TY - THES A1 - Nietzsche, Madlen T1 - Identifizierung und Charakterisierung neuer Komponenten der SnRK1-Signaltransduktion in Arabidopsis thaliana T1 - Identification and characterization of novel components of SnRK1-Signalling in Arabidopsis thaliana N2 - Für alle Organismen ist die Aufrechterhaltung ihres energetischen Gleichgewichts unter fluktuierenden Umweltbedingungen lebensnotwendig. In Eukaryoten steuern evolutionär konservierte Proteinkinasen, die in Pflanzen als SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1) bezeichnet werden, die Adaption an Stresssignale aus der Umwelt und an die Limitierung von Nährstoffen und zellulärer Energie. Die Aktivierung von SnRK1 bedingt eine umfangreiche transkriptionelle Umprogrammierung, die allgemein zu einer Repression energiekonsumierender Prozesse wie beispielsweise Zellteilung und Proteinbiosynthese und zu einer Induktion energieerzeugender, katabolischer Stoffwechselwege führt. Wie unterschiedliche Signale zu einer generellen sowie teilweise gewebe- und stressspezifischen SnRK1-vermittelten Antwort führen ist bisher noch nicht ausreichend geklärt, auch weil bislang nur wenige Komponenten der SnRK1-Signaltransduktion identifiziert wurden. In dieser Arbeit konnte ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk um die SnRK1αUntereinheiten aus Arabidopsis AKIN10/AKIN11 etabliert werden. Dadurch wurden zunächst Mitglieder der pflanzenspezifischen DUF581-Proteinfamilie als Interaktionspartner der SnRK1α-Untereinheiten identifiziert. Diese Proteine sind über ihre konservierte DUF581Domäne, in der ein Zinkfinger-Motiv lokalisiert ist, fähig mit AKIN10/AKIN11 zu interagieren. In planta Ko-Expressionsanalysen zeigten, dass die DUF581-Proteine eine Verschiebung der nucleo-cytoplasmatischen Lokalisierung von AKIN10 hin zu einer nahezu ausschließlichen zellkernspezifischen Lokalisierung begünstigen sowie die Ko-Lokalisierung von AKIN10 und DUF581-Proteinen im Nucleus. In Bimolekularen Fluoreszenzkomplementations-Analysen konnte die zellkernspezifische Interaktion von DUF581-Proteinen mit SnRK1α-Untereinheiten in planta bestätigt werden. Außerhalb der DUF581-Domäne weisen die Proteine einander keine große Sequenzähnlichkeit auf. Aufgrund ihrer Fähigkeit mit SnRK1 zu interagieren, dem Fehlen von SnRK1Phosphorylierungsmotiven sowie ihrer untereinander sehr variabler gewebs-, entwicklungs- und stimulusspezifischer Expression wurde für DUF581-Proteine eine Funktion als Adaptoren postuliert, die unter bestimmten physiologischen Bedingungen spezifische Substratproteine in den SnRK1-Komplex rekrutieren. Auf diese Weise könnten DUF581Proteine die Interaktion von SnRK1 mit deren Zielproteinen modifizieren und eine Feinjustierung der SnRK1-Signalweiterleitung ermöglichen. Durch weiterführende Interaktionsstudien konnten DUF581-interagierende Proteine darunter Transkriptionsfaktoren, Proteinkinasen sowie regulatorische Proteine gefunden werden, die teilweise ebenfalls Wechselwirkungen mit SnRK1α-Untereinheiten aufzeigten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eines dieser Proteine für das eine Beteiligung an der SnRK1Signalweiterleitung als Transkriptionsregulator vermutet wurde näher charakterisiert. STKR1 (STOREKEEPER RELATED 1), ein spezifischer Interaktionspartner von DUF581-18, gehört zu einer pflanzenspezifischen Leucin-Zipper-Transkriptionsfaktorfamilie und interagiert in Hefe sowie in planta mit SnRK1. Die zellkernspezifische Interaktion von STKR1 und AKIN10 in Pflanzen unterstützt die Vermutung der kooperativen Regulation von Zielgenen. Weiterhin stabilisierte die Anwesenheit von AKIN10 die Proteingehalte von STKR1, das wahrscheinlich über das 26S Proteasom abgebaut wird. Da es sich bei STKR1 um ein Phosphoprotein mit SnRK1-Phosphorylierungsmotiv handelt, stellt es sehr wahrscheinlich ein SnRK1-Substrat dar. Allerdings konnte eine SnRK1-vermittelte Phosphorylierung von STKR1 in dieser Arbeit nicht gezeigt werden. Der Verlust von einer Phosphorylierungsstelle beeinflusste die Homo- und Heterodimerisierungsfähigkeit von STKR1 in Hefeinteraktionsstudien, wodurch eine erhöhte Spezifität der Zielgenregulation ermöglicht werden könnte. Außerdem wurden Arabidopsis-Pflanzen mit einer veränderten STKR1-Expression phänotypisch, physiologisch und molekularbiologisch charakterisiert. Während der Verlust der STKR1-Expression zu Pflanzen führte, die sich kaum von Wildtyp-Pflanzen unterschieden, bedingte die konstitutive Überexpression von STKR1 ein stark vermindertes Pflanzenwachstum sowie Entwicklungsverzögerungen hinsichtlich der Blühinduktion und Seneszenz ähnlich wie sie auch bei SnRK1α-Überexpression beschrieben wurden. Pflanzen dieser Linien waren nicht in der Lage Anthocyane zu akkumulieren und enthielten geringere Gehalte an Chlorophyll und Carotinoiden. Neben einem erhöhten nächtlichen Stärkeumsatz waren die Pflanzen durch geringere Saccharosegehalte im Vergleich zum Wildtyp gekennzeichnet. Eine Transkriptomanalyse ergab, dass in den STKR1-überexprimierenden Pflanzen unter Energiemangelbedingungen, hervorgerufen durch eine verlängerte Dunkelphase, eine größere Anzahl an Genen im Vergleich zum Wildtyp differentiell reguliert war als während der Lichtphase. Dies spricht für eine Beteiligung von STKR1 an Prozessen, die während der verlängerten Dunkelphase aktiv sind. Ein solcher ist beispielsweise die SnRK1-Signaltransduktion, die unter energetischem Stress aktiviert wird. Die STKR1Überexpression führte zudem zu einer verstärkten transkriptionellen Induktion von Abwehrassoziierten Genen sowie NAC- und WRKY-Transkriptionsfaktoren nach verlängerter Dunkelphase. Die Transkriptomdaten deuteten auf eine stimulusunabhängige Induktion von Abwehrprozessen hin und konnten eine Erklärung für die phänotypischen und physiologischen Auffälligkeiten der STKR1-Überexprimierer liefern. N2 - For all living organism maintenance of energy homeostasis under changing environmental conditions is indispensable. In eukaryotes, evolutionary conserved protein kinases, such as the SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1) in plants, integrate environmental stress signals, nutrient availability and energy depletion during adaptational responses. Activation of SnRK1 triggers a broad transcriptional reprogramming, which in general represses energy consuming processes such as proliferation and protein biosynthesis and induces energy producing catabolic pathways. Although SnRK1 acts as a convergent point for many different environmental and metabolic signals to control growth and development, it is currently unknown how these many different signals could be translated into a cell-type or stimulusspecific response. This is also due to the fact that only a few proteins participating in SnRK1 signal transduction have yet been identified. In this work, a protein-protein interaction network of the Arabidopsis SnRK1α-subunits AKIN10/AKIN11 was established. Thereby, members of the plant specific DUF581 protein family were identified as SnRK1α interacting proteins. The highly conserved DUF581 domain possesses a zinc finger motif and mediates the interaction with AKIN10/AKIN11. In planta co-expression of AKIN10 with DUF581 proteins leads to a shift of subcellular localization from a nucleo-cytoplasmic distribution of both proteins to a nearly exclusive nuclear localization and show that AKIN10 and DUF581 proteins co-localize in nuclei of plant cells. Bimolecular fluorescence complementation analysis revealed that SnRK1α-subunits interact with DUF581 proteins in plants. Apart from their DUF581 domain there is no strong sequence similarity between DUF581 proteins. Because of their ability to interact with SnRK1, the absence of SnRK1-target motifs and their highly variable transcriptional regulation in a tissue-, development- or stimuli-specific manner, it is possible that DUF581 proteins act as adaptor proteins recruiting substrate proteins into the SnRK1 complex under defined physiological conditions. That said, DUF581 could modify the interaction of SnRK1 with its target proteins and facilitate fine-tuning of SnRK1 signal transduction. Additional interaction studies revealed further DUF581 interacting proteins such as transcription factors, protein kinases and regulatory proteins that in part were also able to interact with SnRK1α. One of these proteins which is supposed to be involved in SnRK1 signaling as a transcriptional regulator was characterized in more detail: Arabidopsis STKR1 (STOREKEPPER RELATED 1) a DUF581-18 interaction partner belongs to a plant specific leucine zipper transcription factor family and is able to interact with SnRK1 in yeast and in planta. Co-operative regulation of target genes by STKR1 and AKIN10 is supported by the specific interaction of these proteins inside the plant nucleus. Furthermore, AKIN10 seems to stabilize protein levels of STKR1 in that it attenuates its proteasomal turnover. Due to the fact that STKR1 is a phosphoprotein with putative SnRK1 target motives it is likely a SnRK1 substrate. However, SnRK1 mediated phosphorylation of STKR1 could not be shown in this work. Though, interaction studies in yeast revealed that a loss of putative phosphorylation sites influences the ability of homo- and hetero-dimerization of STKR1, possibly allowing a higher specificity during target gene regulation. Another part of this work was the phenotypic, physiological and molecular characterization of Arabidopsis plants with altered expression of STKR1. Whereas the absence of STKR1 expression results in plants without strong phenotypic abnormality compared to wildtype the overexpression leads to a strong decrease in plant growth as well as developmental retardations regarding to the induction of flowering and senescence reminiscent of SnRK1overexpressing plants. Plants of these lines were not able to accumulate anthocyanins and also contain reduced levels of chlorophyll and carotenoids. Besides a higher starch turnover in dark, these plants displayed lower sucrose contents. Microarray analysis revealed that under energy deficit stress, induced by extended darkness, a higher number of genes were differentially regulated in plants overexpressing STKR1 compared to wildtype than during the light period. This observation argues for a participation of STKR1 in processes, which are active under extended darkness, being the case for SnRK1 signaling which is strongly activated under energy deficient stress. Overexpression of STKR1 also leads to transcriptional induction of genes associated with defense like NAC and WRKY transcription factors after an extended dark. Results of transcriptome data analysis indicate a stimulus independent induction of defense associated processes and are suitable to explain phenotypical and physiological abnormality of the STKR1 overexpressing lines. KW - SnRK1 KW - Proteinkinase KW - Phosphorylierung KW - Arabidopsis thaliana KW - Energiemangel KW - phosphorylation KW - energy starvation KW - protein kinase Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-98678 ER - TY - THES A1 - Bufe, Bernd T1 - Identifizierung und Charakterisierung von Bitterrezeptoren N2 - Menschen nehmen Tausende von Stoffen als bitter wahr. Die chemische Struktur der verschiedenen Bitterstoffe ist sehr vielfältig: Sie reicht von kleinen Molekülen wie Kaliumchlorid oder Harnstoff, bis zu sehr komplexen organischen Verbindungen. Die Größe der einzigen bekannten menschlichen Familie von Bitterrezeptoren (TAS2Rs) wurde auf nur ca. 80-120 Mitglieder geschätzt. In Anbetracht der hohen Zahl und Komplexität der Bitterstoffe erscheint die Zahl von Rezeptoren als sehr gering. Dies führt natürlich zu einer Reihe von Fragen: Wie viele Mitglieder hat die menschliche TAS2R-Genfamilie? Wie viele verschiedene Substanzen können denselben Rezeptor aktivieren? Scheint die Zahl der TAS2R-Rezeptoren ausreichend, alle Bitterstoffe wahrnehmen zu können oder muss es noch andere Bitterrezeptorfamilien geben? Diese Fragen zu beantworten, ist das Ziel der vorliegenden Arbeit. Hier durchgeführte Analysen des menschlichen Genomprojektes zeigen, dass Menschen ca. 25 TAS2R-Rezeptoren besitzt, die eine sehr divergente Aminosäurestruktur aufweisen. Diese Rezeptoren wurden in eine neu entwickelte Expressionskassette kloniert, die den Transport des Rezeptors an die Zelloberfläche ermöglicht. Um Liganden für die menschliche TAS2R-Rezeptoren zu identifizieren, wurden die Rezeptoren in HEK293 Zellen exprimiert und mit verschiedenen Bitterstoffen stimuliert. Der Nachweis der Rezeptoraktivierung erfolgte durch Calcium-Imaging. Es konnte gezeigt werden, dass hTAS2R16 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Salicin und verwandten bitteren Pyranosiden ist. So wird hTAS2R16 in HEK293 Zellen durch Salicin und chemisch verwandte Substanzen aktiviert. Ein Vergleich der in diesem Messsystem erhaltenen Daten mit psychophysikalisch ermittelten Geschmackswahrnehmungen beim Menschen, ergab eine hohe Übereinstimmung. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die Desensitiverung einzelner Rezeptoren die Ursache für die Adaption des Bittergeschmacks ist. Der Nachweis der Expression des Rezeptors in menschlichen Geschmackspapillen, sowie die festgestellte Assoziation des G/A Polymorpphismus an Position 665 des hTAS2R16 Gens mit einer reduzierten Salicinwahrnehmung, sind weitere unabhängige Beweise für diese These. Ein anderer menschlicher Rezeptor, hTAS2R10, wird durch die Bitterstoffe Strychnin, Brucin und Denatonium aktiviert. Dies sowie die Tatsache, dass die zur Aktivierung benutzten Konzentrationen eine sinnvolle Korrelation zu dem menschlichen Geschmacksschwellwert von Strychnin zeigen, sind starke Hinweise, dass hTAS2R10 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Strychnin und verwandten Substanzen ist. Die vorliegenden Daten zeigen eindeutig, dass die TAS2R-Rezeptoren auch beim Menschen Bitterrezeptoren darstellen. Sowohl hTAS2R16, als auch hTAS2R10 werden durch ein Spektrum strukturell sehr unterschiedlicher Bitterstoffe aktiviert. Falls die anderen Mitglieder der TAS2R-Familie ebenfalls dieses Verhalten zeigen, wäre es möglich, dass die nur ca. 25 Mitglieder umfassende TAS2R-Rezeptorfamilie des Menschen tatsächlich zur Wahrnehmung aller Bitterstoffe ausreicht. N2 - Bitter taste generally is aversive and protects vertebrates from ingestion of toxic substances, but bitter tastants also contribute to the enjoyment and palatability of food influencing human nutritional habits. Although bitter taste has been extensively studied, receptor mechanisms are still poorly understood. Anatomic, functional and genetic evidence from rodents suggested, however, that the T2R genes encode a family of bitter receptors while definite proof is missing in humans 6. We here report that the hT2R16 receptor is present in vallate papilla taste buds of the human tongue and activated by bitter b-glucopyranosides. These phytonutrients did not activate any other human T2R and showed similar concentration-response relations and cross-desensitization in hT2R16 expressing cells and psychobiological experiments. hT2R16 is broadly tuned. It binds bitter compounds that share only a b-glycosidic bond and a glucose residue. The broad tuning of T2Rs could explain how a limited number of receptors permits the perception and coding of numerous and different bitter substances. Together our data identify the hT2R16 as a broadly tuned, genuine human bitter receptor for b-glucopyranosides. KW - Geschmack KW - Bitter KW - Rezeptoren KW - TAS2R KW - Salicin KW - HEK293 KW - calcium imaging KW - taste KW - bitter KW - receptor KW - TAS2R KW - HEK293 KW - Salicin KW - calcium imaging Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001130 ER - TY - THES A1 - Reinert, Armin T1 - Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von für die arbuskuläre Mykorrhizasymbiose spezifischen Genen in Medicago truncatula T1 - Identification and functional characterization of genes specific for the arbuscular mycorrhizal symbiosis in Medicago truncatula N2 - Die Mykorrhiza (griechisch: mýkēs für „Pilz”; rhiza für „Wurzel”) stellt eine Symbiose zwischen Pilzen und einem Großteil der Landpflanzen dar. Der Pilz verbessert durch die Symbiose die Versorgung der Pflanze mit Nährstoffen, während die Pflanze den Pilz mit Kohlenhydraten versorgt. Die arbuskuläre Mykorrhiza (AM) stellt dabei einen beson-dere Form der Mykorrhiza dar. Der AM-Pilz bildet dabei während der Symbiose die namensgebenden Arbuskeln innerhalb der Wurzelzellen als Ort des primären Nährstoff- austausches aus. Die AM-Symbiose (AMS) ist der Forschungsschwerpunkt dieser Arbeit. Als Modellorganismen wurden Medicago truncatula und Glomus intraradices verwendet. Es wurden Transkriptionsanalysen durchgeführt um u.a. AMS regulierte Transkriptions- faktoren (TFs) zu identifizieren. Die Aktivität der Promotoren von drei der so identifizier-ten AMS-regulierten TFs (MtOFTN, MtNTS, MtDES) wurde mit Hilfe eine Reportergens visualisiert. Der Bereich der größten Promotoraktivität waren in einem Fall nur die ar- buskelhaltigen Zellen (MtOFTN). Im zweiten Fall war der Promotor auch aktiv in nicht arbuskelhaltigen Zellen, jedoch am stärksten aktiv in den arbuskelhaltigen Zellen (MtNTS). Ein weiterer Promotor war in arbuskelhaltigen Zellen und den diesen benach-barten Zellen gleich aktiv (MtDES). Zusätzlich wurden weitere Gene als AMS-reguliert identifiziert und es wurde für drei dieser Gene (MtPPK, MtAmT, MtMDRL) ebenfalls eine Promotor::Reporter-Aktivitäts- studie durchgeführt. Die Promotoren der Kinase (MtPPK) und des Ammoniumtrans-porters (MtAmt) waren dabei ausschließlich in arbuskelhaltigen Zellen aktiv, während die Aktivität des ABC-Transporters (MtMDRL) keinem bestimmten Zelltyp zuzuordnen war. Für zwei weitere identifizierte Gene, ein Kupfertransporter (MtCoT) und ein Zucker- bzw. Inositoltransporter (MtSuT), wurden RNA-Interferenz (RNAi)-Untersuchungen durchgeführt. Dabei stellte sich in beiden Fällen heraus, dass, sobald ein RNAi-Effekt in den transformierten Wurzeln vorlag, diese in einem deutlich geringerem Ausmaß wie in der Wurzelkontrolle von G. intraradices kolonisiert worden sind. Im Falle von MtCoT könnte das aus dem selben Grund geschehen, wie im Falle von MtPt4. Welche Rolle MtSuT genau in der Ausbildung der AMS spielt und welche Rolle Inositol in der Aus- bildung der AMS spielt müsste durch weitere Untersuchungen am Protein untersucht werden. Weitere Untersuchen an den in dieser Arbeit als spezifisch für arbuskelhaltige Zellen gezeigten Genen MtAmT, MtPPK und MtOFTN könnten ebenfalls aufschlussreich für das weitere Verständnis der AMS sein. Dies trifft auch auf die TFs MtNTS und MtDES zu, die zwar nicht ausschließlich arbuskelspezifisch transkribiert werden, aber auch eine Rolle in der Regulation der AMS innerhalb von M. truncatula Wurzeln zu spielen scheinen. N2 - The mycorrhiza (Greek: mýkēs for "mushroom"; rhiza for "root") is a symbiosis between fungi and the vast majority of land plants. The fungus improves the nutrient supply of the plant, while the plant provides the fungus with carbohydrates. The arbuscular my-corrhiza (AM) represents a special type of mycorrhiza. The AM forms during the sym-biosis eponymous arbuscules within the root cells as the supposed site of the major nu-trient exchange. The AM symbiosis (AMS) is the research focus of this work. Medicago truncatula and Glomus intraradices were used as model organisms. During the project several transcription analysis were performed to identify AMS re-gulated transcription factors (TFs). The activity of the promoters of three of the identified AMS regulated TFs (MtOFTN, MtNTS, MtDES) were visualised using a reporter gene. Cells with promoter activity were in one case the arbuscle containing cells (MtOFTN). In the another case, the promoter was also weakly active in non arbuscle containing cells, however the major site of activity were the arbuscle containing cells (MtNTS). Another promoter was active in arbuscle containing and adjacent cells (MtDES). In addition, other genes were identified as AMS regulated and for three of these genes (MtPPK, MtAmT, MtMDRL) a promoter::reporter activity study was conducted, too. The promoters of the kinase (MtPPK) and the ammonium transporter (MtAmT) were active exclusively in arbuscle containing cells, whereas the activity of the ABC-transporter (MtMDRL) could not be assigned to a specific cell type. For two other identified genes (a copper transporter (MtCoT) and a sugar/ inositol transporter (MtSuT)) RNA-interference (RNAi) studies were carried out. The studies revealed in both cases that, once an RNAi effect was present in the transformed roots, the roots were colonised by G. intraradices in a much lesser extent as in the vector-control. In the case of MtCoT it maybe has the same basic principle as in the case of the phosphate transporter MtPt4. Which role MtSuT and inositol plays during the fo-rmation of the AMS has to be reviewed. Further examinations on the genes MtAmT, MtPPK and MtOFTN could also be reveal-ing for the understanding of the AMS, as their promotors, as shown in this thesis, are exclusively active in arbuscle containing cells The same can be said for the TFs MtNFTS and MtDES. They are not exclusively transcripted in arbuscle containing cells, but nevertheless seem to play a role in the formation of the AMS within M. truncatula roots. KW - Mykorrhiza KW - Medicago truncatula KW - Transkriptom KW - RNAi KW - Promotor KW - Mycorrhiza KW - Medicago truncatula KW - transcriptomics KW - RNAi KW - Promotor Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-63805 ER - TY - THES A1 - Danckert, Lena T1 - Immunscreening Virulenz-adaptierter Expressionsbibliotheken aus einem in vitro Infektionsmodell mit Salmonella Enteritidis T1 - Immunoscreening of virulence adapted expressionlibraries of an in vitro infection model with salmonella enteritidis N2 - Die Folgen einer lebensmittelbedingten Erkrankung sind zum Teil gravierend, insbesondere für Kinder und immunsupprimierte Menschen. Hierbei gehören Salmonella und Campylobacter zu den häufigsten Erregern, die verantwortlich für gastrointestinale Erkrankungen in Deutschland sind. Trotz umfassender Maßnahmen der EU zur Prävention und Bekämpfung von Salmonellen in Geflügelbeständen und der Lebensmittel-Industrie, wird von einem stagnierenden Trend von Infektionszahlen berichtet. Zoonose-Erreger wie Salmonellen können über Nutztiere in die Nahrungskette des Menschen gelangen, wodurch sich Infektionsherde schnell ausbreiten können. Dabei sind bestehende Präventionsstrategien für Geflügel vorhanden, die aber nicht auf den Menschen übertragbar sind. Folglich sind Diagnostik und Prävention in der Lebensmittelindustrie essentiell. Deshalb besteht ein hoher Bedarf für spezifische, sensitive und zuverlässige Nachweismethoden, die eine Point-of-care Diagnostik gewährleisten. Durch ein wachsendes Verständnis der wirtsspezifischen Faktoren von S. enterica Serovaren kann die Entwicklung sowohl neuartiger diagnostischer Methoden, als auch neuartiger Therapien und Impfstoffe maßgeblich vorangetrieben werden. Infolgedessen wurde in dieser Arbeit ein infektionsähnliches in vitro Modell für S. Enteritidis etabliert und darauf basierend eine umfassende Untersuchung zur Identifizierung neuer Zielstrukturen für den Erreger durchgeführt. Während einer Salmonellen-Infektion ist die erste zelluläre Barriere im Wirt die Epithelschicht. Dementsprechend wurde eine humane Zelllinie (CaCo 2, Darmepithel) für die Pathogen-Wirt-Studie ausgewählt. Das Salmonellen-Transkriptom und morphologische Eigenschaften der Epithelzellen wurden in verschiedenen Phasen der Salmonellen-Infektion untersucht und mit bereits gut beschriebenen Virulenzfaktoren und Beobachtungen in Bezug gesetzt. Durch dieses Infektionsmodell konnte ein spezifischer Phänotyp für die intrazellulären Salmonellen in den Epithelzellen nachgewiesen werden. Zudem wurde aufgezeigt, dass bereits die Kultivierung in Flüssigmedium einen invasionsaktiven Zustand der Salmonellen erzeugt. Allerdings wurde durch die Kokultivierung mit Epithelzellen eine zusätzliche Expression relevanter Gene induziert, um eine effiziente Adhäsion und Transmembran-Transport zu gewährleisten. Letzterer ist charakteristisch für die intrazelluläre Limitierung von Nährstoffen und prägt den infektionsrelevanten Status. Unter Berücksichtigung dieser Faktoren ergab sich ein Phänotyp, der eindeutig Mechanismen zur Wirtsadaptation und möglicherweise auch Pathogenese aufzeigt. Die intrazellulären Bakterien müssen vom Wirt separiert werden, was ein wesentlicher Schritt für Pathogen-bestimmende Analysen ist. Hierbei wurde mithilfe einer Detergenz-basierten Lyse der eukaryotischen Zellmembran und differentieller Zentrifugation, der eukaryotische Eintrag minimal gehalten. Unter Verwendung der Virulenz-adaptierten Salmonellen wurden Untersuchungen in Hinblick auf die Identifizierung neuer Zielstrukturen für S. Enteritidis durchgeführt. Mithilfe eines immunologischen Screenings wurden neue potentielle Antigene entdeckt. Zu diesem Zweck wurden bakterielle cDNA-basierte Expressionsbibliotheken hergestellt, die durch eine vereinfachte Microarray-Anwendung ein Hochdurchsatzscreening von Proteinen als potentielle Binder ermöglichen. Folglich konnten neue unbeschriebene Proteine identifiziert werden, die sich durch eine Salmonella-Spezifität oder Membranständigkeit auszeichnen. Ebenso wurde ein Vergleich der im Screening identifizierten Proteine mit der Regulation der kodierenden Gene im infektionsähnlichen Modell durchgeführt. Dabei wurde deutlich, dass die Häufigkeit von Transkripten einen Einfluss auf die Verfügbarkeit in der cDNA-Bibliothek und folglich auch auf die Expressionsbibliothek nimmt. Angesichts eines Ungleichgewichts zwischen der Gesamtzahl protein-kodierender Gene in S. Enteritidis zu möglichen Klonen, die während des Microarray-Screenings untersucht werden können, besteht der Bedarf einer Anreicherung von Proteinen in der Expressionsbibliothek. Das infektionsähnliche Modell zeigte, dass nicht nur Virulenz-assoziierte, sondern auch Stress- und Metabolismus-relevante Gene hochreguliert werden. Durch die Konstruktion dieser spezifischen cDNA-Bibliotheken ist die Erkennung von charakteristischen molekularen Markern gegeben. Weiterhin wurden anhand der Transkriptomanalyse spezifisch hochregulierte Gene identifiziert, die relevant für das intrazelluläre Überleben von S. Enteritidis in humanen Epithelzellen sind. Hiervon wurden drei Gene näher untersucht, indem ihr Einfluss im infektionsähnlichen Modell mittels entsprechender Gen-Knockout-Stämme analysiert wurde. Dabei wurde für eine dieser Mutanten ein reduziertes Wachstum in der späten intrazellulären Phase nachgewiesen. Weiterführende in vitro Analysen sind für die Charakterisierung des Knockout-Stamms notwendig, um den Einsatz als potenzielles Therapeutikum zu verifizieren. Zusammenfassend wurde ein in vitro Infektionsmodell für S. Enteritidis etabliert, wodurch neue Zielstrukturen des Erregers identifiziert wurden. Diese sind für diagnostische oder therapeutische Anwendungen interessant. Das Modell lässt sich ebenso für andere intrazelluläre Pathogene übertragen und gewährleistet eine zuverlässige Identifizierung von potentiellen Antigenen. N2 - The outcomes of food-borne diseases are in part severe, especially for children and immunocompromised people. Salmonella and Campylobacter are among the most common pathogens responsible for gastrointestinal diseases in Germany. Despite the comprehensive EU efforts to prevent and control salmonella in poultry flocks and the food industry, a trend of stagnating outbreaks is reported. Zoonotic agents like salmonella can enter the human food chain through livestock, allowing colonies to spread rapidly. There are existing prevention strategies for poultry, but they are not transferable to humans. Consequently, diagnostics and prevention are essential in the food industry. Therefore, a high demand exists for specific, sensitive and reliable detection methods that guarantee point-of-care diagnostics. Through a growing understanding of the host-specific factors of S. enterica serovars, the development of novel diagnostic methods as well as novel therapies and vaccines can be significantly advanced. As a result, an infection-like in vitro model for S. Enteritidis was established and a comprehensive study was conducted to identify new target structures for the pathogen. During a salmonella infection, the first cellular barrier in the host is the epithelial layer. Accordingly, a human cell line (CaCo-2, intestinal epithelium) was selected for the pathogen-host study. The salmonella transcriptome and morphological properties of epithelial cells were studied at different stages of salmonella infection and were compared with well-described virulence factors and findings. Through this infection model, a specific phenotype for intracellular salmonella in epithelial cells could be detected. In addition, it was shown that cultivation in liquid medium already induces an invasion-active state of salmonella. However, co-cultivation with epithelial cells induced additional expression of specific genes to ensure efficient adhesion and transport of the membrane. The latter is characteristic for the intracellular limitation of nutrients and determines the infection-relevant status. Taking these factors into account, a phenotype