Kristine Wolf

• Sekundäre Pflanzenstoffe und ihre gesundheitsfördernden Eigenschaften sind in den letzten zwei Jahrzehnten vielfach ernährungsphysiologisch untersucht und spezifische positive Effekte im humanen Organismus zum Teil sehr genau beschrieben worden. Zu den Carotinoiden zählend ist der sekundäre Pflanzenstoff Lutein insbesondere in der Prävention von ophthalmologischen Erkrankungen in den Mittelpunkt der Forschung gerückt. Das ausschließlich von Pflanzen und einigen Algen synthetisierte Xanthophyll wird über die pflanzliche Nahrung insbesondere grünes Blattgemüse in den humanen Organismus aufgenommen. Dort akkumuliert es bevorzugt im Makulapigment der Retina des menschlichen Auges und ist bedeutend im Prozess der Aufrechterhaltung der Funktionsfähigkeit der Photorezeptorzellen. Im Laufe des Alterns kann die Abnahme der Dichte des Makulapigments und der Abbau von Lutein beobachtet werden. Die dadurch eintretende Destabilisierung der Photorezeptorzellen im Zusammenhang mit einer veränderten Stoffwechsellage im alternden Organismus kann zurSekundäre Pflanzenstoffe und ihre gesundheitsfördernden Eigenschaften sind in den letzten zwei Jahrzehnten vielfach ernährungsphysiologisch untersucht und spezifische positive Effekte im humanen Organismus zum Teil sehr genau beschrieben worden. Zu den Carotinoiden zählend ist der sekundäre Pflanzenstoff Lutein insbesondere in der Prävention von ophthalmologischen Erkrankungen in den Mittelpunkt der Forschung gerückt. Das ausschließlich von Pflanzen und einigen Algen synthetisierte Xanthophyll wird über die pflanzliche Nahrung insbesondere grünes Blattgemüse in den humanen Organismus aufgenommen. Dort akkumuliert es bevorzugt im Makulapigment der Retina des menschlichen Auges und ist bedeutend im Prozess der Aufrechterhaltung der Funktionsfähigkeit der Photorezeptorzellen. Im Laufe des Alterns kann die Abnahme der Dichte des Makulapigments und der Abbau von Lutein beobachtet werden. Die dadurch eintretende Destabilisierung der Photorezeptorzellen im Zusammenhang mit einer veränderten Stoffwechsellage im alternden Organismus kann zur Ausprägung der altersbedingten Makuladegeneration (AMD) führen. Die pathologische Symptomatik der Augenerkrankung reicht vom Verlust der Sehschärfe bis hin zum irreversiblen Erblinden. Da therapeutische Mittel ausschließlich ein Fortschreiten verhindern, bestehen hier Forschungsansätze präventive Maßnahmen zu finden. Die Supplementierung von luteinhaltigen Präparaten bietet dabei einen Ansatzpunkt. Auf dem Markt finden sich bereits Nahrungsergänzungsmittel (NEM) mit Lutein in verschiedenen Applikationen. Limitierend ist dabei die Stabilität und Bioverfügbarkeit von Lutein, welches teilweise kostenintensiv und mit unbekannter Reinheit zu erwerben ist. Aus diesem Grund wäre die Verwendung von Luteinestern als die pflanzliche Speicherform des Luteins im Rahmen eines NEMs vorteilhaft. Neben ihrer natürlichen, höheren Stabilität sind Luteinester nachhaltig und kostengünstig einsetzbar. In dieser Arbeit wurden physikochemische und ernährungsphysiologisch relevante Aspekte in dem Produktentwicklungsprozess eines NEMs mit Luteinestern in einer kolloidalen Formulierung untersucht. Die bisher einzigartige Anwendung von Luteinestern in einem Mundspray sollte die Aufnahme des Wirkstoffes insbesondere für ältere Menschen erleichtern und verbessern. Unter Beachtung der Ergebnisse und der ernährungsphysiologischen Bewertung sollten u.a. Empfehlungen für die Rezepturzusammensetzungen einer Miniemulsion (Emulsion mit Partikelgrößen <1,0 µm) gegeben werden. Eine Einschätzung der Bioverfügbarkeit der Luteinester aus den entwickelten, kolloidalen Formulierungen konnte anhand von Studien zur Resorption- und Absorptionsverfügbarkeit in vitro ermöglicht werden. In physikalischen Untersuchungen wurden zunächst Basisbestandteile für die Formulierungen präzisiert. In ersten wirkstofffreien Musteremulsionen konnten ausgewählte Öle als Trägerphase sowie Emulgatoren und Löslichkeitsvermittler (Peptisatoren) hinsichtlich ihrer