bildet, die mit einer Lipiddoppelschicht bedeckt ist. Um intakte Doppelschichten zu erzeugen, muss die Wechselwirkung zwischen Lipid und Polyelektrolyt (z.B. DNA) verstanden und optimiert werden. Dazu ist es notwendig, die strukturelle Grundlage der Interaktion aufzukl{\"a}ren. Positiv geladene Lipide gehen zwar starke Wechselwirkungen mit der negativ geladenen DNA ein, sie wirken jedoch toxisch auf biologische Zellen. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die durch zweiwertige Kationen vermittelte Kopplung von genomischer oder Plasmid-DNA an zwitterionische oder negativ geladene Phospholipide an zwei Modellsystemen untersucht. 1. Modellsystem: Lipidmonoschicht an der Wasser/Luft-Grenzfl{\"a}che Methoden: Filmwaagentechnik in Kombination mit IR-Spektroskopie (IRRAS), R{\"o}ntgenreflexion (XR), R{\"o}ntgendiffraktion (GIXD), Brewsterwinkel-Mikroskopie (BAM), R{\"o}ntgenfluoreszenz (XRF) und Oberfl{\"a}chenpotentialmessungen Resultate: A) Die Anwesenheit der zweiwertigen Kationen Ba2+, Mg2+, Ca2+ oder Mn2+ in der Subphase hat keinen nachweisbaren Einfluss auf die Struktur der zwitterionischen DMPE- (1,2-Dimyristoyl-phosphatidyl-ethanolamin) Monoschicht. B) In der Subphase gel{\"o}ste DNA adsorbiert nur in Gegenwart dieser Kationen an der DMPE-Monoschicht. C) Sowohl die Adsorption genomischer Kalbsthymus-DNA als auch der Plasmid-DNA pGL3 bewirkt eine Reduktion des Neigungswinkels der Alkylketten, die auf einen ver{\"a}nderten Platzbedarf der Kopfgruppe zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. Durch die Umorientierung der Kopfgruppe wird die elektrostatische Wechselwirkung zwischen den positiv geladenen Stickstoffatomen der Lipidkopfgruppen und den negativ geladenen DNA-Phosphaten erh{\"o}ht. D) Die adsorbierte DNA weist eine geordnete Struktur auf, wenn sie durch Barium-, Magnesium-, Calcium- oder Manganionen komplexiert ist. Der Abstand zwischen parallelen DNA-Str{\"a}ngen h{\"a}ngt dabei von der Gr{\"o}ße der DNA-Fragmente sowie von der Art des Kations ab. Die gr{\"o}ßten Abst{\"a}nde ergeben sich mit Bariumionen, gefolgt von Magnesium- und Calciumionen. Die kleinsten DNA-Abst{\"a}nde werden durch Komplexierung mit Manganionen erhalten. Diese Ionenreihenfolge stellt sich sowohl f{\"u}r genomische DNA als auch f{\"u}r Plasmid-DNA ein. E) Die DNA-Abst{\"a}nde werden durch die Kompression des Lipidfilms nicht beeinflusst. Zwischen der Lipidmonoschicht und der adsorbierten DNA besteht demnach nur eine schwache Wechselwirkung. Offensichtlich befindet sich die durch zweiwertige Kationen komplexierte DNA als weitgehend eigenst{\"a}ndige Schicht unter dem Lipidfilm. 2. Modellsystem: Lipiddoppelschicht an der fest/fl{\"u}ssig-Grenzfl{\"a}che Methoden: Neutronenreflexion (NR) und Quarzmikrowaage (QCM-D) Resultate: A) Das zwitterionische Phospholipid DMPC (1,2-Dimyristoyl-phosphatidylcholin) bildet keine Lipiddoppelschicht auf planaren Polyelektrolytmultischichten aus, deren letzte Lage das positiv geladene PAH (Polyallylamin) ist. B) Hingegen bildet DMPC auf dem negativ geladenen PSS (Polystyrolsulfonat) eine Doppelschicht aus, die jedoch Defekte aufweist. C) Eine Adsorption von genomischer Kalbsthymus-DNA auf dieser Lipidschicht findet nur in Gegenwart von Calciumionen statt. Andere zweiwertige Kationen wurden nicht untersucht. D) Das negativ geladene Phospholipid DLPA (1,2-Dilauryl-phosphatids{\"a}ure) bildet auf dem positiv geladenen PAH eine Lipiddoppelschicht aus, die Defekte aufweist. E) DNA adsorbiert ebenfalls erst in Anwesenheit von Calciumionen in der L{\"o}sung an die DLPA-Schicht. F) Durch die Zugabe von EDTA (Ethylendiamintetraessigs{\"a}ure) werden die Calciumionen dem DLPA/DNA-Komplex entzogen, wodurch dieser dissoziiert. Demnach ist die calciuminduzierte Bildung dieser Komplexe reversibel.},
  subject      = {Lipide / Doppelschicht},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schwonbeck2004,
  author    = {Schwonbeck, Susanne},
  title     = {Analyse von Single Nucleotide Polymorphisms an Glas-Oberfl{\"a}chen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-0001853},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2004},
