Matthias Festag

• Substanzen der pharmazeutischen und chemischen Industrie müssen nach internationalen Richtlinien auf deren Toxizität gegenüber Mensch und Umwelt geprüft werden. Dazu gehören u. a. Prüfungen zur Vorhersage des embryotoxischen Potentials, die am lebenden Organismus durchgeführt werden. Mit dem Ziel die Anzahl der Tierversuche zu verringern, die notwendig sind um das toxikologische Profil einer Prüfsubstanz zu bestimmen, wurde der Embryonale Stammzelltest (EST) entwickelt. Als Grundlage des EST dienen embryonale Stammzellen (ES-Zellen) einer Zelllinie. ES-Zellen sind Zellen, die sich in der frühen embryonalen Entwicklung in die Zellen der Keimblätter entwickeln können. Daraus wiederum differenzieren die vielen verschiedenen, unterschiedlich spezialisierten Zelltypen des komplexen Organismus. Im EST wird die Konzentration einer Prüfsubstanz bestimmt, bei der die Differenzierung von ES-Zellen zu Herzmuskelzellen zu 50 % inhibiert wird. Zusätzlich wird die Konzentration der Prüfsubstanz bestimm°t, bei der 50 % der ES-Zellen (IC50D3)Substanzen der pharmazeutischen und chemischen Industrie müssen nach internationalen Richtlinien auf deren Toxizität gegenüber Mensch und Umwelt geprüft werden. Dazu gehören u. a. Prüfungen zur Vorhersage des embryotoxischen Potentials, die am lebenden Organismus durchgeführt werden. Mit dem Ziel die Anzahl der Tierversuche zu verringern, die notwendig sind um das toxikologische Profil einer Prüfsubstanz zu bestimmen, wurde der Embryonale Stammzelltest (EST) entwickelt. Als Grundlage des EST dienen embryonale Stammzellen (ES-Zellen) einer Zelllinie. ES-Zellen sind Zellen, die sich in der frühen embryonalen Entwicklung in die Zellen der Keimblätter entwickeln können. Daraus wiederum differenzieren die vielen verschiedenen, unterschiedlich spezialisierten Zelltypen des komplexen Organismus. Im EST wird die Konzentration einer Prüfsubstanz bestimmt, bei der die Differenzierung von ES-Zellen zu Herzmuskelzellen zu 50 % inhibiert wird. Zusätzlich wird die Konzentration der Prüfsubstanz bestimm°t, bei der 50 % der ES-Zellen (IC50D3) bzw. Fibroblastenzellen (IC503T3) absterben. Die allgemeine Toxizität ist damit von der spezifischen Toxizität der Prüfsubstanz auf die ES-Zellen und deren Differenzierung unterscheidbar. Die Parameter fliessen in ein biostatistisches Modell zur Prädiktion des embryotoxischen Potentials der Prüfsubstanzen ein. Es wurde ein Versuchsprotokoll entwickelt, wonach die ES-Zellen sich verstärkt zu Endothelzellen differenzieren. Die Endothelzellen, die im lebenden Organismus die Wand der späteren Blutgefässe, wie Venen und Arterien bilden, wurden mittels molekularbiologischer Methoden auf der RNA- und der Protein-Ebene nachgewiesen und quantifiziert. Verschiedene Zellkulturmethoden, Wachstumsfaktoren, als auch Wachstumsfaktorkonzentrationen wurden auf deren Vermögen die Differenzierung der ES-Zellen zu Endothelzellen zu induzieren, untersucht. Nach der Etablierung des Differenzierungsprotokolls wurden sieben Substanzen auf deren Vermögen geprüft, die Differenzierung von ES-Zellen zu Endothelzellen zu inhibieren. Die Endothelzellen wurden dabei über die Expression der RNA von zwei endothelzellspezifischen Genen quantifiziert. Im Vergleich dazu wurden die IC50D3 und die IC503T3 der Prüfsubstanz bestimmt, um eine Abschätzung des embryotoxischen Potentials der Prüfsubstanz zu ermöglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine Abschätzung des embryotoxischen Potentials der sieben Prüfsubstanzen in nicht-, schwach- oder stark embryotoxisch vorgenommen werden konnte. Es ist zu schlussfolgern, dass der weiterentwickelte in vitro Embryotoxizitätsassay sensitiv und reproduzierbar ist. Mit der Verwendung von verschiedenen Differenzierungsendpunkten kann die Prädiktionskraft des Assays deutlich verbessert, und die Anzahl von Tierversuchen verringert werden. Durch die Verwendung von molekularbiologischen Markern kann der Assay einem Hochdurchsatzscreening zugängig gemacht werden und damit die Anzahl von Prüfsubstanzen deutlich erhöht werden.…