Eignung zur Bereitstellung einer Miniemulsion physikalisch geprüft werden. Die beste Stabilität und optimale Eigenschaften einer Miniemulsion zeigten sich bei der Verwendung von MCT-Öl (engl. medium chain triglyceride) bzw. Rapsöl in der Trägerphase sowie des Emulgators Tween® 80 (Tween 80) allein oder in Kombination mit dem Molkenproteinhydrolysat Biozate® 1 (Biozate 1). Aus den physikalischen Untersuchungen der Musteremulsionen gingen die Präemulsionen als Prototypen hervor. Diese enthielten den Wirkstoff Lutein in verschiedenen Formen. So wurden Präemulsionen mit Lutein, mit Luteinestern sowie mit Lutein und Luteinestern konzipiert, welche den Emulgator Tween 80 oder die Kombination mit Biozate 1 enthielten. Bei der Herstellung der Präemulsionen führte die Anwendung der Emulgiertechniken Ultraschall mit anschließender Hochdruckhomogenisation zu den gewünschten Miniemulsionen. Beide eingesetzten Emulgatoren boten optimale Stabilisierungseffekte. Anschließend erfolgte die physikochemische Charakterisierung der Wirkstoffe. Insbesondere Luteinester aus Oleoresin erwiesen sich hier als stabil gegenüber verschiedenen Lagerungsbedingungen. Ebenso konnte bei einer kurzzeitigen Behandlung der Wirkstoffe unter spezifischen mechanischen, thermischen, sauren und basischen Bedingungen eine Stabilität von Lutein und Luteinestern gezeigt werden. Die Zugabe von Biozate 1 bot dabei nur für Lutein einen zusätzlichen Schutz. Bei längerer physikochemischer Behandlung unterlagen die in den Miniemulsionen eingebrachten Wirkstoffe moderaten Abbauvorgängen. Markant war deren Sensitivität gegenüber dem basischen Milieu. Im Rahmen der Rezepturentwicklung des NEMs war hier die Empfehlung, eine Miniemulsion mit einem leicht saurem pH-Milieu zum Schutz des Wirkstoffes durch kontrollierte Zugabe weiterer Inhaltstoffe zu gestalten. Im weiteren Entwicklungsprozess des NEMs wurden Fertigrezepturen mit dem Wirkstoff Luteinester aufgestellt. Die alleinige Anwendung des Emulgators Biozate 1 zeigte sich dabei als ungeeignet. Die weiterhin zur Verfügung stehenden Fertigrezepturen enthielten in der Öl-phase neben dem Wirkstoff das MCT-ÖL oder Rapsöl sowie a-Tocopherol zur Stabilisierung. Die Wasserphase bestand aus dem Emulgator Tween 80 oder einer Kombination aus Tween 80 und Biozate 1. Zusatzstoffe waren zudem als mikrobiologischer Schutz Ascorbinsäure und Kaliumsorbat sowie für sensorische Effekte Xylitol und Orangenaroma. Die Anordnung der Basisrezeptur und das angewendete Emulgierverfahren lieferten stabile Miniemulsionen. Weiterhin zeigten langfristige Lagerungsversuche mit den Fertigrezepturen bei 4°C, dass eine Aufrechterhaltung der geforderten Luteinestermenge im Produkt gewährleistet war. Analoge Untersuchungen an einem luteinhaltigen, marktgängigen Präparat bestätigten dagegen eine bereits bei kurzfristiger Lagerung auftretende Instabilität von Lutein. Abschließend wurde durch Resorptions- und Absorptionsstudien in vitro mit den Präemulsionen und Fertigrezepturen die Bioverfügbarkeit von Luteinestern geprüft. Nach Behandlung in einem etablierten in vitro Verdaumodell konnte eine geringfügige Resorptionsverfügbarkeit der Luteinester definiert werden. Limitiert war eine Micellarisierung des Wirkstoffes aus den konzipierten Formulierungen zu beobachten. Eine enzymatische Spaltung der Luteinester zu freiem Lutein wurde nur begrenzt festgestellt. Spezifität und Aktivität von entsprechenden hydrolytischen Lipasen sind als äußerst gering gegenüber Luteinestern zu bewerten. In sich anschließenden Zellkulturversuchen mit der Zelllinie Caco-2 wurden keine zytotoxischen Effekte durch die relevanten Inhaltsstoffe in den Präemulsionen gezeigt. Dagegen konnten eine Sensibilität gegenüber den Fertigrezepturen beobachtet werden. Diese sollte im Zusammenhang mit Irritationen der Schleimhäute des Magen-Darm-Traktes bedacht werden. Eine weniger komplexe Rezeptur könnte die beobachteten Einschränkungen möglicherweise minimieren. Abschließende Absorptionsstudien zeigten, dass grundsätzlich eine geringfügige Aufnahme