Sergiy Kryvych

• Each organ of a multicellular organism is unique at the level of its tissues and cells. Furthermore, responses to environmental stimuli or developmental signals occur differentially at the single cell or tissue level. This underlines the necessity of precise investigation of the “building block of life” -the individual cell. Although recently large amount of data concerning different aspects of single cell performance was accumulated, our knowledge about development and differentiation of individual cell within specialized tissue are still far from being complete. To get more insight into processes that occur in certain individual cell during its development and differentiation changes in gene expression during life cycle of A. thaliana leaf hair cell (trichome) were explored in this work. After onset of trichome development this cell changes its cell cycle: it starts endoreduplication (a modified cell cycle in which DNA replication continues in the absence of mitosis and cytokinesis). This makes trichomes a suitable model forEach organ of a multicellular organism is unique at the level of its tissues and cells. Furthermore, responses to environmental stimuli or developmental signals occur differentially at the single cell or tissue level. This underlines the necessity of precise investigation of the “building block of life” -the individual cell. Although recently large amount of data concerning different aspects of single cell performance was accumulated, our knowledge about development and differentiation of individual cell within specialized tissue are still far from being complete. To get more insight into processes that occur in certain individual cell during its development and differentiation changes in gene expression during life cycle of A. thaliana leaf hair cell (trichome) were explored in this work. After onset of trichome development this cell changes its cell cycle: it starts endoreduplication (a modified cell cycle in which DNA replication continues in the absence of mitosis and cytokinesis). This makes trichomes a suitable model for studying cell cycle regulation, regulation of cell development and differentiation. Cells of interest were sampled by puncturing them with glass microcapillaries. Each sample contained as few as ten single cells. At first time trichomes in initial stage of trichome development were investigated. To allow their sampling they were specifically labelled by green fluorescent protein (GFP). In total three cell types were explored: pavement cells, trichome initials and mature trichomes. Comparison of gene expression profiles of these cells allowed identification of the genes differentially expressed in subsequent stages of trichome development. Bioinformatic analysis of genes preferentially expressed in trichome initials showed their involvement in hormonal, metal, sulphur response and cell-cycle regulation. Expression pattern of three selected candidate genes, involved in hormonal response and early developmental processes was confirmed by independent method. Effects of mutations in these genes on both trichome and plant development as well as on plant metabolism were analysed. As an outcome of this work novel components in the sophisticated machinery of trichome development and cell cycle progression were identified. These factors could integrate hormone stimuli and network interactions between characterized and as yet unknown members of this machinery. I expect findings presented in this work to enhance and complement our current knowledge about cell cycle progression and trichome development, as well as about performance of the individual cell in general.…
