The search result changed since you submitted your search request. Documents might be displayed in a different sort order.
  • search hit 2 of 9
Back to Result List

Charakterisierung der Lipopolysaccharid-Bindungseigenschaften von Adhäsionsproteinen aus Salmonella-Bakteriophagen

Characterization of lipopolysaccharide-binding properties of adhesion proteins from Salmonella-bacteriophages

  • Die Interaktionen von komplexen Kohlenhydraten und Proteinen sind ubiquitär. Sie spielen wichtige Rollen in vielen physiologischen Prozessen wie Zelladhäsion, Signaltransduktion sowie bei viralen Infektionen. Die molekularen Grundlagen der Interaktion sind noch nicht komplett verstanden. Ein Modellsystem für Kohlenhydrat-Protein-Interaktionen besteht aus Adhäsionsproteinen (Tailspikes) von Bakteriophagen, die komplexe Kohlenhydrate auf bakteriellen Oberflächen (O-Antigen) erkennen. Das Tailspike-Protein (TSP), das in dieser Arbeit betrachtet wurde, stammt aus dem Bakteriophagen 9NA (9NATSP). 9NATSP weist eine hohe strukturelle Homologie zum gut charakterisierten TSP des Phagen P22 (P22TSP) auf, bei einer niedriger sequenzieller Ähnlichkeit. Die Substratspezifitäten beider Tailspikes sind ähnlich mit Ausnahme der Toleranz gegenüber den glucosylierten Formen des O-Antigens. Die Struktur der beiden Tailspikes ist bekannt, sodass sie ein geeignetes System für vergleichende Bindungsstudien darstellen, um die strukturellen Grundlagen fürDie Interaktionen von komplexen Kohlenhydraten und Proteinen sind ubiquitär. Sie spielen wichtige Rollen in vielen physiologischen Prozessen wie Zelladhäsion, Signaltransduktion sowie bei viralen Infektionen. Die molekularen Grundlagen der Interaktion sind noch nicht komplett verstanden. Ein Modellsystem für Kohlenhydrat-Protein-Interaktionen besteht aus Adhäsionsproteinen (Tailspikes) von Bakteriophagen, die komplexe Kohlenhydrate auf bakteriellen Oberflächen (O-Antigen) erkennen. Das Tailspike-Protein (TSP), das in dieser Arbeit betrachtet wurde, stammt aus dem Bakteriophagen 9NA (9NATSP). 9NATSP weist eine hohe strukturelle Homologie zum gut charakterisierten TSP des Phagen P22 (P22TSP) auf, bei einer niedriger sequenzieller Ähnlichkeit. Die Substratspezifitäten beider Tailspikes sind ähnlich mit Ausnahme der Toleranz gegenüber den glucosylierten Formen des O-Antigens. Die Struktur der beiden Tailspikes ist bekannt, sodass sie ein geeignetes System für vergleichende Bindungsstudien darstellen, um die strukturellen Grundlagen für die Unterschiede der Spezifität zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der ELISA-like tailspike adsorption assay (ELITA) etabliert, um Binderpaare aus TSPs und O-Antigen zu identifizieren. Dabei wurden 9NATSP und P22TSP als Sonden eingesetzt, deren Bindung an die intakten, an die Mikrotiterplatte adsorbierten Bakterien getestet wurde. Beim Test einer Sammlung aus 44 Salmonella-Stämmen wurden Stämme identifiziert, die bindendes O-Antigen exprimieren. Gleichzeitig wurden Unterschiede in der Bindung der beiden TSPs an Salmonella-Stämme mit gleichem O-Serotyp beobachtet. Die Ergebnisse der ELITA-Messung wurden qualitativ durch eine FACS-basierte Bindungsmessung bestätigt. Zusätzlich ermöglichte die FACS-Messung bei Stämmen, die teilweise modifizierte O-Antigene herstellen, den Anteil an Zellen mit und ohne Modifikation zu erfassen. Die Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-basierten Interaktionsmessungen wurden eingesetzt, um Bindungsaffinitäten für eine TSP-O-Antigen Kombination zu quantifizieren. Dafür wurden zwei Methoden getestet, um die Oligosaccharide auf einem SPR-Chip zu immobilisieren. Zum einen wurden die enzymatisch hergestellten O-Antigenfragmente mit einem bifunktionalen Oxaminadapter derivatisiert, der eine primäre Aminogruppe für die Immobilisierung bereitstellt. Ein Versuch, diese Oligosaccharidfragmente zu immobilisieren, war jedoch nicht erfolgreich. Dagegen wurde das nicht derivatisierte Polysaccharid, bestehend aus repetitivem O-Antigen und einem konservierten Kernsaccharid, erfolgreich auf einem SPR-Chip immobilisiert. Die Immobilisierung wurde durch Interaktionsmessungen mit P22TSP bestätigt. Durch die Immobilisierung des Polysaccharids sind somit quantitative SPR-Bindungsmessungen mit einem polydispersen Interaktionspartner möglich. Eine Auswahl von Salmonella-Stämmen mit einer ausgeprägt unterschiedlichen Bindung von 9NATSP und P22TSP im ELITA-Testsystem wurde hinsichtlich der Zusammensetzung des O-Antigens mittels HPLC, Kapillargelelektrophorese und MALDI-MS analysiert. Dabei wurden nicht-stöchiometrische Modifikationen der O-Antigene wie Acetylierung und Glucosylierung detektiert. Das Ausmaß der Glucosylierung korrelierte negativ mit der Effizienz der Bindung und des Verdaus durch die beiden TSPs, wobei der negative Effekt bei 9NATSP weniger stark ausgeprägt war als bei P22TSP. Dies stimmt mit den Literaturdaten zu Infektivitätsstudien mit 9NA und P22 überein, die mit Stämmen mit vergleichbaren O-Antigenvarianten durchgeführt wurden. Die Korrelation zwischen der Glucosylierung und Bindungseffizienz konnte strukturell interpretiert werden. Auf Grundlage der O-Antigenanalysen sowie der Ergebnisse der ELITA- und FACS-Bindungstests wurden die Salmonella-Stämme Brancaster und Kalamu identifiziert, die annähernd quantitativ glucosyliertes O-Antigen exprimieren. Damit eignen sich diese Stämme für weiterführende Studien, um die Zusammenhänge zwischen der Spezifität und der Organisation der Bindestellen der beiden TSPs zu untersuchen.show moreshow less
