@phdthesis{OsterlohQuiroz2006,
  author    = {Osterloh-Quiroz, Mandy},
  title     = {Optimierung der Expressionsst{\"a}rke von fremdstoffmetabolisierenden Enzymen in Bakterien und permanenten Zellkulturen f{\"u}r toxikologische Untersuchungen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-8945},
  school      = {Universit{\"a}t Potsdam},
  year      = {2006},
  abstract  = {Die Enzymsuperfamilie der l{\"o}slichen Sulfotransferasen (SULT) spielt eine wichtige Rolle in der Phase II des Fremdstoffmetabolismus. Sie katalysieren den Transfer einer Sulfonylgruppe auf nucleophile Gruppen endogener und exogener Substrate. Die Sulfokonjugation von Fremdstoffen erh{\"o}ht deren Wasserl{\"o}slichkeit und behindert die passive Permeation von Zellmembranen. Dadurch wird die Ausscheidung dieser konjugierten Substanzen erleichtert. In Abh{\"a}ngigkeit von der Struktur des Zielmolek{\"u}ls kann die Sulfokonjugation aber auch zur metabolischen Aktivierung von Fremdstoffen durch die Bildung instabiler Metabolite f{\"u}hren. Die SULT-vermittelte Aktivierung promutagener Substanzen ist somit von toxikologischem Interesse. F{\"u}r die Detektion SULT-vermittelter Mutagenit{\"a}t mittels bakterieller in-vitro Testsysteme ist die heterologe Expression der fremdstoffmetabolisierenden Enzyme direkt in den Indikatorzellen notwendig. S. typhimurium exprimieren selbst keine SULT, und externe Metabolisierungssysteme sind problematisch, weil die negativ geladenen, kurzlebigen Metabolite nur schlecht die Zellmembran penetrieren k{\"o}nnen. Die Expression humaner Enyme in Bakterien ist jedoch zum Teil sehr kritisch. So zeigen z.B. sehr {\"a}hnliche Enzyme (SULT1A2*1 und *2) deutliche Unterschiede im Expressionsniveau bei exakt gleichen {\"a}ußeren Bedingungen. Dies erschwert den Vergleich der enzymatischen Aktivit{\"a}ten dieser Enzyme im in-vitro Testsystem. Andere Enzyme (z.B. SULT2B1b) werden unter Verwendung ihrer Wildtyp-cDNA zum Teil nicht detektierbar exprimiert. Deshalb sollte in dieser Arbeit eine Methode zur Optimierung der heterologen Expression fremdstoffmetabolisierender Enzyme f{\"u}r Genotoxizit{\"a}tsuntersuchungen etabliert werden. Es wurde bereits gezeigt dass synonyme Codonaustausche am 5'-Ende der humanen SULT1A2-cDNA zu einer Erh{\"o}hung der Expression des entsprechenden Enzyms in S. typhimurium f{\"u}hrten. Dementsprechend wurden in dieser Arbeit Codonaustausche am 5'-Ende der cDNA verschiedener SULT (1A1*1, 1A2*1, 2B1b) sowie der Ratten Glutathion-S-Transferase Theta 2 (rGSTT2) und dem Reportergen Luciferase durchgef{\"u}hrt. Die Expression der so generierten Konstrukte wurde in verschiedenen S. typhimurium und E. coli St{\"a}mmen quantifiziert und die Aktivit{\"a}t der {\"u}berexprimierten Enzyme im Ames-Test bzw. im Enzym-Aktivit{\"a}tsassay {\"u}berpr{\"u}ft. Durch das Einf{\"u}hren seltener Codons in die cDNA konnte die Proteinexpression von SULT1A1*1, SULT1A2*1 und SULT2B1b maximal 7-fach, 18-fach und 100-fach im Vergleich zur Wildtyp-cDNA gesteigert werden. Die Expression der rGSTT2 wurde ebenfalls durch das Einf{\"u}hren seltener Codons erh{\"o}ht (maximal 5-fach). Bei dem Reportergen Luciferase jedoch f{\"u}hrte das Austauschen h{\"a}ufiger Codons gegen seltene Codons zu einer Reduktion der Proteinexpression um 80 \%. Die Expression von Fusionsproteinen aus 2B1b (5'-Ende) und Luciferase (3'-Ende) wurde durch das Einf{\"u}hren seltener Codons ebenfalls um 50 \% reduziert. Die S. typhimurium St{\"a}mme mit optimierter SULT 1A1*1- bzw. 1A2*1-Expression wurden im Ames-Test eingesetzt und zeigten im Vergleich zu den geringer exprimierenden St{\"a}mmen eine h{\"o}here Sensitivit{\"a}t. F{\"u}r SULT2B1b konnte keine Mutagenaktivierung im Ames-Test nachgewiesen werden. Allerdings zeigte ein Enzym-Aktivit{\"a}tsassay mit Dehydroepiandosteron, dass das bakteriell exprimierte Enzym funktionell war. Da in der Literatur der Effekt seltener Codons auf die Expression in Bakterien bisher fast ausschließlich als inhibitorisch beschrieben wurde, sollte die Wirkungsweise der hier beobachteten Expressionserh{\"o}hung durch seltene Codons genauer untersucht werden. Dazu wurden verschiedene Konstrukte der SULT1A2*1 und der SULT2B1b, die unterschiedlich viele seltene Codons in verschiedenen Kombinationen besaßen, hergestellt. Es konnten jedoch keine einzelnen Codons, die f{\"u}r die Expressionssteigerung allein verantwortlich waren, identifiziert werden. Die Plasmidkopienzahl in den verschiedenen SULT2B1b-Klonen war konstant und die SULT2B1b-mRNA-Konzentration zeigte nur moderate Schwankungen, die nicht als Ursache f{\"u}r die dramatische Erh{\"o}hung der SULT2B1b-Expression in Frage kommen. Die berechnete Stabilit{\"a}t der potentiellen mRNA-Sekund{\"a}rstrukturen wurde durch die seltenen Codons h{\"a}ufig stark gesenkt und ist als eine m{\"o}gliche Ursache f{\"u}r die Expressionssteigerung anzusehen. Zus{\"a}tzlich erh{\"o}hten die seltenen Codons den Consensus der Downstream Box zur 16S rRNA, was ebenfalls eine Ursache f{\"u}r die Expressionssteigerung sein kann. In dieser Arbeit konnte somit die Expression der humanen SULT1A1*1, 1A2*1 und der 2B1b sowie der rGSTT2 erfolgreich mittels synonymer Codonaustausche erh{\"o}ht werden. Die so optimierten S. typhimurium St{\"a}mme zeigten im Ames-Test eine erh{\"o}hte Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber SULT aktivierten Promutagenen bzw. erh{\"o}hte Aktivit{\"a}t in spezifischen Enymaktivit{\"a}tsassays.},
  subject      = {Mutagenit{\"a}t},
  language  = {de}
}