Eva Katharina Barbosa Pfannes

• Actin-based directional motility is important for embryonic development, wound healing, immune responses, and development of tissues. Actin and myosin are essential players in this process that can be subdivided into protrusion, adhesion, and traction. Protrusion is the forward movement of the membrane at the leading edge of the cell. Adhesion is required to enable movement along a substrate, and traction finally leads to the forward movement of the entire cell body, including its organelles. While actin polymerization is the main driving force in cell protrusions, myosin motors lead to the contraction of the cell body. The goal of this work was to study the regulatory mechanisms of the motile machinery by selecting a representative key player for each stage of the signaling process: the regulation of Arp2/3 activity by WASP (actin system), the role of cGMP in myosin II assembly (myosin system), and the influence of phosphoinositide signaling (upstream receptor pathway). The model organism chosen for this work was the social amebaActin-based directional motility is important for embryonic development, wound healing, immune responses, and development of tissues. Actin and myosin are essential players in this process that can be subdivided into protrusion, adhesion, and traction. Protrusion is the forward movement of the membrane at the leading edge of the cell. Adhesion is required to enable movement along a substrate, and traction finally leads to the forward movement of the entire cell body, including its organelles. While actin polymerization is the main driving force in cell protrusions, myosin motors lead to the contraction of the cell body. The goal of this work was to study the regulatory mechanisms of the motile machinery by selecting a representative key player for each stage of the signaling process: the regulation of Arp2/3 activity by WASP (actin system), the role of cGMP in myosin II assembly (myosin system), and the influence of phosphoinositide signaling (upstream receptor pathway). The model organism chosen for this work was the social ameba Dictyostelium discoideum, due to the well-established knowledge of its cytoskeletal machinery, the easy handling, and the high motility of its vegetative and starvation developed cells. First, I focused on the dynamics of the actin cytoskeleton by modulating the activity of one of its key players, the Arp2/3 complex. This was achieved using the carbazole derivative Wiskostatin, an inhibitor of the Arp2/3 activator WASP. Cells treated with Wiskostatin adopted a round shape, with no of few pseudopodia. With the help of a microfluidic cell squeezer device, I could show that Wiskostatin treated cells display a reduced mechanical stability, comparable to cells treated with the actin disrupting agent Latrunculin A. Furthermore, the WASP inhibited cells adhere stronger to a surface and show a reduced motility and chemotactic performance. However, the overall F-actin content in the cells was not changed. Confocal microscopy and TIRF microscopy imaging showed that the cells maintained an intact actin cortex. Localized dynamic patches of increased actin polymerization were observed that, however, did not lead to membrane deformation. This indicated that the mechanisms of actin-driven force generation were impaired in Wiskostatin treated cells. It is concluded that in these cells, an altered architecture of the cortical network leads to a reduced overall stiffness of the cell, which is insufficient to support the force generation required for membrane deformation and pseudopod formation. Second, the role of cGMP in myosin II dynamics was investigated. Cyclic GMP is known to regulate the association of myosin II with the cytoskeleton. In Dictyostelium, intracellular cGMP levels increase when cells are exposed to chemoattractants, but