@phdthesis{KoikkarahAji2023, author = {Koikkarah Aji, Amit}, title = {Quantitative sub cellular characterization of Hantavirus structural proteins}, doi = {10.25932/publishup-58661}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-586612}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {101}, year = {2023}, abstract = {Hantaviruses (HVs) are a group of zoonotic viruses that infect human beings primarily through aerosol transmission of rodent excreta and urine samplings. HVs are classified geographically into: Old World HVs (OWHVs) that are found in Europe and Asia, and New World HVs (NWHVs) that are observed in the Americas. These different strains can cause severe hantavirus diseases with pronounced renal syndrome or severe cardiopulmonary system distress. HVs can be extremely lethal, with NWHV infections reaching up to 40 \% mortality rate. HVs are known to generate epidemic outbreaks in many parts of the world including Germany, which has seen periodic HV infections over the past decade. HV has a trisegmented genome. The small segment (S) encodes the nucleocapsid protein (NP), the middle segment (M) encodes the glycoproteins (GPs) Gn and Gc which forms up to tetramers and primarily monomers \\& dimers upon independent expression respectively and large segment (L) encodes RNA dependent RNA polymerase (RdRp). Interactions between these viral proteins are crucial in providing mechanistic insights into HV virion development. Despite best efforts, there continues to be lack of quantification of these associations in living cells. This is required in developing the mechanistic models for HV viral assembly. This dissertation focuses on three key questions pertaining to the initial steps of virion formation that primarily involves the GPs and NP. The research investigations in this work were completed using Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) approaches. FCS is frequently used in assessing the biophysical features of bio-molecules including protein concentration and diffusion dynamics and circumvents the requirement of protein overexpression. FCS was primarily applied in this thesis to evaluate protein multimerization, at single cell resolution. The first question addressed which GP spike formation model proposed by Hepojoki et al.(2010) appropriately describes the evidence in living cells. A novel in cellulo assay was developed to evaluate the amount of fluorescently labelled and unlabeled GPs upon co-expression. The results clearly showed that Gn and Gc initially formed a heterodimeric Gn:Gc subunit. This sub-unit then multimerizes with congruent Gn:Gc subunits to generate the final GP spike. Based on these interactions, models describing the formation of GP complex (with multiple GP spike subunits) were additionally developed. HV GP assembly primarily takes place in the Golgi apparatus (GA) of infected cells. Interestingly, NWHV GPs are hypothesized to assemble at the plasma membrane (PM). This led to the second research question in this thesis, in which a systematic comparison between OWHV and NWHV GPs was conducted to validate this hypothesis. Surprisingly, GP localization at the PM was congruently observed with OWHV and NWHV GPs. Similar results were also discerned with OWHV and NWHV GP localization in the absence of cytoskeletal factors that regulate HV trafficking in cells. The final question focused on quantifying the NP-GP interactions and understanding their influence of NP and GP multimerization. Gc mutlimers were detected in the presence of NP and complimented by the presence of localized regions of high NP-Gc interactions in the perinuclear region of living cells. Gc-CT domain was shown to influence NP-Gc associations. Gn, on the other hand, formed up to tetrameric complexes, independent from the presence of NP. The results in this dissertation sheds light on the initial steps of HV virion formation by quantifying homo and heterotypic interactions involving NP and GPs, which otherwise are very difficult to perform. Finally, the in cellulo methodologies implemented in this work can be potentially extended to understand other key interactions involved in HV virus assembly.