von vorrangig Lutein, aber auch Luteinmonoestern in den Enterocyten aus Miniemulsionen erfolgen kann. Dabei hatte weder Tween 80 noch Biozate 1 einen förderlichen Einfluss auf die Absorptionsrate von Lutein oder Luteinestern. Die Metabolisierung der Wirkstoffe durch vorherigen in vitro-Verdau steigerte die zelluläre Aufnahme von Wirkstoffen aus Formulierungen mit Lutein und Luteinestern gleichermaßen. Die beobachtete Aufnahme von Lutein und Luteinmonoestern in den Enterocyten scheint über passive Diffusion zu erfolgen, wobei auch der aktive Transport nicht ausgeschlossen werden kann. Dagegen können Luteindiester aufgrund ihrer Molekülgröße nicht über den Weg der Micellarisierung und einfachen Diffusion in die Enterocyten gelangen. Ihre Aufnahme in die Dünndarmepithelzellen bedarf einer vorherigen hydrolytischen Spaltung durch spezifische Lipasen. Dieser Schritt limitiert wiederum die effektive Aufnahme der Luteinester in die Zellen bzw. stellt eine Einschränkung in ihrer Bioverfügbarkeit im Vergleich zu freiem Lutein dar. Zusammenfassend konnte für die physikochemisch stabilen Luteinester eine geringe Bioverfügbarkeit aus kolloidalen Formulierungen gezeigt werden. Dennoch ist die Verwendung als Wirkstoffquelle für den sekundären Pflanzenstoff Lutein in einem NEM zu empfehlen. Im Zusammenhang mit der Aufnahme von luteinreichen, pflanzlichen Lebensmitteln kann trotz der zu erwartenden geringen Bioverfügbarkeit der Luteinester aus dem NEM ein Beitrag zur Verbesserung des Luteinstatus erreicht werden. Entsprechende Publikationen zeigten eindeutige Korrelationen zwischen der Aufnahme von luteinesterhaltigen Präparaten und einem Anstieg der Luteinkonzentration im Serum bzw. der Makulapigmentdichte in vivo. Die geringfügig bessere Bioverfügbarkeit von freiem Lutein steht im kritischen Zusammenhang mit seiner Instabilität und Kostenintensität. Bilanzierend wurde im Rahmen dieser Arbeit das marktgängige Produkt Vita Culus® konzipiert. Im Ausblick sollten humane Interventionsstudien mit dem NEM die abschließende Bewertung der Bioverfügbarkeit von Luteinestern aus dem Präparat möglich machen.…
• Secondary plant metabolites and their health-promoting properties have been studied and pub-lished over the past two decades. Their specificity with regard to positive properties and effects in the human organism has been described precisely. Among the carotenoids, the secondary plant metabolite lutein has become the focus of research, particularly in the prevention of ophthalmic diseases. The xanthophyll, which is synthesized exclusively by plants (incl. some algae), is absorbed into the human organism through plant food especially green leafy vegetables. There it accumulates preferentially in the macular pigment of the retina of the human eye and is important in the process of maintaining the functionality of the photoreceptors. As the aging progresses, the decrease in the density of the macular pigment and the depletion of lutein can be observed. The resulting destabilization of the photoreceptors in connection with a changed metabolism in the aging organism can lead to the development of age-related macular degeneration (AMD). TheSecondary plant metabolites and their health-promoting properties have been studied and pub-lished over the past two decades. Their specificity with regard to positive properties and effects in the human organism has been described precisely. Among the carotenoids, the secondary plant metabolite lutein has become the focus of research, particularly in the prevention of ophthalmic diseases. The xanthophyll, which is synthesized exclusively by plants (incl. some algae), is absorbed into the human organism through plant food especially green leafy vegetables. There it accumulates preferentially in the macular pigment of the retina of the human eye and is important in the process of maintaining the functionality of the photoreceptors. As the aging progresses, the decrease in the density of the macular pigment and the depletion of lutein can be observed. The