• Compounds of the pharmaceutical and chemical industry need to be tested for their toxicological potential with regard to humans and environment following international guidelines. Tests for the prediction of the embryotoxic potential executed on living organisms are examples of these guidelines. In order to reduce the number of animal experiments necessary for the assessment of the toxicological profile of compounds the embryonic stem cell test (EST) was developed. Embryonic stem cells (ES-cells) of a cell line are used as the basis of the EST. ES-cells are cells which develop at the early embryonic development into cells of the germ layers. Out of these the many different specialized cell types of the complex organism can differentiate. With the EST this concentration of a test compound will be determined where a 50 % inhibition of the differentiation of ES-cells into cardiomyocytes can be detected. Additionally, the concentration of a test compound which is cytotoxic to 50 % of the ES-cells (IC50D3) and to 50 % of fibroblastsCompounds of the pharmaceutical and chemical industry need to be tested for their toxicological potential with regard to humans and environment following international guidelines. Tests for the prediction of the embryotoxic potential executed on living organisms are examples of these guidelines. In order to reduce the number of animal experiments necessary for the assessment of the toxicological profile of compounds the embryonic stem cell test (EST) was developed. Embryonic stem cells (ES-cells) of a cell line are used as the basis of the EST. ES-cells are cells which develop at the early embryonic development into cells of the germ layers. Out of these the many different specialized cell types of the complex organism can differentiate. With the EST this concentration of a test compound will be determined where a 50 % inhibition of the differentiation of ES-cells into cardiomyocytes can be detected. Additionally, the concentration of a test compound which is cytotoxic to 50 % of the ES-cells (IC50D3) and to 50 % of fibroblasts (IC503T3) will be determined. Therefore, general toxicity caused by the test compound on ES-cells and its differentiation can be distinguished from specific toxicity of the test compound. Determined parameters will be included into a biostatistical model for the subsequent predicition of the embryotoxic potential of test compounds. A protocol was developed whereby the differentiation of ES-cells into endothelial cells is induced. Endothelial cells which make up the walls of blood vessels, such as arteries and veins, were detected and quantified at the RNA and the protein level applying molecular biological methods. Different cell culture methods, growth factors and growth factor concentrations were studied for their ability to induce the differentiation of ES-cells into endothelial cells. Applying the developed differentiation protocol seven compounds were tested for their potential to inhibit the differentiation of ES-cells into endothelial cells. Endothelial cells were quantified by the RNA-expression of two endothelial-specific genes. In comparison to the expression levels the IC50D3 and the IC503T3 were determined in order to assess the embryotoxic potential of the test compound. The results showed that an assessment of the embryotoxic potential of the seven test compounds into non-, weakly- and strongly embroytoxic was possible. It can be concluded that the improved in vitro embryotoxicity assay is sensitive and reproducible. With the use of different differentiation endpoints the power of predicitivity of this assay can be significantly increased and the number of animal experiments can be reduced. With the application of molecular biological markers this assay can be applied as a high througput screening and therefore the number of test compounds can be strongly increased.…