Cytochrome c-DNA and cytochrome c-enzyme interactions for the construction of analytical signal chains

  • Electron transfer (ET) reactions play a crucial role in the metabolic pathways of all organisms. In biotechnological approaches, the redox properties of the protein cytochrome c (cyt c), which acts as an electron shuttle in the respiratory chain, was utilized to engineer ET chains on electrode surfaces. With the help of the biopolymer DNA, the redox protein assembles into electro active multilayer (ML) systems, providing a biocompatible matrix for the entrapment of proteins. In this study the characteristics of the cyt c and DNA interaction were defined on the molecular level for the first time and the binding sites of DNA on cyt c were identified. Persistent cyt c/DNA complexes were formed in solution under the assembly conditions of ML architectures, i.e. pH 5.0 and low ionic strength. At pH 7.0, no agglomerates were formed, permitting the characterization of the NMR spectroscopy. Using transverse relaxation-optimized spectroscopy (TROSY)-heteronuclear single quantum coherence (HSQC) experiments, DNAs’ binding sites on the proteinElectron transfer (ET) reactions play a crucial role in the metabolic pathways of all organisms. In biotechnological approaches, the redox properties of the protein cytochrome c (cyt c), which acts as an electron shuttle in the respiratory chain, was utilized to engineer ET chains on electrode surfaces. With the help of the biopolymer DNA, the redox protein assembles into electro active multilayer (ML) systems, providing a biocompatible matrix for the entrapment of proteins. In this study the characteristics of the cyt c and DNA interaction were defined on the molecular level for the first time and the binding sites of DNA on cyt c were identified. Persistent cyt c/DNA complexes were formed in solution under the assembly conditions of ML architectures, i.e. pH 5.0 and low ionic strength. At pH 7.0, no agglomerates were formed, permitting the characterization of the NMR spectroscopy. Using transverse relaxation-optimized spectroscopy (TROSY)-heteronuclear single quantum coherence (HSQC) experiments, DNAs’ binding sites on the protein were identified. In particular, negatively charged AA residues, which are known interaction sites in cyt c/protein binding were identified as the main contact points of cyt c and DNA. Moreover, the sophisticated task of arranging proteins on electrode surfaces to create functional ET chains was addressed. Therefore, two different enzyme types, the flavin dependent fructose dehydrogenase (FDH) and the pyrroloquinoline quinone dependent glucose dehydrogenase (PQQ-GDH), were tested as reaction partners of freely diffusing cyt c and cyt c immobilized on electrodes in mono- and MLs. The characterisation of the ET processes was performed by means of electrochemistry and the protein deposition was monitored by microgravimetric measurements. FDH and PQQ-GDH were found to be generally suitable for combination with the cyt c/DNA ML system, since both enzymes interact with cyt c in solution and in the immobilized state. The immobilization of FDH and cyt c was achieved with the enzyme on top of a cyt c monolayer electrode without the help of a polyelectrolyte. Combining FDH with the cyt c/DNA ML system did not succeed, yet. However, the basic conditions for this protein-protein interaction were defined. PQQ-GDH was successfully coupled with the ML system, demonstrating that that the cyt c/DNA ML system provides a suitable interface for enzymes and that the creation of signal chains, based on the idea of co-immobilized proteins is feasible. Future work may be directed to the investigation of cyt c/DNA interaction under the precise conditions of ML assembly. Therefore, solid state NMR or X-ray crystallography may be required. Based on the results of this study, the combination of FDH with the ML system should be addressed. Moreover, alternative types of enzymes may be tested as catalytic component of the ML assembly, aiming on the development of innovative biosensor applications.show moreshow less
  • In den Energiegewinnungsprozessen der Zellen spielen biochemische Reaktion, die auf Elektronentransfer (ET) basieren, eine wichtige Rolle. So sind die Proteinkomplexe der Atmungskette, welche an der inneren Membran der Mitochondrien abläuft, über eine ET-Kette miteinander verbunden. In biotechnologischen Anwendungen wird dieses Phänomen genutzt um Proteine auf der Oberfläche von Elektroden als funktionierende ET-Ketten zu arrangieren. Dabei kann der ET innerhalb dieser Kaskaden als elektrischer Strom gemessen und als Signal betrachtet werden. Dies ermöglicht die Anwendung von proteinmodifizierten Elektroden als Biosensoren und Biobrennstoffzellen. Ein geeigneter Baustein für den Aufbau vielschichtiger ET-Systeme ist das kleine, eisenhaltige Protein Cytochrom c (Cyt c), welches in der Lage ist Elektronen aufzunehmen, zu transportieren und wieder abzugeben. Als zweiter Baustein dient das lange, fadenartige Biomolekül DNA. DNA und Cyt c interagieren unter bestimmten Bedingungen aufgrund ihrer entgegengesetzten Oberflächenladungen. DiesIn den Energiegewinnungsprozessen der Zellen spielen biochemische Reaktion, die