with clear mechanisms for host adaptation and also potentially pathogenesis was observed. The intracellular bacteria must be separated from the host, which is an essential step for pathogen-determined analyses. With the help of detergent-based lysis of the eukaryotic cell membrane and differential centrifugation, the eukaryotic input was kept to a minimum. Using virulence-adapted Salmonella RNA, experiments were conducted to identify new target structures for S. Enteritidis. With the help of immunological screening, new potential antigens were discovered. For this purpose, bacterial cDNA-based expression libraries were created that enable high-throughput protein screening through a simplified microarray application providing potential binders. Consequently, new undescribed proteins characterised by salmonella specificity or membrane origin could be identified. A comparison of the identified screening proteins with the regulation of the coding genes in the infection-like model was also carried out. It became clear that the frequency of transcripts has an influence on their availability in the cDNA library and consequently also on the expression library. Given an imbalance between the total number of protein-coding genes in S. Enteritidis and possible clones that can be tested during microarray screening, there is a need for protein enrichment in the expression library. The infection-like model showed that not only genes associated with virulence but also genes relevant to stress and metabolism are upregulated. The construction of such specific cDNA libraries enables the recognition of characteristic molecular markers. Furthermore, transcriptome analysis was used to identify specifically up-regulated genes that are relevant for the intracellular survival of S. Enteritidis in human epithelial cells. Three of these genes were investigated in more detail by examining their influence in the infection-like model using corresponding gene knockout strains. For one of these mutants, reduced growth in the late intracellular phase was proven. Further in vitro analyses are necessary for the characterization of the knockout strain in order to verify its use as a potential therapeutic agent. In summary, an in vitro infection model for S. Enteritidis was established, which revealed new target structures of the pathogen. These are interesting for diagnostic or therapeutic applications. The model can also be transferred to other intracellular pathogens and provides reliable identification of potential antigens. KW - Diagnostik KW - Immunscreening KW - Salmonellen KW - diagnostic KW - immunoscreening KW - salmonella Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-421108 ER - TY - THES A1 - Sellrie, Frank T1 - Immuntechnologische Verfahren zum Aufbau homogener Immunoassays sowie zur Selektion Antikörper produzierender Zellen T1 - Immunotechnological procedures for the development of homogeneous immunoassays and the selection of antibody producing cells N2 - Homogene Immunoassays sind immunologische Testverfahren, bei deren Durchführung vollständig auf Separations- und Waschschritte verzichtet werden kann. Der Substrate Channeling Immunoassay beruht auf der Weitergabe eines Substrates in einem immunologischen Komplex aus zwei Enzymen. Das Produkt des ersten Enzyms dient dem zweiten Enzym als Substrat zur Generierung eines photometrisch nachweisbaren Produktes. Voraussetzung für diese Weitergabe ist die enge räumliche Nähe beider Enzyme. Diese Nähe wird durch eine Bindung zwischen Analyt und anti-Analyt Antikörper vermittelt. Ein solcher Substrate Channeling Immunoassay wurde unter Verwendung der Enzyme Glucoseoxidase und Peroxidase aufgebaut. Das so etablierte System war funktionstüchtig, jedoch blieb seine Sensitivität hinter der normaler, heterogener Immunoassays zurück. Die Grundlage eines Fluorescence Quenching Immunoassays ist der gegenseitige Ausschluß zweier Antikörper bei der Bindung eines Dihapten-Konjugates. Das Konjugat besteht dabei aus dem Analyten und einem Fluorophor. Die beiden um die Konjugatbindung konkurrierenden Antikörper sind ein anti-Analyt Antikörper und ein anti-Fluorophor Antikörper, der zudem über die Eigenschaft verfügt, bei Bindung des Fluorophors dessen Fluoreszenz zu löschen. Externe Gaben des freien Analyten verschieben das eingestellte Gleichgewicht in Richtung Fluorophor-Bindung und damit Fluoreszenz-Löschung. Die Änderung der Fluoreszenz ist direkt an die Konzentration des freien Analyten gekoppelt und dient zu deren Bestimmung. Ein solcher Fluorescence Quenching Immunoassays wurde für die Konzentrationsbestimmung des Herbizides Diuron etabliert. Die erreichten Sensitivitäten erlauben die praktische, immundiagnostische Anwendung des Systems. Ein Dihapten-Konjugat wurde ebenfalls zum Aufbau eines Verfahrens zur Selektion Antikörper produzierender Zellen eingesetzt. Die Selektion der Antikörper produzierenden Zellen erfolgt unter Verwendung eines Toxinkonjugates. Dieses Konjugat besteht aus einem Liganden und einem Toxin. Die Antikörperbindung des Liganden behindert sterisch die Wechselwirkung der Toxinkomponente im Konjugat mit deren Zielstruktur in oder auf der Zelle. Nur Zellen die einen geeigneten Antikörper sezernieren, überleben die Selektion und reichern sich in der Kultur an. Das Selektionsverfahren wurde erfolgreich für die Selektion von E.coli Zellen eingesetzt, die einen rekombinanten, Fluorescein bindenden Antikörper produzierten. Das hierfür synthetisierte Toxinkonjugat bestand aus Fluorescein (Ligand) und Ampicillin (Toxinkomponente). Eine Ablösung der bisher für diese Aufgabe gebräuchlichen, außerordentlich kostenintensiven, Screening Methoden wird damit möglich. N2 - Homogeneous immunoassays are test systems which do not depend on separation steps. The substrate channeling immunoassay is based on the product/substrate transfer in an immunological complex built up by two enzymes. The product of the first enzyme functions as substrate for the second enzyme. The second enzyme generates a photometrically detectable product. The close proximity of these two enzymes is the basis of the substrate channeling. This proximity is created by antibody binding to the corresponding analyte. The enzymes glucose oxidase and peroxidase were used for the development of such an assay system. The established homogeneous immunoassay was functional. But the sensitivity of the assay was much lower than that of conventional heterogeneous immunoassays. The principle of a fluorescence quenching immunoassay is based on the fact that two antibodies exclude each other from binding to a dihapten conjugate. The conjugate consists of the analyte and the fluorophore. The two antibodies which compete for the conjugate binding are an anti-analyte antibody and an anti-fluorophore antibody. This anti-fluorophore antibody quenches the fluorescence of the fluorophore after binding. The addition of free analyte alters the equilibrium of the system so that the anti-fluorophore antibody is bound to the fluorophore and the fluorescence is quenched. The change in fluorescence is therefore an indicator of the concentration of free analyte added. A homogeneous fluorescence quenching immunoassay was established for the determination of the herbicide diuron. The sensitivities obtained allow the practical immunodiagnostic application of the system. A dihapten conjugate was also employed for the development of a selection method for antibody-producing cells. Toxin conjugates were used in this system. Each conjugate consisted of a ligand and a toxin. Antibody binding to the ligand sterically inhibits the toxin component to interact with its target structure. Only cells secreting a binding antibody will survive the selection and will accumulate in culture. The system was applied to the selection of E.coli cells producing a recombinant fluorescein-binding antibody. The toxin conjugate used in experiment consisted of fluorescein (ligand) and ampicillin (toxin component). This selection procedure allowed the isolation of recombinant antibody-producing E.coli cells. It has the potential to replace the time-consuming and labour-intensive methods used so far. KW - Homoger Immunoassay KW - Substate Channeling Immunoassay KW - Fluorescence Quenching Immunoassay KW - Selektion Antikörper-produzierender Zellen KW - Homogeneous immunoassay KW - Substrate channeling immunoassay KW - Fluorescence quenching immunoassay KW - Selection of antibody producing cells Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-15982 ER - TY - THES A1 - Gottmann, Pascal T1 - In silico Analyse zur Klärung der Beteiligung von micro-RNAs, die in QTL lokalisiert sind, an den metabolischen Erkrankungen Adipositas und Typ-2-Diabetes mit Hilfe von Mausmodellen Y1 - 2019 ER - TY - THES A1 - Fischbach, Jens T1 - Isothermale Amplifikationsmethoden für den DNA- und Pyrophosphat-abhängigen Pathogennachweis T1 - Isothermal amplification methods for DNA- and pyrophophate based pathogen detection N2 - Hintergrund: Etablierte Protein- und Nukleinsäure-basierte Methoden für den spezifischen Pathogennachweis sind nur unter standardisierten Laborbedingungen von geschultem Personal durchführbar und daher mit einem hohen Zeit- und Kostenaufwand verbunden. In der Nukleinsäure-basierten Diagnostik kann durch die Einführung der isothermalen Amplifikation eine schnelle und kostengünstige Alternative zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden. Die Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) bietet aufgrund der hohen Amplifikationseffizienz vielfältige Detektionsmöglichkeiten, die sowohl für Schnelltest- als auch für Monitoring-Anwendungen geeignet sind. Ein wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung der Anwendbarkeit der LAMP und die Entwicklung einer neuen Methode für den einfachen, schnellen und günstigen Nachweis von Pathogenen mittels alternativer DNA- oder Pyrophosphat-abhängiger Detektionsverfahren. Hier wurden zunächst direkte und indirekte Detektionsmethoden untersucht und darauf aufbauend ein Verfahren entwickelt, mit dem neue Metallionen-abhängige Fluoreszenzfarbstoffe für die selektive Detektion von Pyrophosphat in der LAMP und anderen enzymatischen Reaktionen identifiziert werden können. Als Alternative für die DNA-basierte Detektion in der digitalen LAMP sollten die zuvor etablierten Farbstoffe für den Pyrophosphatnachweis in einer Emulsion getestet werden. Abschließend wurde ein neuer Reaktionsmechanismus für die effiziente Generierung hochmolekularer DNA unter isothermalen Bedingungen als Alternative zur LAMP entwickelt. Ergebnisse: Für den Nachweis RNA- und DNA-basierter Phythopathogene konnte die Echtzeit- und Endpunktdetektion mit verschiedenen Farbstoffen in einem geschlossenen System etabliert werden. Hier wurde Berberin als DNA-interkalierender Fluoreszenzfarbstoff mit vergleichbarer Sensitivität zu SYBR Green und EvaGreen erfolgreich in der LAMP mit Echtzeitdetektion eingesetzt. Ein Vorteil von Berberin gegenüber den anderen Farbstoffen ist die Toleranz der DNA-Polymerase auch bei hohen Farbstoffkonzentrationen. Berberin kann daher auch in der geschlossenen LAMP-Reaktion ohne zusätzliche Anpassung der Reaktionsbedingungen für die Endpunktdetektion verwendet werden. Darüber hinaus konnte Hydroxynaphtholblau (HNB), das für den kolorimetrischen Endpunktnachweis bekannt ist, erstmals auch für die fluorimetrische Detektion der LAMP in Echtzeit eingesetzt werden. Zusätzlich konnten in der Arbeit weitere Metallionen-abhängige Farbstoffe zur indirekten Detektion der LAMP über das Pyrophosphat identifiziert werden. Dafür wurde eine iterative Methode entwickelt, mit der potenzielle Farbstoffe hinsichtlich ihrer Enzymkompatibilität und ihrer spektralen Eigenschaften bei An- oder Abwesenheit von Manganionen selektiert werden können. Mithilfe eines kombinatorischen Screenings im Mikrotiterplattenformat konnte die komplexe Konzentrationsabhängigkeit zwischen den einzelnen Komponenten für einen fluorimetrischen Verdrängungsnachweis untersucht werden. Durch die Visualisierung des Signal-Rausch-Verhältnis’ als Intensitätsmatrix (heatmap) konnten zunächst Alizarinrot S und Tetrazyklin unter simulierten Reaktionsbedingungen selektiert werden. In der anschließenden enzymatischen LAMP-Reaktion konnte insbesondere Alizarinrot S als günstiger, nicht-toxischer und robuster Fluoreszenzfarbstoff identifiziert werden und zeigte eine Pyrophosphat-abhängige Zunahme der Fluoreszenzintensität. Die zuvor etablierten Farbstoffe (HNB, Calcein und Alizarinrot S) konnten anschließend erfolgreich für die indirekte, fluorimetrische Detektion von Pyrophosphat in einer LAMP-optimierten Emulsion eingesetzt werden. Die Stabilität und Homogenität der generierten Emulsion wurde durch den Zusatz des Emulgators Poloxamer 188 verbessert. Durch die fluoreszenzmikroskopische Analyse der Emulsion war eine eindeutige Diskriminierung der positiven und negativen Tröpfchen vor allem bei Einsatz von Calcein und Alizarinrot S möglich. Aufgrund des komplexen Primer-Designs und der hohen Wahrscheinlichkeit unspezifischer Amplifikation in der LAMP wurde eine neue Bst DNA-Polymerase-abhängige isothermale Amplifikationsreaktion entwickelt. Durch die Integration einer spezifischen Linkerstruktur (abasische Stelle oder Hexaethylenglykol) zwischen zwei Primersequenzen konnte ein bifunktioneller Primer die effiziente Regenerierung der Primerbindungsstellen gewährleisten. Der neue Primer induziert nach der spezifischen Hybridisierung auf dem Templat die Rückfaltung zu einer Haarnadelstruktur und blockiert gleichzeitig die Polymeraseaktivität am Gegenstrang, wodurch eine autozyklische Amplifikation trotz konstanter Reaktionstemperatur möglich ist. Die Effizienz der „Hinge-initiated Primer dependent Amplification“ (HIP) konnte abschließend durch die Verkürzung der Distanz zwischen einem modifizierten Hinge-Primer und einem PCR-ähnlichen Primer verbessert werden. Schlussfolgerung: Die LAMP hat sich aufgrund der hohen Robustheit und Effizienz zu einer leistungsfähigen Alternative für die klassische PCR in der molekularbiologischen Diagnostik entwickelt. Unterschiedliche Detektionsverfahren verbessern die Leistungsfähigkeit der qualitativen und quantitativen LAMP für die Feldanwendungen und für die Diagnostik, da die neuen DNA- und Pyrophosphat-abhängigen Nachweismethoden in einer geschlossenen Reaktion eingesetzt werden können und so eine einfache Pathogendiagnostik ermöglichen. Die gezeigten Methoden können darüber hinaus zu einer Kostensenkung und Zeitersparnis gegenüber den herkömmlichen Methoden beitragen. Ein attraktives Ziel stellt die Weiterentwicklung der HIP für den Pathogennachweis als Alternative zur LAMP dar. Hierbei