Thomas Appl

• The central melanin-concentrating hormone (MCH) system has been intensively studied for its involvement in the regulation of feeding behaviour and body weight regulation. The importance of the neuropeptide MCH in the control of energy balance has been underlined by MCH knock out and Melanin-concentrating hormone receptor subtype 1 (MCHR-1) knock-out animals. The anorectic and anti-obesity effects of selective MCHR-1 antagonists have confirmed the notion that pharmacological blockade of MCHR-1 is a potential therapeutic approach for obesity. First aim of this work is to study the neurochemical “equipment” of MCHR-1 immunoreactive neurons by double-labelling immunohistochemistry within the rat hypothalamus. Of special interest is the neuroanatomical identification of other hypothalamic neuropeptides that are co-distributed with MCHR-1. A second part of this study deals with the examination of neuronal activation patterns after pharmacological or physiological, feeding-related stimuli and was introduced to further understand centralThe central melanin-concentrating hormone (MCH) system has been intensively studied for its involvement in the regulation of feeding behaviour and body weight regulation. The importance of the neuropeptide MCH in the control of energy balance has been underlined by MCH knock out and Melanin-concentrating hormone receptor subtype 1 (MCHR-1) knock-out animals. The anorectic and anti-obesity effects of selective MCHR-1 antagonists have confirmed the notion that pharmacological blockade of MCHR-1 is a potential therapeutic approach for obesity. First aim of this work is to study the neurochemical “equipment” of MCHR-1 immunoreactive neurons by double-labelling immunohistochemistry within the rat hypothalamus. Of special interest is the neuroanatomical identification of other hypothalamic neuropeptides that are co-distributed with MCHR-1. A second part of this study deals with the examination of neuronal activation patterns after pharmacological or physiological, feeding-related stimuli and was introduced to further understand central regulatory mechanisms of the MCH system. In the first part of work, I wanted to neurochemically characterize MCHR-1 immunoreactive neurons in the rat hypothalamus for colocalisation with neuropeptides of interest. Therefore I performed an immunohistochemical colocalisation study using a specific antibody against MCHR-1 in combination with antibodies against hypothalamic neuropeptides. I showed that MCHR-1 immunoreactivity (IR) was co-localised with orexin A in the lateral hypothalamus, and with adrenocorticotropic hormone and neuropeptide Y in the arcuate nucleus. Additionally, MCHR-1 IR was co-localised with the neuropeptides vasopressin and oxytocin in magnocellular neurons of the supraoptic and paraventricular hypothalamic nucleus and corticotrophin releasing hormone in the parvocellular division of the paraventricular hypothalamic nucleus. Moreover, for the first time MCHR-1 immunoreactivity was found in both the adenohypophyseal and neurohypophyseal part of the rat pituitary. These results provide the neurochemical basis for previously described potential physiological actions of MCH at its target receptor. In particular, the MCHR-1 may be involved not only in food intake regulation, but also in other physiological actions such as fluid regulation, reproduction and stress response, possibly through here examined neuropeptides. Central activation patterns induced by pharmacological or physiological stimulation can be mapped using c-Fos immunohistochemistry. In the first experimental design, central administration (icv) of MCH in the rat brain resulted in acute and significant increase of food and water intake, but this animal treatment did not induce a specific c-Fos induction pattern in hypothalamic nuclei. In contrast, sub-chronic application of MCHR-1 antagonist promoted a significant decrease in food- and water intake during an eight day treatment period. A qualitative analysis of c-Fos immunohistochemistry of sections derived from MCHR-1 antagonist treated animals showed a specific neuronal activation in the paraventricular nucleus, the supraoptic nucleus and the dorsomedial hypothalamus. These results could be substantiated by quantitative evaluation of an automated, software-supported analysis of the c-Fos signal. Additionally, I examined the activation pattern of rats in a restricted feeding schedule (RFS) to identify pathways involved in hunger and satiety. Animals were trained for 9 days to feed during a three hour period. On the last day, food restricted animals was also