Anne Enzenberg

• Ziel dieser Arbeit war die Synthese und Charakterisierung von neuartigen fluoreszierenden Copolymeren zur Analytdetektion in wässrigen Systemen. Das Detektionssystem sollte ein einfaches Schalten der Fluoreszenz bei Analytbindung „Aus“ bzw. Verdrängung „An“ ermöglichen. Dafür wurde die Synthese eines funktionalisierten Monomers so geplant, dass sich Fluorophor und Analyt innerhalb derselben Monomereinheit in direkter Nachbarschaft zueinander befinden. So sollten bei Erkennung des Analyten durch eine mit einem Fluoreszenzlöscher funktionalisierte Erkennungsstruktur Fluorophor und Löscher in einen vorgegebenen Abstand zueinander gezwungen und die Fluoreszenz des Fluorophors effizient gelöscht werden. Bei anschließender Verdrängung der Erkennungseinheit durch einen stärker bindenden Analyten sollte die Fluoreszenz wieder „angeschaltet“ werden. Eine weitere Zielstellung für das Detektionssystem war eine hohe Löslichkeit und Fluoreszenzintensität in Wasser. Da die Anwendung solcher Sensoren besonders in der Medizin und Biologie, z.B. fürZiel dieser Arbeit war die Synthese und Charakterisierung von neuartigen fluoreszierenden Copolymeren zur Analytdetektion in wässrigen Systemen. Das Detektionssystem sollte ein einfaches Schalten der Fluoreszenz bei Analytbindung „Aus“ bzw. Verdrängung „An“ ermöglichen. Dafür wurde die Synthese eines funktionalisierten Monomers so geplant, dass sich Fluorophor und Analyt innerhalb derselben Monomereinheit in direkter Nachbarschaft zueinander befinden. So sollten bei Erkennung des Analyten durch eine mit einem Fluoreszenzlöscher funktionalisierte Erkennungsstruktur Fluorophor und Löscher in einen vorgegebenen Abstand zueinander gezwungen und die Fluoreszenz des Fluorophors effizient gelöscht werden. Bei anschließender Verdrängung der Erkennungseinheit durch einen stärker bindenden Analyten sollte die Fluoreszenz wieder „angeschaltet“ werden. Eine weitere Zielstellung für das Detektionssystem war eine hohe Löslichkeit und Fluoreszenzintensität in Wasser. Da die Anwendung solcher Sensoren besonders in der Medizin und Biologie, z.B. für Schnellerkennungstest von Pathogenen, von Interesse ist, ist die Kompatibilität mit wässrigen Medien essentiell. Die funktionalisierten Monomere wurden frei radikalisch mit N Vinyl-pyrrolidon bzw. N Vinyl¬caprolactam zu wasserlöslichen, fluoreszierenden Copolymeren umgesetzt. In den N-Vinyl¬pyrrolidon-Polymeren (PNVP) wurde RhodaminB, in den thermoresponsiven N Vinyl¬caprolactam-Polymeren (PNVCL) ein Naphthalsäureimid als Fluorophor verwendet. Während Rhodamine eine hohe Fluoreszenzintensität, gute Quantenausbeuten und hohen Extinktionskoeffizienten in Wasser zeigen, sind Naphthalsäure¬imide umgebungssensitive Chromophore, die bei Änderung ihrer Lösungsmittelumgebung, wie z.B. beim Kollaps eines thermoresponsiven Polymers in Wasser, ihre Fluoreszenzintensität und Quantenausbeute drastisch ändern können. Der Vorteil der hier verwendeten Strategie der Monomersynthese liegt darin, dass bei jeder spezifischen Analytdetektion durch eine Erkennungseinheit die Fluoreszenz effizient gelöscht bzw. bei Verdrängung durch einen stärker bindenden Analyten wieder „angeschaltet“ wird. Dieses Prinzip wird bereits vielfach in der Biologie in sogenannten „Molecular Beacons“ ausgenutzt, wobei ein Fluorophor und ein Löscher durch spezifische DNA Basenpaarung in einen vorgegebenen Abstand zueinander gezwungen werden und so ein „Schalten“ der Fluoreszenz ermöglichen. Aufgrund der vorgegebenen Struktur der DNA Basensequenzen ist es jedoch nicht direkt auf andere Erkennungsreaktionen übertragbar. Daher wurde ein Modellsystem entwickelt, welches die Möglichkeit bietet Analyt, Erkennungseinheit und Signalgeber variabel, je nach Anforderungen des Systems, auszutauschen. So soll es möglich sein, den Sensor a priori für jede Erkennungs¬reaktion zu verwenden. Als Modell Bindungs¬paare wurden ß Cyclodextrin/Adamantan und Con¬cana¬valinA/Mannose ausgewählt. Adamantan bzw. Mannose wurde als Analyt zusammen mit dem Fluorophor in das Polymer eingebunden. ß Cyclo¬dextrin (ß CD) bzw. ConcanavalinA (ConA) wurde als Erkennungsstruktur an einem Fluoreszenzlöscher immobilisiert. Polymer-basierte Fluoreszenzsensoren sind in der Fachliteratur gut dokumentiert. In der Regel sind Signalgeber und Analyt jedoch statistisch im Polymer verteilt, da sie sich entweder in unterschiedlichen Monomereinheiten befinden oder die Funktionalisierung durch eine polymeranaloge Umsetzung erfolgt. Der gewählte Ansatz Fluorophor und Analyt innerhalb derselben Monomereinheit einzubinden, soll bei jeder Erkennungsreaktion des Analyten zu einer Änderung der Signalintensität des Fluorophors führen. Eine hohe Signalintensität bei Analytdetektion ist wünschenswert, insbesondere für Erkennungsreaktionen, die mit möglichst geringem apparativem Aufwand, am besten mit dem bloßen Auge zu verfolgen sein