}, language = {en} } @phdthesis{Pitzen2022, author = {Pitzen, Valentin}, title = {Weitergef{\"u}hrte funktionelle Charakterisierung des centrosomalen Proteins Cep192 und Untersuchung der Topologie des Centrosoms in Dictyostelium Am{\"o}ben}, doi = {10.25932/publishup-54889}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-548891}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {XI, 104}, year = {2022}, abstract = {Das Centrosom von Dictyostelium ist acentriol{\"a}r aufgebaut, misst ca. 500 nm und besteht aus einer dreischichten Core-Struktur mit umgebender Corona, an der Mikrotubuli nukleieren. In dieser Arbeit wurden das centrosomale Protein Cep192 und m{\"o}gliche Interaktionspartner am Centrosom eingehend untersucht. Die einleitende Lokalisationsuntersuchung von Cep192 ergab, dass es w{\"a}hrend der gesamten Mitose an den Spindelpolen lokalisiert und im Vergleich zu den anderen Strukturproteinen der Core-Struktur am st{\"a}rksten exprimiert ist. Die dauerhafte Lokalisation an den Spindelpolen w{\"a}hrend der Mitose wird f{\"u}r Proteine angenommen, die in den beiden identisch aufgebauten {\"a}ußeren Core-Schichten lokalisieren, die das mitotische Centrosom formen. Ein Knockdown von Cep192 f{\"u}hrte zur Ausbildung von {\"u}berz{\"a}hligen Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOC) sowie zu einer leicht erh{\"o}hten Ploidie. Deshalb wird eine Destabilisierung des Centrosoms durch die verminderte Cep192-Expression angenommen. An Cep192 wurden zwei kleine Tags, der SpotH6- und BioH6-Tag, etabliert, die mit kleinen fluoreszierenden Nachweiskonjugaten markiert werden konnten. Mit den so getagten Proteinen konnte die hochaufl{\"o}sende Expansion Microscopy f{\"u}r das Centrosom optimiert werden und die Core-Struktur erstmals proteinspezifisch in der Fluoreszenzmikroskopie dargestellt werden. Cep192 lokalisiert dabei in den {\"a}ußeren Core-Schichten. Die kombinierte Markierung von Cep192 und den centrosomalen Proteinen CP39 und CP91 in der Expansion Microscopy erlaubte die Darstellung des dreischichtigen Aufbaus der centrosomalen Core-Struktur, wobei CP39 und CP91 zwischen Cep192 in der inneren Core-Schicht lokalisieren. Auch die Corona wurde in der Expansion Microscopy untersucht: Das Corona-Protein CDK5RAP2 lokalisiert in r{\"a}umlicher N{\"a}he zu Cep192 in der inneren Corona. Ein Vergleich der Corona-Proteine CDK5RAP2, CP148 und CP224 in der Expansion Microscopy ergab unterscheidbare Sublokalisationen der Proteine innerhalb der Corona und relativ zur Core-Struktur. In Biotinylierungsassays mit den centrosomalen Core-Proteinen CP39 und CP91 sowie des Corona-Proteins CDK5RAP2 konnte Cep192 als m{\"o}glicher Interaktionspartner identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die wichtige Funktion des Proteins Cep192 im Dictyostelium-Centrosom und erm{\"o}glichen durch die Kombination aus Biotinylierungsassays und Expansion Microscopy der untersuchten Proteine ein verbessertes Verst{\"a}ndnis der Topologie des Centrosoms.