@phdthesis{KoikkarahAji2023,
  author    = {Koikkarah Aji, Amit},
  title     = {Quantitative sub cellular characterization of Hantavirus structural proteins},
  doi       = {10.25932/publishup-58661},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-586612},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {101},
  year      = {2023},
  abstract  = {Hantaviruses (HVs) are a group of zoonotic viruses that infect human beings primarily through aerosol transmission of rodent excreta and urine samplings. HVs are classified geographically into: Old World HVs (OWHVs) that are found in Europe and Asia, and New World HVs (NWHVs) that are observed in the Americas. These different strains can cause severe hantavirus diseases with pronounced renal syndrome or severe cardiopulmonary system distress. HVs can be extremely lethal, with NWHV infections reaching up to 40 \% mortality rate. HVs are known to generate epidemic outbreaks in many parts of the world including Germany, which has seen periodic HV infections over the past decade. HV has a trisegmented genome. The small segment (S) encodes the nucleocapsid protein (NP), the middle segment (M) encodes the glycoproteins (GPs) Gn and Gc which forms up to tetramers and primarily monomers \\& dimers upon independent expression respectively and large segment (L) encodes RNA dependent RNA polymerase (RdRp). Interactions between these viral proteins are crucial in providing mechanistic insights into HV virion development. Despite best efforts, there continues to be lack of quantification of these associations in living cells. This is required in developing the mechanistic models for HV viral assembly. This dissertation focuses on three key questions pertaining to the initial steps of virion formation that primarily involves the GPs and NP. The research investigations in this work were completed using Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) approaches. FCS is frequently used in assessing the biophysical features of bio-molecules including protein concentration and diffusion dynamics and circumvents the requirement of protein overexpression. FCS was primarily applied in this thesis to evaluate protein multimerization, at single cell resolution. The first question addressed which GP spike formation model proposed by Hepojoki et al.(2010) appropriately describes the evidence in living cells. A novel in cellulo assay was developed to evaluate the amount of fluorescently labelled and unlabeled GPs upon co-expression. The results clearly showed that Gn and Gc initially formed a heterodimeric Gn:Gc subunit. This sub-unit then multimerizes with congruent Gn:Gc subunits to generate the final GP spike. Based on these interactions, models describing the formation of GP complex (with multiple GP spike subunits) were additionally developed. HV GP assembly primarily takes place in the Golgi apparatus (GA) of infected cells. Interestingly, NWHV GPs are hypothesized to assemble at the plasma membrane (PM). This led to the second research question in this thesis, in which a systematic comparison between OWHV and NWHV GPs was conducted to validate this hypothesis. Surprisingly, GP localization at the PM was congruently observed with OWHV and NWHV GPs. Similar results were also discerned with OWHV and NWHV GP localization in the absence of cytoskeletal factors that regulate HV trafficking in cells. The final question focused on quantifying the NP-GP interactions and understanding their influence of NP and GP multimerization. Gc mutlimers were detected in the presence of NP and complimented by the presence of localized regions of high NP-Gc interactions in the perinuclear region of living cells. Gc-CT domain was shown to influence NP-Gc associations. Gn, on the other hand, formed up to tetrameric complexes, independent from the presence of NP. The results in this dissertation sheds light on the initial steps of HV virion formation by quantifying homo and heterotypic interactions involving NP and GPs, which otherwise are very difficult to perform. Finally, the in cellulo methodologies implemented in this work can be potentially extended to understand other key interactions involved in HV virus assembly.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Pitzen2022,