• Jedes Organ eines vielzelligen Organismus weißt einzigartige Merkmale auf seiner Gewebe und Zellebene auf. Darüber hinaus, werden entwicklungsabhängige sowie aus der Umwelt empfangene Signale zelltypspezifisch interpretiert. Aus dieser Spezialisierung einzelner Zellen ergibt sich somit unmittelbar die Notwendigkeit einzelne Zellen, als Bausteine komplexer Organe, individuell zu untersuchen. Obwohl in den letzten Jahrzehnten große Datenmengen über verschiedene Aspekte einzelner Zellen akkumuliert wurden, ist das Gesamtbild der Differenzierung und Entwicklung individueller Zellen in einem vielzelligen Organismus weitgehend unbekannt. Um der Frage nachzugehen, welche Prozesse sich in einer einzelnen Zelle während ihrer Differenzierung und Entwicklung abspielen, wurden Genexpressionsprofile einzelner Blatthaarzellen der Pflanze Arabidopsis thaliana in verschiedene Entwicklungsstadien erstellt. Nach dem Beginn der Entwicklung einer Protodermalzelle in ein Blatthaar (Trichom) kommt es zu einem Umschalten des Zellzyklus; EndoreduplikationJedes Organ eines vielzelligen Organismus weißt einzigartige Merkmale auf seiner Gewebe und Zellebene auf. Darüber hinaus, werden entwicklungsabhängige sowie aus der Umwelt empfangene Signale zelltypspezifisch interpretiert. Aus dieser Spezialisierung einzelner Zellen ergibt sich somit unmittelbar die Notwendigkeit einzelne Zellen, als Bausteine komplexer Organe, individuell zu untersuchen. Obwohl in den letzten Jahrzehnten große Datenmengen über verschiedene Aspekte einzelner Zellen akkumuliert wurden, ist das Gesamtbild der Differenzierung und Entwicklung individueller Zellen in einem vielzelligen Organismus weitgehend unbekannt. Um der Frage nachzugehen, welche Prozesse sich in einer einzelnen Zelle während ihrer Differenzierung und Entwicklung abspielen, wurden Genexpressionsprofile einzelner Blatthaarzellen der Pflanze Arabidopsis thaliana in verschiedene Entwicklungsstadien erstellt. Nach dem Beginn der Entwicklung einer Protodermalzelle in ein Blatthaar (Trichom) kommt es zu einem Umschalten des Zellzyklus; Endoreduplikation setzt ein. Dies bedeutet, dass DNA repliziert wird, aber keine Zellteilung mehr stattfindet. Aus diesem Grunde eignen sich heranwachsende Trichome besonders gut Mechanismen zu erforschen, die in Verbindung mit der Zellzyklusregulation und Zellentwicklung stehen. Die Inhalte ausgewählter Einzelzellen wurden mit Glasmikrokapillaren extrahiert. Jeweils zehn derartige Einzelzellextrakte wurden daraufhin vereint. Als besonders hervorzuheben gilt, dass es uns in dieser Studie zum ersten mal überhaupt gelang die Inhalte einzelner Trichomzellen in ganz frühen Entwicklungsstadien zu extrahieren und anschließend zu analysieren. Um die Extraktion der Inhalte dieser frühen Zellstadien überhaupt zu ermöglichen, war es erforderlich diese mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) zu markieren. Neben den Trichominitialzellen wurden ausgewachsene Trichomzellen sowie Epidermiszellen (Pavementzellen) mittels der Einzelzelltechnik untersucht. Ein Vergleich der erstellten Genexpressionsprofile dieser drei Zelltypen ermöglichte es Gene zu identifizieren, die in den ausgewählten Entwicklungsstadien der Trichombildung differentiell induziert wurden. Mittels bioinformatischer Analysemethoden gelang es, Gruppen von Genen zu identifieren, die exklusiv in Trichominitialzellen exprimiert sind und den Kategorien, Hormonregulation, Metallhomeostase, Schwefelstoffwechesol sowie Zellzyklusregulation zuzuordnen sind. Weiterhin wurde das Expressionsmuster dreier ausgewählter Kandidatengene mit alternativen Techniken verifiziert. Die ausgewählten Kandidatengene gehörten den Katergorien, Hormonrespons sowie frühe Entwicklungsprozesse, an. Darüber hinaus wurden Mutanten in allen drei Gene erzeugt und der Einfluss dieser Mutationen auf die Trichomentwicklung analysiert. Ein weiterer Aspekt der Mutantenanalyse lag in der Erstellung von Metabolitenprofilen ausgewählter Mutanten. Als ein wesentliches Ziel dieser Arbeit gelang es mir bisher unbekannte Komponenten in der Trichomentwicklung und damit der Zellzyklusregulation zu identifizieren. Diese neu identifizierten Komponenten führen zu einer Integration der hormonellen Kontrolle der Zellteilung und Entwicklung mit bisher unbekannten Faktoren. Ich erwarte, dass die von mir erbrachten Ergebnisse zu einem tieferen Verständnis der Prozesse, die an der Trichomentwicklung sowie an der Zellzyklusregulation beteiligt sind, beitragen. Insbesondere, zu einem erweiterten Verständnis des Verhaltens individueller Zellen in einem vielzelligen Organismus.…