sollen. Des Weiteren ist es möglich den Fluorophorgehalt im Polymer genau einzustellen und so Selbstlöschung zu vermeiden. Die synthetisierten Polymere haben einen Fluorophorgehalt von 0,01 mol% bis 0,5 mol%. Für die RhodaminB haltigen Polymere zeigte sich, dass ein Fluorophorgehalt unterhalb 0,1 mol% im Polymer die höchsten Ausbeuten, Molmassen und Quantenausbeuten liefert. Für die Naphthalsäureimid haltigen Polymere hingegen wurden auch für einen Fluorophorgehalt von bis zu 1 mol% hohe Ausbeuten und Molmassen erreicht. Die Naphthalsäureimid haltigen Polymere haben jedoch in wässriger Lösungsmittelumgebung nur geringe Quantenausbeuten. Als Fluoreszenzlöscher wurden Goldnanopartikel synthetisiert, die mit den entsprechenden Erkennungsstrukturen (ß-CD oder ConA) für den verwendeten Analyten funktionalisiert wurden. Goldnanopartikel als Löscher bieten den Vorteil, dass ihre Dispergierbarkeit in einem Lösemittel durch Funktionalisierung ihrer Hülle gezielt gesteuert werden kann. Durch die hohe Affinität von Goldnanopartikeln zu Thiolen und Aminen konnten sie mit Hilfe einfacher Syntheseschritte mit Thio ß CD Derivaten bzw. ConA funktionalisiert werden. In der hier vorgelegten Arbeit sollte ein Modellsystem für einen solches fluoreszenz-basiertes Detektionssystem in Wasser entwickelt werden. Nachfolgend werden die zu erfüllenden strukturellen Voraussetzungen für die Synthese eines solchen Sensors nochmals zusammengefasst: 1. Verwendung eines Fluorophors, der eine hohe Signalintensität zeigt. 2. Analyt bzw. Erkennungseinheit soll sich im Abstand von wenigen Nanometern zum Signalgeber befinden, um bei jeder Detektionsreaktion die Signalintensität des Signalgebers beeinflussen zu können. 3. Die Detektionseinheit benötigt eine funktionelle Gruppe zur Immobilisierung. Immobilisierung kann z.B. durch Einbindung in ein Polymer erfolgen. 4. Der Fluorophor soll bei Änderung seiner lokalen Umgebung, durch Binden eines Löschers oder Änderung seiner Lösemittelumgebung seine Fluoreszenzeigenschaften drastisch ändern. 5. Die Reaktion sollte schnell und mit möglichst geringem apparativem Aufwand, am besten mit bloßem Auge zu verfolgen sein. Für das ß-CD/Adamantan Modellsystem wurde ein Fluoreszenz Aus/An Sensor entwickelt, der bei Binden ß CD funktionalisierter Goldnanopartikel an das polymergebundene Adamantan die Fluoreszenz des RhodaminB Fluorophors effizient löscht und bei Verdrängung der Goldnanopartikel wieder zurück gewinnt. Dies konnte auch mit bloßem Auge verfolgt werden. Für die Naphthalsäureimid Monomere, die mit NVCL copolymerisiert wurden, wurde abhängig von der lokalen Umgebung des Fluorophors eine unterschiedliche Verstärkung der Fluoreszenzintensität bei Überschreiten des Trübungspunktes des Polymers gefunden. Dabei zeigte sich, dass die Einführung eines Abstandshalters zwischen Polymerrückgrat und Fluorophor zu einer großen Fluoreszenz¬verstärkung führt, während sich ohne Abstandshalter die Fluoreszenzintensität bei Über¬schreiten des Trübungspunktes kaum ändert.…
• Novel fluorescent copolymers for analyte detection in aqueous media have been synthesized and characterized. The detection system is designed to switch fluorescence between an “Off” state for analyte binding and an “On” state for analyte displacement. A functional monomer was synthesized in which fluorophore and analyte are placed close to each other within the same monomer unit. If the fluorescence quencher labeled recognition unit detects an analyte, fluorophore and quencher are forced in a very short distance to each other and fluorescence is quenched efficiently. The recognition unit is afterwards replaced through a stronger binding analyte and fluorescence should be “turned on” again. Another requirement for the detection system was high solubility and fluorescence intensity in water. Water compatibility is essential for implementation of such sensor systems especially in medicine and biology, e.g. for fast testing systems of pathogens. The synthesized monomers have been copolymerized in a free radical polymerization with NNovel fluorescent copolymers for analyte detection in aqueous media have been synthesized and characterized. The detection system is designed to switch fluorescence between an “Off” state for analyte binding and an “On” state for analyte displacement. A functional monomer was synthesized in which fluorophore and analyte are placed close to each other within the same monomer unit. If the fluorescence quencher labeled recognition unit detects an analyte, fluorophore and quencher are forced in a very short distance to each other and fluorescence is quenched efficiently. The recognition unit is afterwards replaced through a stronger binding analyte and fluorescence should be “turned on” again. Another requirement for the detection system was high solubility and fluorescence intensity in water. Water compatibility is essential for