  author    = {Pitzen, Valentin},
  title     = {Weitergef{\"u}hrte funktionelle Charakterisierung des centrosomalen Proteins Cep192 und Untersuchung der Topologie des Centrosoms in Dictyostelium Am{\"o}ben},
  doi       = {10.25932/publishup-54889},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-548891},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  pages     = {XI, 104},
  year      = {2022},
  abstract  = {Das Centrosom von Dictyostelium ist acentriol{\"a}r aufgebaut, misst ca. 500 nm und besteht aus einer dreischichten Core-Struktur mit umgebender Corona, an der Mikrotubuli nukleieren. In dieser Arbeit wurden das centrosomale Protein Cep192 und m{\"o}gliche Interaktionspartner am Centrosom eingehend untersucht. Die einleitende Lokalisationsuntersuchung von Cep192 ergab, dass es w{\"a}hrend der gesamten Mitose an den Spindelpolen lokalisiert und im Vergleich zu den anderen Strukturproteinen der Core-Struktur am st{\"a}rksten exprimiert ist. Die dauerhafte Lokalisation an den Spindelpolen w{\"a}hrend der Mitose wird f{\"u}r Proteine angenommen, die in den beiden identisch aufgebauten {\"a}ußeren Core-Schichten lokalisieren, die das mitotische Centrosom formen. Ein Knockdown von Cep192 f{\"u}hrte zur Ausbildung von {\"u}berz{\"a}hligen Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOC) sowie zu einer leicht erh{\"o}hten Ploidie. Deshalb wird eine Destabilisierung des Centrosoms durch die verminderte Cep192-Expression angenommen. An Cep192 wurden zwei kleine Tags, der SpotH6- und BioH6-Tag, etabliert, die mit kleinen fluoreszierenden Nachweiskonjugaten markiert werden konnten. Mit den so getagten Proteinen konnte die hochaufl{\"o}sende Expansion Microscopy f{\"u}r das Centrosom optimiert werden und die Core-Struktur erstmals proteinspezifisch in der Fluoreszenzmikroskopie dargestellt werden. Cep192 lokalisiert dabei in den {\"a}ußeren Core-Schichten. Die kombinierte Markierung von Cep192 und den centrosomalen Proteinen CP39 und CP91 in der Expansion Microscopy erlaubte die Darstellung des dreischichtigen Aufbaus der centrosomalen Core-Struktur, wobei CP39 und CP91 zwischen Cep192 in der inneren Core-Schicht lokalisieren. Auch die Corona wurde in der Expansion Microscopy untersucht: Das Corona-Protein CDK5RAP2 lokalisiert in r{\"a}umlicher N{\"a}he zu Cep192 in der inneren Corona. Ein Vergleich der Corona-Proteine CDK5RAP2, CP148 und CP224 in der Expansion Microscopy ergab unterscheidbare Sublokalisationen der Proteine innerhalb der Corona und relativ zur Core-Struktur. In Biotinylierungsassays mit den centrosomalen Core-Proteinen CP39 und CP91 sowie des Corona-Proteins CDK5RAP2 konnte Cep192 als m{\"o}glicher Interaktionspartner identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die wichtige Funktion des Proteins Cep192 im Dictyostelium-Centrosom und erm{\"o}glichen durch die Kombination aus Biotinylierungsassays und Expansion Microscopy der untersuchten Proteine ein verbessertes Verst{\"a}ndnis der Topologie des Centrosoms.},
  language  = {de}
}
@misc{TzonevaStoyanovaPetrichetal.2020,
  author    = {Tzoneva, Rumiana and Stoyanova, Tihomira and Petrich, Annett and Popova, Desislava and Uzunova, Veselina and Albena, Momchilova and Chiantia, Salvatore},
  title     = {Effect of Erufosine on Membrane Lipid Order in Breast Cancer Cell Models},
  series = {Postprints der Universit{\"a}t Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe},
  journal   = {Postprints der Universit{\"a}t Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe},
  number    = {1000},
  issn      = {1866-8372},
  doi       = {10.25932/publishup-47705},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-477056},
  pages     = {19},
  year      = {2020},