}, language = {de} } @misc{TzonevaStoyanovaPetrichetal.2020, author = {Tzoneva, Rumiana and Stoyanova, Tihomira and Petrich, Annett and Popova, Desislava and Uzunova, Veselina and Albena, Momchilova and Chiantia, Salvatore}, title = {Effect of Erufosine on Membrane Lipid Order in Breast Cancer Cell Models}, series = {Postprints der Universit{\"a}t Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe}, journal = {Postprints der Universit{\"a}t Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe}, number = {1000}, issn = {1866-8372}, doi = {10.25932/publishup-47705}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-477056}, pages = {19}, year = {2020}, abstract = {Alkylphospholipids are a novel class of antineoplastic drugs showing remarkable therapeutic potential. Among them, erufosine (EPC3) is a promising drug for the treatment of several types of tumors. While EPC3 is supposed to exert its function by interacting with lipid membranes, the exact molecular mechanisms involved are not known yet. In this work, we applied a combination of several fluorescence microscopy and analytical chemistry approaches (i.e., scanning fluorescence correlation spectroscopy, line-scan fluorescence correlation spectroscopy, generalized polarization imaging, as well as thin layer and gas chromatography) to quantify the effect of EPC3 in biophysical models of the plasma membrane, as well as in cancer cell lines. Our results indicate that EPC3 affects lipid-lipid interactions in cellular membranes by decreasing lipid packing and increasing membrane disorder and fluidity. As a consequence of these alterations in the lateral organization of lipid bilayers, the diffusive dynamics of membrane proteins are also significantly increased. Taken together, these findings suggest that the mechanism of action of EPC3 could be linked to its effects on fundamental biophysical properties of lipid membranes, as well as on lipid metabolism in cancer cells.}, language = {en} } @phdthesis{Knigge2020, author = {Knigge, Xenia}, title = {Einzelmolek{\"u}l-Manipulation mittels Nano-Elektroden und Dielektrophorese}, doi = {10.25932/publishup-44313}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-443137}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {106, xxxii}, year = {2020}, abstract = {In dieser Arbeit wurden Nano-Elektroden-Arrays zur Einzel-Objekt-Immobilisierung mittels Dielektrophorese verwendet. Hierbei wurden fluoreszenzmarkierte Nano-Sph{\"a}ren als Modellsystem untersucht und die gewonnenen Ergebnisse auf biologische Proben {\"u}bertragen. Die Untersuchungen in Kombination mit verschiedenen Elektrodenlayouts f{\"u}hrten zu einer deterministischen Vereinzelung der Nano-Sph{\"a}ren ab einem festen Gr{\"o}ßenverh{\"a}ltnis zwischen Nano-Sph{\"a}re und Durchmesser der Elektrodenspitzen. An den Proteinen BSA und R-PE konnte eine dielektrophoretische Immobilisierung ebenfalls demonstriert und R-PE Molek{\"u}le zur Vereinzelung gebracht werden. Hierf{\"u}r war neben einem optimierten Elektrodenlayout, das durch Feldsimulationen den Feldgradienten betreffend gesucht wurde, eine Optimierung der Feldparameter, insbesondere von Spannung und Frequenz, erforderlich. Neben der Dielektrophorese erfolgten auch Beobachtungen anderer Effekte des elektrischen Feldes, wie z.B. Elektrolyse an Nano-Elektroden und Str{\"o}mungen {\"u}ber dem Elektroden-Array, hervorgerufen durch Joulesche W{\"a}rme und AC-elektroosmotischen Fluss. Zudem konnte Dielektrophorese an Silberpartikeln beobachtet werden und mittels Fluoreszenz-, Atom-Kraft-, Raster-Elektronen-Mikroskopie und energiedispersiver R{\"o}ntgenspektroskopie untersucht werden. Schließlich wurden die verwendeten Objektive und Kameras auf ihre Lichtempfindlichkeit hin analysiert, so dass die Vereinzelung von Biomolek{\"u}len an Nano-Elektroden nachweisbar war. Festzuhalten bleibt also, dass die Vereinzelung von Nano-Objekten und Biomolek{\"u}len an Nano-Elektroden-Arrays gelungen ist. Durch den parallelen Ansatz erlaubt dies, Aussagen {\"u}ber das Verhalten von Einzelmolek{\"u}len mit guter Statistik zu treffen.