können die neuen LAMP-Detektionsverfahren ebenfalls Anwendung finden. Die Verwendung von Bst DNA-Polymerase-abhängigen Reaktionen ermöglicht darüber hinaus die Integration einer robusten isothermalen Amplifikation in mikrofluidische Systeme. Durch die Kombination der Probenvorbereitung, Amplifikation und Detektion sind zukünftige Anwendungen mit kurzer Analysezeit und geringem apparativen Aufwand insbesondere in der Pathogendiagnostik möglich. N2 - Background: Established protein- and nucleic acid-based methods for the specific pathogen detection are usually performed under standardized laboratory conditions by trained staff and are associated with long processing time and high costs. In nucleic acid-based pathogen diagnostics, the isothermal amplification can be used as a rapid and cost-effective alternative to the polymerase chain reaction (PCR). Among all isothermal techniques, the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) offers a wide range of applications for the rapid endpoint and real-time detection. A major goal of this work, was to improve the applicability of LAMP and the development of a new method to get a simple, fast and cost-effective diagnostic tool that is based on the detection of DNA and pyrophosphate. For this purpose, direct and indirect detection methods were investigated as well as additional metal ion-dependent fluorescent dyes for the selective detection of pyrophosphate in LAMP or other enzymatic reactions identified. As an alternative to the DNA-based digital LAMP, the previously established dyes were tested for the detection of pyrophosphate in emulsion. Finally, a new reaction mechanism was developed that allows the efficient generation of high molecular weight DNA under isothermal reaction conditions. Results: The detection of RNA- and DNA-based phytopathogens in closed reactions was established successfully with different dyes for real-time and endpoint detection. Berberine as DNA-intercalating fluorescent dye was used in the real-time detection of LAMP with comparable sensitivity to SYBR Green and EvaGreen for the first time. Additionally, the results revealed adequate tolerance of the Bst DNA polymerase to higher concentrations of the dye. Thus, it could be used directly in a closed LAMP reaction without any optimization. Furthermore, the magnesium indicator hydroxynaphthol blue (HNB) was used for fluorometric real-time detection in LAMP for the first time. To extend the number of indirect detection methods for the accumulating pyrophosphate in LAMP and other enzymatic reactions, new metal-ion-dependent dyes were identified. The developed platform could support the iterative process of finding new fluorescent dyes with regard to enzyme compatibility and their spectral properties in the presence or absence of manganese ions. To obtain a selective fluorometric displacement assay, the complex concentration dependence between all components was investigated successfully by the establishment of a combinatorial screening in a microtiter plate. The visualization of the calculated signal-to-noise ratio was then used to identify alizarin red S and tetracycline as promising candidates under simulated reaction conditions. By testing both dyes in the enzymatic assay, alizarin red S was confirmed as low-cost, non-toxic and robust dye for the pyrophosphate dependent increase of the fluorescence intensity. The previously established dyes (HNB, calcein and alizarin red S) were applied successfully for the indirect and fluorometric detection of pyrophosphate in a LAMP-optimized emulsion. The stability and homogeneity of the generated emulsion was increased by adding the surfactant poloxamer 188. The fluorescence microscopic analysis showed a distinct discrimination between positive and negative droplets, in particular by using calcein, HNB and alizarin red S. Additionally, a new amplification reaction that is also based on the Bst DNA polymerase was developed to prevent the complicated primer design and likelihood of unspecific amplification in LAMP. The efficient regeneration of the single stranded priming site was achieved by the integration of a specific linker (abasic site or hexaethylenglycol) between two priming sites to create a bifunctional hinge-primer. After the hybridization on the template sequence, the hinge-primer was used to induce the refolding to a hairpin structure and for blocking the polymerase activity on the reverse strand. Thus, an autocyclic amplification can be achieved at isothermal reaction conditions. Finally, the efficiency of the hinge-initiated primer dependent amplification (HIP) was improved by decreasing the distance between the modified hinge-primer and the corresponding PCR-like primer. Conclusion: Due to its robustness and efficiency, LAMP has been developed to a powerful alternative for the standardized PCR-based diagnostics in molecular biology in the past years. Different detection methods improve the performance of the qualitative and quantitative LAMP in field applications as well as in diagnostics. The new DNA and pyrophosphate based assays can be used in closed reactions and contribute to a simple pathogen detection. Furthermore, the advancements can lead to a considerable reduction of costs and time compared to conventional methods. An attractive achievement is the further optimization of the HIP as sensitive pathogen assay by using LAMP-based detection methods. The use of Bst DNA polymerasedependent reactions will allow a robust integration of the isothermal amplification in microfluidic systems. By combining sample preparation, amplification and detection in one device, powerful applications with short analysis time and low instrumental requirements are a future perspective in pathogen diagnostics. KW - isothermale Amplifikation KW - isothermal amplification KW - Pyrophosphat KW - pyrophosphate KW - DNA KW - DNA KW - Pathogen KW - pathogen KW - LAMP KW - LAMP Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-406072 ER - TY - THES A1 - Born, Stephan T1 - Kartierung der Bindungstasche des humanen Bittergeschmacksrezeptors hTAS2R10 T1 - Mapping the binding site of the human bitter taste receptor hTAS2R10 N2 - Die Bittergeschmacksrezeptoren stellen in der Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren eine besondere Gruppe dar. Im Menschen können die 25 Rezeptoren eine große Anzahl unterschiedlichster Bittergeschmacksstoffe detektieren. Diese Substanzen können sowohl schädlich, wie etwa Strychnin, als auch der Gesundheit förderliche Arzneistoffe, wie etwa Chloramphenicol sein. Unter den Bittergeschmacksrezeptoren des Menschen gibt es eine Gruppe von drei Rezeptoren, die besonders viele Bitterstoffe detektieren können. Einer von ihnen ist der Rezeptor hTAS2R10. In dieser Arbeit konnte sowohl experimentell als auch durch computergestützte Modellierung gezeigt werden, dass der hTAS2R10 nur eine Bindungstasche besitzt. Das stimmt mit den bisher ausführlich experimentell und in silico untersuchten Rezeptoren hTAS2R1, -R16, -R38 und -R46 überein. Die für die Agonisteninteraktionen nachweislich wichtigen Transmembrandomänen sind in den bisher untersuchten Bittergeschmacksrezeptoren, wie auch im hTAS2R10, die Transmembrandomänen 3, 5, 6 und 7. Die Untersuchungen zeigten, dass die Bindungstasche des hTAS2R10 in der oberen Hälfte des zum extrazellulären Raum gerichteten Bereichs lokalisiert ist. Insbesondere konnte für die untersuchten Agonisten Strychnin, Parthenolid und Denatoniumbenzoat gezeigt werden, dass die Seitenketten der Aminosäuren in Position 3.29 und 5.40 ausgeprägte agonistenselektive Wechselwirkungen eingehen. Weitere Untersuchungen haben ergeben, dass das weitgefächerte Agonistenspektrum des hTAS2R10 zu Lasten der Sensitivität für einzelne Bitterstoffe geht. Der Vergleich wichtiger Positionen im hTAS2R10, hTAS2R46 und mTas2r105 hat deutlich gemacht, dass sich die Bindungsmodi zwischen diesen Rezeptoren unterscheiden. Dies deutet auf eine getrennte evolutionäre Entwicklung der Bindungseigenschaften dieser Rezeptoren hin. Gleichfalls zeigten die Untersuchungen, dass einige Positionen wie z.B. 7.39 die Funktion aller untersuchten Bittergeschmacksrezeptoren prägen, sich jedoch die genaue Bedeutung im jeweiligen Rezeptor unterscheiden kann. Einzelne dieser Positionen konnten auch bei der Agonisteninteraktion des Rhodopsins und des β2-adrenergen Rezeptors beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit helfen dabei die Wechselwirkungen zwischen Bitterstoffen und den Bittergeschmacksrezeptoren zu verstehen und geben erste Einblicke in die Entwicklung der Rezeptoren in Hinblick auf ihren Funktionsmechanismus. Diese Erkenntnisse können genutzt werden, um Inhibitoren zu entwickeln, die sowohl ein wichtiges Werkzeug in der Rezeptoranalytik wären, als auch dazu genutzt werden könnten, den unerwünschten bitteren Geschmack von Medikamenten oder gesundheitsfördernden sekundären Pflanzenstoffen zu mindern. Damit könnte ein Beitrag zur Gesundheit der Menschen geleistet werden. N2 - In the Superfamily of G protein-coupled receptors the bitter taste receptors form a notable group. The 25 human receptors are able to detect a large group of structurally diverse bitter compounds. These compounds can be toxic – like strychnine – or have beneficial effects on health – like the pharmacological agent chloramphenicol. Three of these bitter taste receptors show a strikingly broad agonist spectrum. One of them is the hTAS2R10. It was shown empirically and by computational modelling that the hTAS2R10 has only one binding pocket. This agrees with the findings of studies on the bitter taste receptors hTAS2R1, -R16, -R38 and -R46. The domains important for agonist interaction in these receptors, as well as in the hTAS2R10, are the transmembrane domains 3, 5, 6 and 7. The results of this thesis show that the binding pocket of the hTAS210 is located in the upper part of the receptor which points into the direction of the extracellular area. Interestingly, it has been shown for the amino acid side chains in the positions 3.29 and 5.40, that they can interact with the analysed agonists strychnine, parthenolide and denatonium benzoate in an agonist-selective way. Further analyses showed that the broad tuning of the hTAS2R10 goes at the expense of the sensitivity to single agonists. The comparison of crucial positions in the hTAS2R10, hTAS2R46 and the mTas2r105 reveal that these receptors differ in their binding mode. These could be evidence that the binding abilities of these receptors evolved independently. However, the results show that some positions, e.g. 7.39, influence the receptor activity in all analysed receptors, but the function of these positions in the receptors could be different. Some of these positions also have an influence on the agonist-receptor interaction of Rhodopsin and the β2-adrenergic receptor. The findings in this thesis contribute to the knowledge about interaction between bitter receptors and bitter compounds. The results also provide insight into the evolvement of receptor functions. These outcomes can be of use for the development of inhibitors which could serve as analytical tools in taste research. Furthermore, such inhibitors could be used to reduce the bitter taste of medicine and healthy plant compounds and thus increase palatability. This could contribute to improve human well-being. KW - Bittergeschmack KW - hTAS2R10 KW - Geschmack KW - Agonisteninteraktion KW - Homologiemodellierung KW - taste KW - hTAS2R10 KW - homology modelling KW - agonists interaction KW - bitter taste Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-61392 ER - TY - THES A1 - Lettau, Kristian T1 - Katalytische molekular geprägte Polymere : Herstellung und Anwendung in einem Thermistor T1 - Catalytically molecular imprinted polymers : synthesis and application in a thermistor N2 - Biomakromoleküle sind in der Natur für viele Abläufe in lebenden Organismen verantwortlich. Dies reicht vom Aufbau der extrazellulären Matrix und dem Cytoskelett über die Erkennung von Botenstoffen durch Rezeptoren bis hin zur Katalyse der verschiedensten Reaktionen in den Zellen selbst. Diese Aufgaben werden zum größten Teil von Proteinen übernommen, und besonders das spezifische Erkennen der Interaktionspartner ist für alle diese Moleküle äußerst wichtig, um eine fehlerfreie Funktion zu gewährleisten. Als Alternative zur evolutiven Erzeugung von optimalen Bindern und Katalysatoren auf der Basis von Aminosäuren und Nukleotiden wurden von Wulff, Shea und Mosbach synthetische molekular geprägte Polymere (molecularly imprinted polymers, MIPs) konzipiert. Das Prinzip dieser künstlichen Erkennungselemente beruht auf der Tatsache, dass sich funktionelle Monomere spezifisch um eine Schablone (Templat) anordnen. Werden diese Monomere dann vernetzend polymerisiert, entsteht ein Polymer mit molekularen Kavitäten, in denen die Funktionalitäten komplementär zum Templat fixiert sind. Dadurch ist die selektive Bindung des Templats in diese Kavitäten möglich. Aufgrund ihrer hohen chemischen und thermischen Stabilität und ihrer geringen Kosten haben “bio-inspirierte” molekular geprägte Polymere das Potential, biologische Erkennungselemente in der Affinitätschromatographie sowie in Biosensoren und Biochips zu ersetzen. Trotz einiger publizierter Sensorkonfigurationen steht der große Durchbruch noch aus. Ein Hindernis für Routineanwendungen ist die Signalgenerierung bei Bindung des Analyten an das Polymer. Eine Möglichkeit für die markerfreie Detektion ist die Benutzung von Kalorimetern, die Bindungs- oder Reaktionswärmen direkt messen können. In der Enzymtechnologie wird der Enzym-Thermistor für diesen Zweck eingesetzt, da enzymatische Reaktionen eine Enthalpie in einer Größenordnung von 5 – 100 kJ/mol besitzen. In dieser Arbeit wird die Herstellung von katalytisch geprägten Polymeren nach dem Verfahren des Oberflächenprägens erstmalig beschrieben. Die Methode zur Immobilisierung des Templats auf der Oberfläche von porösem Kieselgel sowie die Polymerzusammensetzung wurden optimiert. Weiter wird die Evaluation der katalytischen Eigenschaften über einen optischen Test, sowie das erste Mal die Kombination eines kalorimetrischen Transduktors – des Thermistors – mit der Analyterkennung durch ein katalytisch aktives MIP gezeigt. Bei diesen Messungen konnte zum ersten Mal gleichzeitig die Bindung/Desorption, sowie die katalytische Umwandlung des Substrats durch konzentrationsabhängige Wärmesignale nachgewiesen werden. N2 - Bio macromolecules are responsible in nature for many reactions in living organisms. This reaches from the structure of the extra cellular matrix and the cytoskeleton over the recognition of ligands