also in response to osmotic stress. To study the influence of cyclic GMP on actin and myosin II dynamics, I used the laser-induced photoactivation of a DMACM-caged-Br-cGMP to locally release cGMP inside the cell. My results show that cGMP directly activates the myosin II machinery, but is also able to induce an actin response independently of cAMP receptor activation and signaling. The actin response was observed in both vegetative and developed cells. Possible explanations include cGMP-induced actin polymerization through VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein) or through binding of cGMP to cyclic nucleotide-dependent kinases. Finally, I investigated the role of phosphoinositide signaling using the Polyphosphoinositide-Binding Peptide (PBP10) that binds preferentially to PIP2. Phosphoinositides can recruit actin-binding proteins to defined subcellular sites and alter their activity. Neutrophils, as well as developed Dictyostelium cells produce PIP3 in the plasma membrane at their leading edge in response to an external chemotactic gradient. Although not essential for chemotaxis, phosphoinositides are proposed to act as an internal compass in the cell. When treated with the peptide PBP10, cells became round, with fewer or no pseudopods. PH-CRAC translocation to the membrane still occurs, even at low cAMP stimuli, but cell motility (random and directional) was reduced. My data revealed that the decrease in the pool of available PIP2 in the cell is sufficient to impair cell motility, but enough PIP2 remains so that PIP3 is formed in response to chemoattractant stimuli. My data thus highlights how sensitive cell motility and morphology are to changes in the phosphoinositide signaling. In summary, I have analyzed representative regulatory mechanisms that govern key parts of the motile machinery and characterized their impact on cellular properties including mechanical stability, adhesion and chemotaxis.…
• Das Ziel der Arbeit war es, die regulatorischen Mechanismen der Zellmotilität zu untersuchen. Dazu habe ich für jedes Stadium dieses Prozesses einen repräsentativen regulatorischen Schritt ausgewählt und genauer untersucht: Die Regelung des Arp2/3 Komplexes durch WASP (Aktinsystem), die Rolle von cGMP in der Myosin II-Regulation (Myosinsystem) und der Einfluss von Phosphoinositiden im intrazellulären Signalprozess (Rezeptor-Signalweg). Die soziale Amöbe Dictyostelium discoideum wurde als Modellorganismus für diese Arbeiten gewählt. Gründe für diese Wahl waren die bereits vorliegenden detaillierten Kenntnisse über das Zytoskelett dieser Zellen, ihre einfache Handhabbarkeit im Labor, und die hohe Motilität der Zellen im vegetativen und entwickelten Zustand. Als Erstes analysierte ich die Dynamik des Aktin-Zytoskeletts durch Modulation der Aktivität des Arp2/3-Komplexes. Dafür benutzte ich das Carbazol-Derivat Wiskostatin, ein Inhibitor des Arp2/3-Aktivators WASP. Zellen, die mit Wiskostatin behandelt wurden, zeigten eine runde Form mitDas Ziel der Arbeit war es, die regulatorischen Mechanismen der Zellmotilität zu untersuchen. Dazu habe ich für jedes Stadium dieses Prozesses einen repräsentativen regulatorischen Schritt ausgewählt und genauer untersucht: Die Regelung des Arp2/3 Komplexes durch WASP (Aktinsystem), die Rolle von cGMP in der Myosin II-Regulation (Myosinsystem) und der Einfluss von Phosphoinositiden im intrazellulären Signalprozess (Rezeptor-Signalweg). Die soziale Amöbe Dictyostelium discoideum wurde als Modellorganismus für diese Arbeiten gewählt. Gründe für diese Wahl waren die bereits vorliegenden detaillierten Kenntnisse über das Zytoskelett dieser Zellen, ihre einfache Handhabbarkeit im Labor, und die hohe Motilität der Zellen im vegetativen und entwickelten Zustand. Als Erstes analysierte ich die Dynamik des Aktin-Zytoskeletts durch Modulation der Aktivität des Arp2/3-Komplexes. Dafür