Phillip Roder

• Innerhalb dieser Doktorarbeit wurde eine neuartige Mikromanipulationstechnik für die lokale Flüssigkeitsabgabe am komplexen Drüsengewebe der Schabe P. americana charakterisiert und für die damit verbundene gezielte Manipulation von einzelnen Zellen in einem Zellkomplex (Gewebe) angewandt. Bei dieser Mikromanipulationstechnik handelt es sich um die seit 2009 bekannte nanofluidische Rasterkraftmikroskopie (FluidFM = fluidic force microscopy). Dabei werden sehr kleine mikrokanälige Rasterkraftspitzen bzw. Mikro-/Nanopipetten mit einer Öffnung zwischen 300 nm und 2 µm verwendet, mit denen es möglich ist, sehr kleine Volumina im Pikoliter- bis Femtoliter-Bereich (10-12 L – 10-15 L) gezielt und ortsgenau abzugeben. Das Ziel dieser Arbeit war die Analyse zellulärer Prozesse, wie z. B. Zell-Zell-Kommunikation oder Signalweiterleitung, zwischen benachbarten Zellen unter Zuhilfenahme der Fluoreszenzmikroskopie. Mit dieser Methode können die Zellen und ihre Bestandteile mittels vorheriger Farbstoffbeladung unter einem Mikroskop mit hohemInnerhalb dieser Doktorarbeit wurde eine neuartige Mikromanipulationstechnik für die lokale Flüssigkeitsabgabe am komplexen Drüsengewebe der Schabe P. americana charakterisiert und für die damit verbundene gezielte Manipulation von einzelnen Zellen in einem Zellkomplex (Gewebe) angewandt. Bei dieser Mikromanipulationstechnik handelt es sich um die seit 2009 bekannte nanofluidische Rasterkraftmikroskopie (FluidFM = fluidic force microscopy). Dabei werden sehr kleine mikrokanälige Rasterkraftspitzen bzw. Mikro-/Nanopipetten mit einer Öffnung zwischen 300 nm und 2 µm verwendet, mit denen es möglich ist, sehr kleine Volumina im Pikoliter- bis Femtoliter-Bereich (10-12 L – 10-15 L) gezielt und ortsgenau abzugeben. Das Ziel dieser Arbeit war die Analyse zellulärer Prozesse, wie z. B. Zell-Zell-Kommunikation oder Signalweiterleitung, zwischen benachbarten Zellen unter Zuhilfenahme der Fluoreszenzmikroskopie. Mit dieser Methode können die Zellen und ihre Bestandteile mittels vorheriger Farbstoffbeladung unter einem Mikroskop mit hohem Kontrast optisch dargestellt werden. Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sollten schlussendlich die zellulären Reaktionen innerhalb des Gewebes nach der lokalen Manipulation visualisiert werden. Zunächst wurde die Anwendung des Systems an Luft und wässriger Umgebung beschrieben. In diesem Zusammenhang wurde eine Reinigungs- und Beladungsmethode entwickelt, mit der es möglich war, die kostspieligen Mikro-/Nanopipetten zu reinigen und anschließend mehrmals wiederzuverwenden. Hierzu wurde eine alternative Methode getestet, mit der das Diffusionsverhalten von Farbstoffmolekülen in unterschiedlichen Medien untersucht werden kann. Des Weiteren wurden die Systemparameter optimiert, welche nötig sind, um zwischen der Probenoberfläche und der Pipette einen guten Pipettenöffnungs-abschluss zu erhalten. Dieser Abschluss ist essentiell, damit die abgegebene Flüssigkeit ausschließlich in der Abgaberegion mit der Probe wechselwirkt und die darauffolgenden Reaktionen nur innerhalb des Gewebes erfolgen, da ansonsten die Zell-Zell-Signalweiterleitung zwischen den Zellen nicht eindeutig nachvollzogen werden kann. Diese interzelluläre Kommunikation wurde anhand zweier sekundärer Botenstoffe (Ca2+ und NO) untersucht. Hierbei war es möglich einzelne lokale Reaktionen zu detektieren, welche sich über weitere Zellen ausbreiteten. Schlussendlich wurde die Fertigung einer speziellen Injektionspipette beschrieben, welche an zwei biologischen Systemen getestet wurde.…
• Within this thesis, a novel micromanipulation technique was characterised for the local liquid delivery at the complex salivary glands tissue of the cockroach P. americana and was applied for the associated targeted manipulation of single cells in a cell complex (tissue). This micromanipulation technique is known since 2009 as the fluidic force microscopy (FluidFM) technique. In this case, very small microchanneled AFM tips or rather micro-/nanopipettes with an opening between 300 nm and 2 μm are used to deliver very small volumes in the picoliter to femtoliter range (10-12 L - 10-15 L) targeted and accurate. The aim of this work was the analysis of cellular processes, such as cell-cell communication or signal transduction, between adjacent cells using fluorescence microscopy. Using this method, the cells and their components can be optically visualised by prior dye loading under a microscope with high contrast. Using fluorescence microscopy, the cellular responses within the tissue were finally visualised after localWithin this thesis, a novel micromanipulation technique was characterised for the local liquid delivery at the complex salivary glands tissue of the cockroach P. americana and was applied for the associated targeted manipulation of single cells in a cell complex (tissue). This micromanipulation technique is known since 2009 as the fluidic force microscopy (FluidFM) technique. In this case, very small microchanneled AFM tips or rather micro-/nanopipettes with an opening between 300 nm and 2 μm are used to deliver very small volumes in the picoliter to femtoliter range (10-12 L - 10-15 L) targeted and accurate. The aim of this work was the analysis of cellular processes, such as cell-cell communication or signal transduction, between adjacent cells using fluorescence microscopy. Using this method, the cells and their components can be optically visualised by prior dye loading under a microscope with high contrast. Using fluorescence microscopy, the cellular responses within the tissue were finally visualised after local manipulation. First, the application of the system in air and aqueous environment was described. In this context, a cleaning and loading method was developed which allows the cleaning and the repeated reuse of the expensive micro-/nanopipettes. For this purpose, an alternative method has been tested, with which the diffusion of dye molecules in different media can be examined. Furthermore, the system parameters needed to obtain a good pipette opening sealing between the sample surface and the pipette have been optimised. This sealing is essential to ensure that the delivered liquid interacts only with the sample in the delivery region and that subsequent reactions occur only within the tissue, otherwise cell-cell signaling between the cells can not be clearly understood. This intercellular communication was studied by means of two secondary messengers (Ca2+ and NO). Here it was possible to detect individual local reactions that spread over more cells. Finally, the production of a special injection pipette was described, which was tested on two biological systems.…