by receptors up to the catalysis of the most diverse reactions in the cells themselves. These tasks are taken over to the largest part by proteins, and particularly specific recognizing of the interaction partners is extremely important for all these molecules, in order to ensure an error free function. As alternative to the evolutionary production of optimal binders and catalysts on the basis of amino acids and nucleotides, synthetic molecularly imprinted polymer (MIPs) were invented by Wulff, Shea and Moosbach. The principle of these artificial recognition elements is based on the fact that functional monomers specifically arrange themselves around a template. If these monomers are copolymerized with crosslinking monomers, a polymer with molecular cavities is created, in which the functionalities are fixed complementary to the template. Thus the selective binding of the template is possible into these cavities. Due to their high chemical and thermal stability and their small costs "bioinspired" molecularly imprinted polymers have the potential to replace biological recognition elements in affinity chromatography as well as in biosensors and biochips. Despite some published sensor configurations the large break-through is still pending. An obstacle for routine application of is the signal generation on connection of the analyte to the polymer. A possibility for marker-free detection is the use of calorimeters, which can measure heats of reaction or adsorption directly. In enzyme technology the enzyme thermistor is used for this purpose, as enzymatic reactions possess enthalpies in an order of 5 - 100 kJ/mol. In this work the production of catalytically imprinted polymers is described for the first time by the procedure of surface imprinting. The method for immobilization of the template on the surface of porous silicagel as well as the polymer composition were optimized. The evaluation of the catalytic characteristics is shown by an optical test, as well as the first time the combination of a calorimetric transducer - the thermistor - with the analyte recognition by a catalytically active MIP. With these measurements for the first time the binding/desorption, as well as the catalytic transformation of the substrate could be proven at the same time by concentration-dependent heat signals. KW - Katalyse KW - molekular geprägte Polymere KW - Kalorimetrie KW - Enzymmodelle KW - Biosensoren KW - catalysis KW - molecularly imprinted polymers KW - calorimetry KW - enzyme models KW - biosensors Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-14804 ER - TY - THES A1 - Troppmann, Britta T1 - Klonierung und Charakterisierung aminerger Rezeptoren der Amerikanischen Schabe Periplaneta americana T1 - Characterization of biogenic amine receptors of the american cockroach Periplaneta americana N2 - Biogene Amine sind kleine organische Verbindungen, die sowohl bei Vertebraten als auch bei Invertebraten als Neurotransmitter, Neuromodulatoren und/oder Neurohormone wirken. Sie bilden eine bedeutende Gruppe von Botenstoffen und entfalten ihre Wirkungen vornehmlich über die Bindung an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Bei Insekten wurde eine Vielzahl von Wirkungen biogener Amine beschrieben. Das führte schon frühzeitig zur Vermutung, dass Insekten (u. a. Invertebraten) wie die Wirbeltiere ein diverses Repertoire an aminergen Rezeptoren besitzen. Für ein umfassendes Verständnis der komplexen physiologischen Wirkungen biogener Amine fehlten jedoch wichtige Informationen über die molekulare Identität der entsprechenden Rezeptorproteine und ihrer pharmakologischen Eigenschaften, ihre Lokalisation und ihre intrazellulären Reaktionspartner. Viele bei Schaben gut untersuchte (neuro)physiologische Prozesse sowie Verhaltensweisen werden durch Serotonin und Dopamin gesteuert bzw. moduliert. Über die beteiligten Rezeptoren ist jedoch bisher vergleichsweise wenig bekannt. Die Klonierung und Charakterisierung von Serotonin- und Dopaminrezeptoren der Amerikanischen Schabe P. americana ist damit ein längst überfälliger Schritt auf dem Weg zu einem umfassenden Verständnis der vielfältigen Wirkungen biogener Amine bei Insekten. Durch die Anwendung verschiedener Klonierungsstrategien konnten cDNAs isoliert werden, die für potentielle Serotoninrezeptoren und einen Dopaminrezeptor kodieren. Die Sequenzen weisen die größte Ähnlichkeit zu Mitgliedern der 5-HT1- und 5-HT7-Rezeptorklassen bzw. den Invertebratentyp-Dopaminrezeptoren auf. Die isolierten Rezeptoren der Amerikanischen Schabe wurden dementsprechend Pea(Periplaneta americana)5-HT1, Pea5-HT7 und PeaDop2 benannt. Das Hydropathieprofil dieser Rezeptoren postuliert das Vorhandensein der charakteristischen heptahelikalen Architektur G-Protein-gekoppelter Rezeptoren. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigen typische Merkmale aminerger Rezeptoren. So sind Aminosäuren, die bedeutend für die Ligandenbindung, die Rezeptoraktivierung und die Kopplung an G﷓Proteine sind, in den Rezeptoren konserviert. Expressionsstudien zeigten eine auffallend hohe Expression aller drei Rezeptor-mRNAs im Gehirn sowie in den Speicheldrüsen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden polyklonale Antikörper gegen den Pea5-HT1-Rezeptor sowie den PeaDop2-Rezeptor hergestellt. Der anti-Pea5-HT1-Antikörper detektiert im Homogenat von Schabengehirnen, Speicheldrüsen und Pea5-HT1-exprimierenden HEK 293-Zellen die glykosylierte Form des Rezeptors. In Gehirnschnitten markiert der anti-Pea5-HT1-Antikörper spezifisch einige Zellkörper in der Pars intercerebralis und deren Axone, welche in den Corpora cardiaca Nerv I projizieren. Der PeaDop2-Rezeptor wurde durch den spezifischen anti-PeaDop2-Antikörper in Neuronen mit Somata im anterioren Randbereich der Medulla nachgewiesen. Diese Neurone innervieren die optischen Loben und projizieren in das ventrolaterale Protocerebrum. Die intrazellulären Signalwege der heterolog exprimierten Pea5-HT1- und PeaDop2-Rezeptoren wurden in HEK 293-Zellen untersucht. Die Aktivierung des Pea5-HT1-Rezeptors durch Serotonin führt zur Hemmung der cAMP-Synthese. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der Rezeptor konstitutive Aktivität besitzt. WAY 100635, ein hoch selektiver 5-HT1A-Rezeptorantagonist, wurde als wirksamer inverser Agonist am Pea5-HT1-Rezeptor identifiziert. Der stabil exprimierte PeaDop2-Rezeptor antwortet auf eine Aktivierung durch Dopamin mit einer Erhöhung der cAMP-Konzentration. Eine C-terminal trunkierte Variante dieses Rezeptors ist eigenständig nicht funktional. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit indizieren, dass die untersuchten aminergen Rezeptoren im zentralen Nervensystems der Schabe an der Informationsverarbeitung beteiligt sind und verschiedene physiologische Prozesse in peripheren Organen regulieren. Mit der Klonierung und funktionellen Charakterisierung der ersten Serotoninrezeptoren und eines Dopaminrezeptors ist damit eine wichtige Grundlage für die Untersuchung ihrer Funktionen geschaffen worden. N2 - Biogenic amines are small organic compounds that act as neurotransmitters, neuromodulators and/or neurohormones in vertebrates and in invertebrates. They form an important group of messenger substances and mediate their diverse effects primarily by binding to G protein-coupled receptors. The molecular identification as well as the functional and pharmacological characterization of these receptors is crucial for the comprehension of the intracellular signaling pathways activated by biogenic amines. This work describes the molecular and functional characterization of the first serotonin receptors and an invertebrate-type dopamine receptor of the American cockroach, Periplaneta americana. Using a PCR-strategy based on degenerate primers and RACE-PCR three cDNAs encoding for putative biogenic amine receptors were isolated from P. americana brain cDNA (Pea5-ht1, Pea5-ht7, Peadop2). The deduced amino acid sequences display major characteristics common to all G protein-coupled receptors. Primarily Distribution of receptor mRNA was investigated by RT-PCR. The analysis revealed a high mRNA expression level for all three receptors in the brain and salivary glands. The distribution of the Pea5﷓HT1 and PeaDop2 receptor proteins was analyzed by immunohistochemistry with specific affinity-purified polyclonal antibodies. Both receptor proteins are expressed in brain and salivary glands. Furthermore the cellular distribution of the receptors was investigated by immunocytochemistry on brain sections. The anti-Pea5-HT1 receptor antibody specifically labelled some large somata in the pars intercerebralis. Labeled axons of these neurons pass down the anterior surface of the brain and cross over in the chiasma region of the corpora cardiaca nerve 1. The PeaDop2 receptor was detected in neurons with somata at the anterior edge of the medulla bilaterally innervating the optic lobes and projecting to the ventro-lateral protocerebrum. In order to clarify the functional and pharmacological properties of the cloned receptors, we studied HEK 293 cell lines stably expressing Pea5-HT1 or PeaDop2. Activation of Pea5-HT1 expressing cells by serotonin reduced adenylyl cyclase activity in a dose-dependent manner. The Pea5-HT1 receptor was expressed as a constitutively active receptor with methiothepin acting as a neutral antagonist and WAY 100635 as an inverse agonist. The activation of the PeaDop2 receptor by dopamine induced an increase in intracellular cAMP level, whereas a C-terminally truncated splice variant of this receptor does not exhibit any functional property by itself. The results of this work suggest important roles of the investigated receptors in various areas of the cockroach brain. The molecular and pharmacological characterization of the first serotonin receptors and a dopamine receptor of the cockroach now provides the basis for forthcoming studies regarding the significance of these particular receptors for cockroach behavior and physiology KW - Insekt KW - Dopamin KW - Serotonin KW - G-Protein-gekoppelte-Rezeptoren KW - insect KW - serotonin KW - dopamine KW - G-protein-coupled-receptors Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-36619 ER - TY - THES A1 - Barbirz, Stefanie T1 - Konservierte Struktur bei genetischer Mosaizität : die Tailspike Proteine dreier Phagen der Familie Podviridae T1 - Tailspike proteins of three Podoviridae : genetic mosaics with conserved hreedimensional structure N2 - Die Tailspike Proteine (TSP) der Bakteriophagen P22, Sf6 und HK620 dienen der Erkennung von Kohlenhydratstrukturen auf ihren gram-negativen Wirtsbakterien und zeigen, von den ersten 110 Aminosäuren des N-Terminus abgesehen, keine Sequenzübereinstimmung. Mit Röntgenkristallstrukturanalyse konnte gezeigt werden, dass HK620TSP und Sf6TSP ebenfalls zu einer parallelen, rechtsgängigen beta-Helix falten, wie dies schon für P22TSP bekannt war. Die Kohlenhydratbindestelle ist bei Sf6TSP im Vergleich zu P22TSP zwischen die Untereinheiten verschoben. N2 - The bacteriophages P22, Sf6 and HK620 need their tailspike proteins (TSP) for recognition of surface carbohydrates on their gram-negative host bacteria. Sequence identity is completely lacking in their C-terminal 500 to 600 amino acids. The three TSP have the same fold, an oligomeric parallel beta-helix, as shown by crystal structure analyses of HK620TSP and Sf6TSP. Compared with P22TSP, the carbohydrate binding site of Sf6TSP is located at the interface between two monomers and not on a single monomer. KW - Bakteriophagen KW - Skleroproteine KW - Helix KW - Lipopolysaccharide KW - parallele beta-Helix KW - genetisches Mosaik KW - Tailspike KW - Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkung KW - parallel beta-helix KW - genetic mosaicism KW - tailspike KW - carbohydrate binding site Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-6885 ER - TY - THES A1 - Dobbernack, Gisela T1 - Konstruktion und Charakterisierung transgener Mauslinien für humane Sulfotransferasen als Modellsysteme für eine SULT-vermittelte metabolische Aktivierung T1 - Construction and characterisation of transgenic mouse lines for human sulfotransferases as model systems for a SULT-mediated metabolic activation N2 - Die Enzyme der Sulfotransferase-Gensuperfamilie (SULT) konjugieren nukleophile Gruppen von kleinen endogenen Verbindungen und Fremdstoffen mit der negativ geladenen Sulfo-Gruppe. Dadurch wird die Polarität dieser Verbindungen erhöht, ihre passive Permeation von Zellmembranen verhindert und somit ihre Ausscheidung erleichtert. Jedoch stellt die Sulfo-Gruppe in bestimmten chemischen Verbindungen eine gute Abgangsgruppen dar. Aus der Spaltung resultierende Carbenium- oder Nitreniumionen können mit DNA oder anderen zellulären Nukleophilen reagieren. In Testsystemen für Mutagenität wurden zahlreiche Verbindungen, darunter Nahrungsinhaltsstoffe und Umweltkontaminanten, durch SULT zu Mutagenen aktiviert. Dabei zeigten sich zum einen eine ausgeprägte Substratspezifität selbst orthologer SULT-Formen unterschiedlicher Spezies und zum anderen Interspezies-Unterschiede in der SULT-Gewebeverteilung. Daher könnten sich die Zielgewebe einer SULT-induzierten Krebsentstehung bei Mensch und Nager unterscheiden. Um die Beteiligung von humanen SULT an der Bioaktivierung von Fremdstoffen im Tiermodell untersuchen zu können, wurden transgene Mauslinien für den Cluster der humanen SULT1A1- und -1A2-Gene sowie für die humane SULT1B1 generiert. Zur Herstellung der transgenen Linien wurden große genomische Konstrukte verwendet, die die SULT-Gene sowie – zum Erreichen einer der Humansituation entsprechenden Gewebeverteilung der Proteinexpression – deren potentielle regulatorische Sequenzen enthielten. Es wurden je drei transgene Linien für hSULT1A1/hSULT1A2 und drei transgene Linien für hSULT1B1 etabliert. Die Expression der humanen Proteine konnte in allen Linien gezeigt werden und fünf der sechs Linien konnten zur Homozygotie bezüglich der Transgene gezüchtet werden. In der molekularbiologischen Charakterisierung der transgenen Linien wurde der chromosomale Integrationsort der Konstrukte bestimmt und die Kopienzahl pro Genom untersucht. Mit Ausnahme einer hSULT1A1/hSULT1A2-transgenen Linie, bei der Kopien des Konstrukts in zwei unterschiedliche Chromosomen integriert vorliegen, wiesen alle Linien nur einen Transgen-Integrationsort auf. Die Untersuchung der Transgen-Kopienzahl ergab, dass die Mauslinien zwischen einer und etwa 20 Kopien des Transgen-Konstrukts pro Genom trugen. In der proteinbiochemischen Charakterisierung wurde gezeigt, dass die transgenen Linien die humanen Proteine mit einer weitgehend der des Menschen entsprechenden