implementation of such sensor systems especially in medicine and biology, e.g. for fast testing systems of pathogens. The synthesized monomers have been copolymerized in a free radical polymerization with N vinyl¬pyrrolidone or N vinylcaprolactame to give fluorescent, water soluble copolymers. For the N vinyl-pyrrolidone polymers (PNVP) a rhodamineB fluorophore was used whereas for the thermoresponsive N vinyl-caprolactame polymers (PNVCL) a naphthalimide fluorophore was used in the comonomer. While rhodamines are well known for their high fluorescence intensity, quantum yield and extinction coefficient in water, naphthalimides are known to be environment sensitive fluorophores who can change their fluorescence intensity drastically depending on their local solvent vicinity. Such a functional monomer design should give the advantage of efficient fluorescence quenching during analyte binding and fluorescence enhancement when the recognition unit is afterwards displaced. This principle is often used in systems like molecular beacons. Fluorophore and quencher are forced in a given distance through specific DNA base pairing and fluorescence can be switched. Because of the given DNA base sequence this detection system cannot be directly implemented to other recognition reactions. Here a model system was developed which gives the possibility to vary analyte, recognition unit and fluorophore. This way it should be possible to adopt the sensor a priori to every recognition reaction. ß-cyclodextrin/adamantane and concana¬valinA/mannose were chosen as model binding pairs. Adamantane or mannose and the fluorophore are attached to the polymer backbone. The ß cyclodextrin (ß-CD) or concanavalinA (ConA) recognition unit is immobilized on a fluorescence quencher. Polymer based fluorescence sensors are well known in literature. Usually fluorophore and analyte are statistically spread in the polymer because they are independently incorporated via different monomer units or functionalization is done polymer analog. To place fluorophore and analyte in the same monomer unit should have the benefit that every recognition event also leads to a change of signal intensity of the fluorophore. High signal intensity is crucial especially for recog¬nition reactions which should be tracked with only simple equipment or even with the naked eye. Even more it is possible to adjust the fluorophore content in the polymer. The synthesized polymers have a fluorophore content between 0.01 mol% and 0.5 mol%. For the rhodamineB containing polymers a fluorophore content below 0.1 mol% gives the highest yields, molecular weight and quantum yields. The polymers which contain naphthalimide as fluorophore give high yields and molecular weight up to 1 mol% of fluorophore content in the polymer but the quantum yields are in general low in aqueous media. Gold nano¬particles (Au NP) are synthesized as fluorescence quencher and functionalized with the recognition units (ß-CD or ConA) for analyte detection. Gold nanoparticles as fluorescence quencher have the advantage that their dispersibility in a solvent can be controlled by the choice of ligand used for the stabilization of the particles. Because of their high affinity to thiols and amines it was possible to synthesize thio-ß-CD and ConA functionalized gold nanoparticles in only a few synthetic steps.   Here a model system for fluorescent detection in water is presented. The structural requirements that have to be fulfilled for the synthesis of such a detection system are summarized: 1. The fluorophore needs to have high signal intensity. 2. Analyte or recognition unit have to be only a few nanometer apart from the signaling unit so every recognition reaction leads to a change of signal intensity. 3. The detection unit needs a functional group for immobilization. Immobilization can be done for example in a polymer matrix. 4. The fluorophore should change its fluorescence properties drastically through change of its local environment for example when binding a fluorescence quencher. 5. Reaction should be fast and detection should be possible with only little equipment or even with the naked eye It was possible to synthesis a fluorescence Off/On sensor for a ß-CD/adamantane model system. Fluorescence of the rhodamineB fluorophore is quenched during binding of ß-CD-Au-NPs and efficiently enhanced when the ß-CD-Au-NPs are displaced through a better binding analyte which can be even followed by the naked eye (Scheme 1). For the naphthalimide containing thermoresponsive N-vinylcaprolactame polymers a dependence of the fluorescence enhancement at polymer collapse is found depending on the local vicinity of the fluorophore. Introducing a spacer between fluorophore and polymer backbone leads to a high fluorescence enhancement while polymers without a spacer show almost no fluorescence enhancement during the collapse.…