benutzte ich das Carbazol-Derivat Wiskostatin, ein Inhibitor des Arp2/3-Aktivators WASP. Zellen, die mit Wiskostatin behandelt wurden, zeigten eine runde Form mit wenigen oder keinen Pseudopodien. Mit Hilfe des mikrofluidischen cell squeezer device konnte ich zeigen, dass Wiskostatin-behandelte Zellen eine geringere mechanische Stabilität aufweisen, vergleichbar mit Zellen unter dem Einfluss des Aktin-depolymerisierenden Wirkstoffes Latrunculin A. Darüber hinaus zeigen Wiskostatin behandelten Zellen eine erhöhte Substratadhäsion und eine verringerte Motilität und chemotaktische Effizienz. Der F-Aktingehalt der Zelle insgesamt blieb jedoch unverändert. Konfokal- und TIRF-mikroskopische Aufnahmen zeigten, dass die Zellen einen intakten Aktinkortex aufweisen. Es konnten lokalisierte dynamische Regionen erhöhter Aktinpolymerisation beobachtet werden, die jedoch nicht zur Ausbildung von Membrandeformationen führten. Daraus kann man rückschließen, dass die Mechanismen der Krafterzeugung im Aktin-Zytoskelett in WASP-inhibierten Zellen beeinträchtigt sind. Vermutlich liegt in diesen Zellen eine veränderte Mikroarchitektur des kortikalen Netzwerks vor, die zu einer verminderten Steifigkeit der Zelle führt, so dass die zur Bildung von Pseudopodien erforderlichen Kräfte nicht entfaltet werden können. Als Zweites wurde die Rolle von cGMP in der Myosin II-Dynamik untersucht. Es ist bekannt, dass cGMP die Assoziation von Myosin II mit dem Zytoskelett reguliert. In Dictyostelium steigt die intrazelluläre Konzentration von cGMP in Gegenwart von chemoattraktiven Lockstoffen sowie in Antwort auf osmotischen Stress. Um den Einfluss von cGMP auf die Aktin und Myosin II -Dynamik zu untersuchen, benutzte ich laserinduzierte Photoaktivierung von DMACM-caged-Br-cGMP, um cGMP lokal innerhalb der Zelle freizusetzen. Meine Ergebnisse zeigten, dass intrazelluläres cGMP direkt zur Aktivierung von Myosin II führt, jedoch auch Aktinantworten unabhängig vom cAMP-Rezeptorsignalweg induzieren kann. Die Aktinreaktion wurde sowohl in vegetativen als auch in entwickelten Zellen beobachtet. Eine mögliche Erklärung könnte die cGMP-induzierte Aktinpolymerisation über VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein) sein oder über die Bindung von cGMP an Nukleotid-abhängige Proteinkinasen. Als dritten Punkt meiner Arbeit untersuchte ich die Rolle der Phosphoinositide mit Hilfe des Phosphoinositide-bindenden Proteins PBP10, das bevorzugt an PIP2 bindet. Phosphoinositiden können Aktin-bindende Proteine zu definierten subzellulären Orten rekrutieren und ihre Aktivität verändern. Sowohl Neutrophile als auch entwickelte Dictyostelium Zellen produzieren PIP3 in der Plasmamembran an ihrer leading edge in Antwort auf externe Gradienten chemischer Lockstoffe. Obwohl Zellen auch ohne PIP3 chemotaktisches Verhalten zeigen, werden Phosphoinositide im Allgemeinen mit dem inneren chemotaktischen Kompass der Zelle in Verbindung gebracht. Mit dem Peptid PBP10 behandelte Zellen nahmen eine runde Form an, mit wenigen oder keinen Pseudopodien. PH-CRAC -Translokation zur Membran konnte in PBP10-behandelten Zellen selbst bei geringen cAMP-Stimuli weiterhin beobachtet werden. Ungerichtete wie auch gerichtete Zellmotiliät waren jedoch beeinträchtigt. Meine Daten zeigen, dass die Abnahme des PIP2-Pools in der Zelle durch PBP10 ausreicht, um die Zellmotilität zu beeinträchtigen, dass jedoch genug PIP2 erhalten bleibt um in Folge einer Rezeptorstimulation PIP3 zu produzieren. Die Ergebnisse demonstrieren daher, wie empfindlich Zellmotilität und -morphologie gegenüber Modifikationen im Phosphoinositid-Signalweg sind. Zusammenfassend habe ich mehrere repräsentative Beispiele für regulatorische Mechanismen der Zellmotilität untersucht und deren Auswirkung auf Eigenschaften der Zelle wie mechanische Stabilität, Zelladhäsion und Chemotaxis charakterisiert.…