  abstract  = {Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer SNP-Genotypisierungsmethode mit auf Mikroarrays immobilisierten PCR-Produkten. F{\"u}r die Analyse wurde ein faseroptischer Affinit{\"a}tssensor bzw. ein Durchfluss-Biochip-Scanner mit integrierter Fluoreszenzdetektion verwendet. An den immobilisierten Analyten (PCR-Produkten) wurde eine Fluoreszenzoligonukleotidsonde hybridisiert und anschließend die Dissoziation der Sonde im Fluss verfolgt. Die Diskriminierung von Wildtyp- und Mutanten-DNA erfolgte durch die kinetische Auswertung der Dissoziationskurven sowie durch die Analyse der Fluoreszenzintensit{\"a}t. Die Versuche am faseroptischen Affinit{\"a}tssensor zeigten, dass DNA-DNA-Hybride sowohl von Oligonukleotiden als auch von PCR-Produkten ein typisches Dissoziationsverhalten aufweisen, wobei fehlgepaarte Hybride eine signifikant schnellere Dissoziation zeigen als perfekt passende Hybride. Dieser Geschwindigkeitsunterschied l{\"a}sst sich durch den Vergleich der jeweiligen kinetischen Geschwindigkeitskonstanten kD quantitativ erfassen. Da die Kopplung des Analyten an der Chipoberfl{\"a}che sowie die Hybridisierungs- und Dissoziationsparameter essentiell f{\"u}r die Methodenentwicklung war, wurden die Parameter f{\"u}r ein optimales Spotting und die Immobilisierung von PCR-Produkten ermittelt. Getestet wurden die affine Kopplung von biotinylierten PCR-Produkten an Streptavidin-, Avidin- und NeutrAvidin-Oberfl{\"a}chen sowie die kovalente Bindung von phosphorylierten Amplifikaten mit der EDC/Methylimidazol-Methode. Die besten Ergebnisse sowohl in Spotform und -homogenit{\"a}t als auch im Signal/Rausch-Verh{\"a}ltnis wurden an NeutrAvidin-Oberfl{\"a}chen erreicht. F{\"u}r die Etablierung der Mikroarray-Genotypisierungsmethode durch kinetische Analyse nach einem Hybridisierungsexperiment wurden Sondenl{\"a}nge, Puffersystem, Spotting-Konzentration des Analyten sowie Temperatur optimiert. Das Analysensystem erlaubte es, PCR-Produkte mit einer Konzentration von 250 ng/µl in einem HEPES-EDTA-NaCl-Puffer auf mit NeutrAvidin beschichtete Glastr{\"a}ger zu spotten. In den anschließenden Hybridisierungs- und Dissoziationsexperimenten bei 30 °C konnte die Diskriminierung von homocygoter Wildtyp- und homocygoter Mutanten- sowie heterocygoter DNA am Beispiel von Oligonukleotid-Hybriden erreicht werden. In einer Gruppe von 24 homocygoten Patienten wurde ein Polymorphismus im SULT1A1-Gen analysiert. Sowohl durch kinetische Auswertung als auch mit der Analyse der Fluoreszenzintensit{\"a}t wurde der Genotyp der Proben identifiziert. Die Ergebnisse wurden mit dem Referenzverfahren, der Restriktionschnittstellenanalyse (PCR-RFLP) validiert. Lediglich ein Genotyp wurde falsch bestimmt, die Genauigkeit lag bei 96\%. In einer Gruppe von 44 Patienten wurde der Genotyp eines SNP in der Adiponectin-Promotor-Region untersucht. Nach Vergleich der Analysenergebnisse mit denen eines Referenzverfahrens konnten lediglich 14 der untersuchten Genotypen best{\"a}tigt werden. Ursache f{\"u}r die unzureichende Genauigkeit der Methode war vor allem das schlechte Signal/Rausch-Verh{\"a}ltnis. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das in dieser Arbeit entwickelte Analysesystem f{\"u}r die Genotypisierung von Einzelpunktmutationen geeignet ist, homocygote Patientenproben zuverl{\"a}ssig zu analysieren. Prinzipiell ist das auch bei heterocygoter DNA m{\"o}glich. Da nach aktuellem Kenntnisstand eine SNP-Analysemethode an immobilisierten PCR-Produkten noch nicht ver{\"o}ffentlicht wurde, stellt das hier entwickelte Verfahren eine Alternative zu bisher bekannten Mikroarray-Verfahren dar. Als besonders vorteilhaft erweist sich der reverse Ansatz der Methode. Der hier vorgestellte Ansatz ist eine kosteng{\"u}nstigere und weniger hoch dimensionierte L{\"o}sung f{\"u}r Fragestellungen beispielsweise in der Ern{\"a}hrungswissenschaft, bei denen meist eine mittlere Anzahl Patienten auf nur einige wenige SNPs zu untersuchen ist. Wenn es gelingt, durch die Weiterentwicklung der Hardware bzw. weiterer Optimierung, eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verh{\"a}ltnisses und damit die Diskriminierung von heterocygoter DNA zu erreichen, kann diese Methode zuk{\"u}nftig bei der Analyse von mittelgroßen Patientengruppen alternativ zu anderen Genotypisierungsmethoden verwendet werden.},
  language  = {de}
}