auf Elektronentransfer (ET) basieren, eine wichtige Rolle. So sind die Proteinkomplexe der Atmungskette, welche an der inneren Membran der Mitochondrien abläuft, über eine ET-Kette miteinander verbunden. In biotechnologischen Anwendungen wird dieses Phänomen genutzt um Proteine auf der Oberfläche von Elektroden als funktionierende ET-Ketten zu arrangieren. Dabei kann der ET innerhalb dieser Kaskaden als elektrischer Strom gemessen und als Signal betrachtet werden. Dies ermöglicht die Anwendung von proteinmodifizierten Elektroden als Biosensoren und Biobrennstoffzellen. Ein geeigneter Baustein für den Aufbau vielschichtiger ET-Systeme ist das kleine, eisenhaltige Protein Cytochrom c (Cyt c), welches in der Lage ist Elektronen aufzunehmen, zu transportieren und wieder abzugeben. Als zweiter Baustein dient das lange, fadenartige Biomolekül DNA. DNA und Cyt c interagieren unter bestimmten Bedingungen aufgrund ihrer entgegengesetzten Oberflächenladungen. Dies ermöglicht den schichtweisen Aufbau stabiler Cyt c/DNA-Multischichten (MS) auf Elektrodenoberflächen, welche durch die sogenannte Layer-by-Layer (LbL) Technik aufgebaut werden. In diesen MS Systemen behält Cyt c trotz der Immobilisierung seine Beweglichkeit um die eigene Achse, wodurch der Selbstaustausch von Elektronen zwischen den Cyt c Molekülen sowie der ET zur Elektrode gewährleistet wird. Der molekulare Aufbau der Cyt c/DNA MS sowie die Interaktion zwischen den zwei biologischen Bausteine ist weitgehend unerforscht, daher wurden in der vorliegenden Studie die genauen Bedingungen der Cyt c/DNA Interaktion in Lösung untersucht. Außerdem wird die Eignung des MS Systems zur Einbettung von Enzymen getestet. Die Bausteine des MS-Systems, Cyt c und DNA bilden in Lösung stabile Komplexe unter den Assemblierungsbedingungen der MS (d.h. pH 5.0 und geringe Salzkonzentration). Im Vergleich dazu tritt bei pH 7.0 eine schwächere Interaktion auf, die für eine Komplexbildung nicht ausreicht. Dies ermöglicht die Untersuchung der Interaktion mittels Kernspinresonanzspektroskopie (NMR, engl. nuclear magnetic resonance spectroscopy), wobei die Interaktionsstellen des DNA-Moleküls auf Cyt c bestimmt werden. Im Vergleich zu pH 7.0 wird im leicht sauren pH-Bereich (6.0) eine erhöhte Anzahl an Interaktionspunkten gefunden, was Rückschlüsse auf eine erhöhte Interaktion zulässt. Dies resultiert schließlich in der starken Bindung bei pH 5.0, die den Aufbau stabiler Cyt c/DNA-MS auf Elektrodenoberflächen ermöglicht. Darüber hinaus spielen der Salzgehalt der Lösung sowie das Konzentrationsverhältnis von Cyt c und DNA eine wichtige Rolle. Auf der Grundlage des Cyt c/DNA-MS Aufbaus sollte durch die Kopplung eines Enzymes eine Signalkette mit sensorischen Eigenschaften geschaffen werden. Das Enzym dient dabei als Erkennungselement für bestimmte Moleküle in Lösung. Durch die Reaktion des Enzyms mit dem Molekül wird ein bioelektrisches Signal generiert, das durch elektrochemische Methoden gemessen wird. Dies wurde mit zwei verschiedenen Enzymen, der Glukose Dehydrogenase (GDH) und der Fruktose Dehydrogenase (FDH), untersucht. Beide Enzyme waren in der Lage mit einer Cyt c Monoschicht zu kommunizieren und konnten mit dem redox Protein auf der Elektrodenoberfläche immobilisiert werden. GDH konnte erfolgreich mit dem Cyt c/DNA-MS System gekoppelt und die Sensoreigenschaften der so aufgebauten Elektronentransferkette charakterisiert werden. Zusammenfassend charakterisiert diese Arbeit die Bedingungen der Cyt c/DNA-Komplexbildung und gibt einen Einblick in die bisher unbekannte Interaktion zwischen Cyt c und DNA auf der molekularen Ebene. Darüber hinaus wird die Nutzbarkeit des Cyt c/DNA MS Systems zur Einbettung von Enzymen am Beispiel der GDH gezeigt und schafft somit die Grundlage für das bessere Verständnis von ET Reaktionen zwischen Proteinen auf Elektrodenoberflächen.show moreshow less

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Metadaten
Author:Christoph Wettstein
URN:urn:nbn:de:kobv:517-opus4-78367
Title Additional (German):Cytochrom c-DNA und Cytochrom c-Enzym Interaktion für den Aufbau analytischer Signalketten
Advisor:Ursula Wollenberger
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2015
Publishing Institution:Universität Potsdam
Granting Institution:Universität Potsdam
Date of final exam:2015/05/29
Release Date:2015/07/28
Tag:Biosensor; DNA; Enzym; Interaktion; Protein
DNA; biosensor; enzyme; interaction; protein
Pagenumber:120
RVK - Regensburg Classification:WD 5380, WC 3420, VG 6867
Organizational units:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Biochemie und Biologie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
MSC Classification:92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92Fxx Other natural sciences (should also be assigned at least one other classification number in this section) / 92F05 Other natural sciences (should also be assigned at least one other classification number in section 92)
PACS Classification:80.00.00 INTERDISCIPLINARY PHYSICS AND RELATED AREAS OF SCIENCE AND TECHNOLOGY / 87.00.00 Biological and medical physics / 87.80.-y Biophysical techniques (research methods) / 87.80.Kc Electrochemical techniques
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