  • Interactions between complex carbohydrates and proteins are ubiquitous. They play a major role in plenty of physiological processes as cell adhesion, signal transduction, as well as viral infections. The molecular details of the interaction are not completely understood. A model system for protein-carbohydrate interactions consists of adhesion proteins (Tailspikes) of bacteriophages, which recognize complex carbohydrates on the bacterial surface (O-antigen). A Tailspike primary used in this work originates from the bacteriophage 9NA (9NATSP). 9NATSP shows a remarkable structural similarity to the extensively studied TSP of the bacteriophage P22 (P22TSP), showing a low sequential similarity. Since structures of both TSP's are known, they provide an appropriate system for comparative interaction studies. An ELISA-like Tailspike-adsorbtion assay (ELITA) was established in this work which allows identification of binding pairs consisting of TSP's and O-antigens. In this approach 9NATSP and P22TSP were used as probes. Their binding toInteractions between complex carbohydrates and proteins are ubiquitous. They play a major role in plenty of physiological processes as cell adhesion, signal transduction, as well as viral infections. The molecular details of the interaction are not completely understood. A model system for protein-carbohydrate interactions consists of adhesion proteins (Tailspikes) of bacteriophages, which recognize complex carbohydrates on the bacterial surface (O-antigen). A Tailspike primary used in this work originates from the bacteriophage 9NA (9NATSP). 9NATSP shows a remarkable structural similarity to the extensively studied TSP of the bacteriophage P22 (P22TSP), showing a low sequential similarity. Since structures of both TSP's are known, they provide an appropriate system for comparative interaction studies. An ELISA-like Tailspike-adsorbtion assay (ELITA) was established in this work which allows identification of binding pairs consisting of TSP's and O-antigens. In this approach 9NATSP and P22TSP were used as probes. Their binding to intact bacteria adsorbed to a multi-well plate was tested. In a collection of 44 Salmonella-strains a set of strains was identified which express a binding O-antigen. Additionally different binding efficiencies were observed among the strains of the same O-serotype. Binding data of the ELITA were qualitatively resembled in a FACS-based binding test. Additionally FACS-measurements allowed estimation of the extent of non-stoichiometric modifications of the O-antigens in strains expressing modified O-antigen variants. The surface plasmone resonance (SPR) interaction-measurements were used to quantify affinities of TSP-O-antigen binding. For this, two carbohydrate immobilization strategies were tested. An O-antigen fragment, produced by enzymatic digestion, was derivatized by a bi-functional Oxamine-spacer. The spacer provides a primary amine-functionality for the immobilization. Despite the successful derivatization, sufficient amount of the O-antigen fragment could not be immobilized. Oppositely, the non-derivatized whole polysaccharide was successfully immobilized. The immobilization was confirmed by SPR-measurements with P22TSP. This approach allows quantitative measurements with polysaccharide as ligand, despite of its polydisperse characteristics. A set of Salmonella-strains with a distinctively different binding to 9NATSP and P22TSP in ELITA were characterized in terms of the content of their O-antigen by HPLC, capillary gel electrophoresis and MALDI-MS. Non-stoichiometric modifications of the O-antigens as acetylation and glucosylation were identified. The extent of glucosylation correlated negatively with the binding efficiencies to both TSP's, identifying 9NATSP as more susceptible to the glucosylation. That finding resembles with published data from early studies on the infectivity of bacteriophages 9NA and P22. Observed data could be interpreted in a structural context. The results of the O-antigen analysis as well as the results of ELITA and FACS-based interaction tests two Salmonella-strains, were identified, which produce almost completely glucosylated O-antigen: Salmonella Brancaster and Salmonella Kalamu. These strains are suitable for further studies to investigate the interdependence of the specificity and the structure of the binding sites of both TSP's.show moreshow less

Download full text files

Export metadata

Additional Services

Search Google Scholar Statistics
Metadaten
Author details:Andreas Schmidt
URN:urn:nbn:de:kobv:517-opus4-79529
Supervisor(s):Robert Seckler, Stefanie Barbirz
Publication type:Doctoral Thesis
Language:German
Publication year:2015
Publishing institution:Universität Potsdam
Granting institution:Universität Potsdam
Date of final exam:2015/07/03
Release date:2015/08/10
Tag:Adhäsionsproteine; Bakteriophagen; Glycosylierung; Lipopolysaccharid; O-Antigen; Protein-Kohlenhydrat Interaktionen; Tailspike; nicht-stöchiometrische Modifikationen
O-antigen; Tailspikes; adhesion proteins; bacteriophages; glycosylation; lipopolysaccharide; non-stoichiometric modifications; protein-carbohydrate interactions
Number of pages:VIII, 114
RVK - Regensburg classification:WF 3300, WC 4170
Organizational units:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Biochemie und Biologie
DDC classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
License (German):License LogoKeine öffentliche Lizenz: Unter Urheberrechtsschutz
Accept ✔
This website uses technically necessary session cookies. By continuing to use the website, you agree to this. You can find our privacy policy here.