resulting destabilization of the photoreceptors in connection with a changed metabolism in the aging organism can lead to the development of age-related macular degeneration (AMD). The pathological symptoms of AMD range from loss of visual acuity to irreversible blindness. Since therapeutic agents only enable the disease to be decelerated or come to a standstill, research approaches exist to find preventive measures. The supplementation of preparations containing lutein offers a starting point to have a targeted positive effect on the stability of the macular pigment density and thus to maintain the quality of vision even in old age. Dietary supplements (DS) with lutein in various applications are available on the market. Limiting is the stability and bioavailability of lutein, which can be expensive and acquired with unknown purity. For this reason, the use of the storage form of lutein in plants, the lutein esters within the framework of a DS would be advantageous. In addition to their natural, higher stability, lutein esters can be used sustainably and inexpensively. In this thesis, physicochemical and nutritionally relevant aspects in the product development process of a DS with lutein esters in a colloidal formulation were investigated. The hitherto unique use of lutein esters in oral spray applications should facilitate and improve the absorption of the active ingredient especially for older people. Taking into account the results and the nutritional assessment, recommendations for the recipe compositions of a miniemulsions (emulsion with particle sizes <1.0 µm) are given. An assessment of the bioavailability of the lutein esters from the developed colloidal formulations was realized by means of studies on the absorption accessibility and availability in vitro. In physical investigations, the basic components for the colloidal formulations to be developed were first specified. In the first active ingredient-free sample emulsions selected oils as carrier phase as well as emulsifiers and solubilizers (peptizers) could be physically tested with regard to their suitability for providing a miniemulsion. The best stability and optimal properties of a miniemulsion were found when using MCT oil (medium chain triglyceride) or rapeseed oil in the carrier phase and the emulsifier Tween® 80 (Tween 80) alone or in combination with the whey protein hydrolyzate Biozate® 1 (Biozate 1) in the aqueous phase. The pre-emulsions were developed as prototypes from the physical examinations of the basic recipes. These contained the active ingredient lutein in various forms. Pre-emulsions with lutein, with lutein esters or with lutein and lutein esters were prepared. They contained the emulsifier Tween 80 or the combination with Biozate 1. In the preparation of the pre-emulsions the use of ultrasound emulsification techniques with subsequent high-pressure homogenization led to the postulated miniemulsions. Both emulsifiers used offered optimal stabilization effects. This was followed by the physicochemical characterization of the active substances in the pre-emulsions. In particular, lutein esters from oleoresin were found to be stable against various storage conditions. A short-term treatment of the active ingredients under specific mechanical, thermal, acidic and basic conditions also demonstrated the stability of lutein and lutein esters. The addition of Biozate 1 offered further protection for lutein. In the case of prolonged physico-chemical treatment, the active substances incorporated in the miniemulsions were subject to moderate degradation processes. The sensitivity of the active ingredients in the formulations to a basic environment was striking. As part of the formulation development of the DS, the recommendation was given to design a miniemulsion with a slightly acidic environment by the controlled addition of further ingredients to protect the active ingredient. In the further development process of the DS, refined formulations with the active ingredient lutein ester and