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The prevalence of diseases associated with misfolded proteins increases with age. When cellular defense mechanisms become limited, misfolded proteins form aggregates and may also develop more stable cross-β structures ultimately forming amyloid aggregates. Amyloid aggregates are associated with neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease and Huntington’s disease. The formation of amyloid deposits, their toxicity and cellular defense mechanisms have been intensively studied. However, surprisingly little is known about the effects of protein aggregates on cellular signal transduction. It is also not understood whether the presence of aggregation-prone, but still soluble proteins affect signal transduction.
In this study, the still soluble aggregation-prone HttExon1Q74 and its amyloid aggregates were used to analyze the effect of amyloid aggregates on internalization and receptor activation of G protein-coupled receptors (GPCRs), the largest protein family of mammalian cell surface receptors involved in signal transduction. The aggregated HttExon1Q74, but not its soluble form, could inhibit ligand-induced clathrin-mediated endocytosis (CME) of various GPCRs. Most likely this inhibitory effect is based on a terminal sequestration of the HSC70 chaperone to the aggregates which is necessary for CME. Using the vasopressinV1a receptor (V1aR) and the corticotropin-releasing factor receptor 1 (CRF1R) as a model, it could be shown that the presence of HttExon1Q74 aggregates and the inhibition of ligand-induced CME leads to an accumulation of desensitized receptors at the plasma membrane. In turn, this disrupts Gq-mediated Ca2+ signaling and Gs-mediated cAMP signaling of the V1aR and the CRF1R respectively. In contrast to HttExon1Q74 amyloid aggregates, soluble HttExon1Q74 as well as amorphous aggregates did not inhibit GPCR internalization and signaling demonstrating that cellular signal transduction mechanisms are specifically impaired in response to the formation of amyloid aggregates.
In addition, preliminary experiments could show that HttExon1Q74 aggregates provoke an increase in membrane expression of a protein from a structurally and functionally unrelated membrane protein family, namely the serotonin transporter SERT. As SERT is the main pharmacological target to treat depression this could shed light on this commonly occurring comorbidity in neurodegenerative diseases, in particular in early disease states.
Der Na⁺-K⁺-2Cl⁻-Kotransporter (NKCC2) wird im distalen Nephron der Niere exprimiert. Seine Verteilung umfasst die Epithelien der medullären und kortikalen Teile der dicken aufsteigenden Henle-Schleife (Thick ascending limb, TAL) und die Macula densa. Resorptiver NaCl-Transport über den NKCC2 dient dem renalen Konzentrierungsmechanismus und reguliert systemisch auch Volumenstatus und Blutdruck. Die Aktivität des NKCC2 ist mit der Phosphorylierung seiner N-terminalen Aminosäurereste Serin 126 und Threonin 96/101 verbunden. Vermittelt wird diese durch die homologen Kinasen SPAK (SPS-related proline/alanine-rich kinase) und OSR1 (Oxidative stress responsive kinase 1), die hierzu ihrerseits phosphoryliert werden müssen. Der regulatorische Kontext dieser Kinasen ist mittlerweile gut charakterisiert. Über Mechanismen und Produkte, die den NKCC2 deaktivieren, war hingegen weniger bekannt. Ziel der Arbeit war daher zu untersuchen, welche Wege zur Deaktivierung des Transporters führen. Der intrazelluläre Sortierungsrezeptor SORLA (Sorting-protein-related receptor with A-type repeats) war zuvor in seiner Bedeutung für das Nephron charakterisiert worden. Ein SORLA-defizientes Mausmodell weist unter anderem eine stark verringerte NKCC2-Phosphorylierung auf. Unter osmotischem Stress können SORLA-defiziente Mäuse ihren Urin weniger effizient konzentrieren. Meine Resultate zeigen mit hochauflösender Technik, dass SORLA apikal im TAL lokalisiert ist und dass mit NKCC2 eine anteilige Kolokalisation besteht. Unter SORLA Defizienz war die für die NKCC2 Aktivität maßgebliche SPAK/OSR1-Phosphorylierung gegenüber dem Wildtyp nicht verändert. Jedoch war die ebenfalls im TAL exprimierte Phosphatase Calcineurin Aβ (CnAβ) per Western blot um das zweifache gesteigert. Parallel hierzu wurde immunhistochemisch die Kolokalisation von verstärktem CnAβ-Signal und NKCC2 bestätigt. Beide Befunde geben zusammen den Hinweis auf einen Bezug zwischen der reduzierten NKCC2-Phosphorylierung und der gesteigerten Präsenz von CnAβ bei SORLA Defizienz. Die parallel induzierte Überexpression von SORLA in HEK-Zellen zeigte entsprechend eine Halbierung der CnAβ Proteinmenge. SORLA steuert demzufolge sowohl die Abundanz als auch die zelluläre Verteilung der Phosphatase. Weiterhin ließ sich die Interaktion zwischen CnAβ und SORLA (intrazelluläre Domäne) mittels Co-Immunpräzipitation bzw. GST-pulldown assay nachweisen. Auch die Interaktion zwischen CnAβ und NKCC2 wurde auf diesem Weg belegt. Da allerdings weder SORLA noch NKCC2 ein spezifisches Bindungsmuster für CnAβ aufweisen, sind vermutlich intermediäre Adapterproteine bei ihrer Bindung involviert. Die pharmakologische Inhibition von CnAβ mittels Cyclosporin A (CsA; 1 h) führte bei SORLA Defizienz zur Normalisierung der NKCC2-Phosphorylierung. Entsprechend führte in vitro die Gabe von CsA bei TAL Zellen zu einer 7-fach gesteigerten NKCC2-Phosphorylierung. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Phosphatase CnAβ über ihre Assoziation mit NKCC2 diesen im adluminalen Zellkompartiment deaktivieren kann. Gesteuert wird dieser Vorgang durch die Eigenschaft von SORLA, CnAβ apikal zu reduzieren und damit die adluminale Phosphorylierung und Aktivität von NKCC2 zu unterstützen. Da Calcineurin-Inhibitoren derzeit die Grundlage der immunsupprimierenden Therapie darstellen, haben die Ergebnisse eine klinische Relevanz. Angesichts der Co-Expression von SORLA und CnAβ in verschiedenen anderen Organen können die Ergebnisse auch über die Niere hinaus Bedeutung erlangen.