}, language = {de} } @phdthesis{Roder2018, author = {Roder, Phillip}, title = {Kombination von Fluoreszenzmikroskopie und Rasterkraftmikroskopie zur Aufkl{\"a}rung physiologischer Prozesse in lebenden Zellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-419806}, school = {Universit{\"a}t Potsdam}, pages = {xvi, 113}, year = {2018}, abstract = {Innerhalb dieser Doktorarbeit wurde eine neuartige Mikromanipulationstechnik f{\"u}r die lokale Fl{\"u}ssigkeitsabgabe am komplexen Dr{\"u}sengewebe der Schabe P. americana charakterisiert und f{\"u}r die damit verbundene gezielte Manipulation von einzelnen Zellen in einem Zellkomplex (Gewebe) angewandt. Bei dieser Mikromanipulationstechnik handelt es sich um die seit 2009 bekannte nanofluidische Rasterkraftmikroskopie (FluidFM = fluidic force microscopy). Dabei werden sehr kleine mikrokan{\"a}lige Rasterkraftspitzen bzw. Mikro-/Nanopipetten mit einer {\"O}ffnung zwischen 300 nm und 2 µm verwendet, mit denen es m{\"o}glich ist, sehr kleine Volumina im Pikoliter- bis Femtoliter-Bereich (10-12 L - 10-15 L) gezielt und ortsgenau abzugeben. Das Ziel dieser Arbeit war die Analyse zellul{\"a}rer Prozesse, wie z. B. Zell-Zell-Kommunikation oder Signalweiterleitung, zwischen benachbarten Zellen unter Zuhilfenahme der Fluoreszenzmikroskopie. Mit dieser Methode k{\"o}nnen die Zellen und ihre Bestandteile mittels vorheriger Farbstoffbeladung unter einem Mikroskop mit hohem Kontrast optisch dargestellt werden. Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sollten schlussendlich die zellul{\"a}ren Reaktionen innerhalb des Gewebes nach der lokalen Manipulation visualisiert werden. Zun{\"a}chst wurde die Anwendung des Systems an Luft und w{\"a}ssriger Umgebung beschrieben. In diesem Zusammenhang wurde eine Reinigungs- und Beladungsmethode entwickelt, mit der es m{\"o}glich war, die kostspieligen Mikro-/Nanopipetten zu reinigen und anschließend mehrmals wiederzuverwenden. Hierzu wurde eine alternative Methode getestet, mit der das Diffusionsverhalten von Farbstoffmolek{\"u}len in unterschiedlichen Medien untersucht werden kann. Des Weiteren wurden die Systemparameter optimiert, welche n{\"o}tig sind, um zwischen der Probenoberfl{\"a}che und der Pipette einen guten Pipetten{\"o}ffnungs-abschluss zu erhalten. Dieser Abschluss ist essentiell, damit die abgegebene Fl{\"u}ssigkeit ausschließlich in der Abgaberegion mit der Probe wechselwirkt und die darauffolgenden Reaktionen nur innerhalb des Gewebes erfolgen, da ansonsten die Zell-Zell-Signalweiterleitung zwischen den Zellen nicht eindeutig nachvollzogen werden kann. Diese interzellul{\"a}re Kommunikation wurde anhand zweier sekund{\"a}rer Botenstoffe (Ca2+ und NO) untersucht. Hierbei war es m{\"o}glich einzelne lokale Reaktionen zu detektieren, welche sich {\"u}ber weitere Zellen ausbreiteten. Schlussendlich wurde die Fertigung einer speziellen Injektionspipette beschrieben, welche an zwei biologischen Systemen getestet wurde.}, language = {de} } @misc{KlaussKoenigHille2015, author = {Klauß, Andr{\´e} and K{\"o}nig, Marcelle and Hille, Carsten}, title = {Upgrade of a scanning confocal microscope to a single-beam path STED microscope}, series = {PLoS ONE}, journal = {PLoS ONE}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-410261}, pages = {27}, year = {2015}, abstract = {By overcoming the diffraction limit in light microscopy, super-resolution techniques, such as stimulated emission depletion (STED) microscopy, are experiencing an increasing impact on life sciences. High costs and technically demanding setups, however, may still hinder a wider distribution of this innovation in biomedical research laboratories. As far-field microscopy is the most widely employed microscopy modality in the life sciences, upgrading already existing systems seems to be an attractive option for achieving diffraction-unlimited fluorescence microscopy in a cost-effective manner. Here, we demonstrate the successful upgrade of a commercial time-resolved confocal fluorescence microscope to an easy-to-align STED microscope in the single-beam path layout, previously proposed as "easy-STED", achieving lateral resolution