Gewebeverteilung exprimieren. Die Intensität der im Immunblot nachgewiesenen Expression korrelierte mit der Kopienzahl der Transgene. Die zelluläre und subzelluläre Verteilung der Transgen-Expression wurden bei einer der hSULT1A1/hSULT1A2-transgenen Linien in Leber, Niere, Lunge, Pankreas, Dünndarm und Kolon und bei einer der hSULT1B1-transgenen Linien im Kolon untersucht. Sie stimmte ebenfalls mit der Verteilung der entsprechenden SULT-Formen im Menschen überein. Da sich die erzeugten transgenen Linien aufgrund ihrer mit dem Menschen vergleichbaren Gewebeverteilung der SULT-Expression als Modellsystem zur Untersuchung der menschlichen SULT-vermittelten metabolischen Aktivierung eigneten, wurde eine der hSULT1A1/hSULT1A2-transgenen Linien für zwei erste toxikologische Untersuchungen eingesetzt. Den Mäusen wurden chemische Verbindungen verabreicht, für die in in-vitro-Versuchen eine hSULT1A1/hSULT1A2-vermittelte Bioaktivierung zu Mutagenen gezeigt worden war. In beiden Untersuchungen wurde die Gewebeverteilung der entstandenen DNA-Addukte als Endpunkt einer gewebespezifischen genotoxischen Wirkung ermittelt. In der ersten Untersuchung wurden 90 mg/kg Körpergewicht 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridin – ein in gebratenem Fleisch gebildetes heterozyklisches aromatisches Amin – transgenen sowie Wildtyp-Mäusen oral verabreicht. Acht Stunden nach Applikation wiesen die transgenen Mäuse signifikant höhere Adduktniveaus als die Wildtyp-Mäuse in Leber, Lunge, Niere, Milz und Kolon auf. In der Leber der transgen Mäuse war das Adduktniveau 17fach höher als in der Leber der Wildtyp-Mäuse. Die Leber war bei den transgenen Tieren das Organ mit dem höchsten, bei den Wildtyp-Tieren hingegen mit dem niedrigsten DNA-Adduktniveau. In der zweiten Untersuchung (Pilotstudie mit geringer Tierzahl) wurde transgenen und Wildtyp-Mäusen 19 mg/kg Körpergewicht des polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffs 1-Hydroxymethylpyren – ein Metabolit der Nahrungs- und Umweltkontaminante 1-Methylpyren – intraperitoneal verabreicht. Nach 30 Minuten wurden, verglichen mit den Wildtyp-Mäusen, bis zu 25fach erhöhte Adduktniveaus bei den transgenen Mäusen in Leber, Niere, Lunge und Jejunum nachgewiesen. Somit konnte anhand einer in dieser Arbeit generierten transgenen Mauslinie erstmals gezeigt werden, dass die Expression der humanen SULT1A1/hSULT1A2 tatsächlich sowohl auf die Stärke als auch die Zielgewebe der DNA-Adduktbildung in vivo eine Auswirkung hat. N2 - The enzymes of the sulfotransferase gene superfamily (SULT) conjugate nucleophilic groups of small endogenous compounds and xenobiotics with the negatively charged sulfo group. Thus, the polarity of the compounds is increased, their passive permeation of cell membranes is hindered and their excretion facilitated. The sulfate groups, however, form a good leaving group in certain chemical linkages due to their electron-withdrawing characteristics. Carbenium or nitrenium ions resulting from a spontaneous cleavage may react with DNA and other cellular nucleophiles. In test systems for mutagenicity, a large amount of compounds including ingredients of nutrition and environmental contaminants were activated to mutagens by SULT. A pronounced substrate specificity even of orthologous SULT forms of different species was evidenced. Also, the tissue distribution of SULT exhibited pronounced interspecies differences. The target tissues of a SULT induced carcinogenesis might thus be different in humans and rodents. To investigate the involvement of human SULT in the bioactivation of xenobiotics in an animal model, transgenic mouse lines for the human SULT1A1- and -1A2 gene cluster as well as for human SULT1B1 were generated. For the construction of the transgenic lines, large genomic constructs were used, containing the SULT genes plus their potential regulatory sequences to cause a tissue distribution of protein expression corresponding to the situation in humans. Three transgenic lines for hSULT1A1/hSULT1A2 and three transgenic lines for hSULT1B1 were established. The expression of the human proteins could be shown for all lines and except for one line, all could be bred to transgene homozygosity. By molecular biological characterization of the transgenic lines, the chromosomal integration locus of the constructs was identified and the copy number per genome was investigated. With the exception of one hSULT1A1/hSULT1A2 transgenic line, where the construct had integrated into two different chromosomes, all lines exhibited just one transgene integration locus. By investigating the transgene copy number it was deduced that the mouse lines carry between one and 20 copies of the transgene construct per genome. The protein biochemical characterization showed that the transgenic mouse lines express the human proteins with a tissue distribution largely similar to the distribution in humans. The intensity of the proteins detected by immunoblotting correlated with the copy number of the transgenes. The cellular and subcellular distribution of the transgene expression was investigated for one of the hSULT1A1/1A2 transgenic lines in liver, kidney, lung, pancreas, small intestine and colon and for one of the hSULT1B1 transgenic lines in colon. It also accorded with the distribution of the respective SULT in humans. Owing to the similarity of transgene expression to the corresponding human tissue distribution, the transgenic lines were considered suitable as model systems for the investigation of the human SULT-mediated metabolic activation. One of the hSULT1A1/hSULT1A2 transgenic lines was used in two first toxicological investigations with chemical compounds for which in vitro experiments had demonstrated a hSULT1A1/hSULT1A2 mediated bioactivation. In both investigations, the tissue distribution of the resulting DNA adducts was determined as an end point for a tissue-specific genotoxic effect. For the first investigation, 90 mg/kg bodyweight of 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine – a heterocyclic amine formed in cooked meat – were orally administered to transgenic and wild type mice. Eight hours after application, the transgenic mice exhibited significantly higher adduct levels than the wild type controls in liver, lung, kidney, spleen and colon. The adduct level in the liver of the transgenic mice exceeded that in the wild type liver by a factor of 17. Furthermore, the liver was the organ with the highest adduct level in the transgenic mice and with the lowest adduct level in the wild type mice. For the second investigation (a pilot study with few animals), 19 mg/kg bodyweight of the polycyclic aromatic hydrocarbon 1-hydroxymethylpyrene – a metabolite of the nutritional and environmental contaminant 1-methylpyrene – were administered intraperitoneally to transgenic and wild type mice. After 30 minutes, up to 25 fold higher adduct levels compared to the wild type were detected in liver, kidney, lung and jejunum of the transgenic mice. Thus, by means of one of the transgenic mouse line generated in this thesis, it could be shown for the first time that the expression of human SULT1A1/SULT1A2 has in fact an impact on the strength as well as on the target tissue of DNA-adduct generation in vivo. KW - transgenes Mausmodell KW - Sulfotransferasen SULT1A1 und SULT1A2 KW - SULT1B1 KW - PhIP KW - heterozyklisches aromatisches Amin KW - transgenic mouse model KW - sulfotransferases SULT1A1 and SULT1A2 KW - SULT1B1 KW - PhIP KW - heterocyclic aromatic amine Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-30447 ER - TY - THES A1 - Wend, Korinna T1 - Konstruktion und toxikologische Nutzung von transgenen Mäusen mit den allelischen Varianten von humanen SULT1A-Genen T1 - Construction and characterisation of transgenic mice for human sulfotransferases with polymorphic SULT1A genes N2 - Eine besondere Rolle im Fremdstoffmetabolismus hat die SULT1A1 beim Menschen aufgrund der hohen Expression und breiten Gewebeverteilung. Während die humane SULT1A1 in sehr vielen Geweben exprimiert wird, wurde die murine SULT1A1 vor allem in der Leber, Lunge und Colon gefunden. Neben der Gewebeverteilung spielt auch der Polymorphismus im humanen SULT1A1-Gen eine bedeutende Rolle. Der häufigste Polymorphismus in diesem Gen führt zu einer Aminosäuresubstitution von Arginin zu Histidin an Position 213. Die Genvariante mit Histidin (auch als SULT1A1*2 bezeichnet) codiert für ein Protein mit einer geringen Enzymaktivität und einer reduzierten Enzymmenge in Thrombocyten. Über den Einfluss dieser allelischen Varianten in anderen Geweben ist bislang wenig bekannt. In vorausgegangenen epidemiologischen Studien wurden mögliche Korrelationen zwischen den Genvarianten und der Krebsentstehung in verschiedenen Geweben untersucht. Diese Daten liefern jedoch widersprüchliche Ergebnisse zum Krebsrisiko. Aufgrund der strittigen epidemiologischen Daten sollten Tiermodelle generiert werden, um die häufigsten SULT1A1-Allele hinsichtlich der Empfindlichkeit gegenüber Nahrungs- und Umweltkanzerogenen zu untersuchen. Zur Erzeugung transgener (tg) Mauslinien wurde mittels Mikroinjektion der codierenden Genbereich und große flankierende Humansequenzen stromaufwärts und stromabwärts in das Mausgenom integriert. Es wurden mehrere Mauslinien hergestellt. Zwei davon, die Mauslinie 31 mit dem SULT1A1*1-Allel und die Mauslinie 28 mit dem SULT1A1*2-Allel, wurden eingehend analysiert. In beiden Linien wurde eine identische Kopienzahl des Transgens ermittelt. Proteinbiochemische Charakterisierungen zeigten eine weitgehend dem Menschen entsprechende Gewebeverteilung und zelluläre und subzelluläre Lokalisation der humanen SULT1A1 in der Linie (Li) 28. In Li 31 wurden Unterschiede zu Li 28 sowohl in der Gewebeverteilung als auch in der zellulären Lokalisation des exprimierten humanen Proteins ermittelt. Dabei war die Expression auf Proteinebene in der SULT1A1*2-tg Linie generell stärker als in der SULT1A1*1-Linie. Dieses Ergebnis war überraschend, denn in humanen Thrombocyten führt das SULT1A1*1-Allel zu einem höheren Gehalt an SULT1A1-Protein als das SULT1A1*2-Allel. Zur Analyse der unterschiedlichen Proteinexpressionen in den tg Mauslinien wurde die cDNA und der 5´-flankierende Bereich des SULT1A1-Gens sequenziert. In beiden tg Linien entsprach die Sequenz der cDNA der Referenzsequenz aus der Gendatenbank (Pubmed). In der 5´-flankierenden Region wurden bekannte Polymorphismen analysiert und unterschiedliche Haplotypen in den tg Linien an den Positionen -624 und -396 ermittelt. Dabei wurde in der Li 31 der Haplotyp detektiert, der in der Literatur mit einer höheren SULT1A1-Enzymaktivität beschrieben wird. Der mögliche Zusammenhang zwischen Transkriptionsrate und Proteinexpression wurde in RNA-Expressionsanalysen im codierenden und 5´-nicht codierenden Bereich (mit den alternativen Exons 1B und 1A) untersucht. Im codierenden Bereich und im Exon 1B konnte in den untersuchten Organen eine höhere RNA-Expression in der Li 28 im Vergleich zur Li 31 ermittelt werden. Außer in der Lunge wurde für Exon 1B eine identische RNA-Expression detektiert. RNA, die Exon 1A enthielt, wurde in allen untersuchten Organen der Li 28, aber nur in der Lunge bei der Li 31 gefunden. In beiden tg Linien konnten mit den Exon 1A-Primern jedoch auch größere PCR-Produkte ermittelt werden. Dieser Unterschied im Exon 1A und mögliche Spleißvarianten könnten damit für die unterschiedliche Proteinexpression des humanen SULT1A1-Proteins in den beiden tg Mauslinien sein. Die in dieser Arbeit generierten und charakterisierten tg Mausmodelle wurden in einer toxikologischen Studie eingesetzt. Es wurde das heterozyklische aromatische Amin 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo-[4,5-b]pyridin (PhIP) verwendet. PhIP wird beim Erhitzen und Braten von Fleisch und Fisch gebildet und könnte mit der erhöhten Krebsentstehung im Colon in der westlichen Welt im Zusammenhang stehen. Mittels 32P-Postlabelling sollte der Einfluss der zusätzlichen Expression der humanen SULT-Proteine auf die PhIP-DNA-Adduktbildung analysiert werden. Dabei wurden mehr DNA-Addukte in den tg Tieren als in den Wildtyp-Mäusen ermittelt. Die Konzentration der gebildeten DNA-Addukte korrelierte mit der Expressionsstärke des humanen SULT1A1-Proteins in den tg Mäusen. An den in dieser Arbeit generierten tg Mauslinien mit den häufigsten allelischen Varianten des SULT1A1-Gens konnten Unterschiede auf RNA- und Protein-Ebene ermittelt werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Expression der humanen SULT1A1 eine Auswirkung sowohl auf die Stärke als auch das Zielgewebe der DNA-Adduktbildung in vivo hat. N2 - In humans, SULT1A1 and its polymorphic variants play an important role in xenobiotic metabolism and display a broad tissue distribution and high expression level. This enzyme is expressed in almost every human organ whereas in mice SULT1A1 can only be detected in liver, lung and colon. The most common polymorphism of this gene leads to an amino acid substitution from arginine to histidine at the position 213. In platelets, the allele encoding histidine (also designated as SULT1A1*2) is associated with both low activity and low thermal stability of the SULT protein. However, so far only little is known about the significance of these allelic variants in the other tissues with hSULT1A1 expression. Previous epidemiological studies have made attempts to correlate SULT1A1 allelic variants and cancer development, their data, however, have been contradictory for an appropriate cancer risk assessment. In this thesis, we addressed the effect of the hSULT1A1 genetic variability on the susceptibility to nutritional and environmental carcinogens using transgenic (tg) mouse models. We generated tg mice carrying the most common allelic variants of the human SULT1A1 gene. The coding region and large flanking human sequences upstream and downstream of the hSULT1A1 gene were integrated randomly into the mouse genome by microinjection. Several tg mouse lines were generated. Two of them, line (li) 31 with the SULT1A1*1 allele and li 28 with the SULT1A1*2 allele, were analysed in detail. At first, an identical transgene copy number was detected in both lines. Furthermore, biochemical characterization of li 28 showed that the tissue distribution, the cellular and subcellular localisation of the protein were very similar to those in humans. In contrast, li 31 exhibited differences in tissue distribution and cellular localisation of the human protein compared to li 28. The protein expression level in the tg line with SULT1A1*2 (li 28) was generally higher than in SULT1A1*1 (li 31) mice. These results were surprising since the