allowed to feed for the three hours, while food deprived (FD) animals did not receive food. Mapping of neuronal activation showed a clear difference between stareved (FD) and satiated (FR) rats. FD animals showed significant induction of c-Fos in forebrain regions, several hypothalamic nuclei, amygdaloid thalamus and FR animals in the supraoptic nucleus and the paraventricular nucleus of the hypothalamus, and the nucleus of the solitary tract. In the lateral hypothalamus of FD rats, c-Fos IR showed strong colocalisation for Orexin A, but no co-staining for MCH immunoreactivity. However, a large number of c-Fos IR neurons within activated regions of FD and FR animals was co-localised with MCHR-1 within selected regions. To conclude, the experimental set-up of scheduled feeding can be used to induce a specific hunger or satiety activation pattern within the rat brain. My results show a differential activation by hunger signals of MCH neurons and furthermore, demonstrates that MCHR-1 expressing neurons may be essential parts of downstream processing of physiological feeding/hunger stimuli. In the final part of my work, the relevance of here presented studies is discussed with respect to possible introduction of MCHR-1 antagonists as drug candidates for the treatment of obesity.…
• Die Regulation des Körpergewichts in einem physiologischen Rahmen setzt ein internes Energiegleichgewicht voraus und wird langfristig durch Abgleich von Nahrungsaufnahme einerseits und Energieverbrauch andererseits gewährleistet. Dieses Gleichgewicht ist bei massivem Übergewicht (Adipositas) oder chronischem Untergewicht (Kachexie) dauerhaft gestört. Bei der Regulation des Energiegleichgewichts spielt der im Zwischenhirn gelegene Hypothalamus als Schaltstation eine wichtige Rolle. Hypothalamische Regelkreise gleichen sensorische, viszerale und humorale Signale miteinander ab und setzen sie in adäquates Verhalten (z.B. Nahrungsaufnahme) um. Innerhalb des Hypothalamus werden Hunger und Sättigung durch zentralnervöse Regulationssysteme kodiert. Dadurch stellt eine pharmakologische Inhibierung eines hunger-stimulierenden (orexigenen), hypothalamischen Regelkreises eine Möglichkeit dar, um Nahrungsaufnahme und Körpergewichts zu reduzieren. Das im lateralen Hypothalamus gebildete Neuropeptid Melanin-konzentrierendes Hormon (MCH) ist einDie Regulation des Körpergewichts in einem physiologischen Rahmen setzt ein internes Energiegleichgewicht voraus und wird langfristig durch Abgleich von Nahrungsaufnahme einerseits und Energieverbrauch andererseits gewährleistet. Dieses Gleichgewicht ist bei massivem Übergewicht (Adipositas) oder chronischem Untergewicht (Kachexie) dauerhaft gestört. Bei der Regulation des Energiegleichgewichts spielt der im Zwischenhirn gelegene Hypothalamus als Schaltstation eine wichtige Rolle. Hypothalamische Regelkreise gleichen sensorische, viszerale und humorale Signale miteinander ab und setzen sie in adäquates Verhalten (z.B. Nahrungsaufnahme) um. Innerhalb des Hypothalamus werden Hunger und Sättigung durch zentralnervöse Regulationssysteme kodiert. Dadurch stellt eine pharmakologische Inhibierung eines hunger-stimulierenden (orexigenen), hypothalamischen Regelkreises eine Möglichkeit dar, um Nahrungsaufnahme und Körpergewichts zu reduzieren. Das im lateralen Hypothalamus gebildete Neuropeptid Melanin-konzentrierendes Hormon (MCH) ist ein solches orexigenes Signal. In unterschiedlichen Tiermodellen wurde gezeigt, dass MCH seine physiologischen Effekte auf das Energiegleichgewicht durch den funktionellen MCH Rezeptor Subtyp 1 (MCHR-1) vermittelt. Die Behandlung von Labornagern mit selektiv wirksamen MCHR-1 Antagonisten hat in verschiedenen Tiermodellen zu einer Verminderung der Nahrungsaufnahme und Körpergewichtsreduktion geführt (anorexigene Wirkung). Das Ziel dieser Arbeit ist eine vertiefte Untersuchung des zentralen MCH Systems. Im ersten Teil der Arbeit werden MCHR-1 enthaltene Nervenzellen (Neurone) im Hypothalamus von Ratten immunhistochemisch identifiziert und neurochemisch charakterisiert. Dieser Teil der Arbeit soll mit Hilfe von Kolokalisationsstudien mögliche Interaktionen des MCH Systems mit anderen neuropeptidergen, hypothalamischen Systemen identifizieren. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Untersuchung von pharmakologischen Effekten bei MCH und MCHR-1 Antagonist behandelten Ratten auf Nahrungsaufnahme, Wasseraufnahme sowie Veränderung des Körpergewichts. Zentrale Regulationsmechanismen wurden durch den immunhistochemischen Nachweis des Transkriptionsfaktors und neuronalen Aktivierungsmarkers c-Fos im Rattenhirn ermittelt. Diese neuronalen Aktivierungsmuster wurden mit solchen Mustern verglichen, die nach einem definierten physiologischen Stimulus (Fütterungsregime) mit derselben Methode aufgezeichnet wurden. Erste Ergebnisse zeigten, dass der hier etablierte Antikörper gegen MCHR-1 spezifisch ist und MCHR-1 in mehreren hypothalamischen Kernarealen mit Hilfe dieses Antikörpers nachgewiesen werden konnte. So konnte im lateralen Hypothalamus eine Kolokalisation von MCHR-1 mit Orexin A nachgewiesen werden, im arcuate Nukleus des Hypothalamus, einem Kernareal, das eine bedeutende Funktion in der Integration von Hunger- und Sättigungssignalen hat, zeigten MCHR-1 positive Neurone eine Kolokalisation mit dem orexigenen Neuropeptid Y oder mit dem Adrenocorticotrophin Hormon, einem Marker für das anorexigen wirkende, zentrale Melanokortin System. Der Paraventrikuläre Nukleus und der Supraoptische Nukleus des Hypothalamus spielen eine wichtige Rolle in neuroendokrinen Regulationen. Im paraventrikulären Hypothalamus konnte eine Kolokalisation von MCHR-1 mit den Neuropeptiden Vasopressin, Oxytocin und Corticotrophin-releasing Hormon festgestellt werden, außerdem konnte eine Kolokalisierung von MCHR-1 mit Vasopressin und Oxytocin im Supraoptischen Nukleus gezeigt werden. Zusätzlich konnte MCHR-1 immunhistochemisch auf Zellen der Adeno- und der Neurohypophyse nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse lassen auf eine Interaktion von MCHR-1 im Hypothalamus nicht nur mit orexigenen (Orexin A und Neuropeptid Y) und anorexigenen (Adrenocorticotrophin Hormon) Signalen schließen, sondern weisen zusätzlich auf eine Rolle von MCHR-1 bei der Regulation des Wasserhaushalts (Vasopressin), der Fortpflanzung (Oxytocin) und bei Stress (Corticotrophin-releasing Hormon) hin. Im zweiten Versuchsvorhaben führte die zentraler Gabe (intrazerebroventrikular) von MCH ins Rattengehirn zu einer akuten und signifikanten Steigerung der Futter- und Wasseraufnahme, es konnte jedoch kein spezifisches Aktivierungsmuster in hypothalamischen Kernarealen (Nuklei) definiert werden. Im Gegensatz dazu führte eine sub-chronische Gabe eines oral verfügbaren MCHR-1 Antagonisten in Ratten zu einer signifikanten Verminderung der Nahrungs-, Wasseraufnahme und des Körpergewichts. Bei qualitativer Analyse des immunhistochemischen Signals für c-Fos bei MCHR-1 Antagonist behandelten Ratten konnte eine spezifische Aktivierung im Paraventrikulären Hypothalamus, im Supraoptischen Nukleus und im Dorsomedialen Hypothalamus gezeigt werden. Diese Ergebnisse ließen sich durch automatisierte, software-unterstützte Quantifizierung des c-Fos Signals bestätigen und heben diese Hirnareale als mögliche neuroanatomische Substrate von MCHR-1 Antagonisten hervor. Um eine mögliche neuronale Aktivierung des MCH Systems nach einem physiologischen Stimulus, hier Hunger oder Sättigung, zu untersuchen, wurden in einem weiteren Versuchsansatz Ratten in einem angepassten, neun Tage dauernden Fütterungsregime, täglich für nur drei Stunden Zugang zu Futter gewährt. Tiere, die am letzten Tag des Fütterungsregimes im 3 Stunden Zeitraum kein Futter bekamen und so als „Hunger-Stimulierte“ definiert wurden, zeigten eine signifikante Induktion von c-Fos in unterschiedlichen hypothalamischen (arcuate Nukleus, Dorsomedial Hypothalamischen Nuklei, Lateral Hypothalamus) und extrahypothalamischen Hirnarealen (Nukleus Accumbens, Basolaterale Amygdala, Paraventriculärer Thalamischer Nukleus). Dieses Aktivierungsmuster unterschied sich von Ratten, die am letzten Tag des Fütterungsregims Futter erhalten hatten, den „gesättigte Tieren“ (Aktivierung vor allem im supraoptischen Nukleus, im paraventrikulären Hypothalamus und Nukleus Tractus Solitarius), oder ad libitum gefütterten Kontrolltieren. Um durch das Fütterungsregime aktivierte Neurone dem MCH System zuzuordnen, wurden immunhistochemische Kolokalisationsexperimente von c-Fos mit MCH beziehungsweise MCHR-1 spezifischen Antikörpern durchgeführt. Zwar konnte keine Kolokalisation von c-Fos mit MCH im lateralen Hypothalamus nachgewiesen werden, aber eine Vielzahl von durch Hunger oder Sättigung aktivierte, c-Fos positive Neurone zeigte MCHR-1 Immunoreaktivität. Zusammenfassend lässt sich daraus schließen, dass Nahrungskarenz differenziert unterschiedliche intra-hypothalamische und extra-hypothalamische Zielstrukturen aktiviert. Die funktionelle Rolle des MCHR-1 in solch aktivierten Neuronen bedarf weiterer Klärung. Im abschließenden Teil der Arbeit wird eine mögliche Relevanz der hier beschriebenen Ergebnisse im Hinblick auf die Entwicklung von MCHR-1 Antagonisten und deren möglicher Einsatz bei Adipositas, diskutiert.…