  abstract  = {Alkylphospholipids are a novel class of antineoplastic drugs showing remarkable therapeutic potential. Among them, erufosine (EPC3) is a promising drug for the treatment of several types of tumors. While EPC3 is supposed to exert its function by interacting with lipid membranes, the exact molecular mechanisms involved are not known yet. In this work, we applied a combination of several fluorescence microscopy and analytical chemistry approaches (i.e., scanning fluorescence correlation spectroscopy, line-scan fluorescence correlation spectroscopy, generalized polarization imaging, as well as thin layer and gas chromatography) to quantify the effect of EPC3 in biophysical models of the plasma membrane, as well as in cancer cell lines. Our results indicate that EPC3 affects lipid-lipid interactions in cellular membranes by decreasing lipid packing and increasing membrane disorder and fluidity. As a consequence of these alterations in the lateral organization of lipid bilayers, the diffusive dynamics of membrane proteins are also significantly increased. Taken together, these findings suggest that the mechanism of action of EPC3 could be linked to its effects on fundamental biophysical properties of lipid membranes, as well as on lipid metabolism in cancer cells.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Breitenstein2012,
  author    = {Breitenstein, Michael},
  title     = {Ortsaufgel{\"o}ster Aufbau von DNA-Nanostrukturen auf Glasoberfl{\"a}chen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-61857},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2012},
  abstract  = {Im Fokus dieser Arbeit stand der Aufbau einer auf DNA basierenden Nanostruktur. Der universelle Vier-Buchstaben-Code der DNA erm{\"o}glicht es, Bindungen auf molekularer Ebene zu adressieren. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften der DNA pr{\"a}destinieren dieses Makromolek{\"u}l f{\"u}r den Einsatz und die Verwendung als Konstruktionselement zum Aufbau von Nanostrukturen. Das Ziel dieser Arbeit war das Aufspannen eines DNA-Stranges zwischen zwei Fixpunkten. Hierf{\"u}r war es notwendig, eine Methode zu entwickeln, welche es erm{\"o}glicht, Funktionsmolek{\"u}le als Ankerelemente ortsaufgel{\"o}st auf eine Oberfl{\"a}che zu deponieren. Das Deponieren dieser Molek{\"u}le sollte dabei im unteren Mikrometermaßstab erfolgen, um den Abmaßen der DNA und der angestrebten Nanostruktur gerecht zu werden. Das eigens f{\"u}r diese Aufgabe entwickelte Verfahren zum ortsaufgel{\"o}sten Deponieren von Funktionsmolek{\"u}len nutzt das Bindungspaar Biotin-Neutravidin. Mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops (AFM) wurde eine zu einem „Stift" umfunktionierte Rasterkraftmikroskopspitze so mit der zu deponierenden „Tinte" beladen, dass das Absetzen von Neutravidin im unteren Mikrometermaßstab m{\"o}glich war. Dieses Neutravidinmolek{\"u}l {\"u}bernahm die Funktion als Bindeglied zwischen der biotinylierten Glasoberfl{\"a}che und dem eigentlichen Adressmolek{\"u}l. Das somit generierte Neutravidin-Feld konnte dann mit einem biotinylierten Adressmolek{\"u}l durch Inkubation funktionalisiert werden. Namensgebend f{\"u}r dieses Verfahren war die M{\"o}glichkeit, Neutravidin mehrmals zu deponieren und zu adressieren. Somit ließ sich sequenziell ein Mehrkomponenten-Feld aufbauen. Die Einschr{\"a}nkung, mit einem AFM nur eine Substanz deponieren zu k{\"o}nnen, wurde so umgangen. Ferner mußten Ankerelemente geschaffen werden, um die DNA an definierten Punkten immobilisieren zu k{\"o}nnen. Die Bearbeitung der DNA erfolgte mit molekularbiologischen Methoden und zielte darauf ab, einen DNA-Strang zu generieren, welcher an seinen beiden Enden komplement{\"a}re Adressequenzen enth{\"a}lt, um gezielt mit den oberfl{\"a}chenst{\"a}ndigen Ankerelementen binden zu k{\"o}nnen. Entsprechend der Geometrie der mit dem AFM erzeugten Fixpunkte und den oligonukleotidvermittelten Adressen kommt es zur Ausbildung einer definierten DNA-Struktur. Mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden wurde die aufgebaute DNA-Nanostruktur nachgewiesen. Der Nachweis der nanoskaligen Interaktion von DNA-bindenden Molek{\"u}len mit der generierten DNA-Struktur wurde durch die Bindung von PNA (peptide nucleic acid) an den DNA-Doppelstrang erbracht. Diese PNA-Bindung stellt ihrerseits ein funktionales Strukturelement im Nanometermaßstab dar und wird als Nanostrukturbaustein verstanden.},
  language  = {de}
}