SULT1A1*1 allele in human platelets usually leads to a higher amount of SULT1A1 protein compared to the SULT1A1*2 allele. To investigate these differences, we sequenced the cDNA and 5´-flanking region of the SULT1A1 gene. In both tg mouse lines, the cDNA sequence was identical to the reference sequence from the gene databank (Pubmed). We subsequently analysed the common polymorphisms of the 5´-flanking region, and determined different haplotypes at position -624 and -396 in the tg mouse lines. According to the literature, the haplotype associated with a higher SULT1A1 enzyme activity, we detected in li 31. We analyzed the possible correlation between gene transcription and protein expression by measuring RNA expression levels of the coding and the non-coding region (with alternative exons 1B and 1A). We detected a higher RNA expression level of the coding region and exon 1B in li 28 compared to li 31, whereas RNA for exon 1A was only found in li 28 in all investigated tissues, but only in lung in li 31. Furthermore we detected with exon 1A-primers larger RNA in both lines. These differences in exon 1A expression accompanied by potential splicing variants could be responsible for the different expression and activity of the human SULT1A1 protein in both tg mouse lines. In order to validate our generated and characterized tg mouse models as toxicological in vivo models, we used them for the evaluation of the heterocyclic aromatic amine 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo-[4,5-b]pyridine (PhIP). PhIP is typically generated during heating and roasting of meat and fish and is suggested to be associated with an increased colon cancer incidence in the western world. We measured the impact of the additionally expressed human SULT proteins on the PhIP-DNA adduct level by 32P-postlabelling. We detected significantly higher DNA adduct levels in tg compared to wildtype mice, which correlated positively with the expression pattern of the human SULT1A1 protein in the tg mice. In conclusion, in this thesis, we have successfully generated and validated the transgenic mouse lines carrying the most common allelic variants of the human SULT1A1 gene. Interestingly, these lines exhibited differences in both the SULT1A1 RNA and protein levels. Using these transgenic mouse models as in vivo toxicological tools we have shown that the expression of human SULT1A1 in mice has a decisive impact on the strength and the target tissue of DNA adducts. KW - transgenes Mausmodell KW - Polymorphismus KW - Sulfotransferase KW - SULT1A1 KW - SULT1A2 KW - PhIP KW - heterocyclisches aromatisches Amin KW - transgenic mousemodel KW - polymorphism KW - sulfotransferase KW - SULT1A1 KW - SULT1A2 KW - PhIP KW - heterocyclic aromatic amine Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-42052 ER - TY - THES A1 - Thalmann, Sophie T1 - Korrelation zwischen der genetischen und der funktionellen Diversität humaner Bitterrezeptoren T1 - Correlation between the genetic and the functional diversity of bitter receptors N2 - Der Mensch besitzt ~25 funktionelle Bitterrezeptoren (TAS2R), die für die Wahrnehmung potenziell toxischer Substanzen in der Nahrung verantwortlich sind. Aufgrund der großen genetischen Variabilität der TAS2R-Gene könnte es eine Vielzahl funktionell unterschiedlicher TAS2R-Haplotypen geben, die zu Unterschieden der Bitterwahrnehmung führen. Dies konnte bereits in funktionellen Analysen und sensorischen Studien für einzelne Bitterrezeptoren gezeigt werden. In dieser Arbeit wurden die häufigsten Haplotypen aller 25 Bitterrezeptoren verschiedener Ethnien funktionell charakterisiert. Das Ziel war eine umfassende Aussage über die funktionelle Diversität der TAS2Rs, die die molekulare Grundlage für individuelle Bitterwahrnehmung bildet, treffen zu können. Fehlende Varianten wurden aus genomischer DNA kloniert oder durch gezielte Mutagenese bereits vorhandener TAS2R-Konstrukte generiert. Die funktionelle Analyse erfolgte mittels Expression der TAS2R-Haplotypen in HEK293TG16gust44 Zellen und anschließenden Calcium-Imaging-Experimenten mit zwei bekannten Agonisten. Die Haplotypen der fünf orphanen TAS2Rs wurden mit über hundert Bitterstoffen stimuliert. Durch die gelungene Deorphanisierung des TAS2R41 in dieser Arbeit, wurden für die 21 aktivierbaren TAS2Rs 36 funktionell-unterschiedliche Haplotypen identifiziert. Die tatsächliche funktionelle Vielfalt blieb jedoch deutlich hinter der genetischen Variabilität der TAS2Rs zurück. Neun Bitterrezeptoren wiesen funktionell homogene Haplotypen auf oder besaßen nur eine weltweit vorherrschende Variante. Funktionell heterogene Haplotypen wurden für zwölf TAS2Rs identifiziert. Inaktive Varianten der Rezeptoren TAS2R9, TAS2R38 und TAS2R46 sollten die Wahrnehmung von Bitterstoffen wie Ofloxacin, Cnicin, Hydrocortison, Limonin, Parthenolid oder Strychnin beeinflussen. Unterschiedlich sensitive Varianten, besonders der Rezeptoren TAS2R47 und TAS2R49, sollten für Agonisten wie Absinthin, Amarogentin oder Cromolyn ebenfalls zu phänotypischen Unterschieden führen. Wie für den TAS2R16 bereits gezeigt, traten Haplotypen des funktionell heterogenen TAS2R7 und TAS2R41 ethnien-spezifisch auf, was auf lokale Anpassung und verschiedene Phänotypen hinweisen könnte. Weiterführend muss nun eine Analyse der funktionell-variablen TAS2Rs in sensorischen Tests erfolgen, um ihre phänotypische Relevanz zu prüfen. Die Analyse der funktionsmodulierenden Aminosäurepositionen, z.Bsp. des TAS2R44, TAS2R47 oder TAS2R49, könnte weiterführend zum besseren Verständnis der Rezeptor-Ligand- und Rezeptor-G-Protein-Interaktion beitragen. N2 - Bitter taste perception varies markedly from person to person, due to a high number of polymorphisms present in the 25 known functional bitter receptors (TAS2Rs). These polymorphisms lead to a number of haplotypes for each receptor, which are common in different populations, but vary in frequency. The individual combination of receptor variants seems to determine the person’s sensitivity of bitter perception, as could already be shown for single TAS2Rs. Bitter is an aversive taste quality, indicating the ingestion of harmful substances. Different sensitivity could have an impact on food choice. In order to characterize functional consequences of the genetic diversity, we performed calcium imaging experiments with all main haplotypes for the 25 bitter receptors. The obtained information about receptor properties enables us on the one hand to analyze structure-function relationships and on the other hand gives us the functional diverse candidates to focus on in psychophysical studies. The overall aim is to show genotype-phenotype correlation for bitter taste perception and their impact on food choice and therefore diet and health. Our first aim was to identify agonists for the 5 receptors, which could not be deorphaned in previous screens. We challenged all main haplotypes of these TAS2Rs with 106 bitter compounds and could identify the antibiotic chloramphenicol as agonist for bitter receptor TAS2R41. In total we identified 36 functionally different receptor variants of the 21 deorphaned TAS2Rs. Main haplotypes of nine TAS2Rs were functionally homogeneous while twelve TAS2Rs possessed between two and three functionally heterogeneous receptor variants. In summary the observed functional diversity is not as big as expected. Based on our in vitro findings the shown functional diversity of these twelve bitter receptors might be the molecular basis for individual differences in bitter taste perception and will be further analyzed in psychophysical studies. KW - Bittergeschmack KW - TAS2R KW - heterologe Expression KW - funktionelle Variabilität KW - bitter taste KW - TAS2R KW - heterologous expression KW - functional diversity Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-66845 ER - TY - THES A1 - Voigt, Andrea T1 - Körperbau, Gelenkbeweglichkeit und Handkräfte Erwachsener im Generationenvergleich T1 - Body type, joint flexibility and hand forces of adults in generation comparism N2 - Die ergonomische Anpassung von Produkten der körpernahen Umwelt an den menschlichen Körper in seiner gesamten Variabilität erfordert anthropometrische Grundlagen. Die vorliegende Arbeit beschreibt und analysiert die Körpermasse, 17 Längenmaße, 5 Skelettrobustizitätsmaße, 6 Korpulenzmaße, 3 Kopfmaße, 5 Handmaße, 3 Fußmaße, sowie 10 Beweglichkeitsmaße der Wirbelsäule, 8 Beweglichkeitsmaße der Hand, 2 Beweglichkeitsmaße des Beines und 7 Handkräfte von 295 Probanden der drei Altersgruppen 20 bis 29 Jahre, 50 bis 59 Jahre und 60 bis 69 Jahre. Die Untersuchungen wurden im Zeitraum von September 2006 bis April 2007 durchgeführt. Ziel der Arbeit ist es, für den überwiegenden Teil der untersuchten körperlichen Merkmale erstmals für die deutsche Bevölkerung geschlechts- und altersspezifische Mittelwerte und Variabilitätsbereiche bis zum vollendeten 70. Lebensjahr zur Verfügung zu stellen. Das gilt insbesondere für die untersuchten Beweglichkeitsmaße und Handkräfte. Erstmals werden Korrelationen zwischen der Körperform, wie sie sich im Maßzusammenhang der unterschiedlichen Körperbautypen darstellt, der Gelenkbeweglichkeit und den Handkräften vorgestellt. Darüber hinaus wird durch den Vergleich der Ergebnisse der jungen und der beiden älteren Erwachsenengruppen untersucht, welche Unterschiede zwischen den verschiedenen Altersgruppen bestehen. Im Hinblick auf die zeitliche Gültigkeit der aktuellen Untersuchungsergebnisse werden der Einfluss des säkularen Trends und der Einfluss der ontogenetischen Alternsprozesse auf Längenmaße und Korpulenzmaße diskutiert. Die Arbeit zeigt auf, dass innerhalb der untersuchten Probanden eine große Variationsbreite in den Körpermaßen auftritt. Es lassen sich typische Altersunterschiede erkennen. Die Älteren sind im Mittel kleiner, weisen jedoch größere Skelettrobustizitäts- und Korpulenzmaße auf. Die dynamischen Maße weisen auf eine geringere Beweglichkeit der Wirbelsäule, teilweise auch der Hand hin. Die Handkräfte der Frauen werden mit zunehmendem Alter geringer, bei den Männern sind die Älteren kräftiger als die jungen Erwachsenen. Die Ergebnisse deuten auf einen gegenüber früheren Generationen verzögerten Beginn von körperlichen Alterserscheinungen hin, der im Hinblick auf die steigende Lebenserwartung der Bevölkerung eingehender untersucht werden sollte. N2 - The ergonomic adaptation of products of the body close environment to the human body in its whole variability requires an anthropometric basis. The present work describes and analyses the body weight, 17 longitudinal, 5 skeletal and 6 corpulence dimensions of the human body, 3 head dimensions, 5 hand measurements, 3 foot measurements, as well as 10 measurements of the mobility of the spine, 8 mobility measurements of the hand, 2 mobility measurements of the leg and 7 hand forces of 295 test persons of the three age groups 20 to 29 years, 50 to 59 years and 60 to 69 years. The investigations were carried out in the period from September 2006 to April 2007 in Wolfsburg and Potsdam, Germany. The aim of the work is to make available averages and variability areas specific for age and specific for men and women up to the 70th birthday for the German population. This is valid in particular for the examined mobility measurements and hand forces. For the first time correlations are introduced between different body types and joint mobility and hand forces. In addition, it is examined by the comparison of the results of the young ones and both older adult's groups which differences exist between the examined age groups. With regard to the temporal validity of the investigation results the influence of the secular trend and the influence of the ontogenetic ageing processes on longitudinal and corpulence dimensions of the human body are discussed. The work indicates that within the examined test persons a big variation width appears in body measurements. Typical age differences exist. The older people are smaller on average, nevertheless, they show bigger skeletal and corpulence dimensions. The dynamic measurements point to a lower mobility of the spine, partially also of the hand. The hand forces of the women become lower with increasing age. In men the older test persons are stronger than the young adults. The results point to a delayed beginning of physical signs of ageing compared to former generations. KW - Anthropometrie KW - Handkraft KW - Gelenkbeweglichkeit KW - Säkulare Akzeleration KW - Metrik-Index KW - anthropometry KW - hand force KW - joint flexibility KW - secular acceleration KW - metric index Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-31217 ER - TY - THES A1 - Trippo, Ulrike T1 - Körperbau, Körperzusammensetzung und Ernährungsgewohnheiten bei Erwachsenen in Abhängigkeit von Alter und Geschlecht N2 - Die vorliegende Arbeit ist eine aktuelle Dokumentation von Körperbau, Körperzusammensetzung und Ernährungsgewohnheiten an 708 jüngeren und älteren Männern und Frauen aus dem Bundesland Brandenburg. Der Körperbau wurde über ein 42 Längen-, Breiten-, Tiefen- und Umfangsmaße umfassendes anthropometrisches Untersuchungsprogramm bestimmt. Die Einschätzung von Gesamtkörperfettanteil und Magermasse erfolgte mit zwei Feldmethoden, der Hautfaltendickenmessung und der bioelektrischen Impedanzanalyse. Mit Hilfe eines semiquantitativen Fragebogens zu den Ernährungsgewohnheiten wurde der Lebensmittelverzehr erfasst und daraus die Energie- und Nährstoffaufnahme berechnet. Die Ergebnisse zum Körperbau zeigen im Mittel eine Abnahme der Längenmaße, jedoch eine Zunahme der Breiten-, Tiefen- und Umfangsmaße mit steigendem Erwachsenenalter. Einfache Parameter zur Beurteilung des Ernährungszustandes, wie Körpermasse und Body-Mass-Index (BMI) nehmen im Alter geschlechtsspezifisch zu. Nach den Richtlinien der WHO für den BMI gelten 55,3% der untersuchten Männern als übergewichtig, davon 10% als adipös. Von allen untersuchten Frauen sind 41,6% übergewichtig, davon sind 14,3% adipös. Der Anteil der Übergewichtigen ist zwar beim weiblichen Geschlecht geringer, aber dafür haben mehr Frauen die Grenze zur Adipositas überschritten. Für eine wissenschaftlich exakte Beurteilung des Ernährungszustandes reichen Körpermasse und BMI nicht aus, da sie die Körperzusammensetzung nicht bzw. nicht genügend berücksichtigen. Die subkutane Fettschichtdicke nimmt insbesondere am Rumpf zu, was als zusätzliches Gesundheitsrisiko gilt. Der Gesamtkörperfettanteil steigt im Erwachsenenalter abhängig von der Berechnungsmethode an. Die untersuchten Frauen sind gegenüber den Männern in allen Altersgruppen durch einen etwa ein Drittel höheren Körperfettanteil gekennzeichnet. Die tägliche Nahrungsenergieaufnahme der untersuchten Personen lässt eine abnehmende Tendenz bis zum 65. Lebensjahr erkennen. Trotz einer sinkenden Nahrungsenergieaufnahme im Alter, nimmt der BMI zu. Mögliche Ursachen hierfür werden in der Arbeit diskutiert. Der Anteil der Grundnährstoffe an der Energiebereitstellung entspricht in keiner der untersuchten Gruppen den Empfehlungen der Deutschen Gesellschaft für Ernährung. Allgemein ist der Fettkonsum zu hoch und der Kohlenhydratanteil zu gering. Das zeigt sich besonders in den beiden mittleren untersuchten Altersgruppen und bei den Männern stärker als bei den Frauen. N2 - The objective of the present study was an analysis of body build, body composition and nutritional habits. 