modifications of the emulsifiers were then set up. The sole use of the emulsifier Biozate 1 turned out to be unsuitable and these formulations were rejected. The refined formulations that were still available contained the carriers MCT oil or rapeseed oil as well as a-tocopherol for stabilization. The water phase consisted of the emulsifier Tween 80 or a combination of Tween 80 and Biozate 1. Additives were ascorbic acid and potassium sorbate for microbial protection such as xylitol and orange aroma for sensory effects. The arrangement of the basic recipe and the emulsifying process used provided stable miniemulsions. Long-term storage tests with the ready formulations at 4°C showed that the required amount of lutein ester is maintained in the product. Analogous tests on a preparation containing lutein confirmed the instability of lutein, which occurs even in the case of short-term storage. Finally, the bioavailability of the lutein esters was investigated using the pre-emulsions and refined formulations in studies of absorption accessibility and availability in vitro. For these studies an in vitro digestion model was confirmed. After treatment of the formulations in this model a slight absorption accessibility of the lutein esters could be classified. Micellarization process and enzymatic cleavage of the lutein esters to free lutein has only been found to a limited extent. The specificity and activity of corresponding hydrolytic lipases to lutein esters can be rated as extremely low. In subsequent cell culture experiments with the Caco-2 cell line, no cytotoxic effects were shown by the relevant ingredients in the pre-emulsions. In contrast, sensitivity to the refined formulations could be observed. This should be considered in connection with irritation of the mucous membranes of the gastrointestinal tract. A less complex formulation could possibly prevent the observed restrictions. In studies of absorption availability in vitro a low uptake of primarily free lutein, but also lutein monoesters in the enterocytes from miniemulsions could be observed. Neither Tween 80 nor Biozate 1 have a beneficial influence on the absorption rate of lutein or lutein esters. But micellarization of the active ingredients through previous in vitro digestion increased the cellular uptake of lutein and lutein esters from the formulations. This gives an evidence of the relevance of micellarization in absorption of lipophilic substances. The uptake of lutein and lutein monoesters in the enterocytes seems to be possible via passive diffusion, although active transport cannot be ruled out either. On the other hand, due to their molecular size, lutein diesters cannot enter into the enterocytes via micellarization or simple diffusion. Their absorption in the small intestine epithelial cells requires prior hydrolytic cleavage by specific lipases. This step in turn limits the effective absorption of the lutein esters into the cells or represents a restriction in their bioavailability in comparison to free lutein. In summary, a low bioavailability for the physicochemically stable lutein esters from colloidal formulations was shown. Nevertheless, the use as a source of active ingredients for the xanthophyll lutein in a DS is recommended. In connection with the intake of plant foods rich in lutein, a contribution to improving the lutein status can be achieved despite the expected low bioavailability of the lutein esters from the DS. Corresponding publications showed clear correlations between the intake of preparations containing lutein ester and an increase in serum lutein concentrations or the macular pigment density in vivo. The slightly better bioavailability of free lutein is critically linked to its instability and cost intensity. On the basis of this work, the product Vita Culus® was designed and is available on the market. As a prospect of future research, human intervention studies with the DS should be conducted to assess the total bio-availability of lutein esters from miniemulsions in detail.…