708 young and elderly men and women of Germany (Brandenburg) have been examined. The test persons underwent a detailed anthropometric examination encompassing 42 length, breadth, depth and circumference measurements. The total body fat and lean body mass were determined by means of two field methods - skinfold thickness measurements and bioelectrical impedance analysis. Dietary intake was assessed by a semiquantitative food frequency questionnaire. The results concerning body build show on average a decrease of length measurements, however, an increase of breadths, depths and circumferences during adult age. Simple parameters for estimation of nutritional status like Body mass and Body-Mass-Index (BMI) rise during adulthood clearly depending on sex. Following the BMI-recommendations of the WHO 55.3% of men investigated are overweight out of this 10% are adipose. From all women investigated 41.6% are overweight out of this 14.6% are obese or adipose. The portion of overweight persons is certainly lower in women but on the other hand women exceed more often the limit of adiposity. For a scientifically correct assessment of the nutritional status body mass and BMI are not sufficient because body composition is not included. Subcutaneous fat layer increases in particular at the trunk. This abdominal fat distribution is an additional health risk. Total body fat increases during adult age depending on the method used. Women show in all investigated age groups a significantly higher total body fat content compared with men (about one third more). During adulthood the energy intake in men and women tends to decrease more and more. Energy intake and BMI show an inverse trend: While energy intake decreases by age, the BMI rises. Possible reasons for that were discussed. Intake of basic nutrients does not meet the recommendations of the German Association of Nutrition. In general the intake of fat is too high and the intake of carbohydrates is too low. This can be especially seen in the two middle-aged groups investigated. In men this unhealthy trend is higher than in women. KW - Körperzusammensetzung KW - BMI KW - BIA KW - Anthropometrie KW - Ernährungsgewohnheiten KW - Ernährungszustand Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000306 ER - TY - THES A1 - Geißler, Katja T1 - Lebensstrategien seltener Stromtalpflanzen : autökologische Untersuchung von Cnidium dubium, Gratiola officinalis und Juncus atratus unter besonderer Berücksichtigung ihrer Stressresistenz T1 - Life strategies of rare river corridor plants : autecological investigation of Cnidium dubium, Gratiola officinalis and Juncus atratus with special consideration of their stress resistance N2 - Die vorliegende Dissertation behandelt die Ökologie von Cnidium dubium (Schkuhr) Thell. (Sumpf-Brenndolde), Gratiola officinalis L. (Gottes-Gnadenkraut) und Juncus atratus Krocker (Schwarze Binse), drei gefährdeten Arten, die als sogenannte Stromtalpflanzen in Mitteleuropa in ihrem Vorkommen eng an die Flussauen gebunden sind. Die Arbeit basiert auf verschiedenen Simulationsexperimenten und Feldstudien in der Unteren Havelniederung, einem „Feuchtgebiet von internationaler Bedeutung“. Sie behandelt Themenkomplexe wie das Samenbankverhalten, die Samenkeimung, die Stickstofflimitierung, die Konkurrenzkraft, das Verhalten der Pflanzen nach einer Sommertrockenheit und nach einer Winter/Frühjahrsüberflutung. Ferner widmet sie sich der Populationsbiologie der Arten und dem Verhalten der Pflanzen nach besonderen Störungsereignissen wie Mahd, Herbivorie und der Sommerflut 2002. Der Leser erfährt, wie die Pflanzen in verschiedenen Lebensphasen auf die auentypische Umwelt reagieren und erhält umfassende Einblicke in physiologische Mechanismen, die der Anpassung an die typischen Bedingungen einer mitteleuropäischen Flussaue dienen. Eine Interpretation der Ergebnisse zeigt auf, welche der spezifischen Eigenschaften zur Gefährdung der drei Stromtalarten beitragen. Die Arbeit ist für den Arten-, Biotop- und Landschaftsschutz interessant. Darüber hinaus bietet sie zahlreiche Anknüpfungspunkte zur ökophysiologischen Grundlagenforschung. Die verstärkte Nutzung physiologischer Methoden bei der Klärung ökologischer Fragestellungen wird angeregt. N2 - The thesis deals with the ecology of three endangered European river corridor angiosperms Cnidium dubium (Schkuhr) Thell., Gratiola officinalis L. und Juncus atratus Krocker. The study is based on different experimental approaches and field surveys in a wetland along the Lower Havel River, a designated German Ramsar-site (Wetland of International Importance). This involves the examination of aspects of seed bank dynamics, germination, nitrogen limitation, competitive ability, and the response of plants to summer drought and/or winter/spring flooding. The thesis continues with a detailed study of the population biology of the species at natural sites and the response of these plants to specific disturbances like mowing, herbivory and the severe summer flooding in 2002. The reader learns about the traits of the three plant species to tolerate the typical conditions their natural sites are exposed to in different phases of their life cycle. He gets a comprehensive look at physiological means by which plants can adapt to the prevailing conditions of European river lowlands. The interpretation of the results is used to reveal specific plant traits, which may contribute to the endangerment of the three river corridor plants. As such, this thesis is interesting for protection of species, biotopes and landscapes. Furthermore, it provides numerous close connections to fundamental research from an ecophysiological perspective. The increased use of physiological methods is recommended in order to be able to adequately resolve ecological problems. KW - untere Havelniederung KW - seltene Pflanzen KW - Stoffwechsel KW - Wachstum KW - Samen KW - Hypoxie KW - Trockenstress KW - Konkurrenz KW - Mahd KW - lower Havel river wetland KW - rare plants KW - metabolism KW - growth KW - seeds KW - hypoxia KW - drought stress KW - competition KW - mowing Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-17468 ER - TY - THES A1 - Schatz, Daniela T1 - LNA-clamp-PCR zum sensitiven Nachweis von Punktmutationen im Rahmen der Entwicklung eines Darmkrebsfrüherkennungstests T1 - LNA-clamp-PCR as a method for sensitive detection of point mutations as part of the development of an assay for the early diagnosis of colon cancer N2 - Darmkrebs ist die zweithäufigste malignombedingte Todesursache in den westlichen Industrieländern. Durch eine frühzeitige Diagnose besteht jedoch eine hohe Chance auf Heilung. Der Goldstandard zur Darmkrebsfrüherkennung ist gegenwärtig die Koloskopie. Eine Darmspiegelung ist jedoch invasiv und mit Unannehmlichkeiten für den Patienten verbunden. Die Akzeptanz in der Bevölkerung ist daher gering. Ziel des BMBF- Projektes „Entwicklung eines nichtinvasiven Nachweissystems zur Früherkennung von humanem Darmkrebs“, in dessen Rahmen diese Arbeit entstand, ist die Bereitstellung eines nichtinvasiven Nachweisverfahrens zur Darmkrebsfrüherkennung. Der Nachweis soll über die Detektion von aus neoplastischen Zellen stammender DNA in Stuhl erfolgen. Die Entartung dieser Zellen beruht auf Veränderungen im Erbgut, welches unter anderem Mutationen sind. Im ersten Teil des BMBF-Projektes wurde ein Set von Mutationen zusammengestellt, welches eine hohe Sensitivität für Vorstufen von Darmkrebs aufweist. Ziel dieser Arbeit war es, eine Nachweismethode für die zuvor identifizierten Punktmutationen zu entwickeln. Das Nachweisverfahren musste dabei unempfindlich gegen einen hohen Hintergrund nichtmutierter DNA sein, da im Stuhl geringe Mengen DNA aus neoplastischen Zellen bei einem hohen Hintergrund von DNA aus gesunden Zellen vorliegen. Hierzu wurden Plasmidmodellsysteme für die aus dem Marker-Set stammenden Genfragmente BRAF und dessen Mutante V600E, CTNNB1 und T41I, T41A, S45P und K-ras G12C hergestellt. Mit Hilfe dieser Plasmidmodellsysteme wurde dann das Nachweissystem entwickelt. Der entscheidende Schritt für die Detektion von Punktmutationen bei hohem Wildtypüberschuss ist eine vorhergehende Anreicherung. In der vorliegenden Arbeit wurde dazu die Methode der LNA-clamp-PCR (locked nucleic acid) etabliert. Die Bewertung der erzielten Anreicherung erfolgte über das relative Detektionslimit. Zur Bestimmung des Detektionslimits wurde die Schmelzkurvenanalyse von Hybridisierungssonden eingesetzt; diese wurde im Rahmen dieser Arbeit für die drei oben genannten Genfragmente und ihre Mutanten entwickelt. Die LNA-clamp-PCR wird in Anwesenheit eines LNA-Blockers durchgeführt. Das Nukleotidanalogon LNA weist im Vergleich zu DNA eine erhöhte Affinität zu komplementären DNA-Strängen auf. Gleichzeitig kommt es bei Anwesenheit einer Basenfehlpaarung zu einer größeren Destabilisierung der Bindung. Als Blocker werden kurze LNA-DNA-Hybridoligonukleotide eingesetzt, die den mutierten Sequenzbereich überspannen und selbst der Wildtypsequenz entsprechen. Durch Bindung an die Wildtypsequenz wird deren Amplifikation während der PCR verhindert (clamp = arretieren, festklemmen). Der Blocker selbst wird dabei nicht verlängert. Der Blocker bindet unter optimalen Bedingungen jedoch nicht an die mutierte Sequenz. Die Mutante wird daher ungehindert amplifiziert und somit gegenüber dem Wildtyp-Fragment angereichert. Die Position des Blockers kann im Bindungsbereich eines der Primer sein und hier dessen Hybridisierung an dem Wildtyp-Fragment verhindern oder zwischen den beiden Primern liegen und so die Synthese durch die Polymerase inhibieren. Die Anwendbarkeit beider Systeme wurde in dieser Arbeit gezeigt. Die LNA-clamp-PCR mit Primerblocker wurde für BRAF etabliert. Es wurde ein Detektionslimit von mindestens 1:100 erzielt. Die LNA-clamp-PCR mit Amplifikationsblocker wurde erfolgreich für BRAF, K-ras und CTNNB1: T41I, T41A mit einem Detektionslimit von 1:1000 bis 1:10 000 entwickelt. In Stuhlproben liegt DNA aus neoplastischen Zellen nach Literaturangaben zu einem Anteil von 1% bis 0,1% vor. Die LNA-clamp-PCR weist also mit Amplifikationsblockern ein ausreichend hohes Detektionslimit für die Analyse von Stuhlproben auf. Durch die erfolgreiche Etablierung der Methode auf drei verschiedenen Genfragmenten und vier unterschiedlichen Punktmutationen konnte deren universelle Einsetzbarkeit gezeigt werden. Für die Ausweitung der LNA-clamp-PCR auf die übrigen Mutationen des Marker-Sets wurden Richtlinien ausgearbeitet und die Blockereffizienz als Kennzahl eingeführt. Die LNA-clamp-PCR ist ein schnelles, kostengünstiges Verfahren, welches einen geringen Arbeitsaufwand erfordert und wenig fehleranfällig ist. Sie ist somit ein geeignetes Anreicherungsverfahren für Punktmutationen in einem diagnostischen System zur Darmkrebsfrüherkennung. Darüber hinaus kann die LNA-clamp-PCR auch in anderen Bereichen, in denen die Detektion von Punktmutationen in einem hohen Wildtyphintergrund erforderlich ist, eingesetzt werden. N2 - Colon cancer is the second leading cause of cancer related deaths in the western world. However if diagnosed early there is a great chance curing the disease. Coloscopy is the gold standard for early detection of colorectal cancer today. Its greatest disadvantage is the fact that it is an invasive technique and provides some discomfort for the patients. Therefore, the compliance to undergo such a procedure is extremely low. This work was generated in the context of the BMBF-project „Development of a non-invasive assay for the early detection of preneoplastic and neoplastic lesions in the human colon“. The aim of the work described here is the development of a non-invasive assay for the early detection of colon cancer. The assay should detect DNA from neoplastic cells in feces samples. The transformation of these cells is based on alterations in the genome predominantly mutations. In the first part of the BMBF-project a mutation panel with high sensitivity for preneoplastic lesions of colon cancer was determined. The aim of this work was to develop a detection method for the point mutations of the determined mutation panel. The rare mutant DNA needs to be detected in the presence of a great amount of wild-type DNA shed from healthy tissue. The assay system needs to be insensitive to this high background of healthy DNA. Therefore a model system of plasmid DNA containing gene fragments of BRAF and its mutation V600E, CTNNB1 and T41I, T41A, S45P and K-ras G12C obtained from the marker panel was established. Using these plasmid system the detection method was developed. The most critical parameter for the detection of rare point mutations is an enrichment of these rare DNA molecules. In this work LNA-clamp-PCR (locked nucleic acid) technology was used to enrich the mutant DNA.. For the estimation of the achieved enrichment the relative detection limit was used. The detection limit was determined by melting curve analysis of hybridization probes. These assays were established in the present work for the three above mentioned gene fragments. LNA-clamp-PCR is performed in the presence of an LNA blocker. LNA is a synthetic DNA analog. LNA nucleotide analog bind to complementary DNA strands with higher affinity. In addition a single mismatch in the LNA-DNA duplex causes a much greater destabilization compared to a DNA-DNA duplex. Short LNA-DNA-hybrids were used as clamp, which cover the mutated region and represent the wild-type sequence. Within an appropriate temperature range, LNA can specifically bind to wild type template and can inhibit its amplification. The clamp itself will not be elongated. Under optimal conditions the LNA clamp will not interfere with the amplification of the mismatched template. Therefore the mutated gene fragment will be enriched in comparison to the wild-type. The position of the LNA clamp can either be at the primer binding site inhibiting primer hybridization on the wild-type fragment or the LNA clamp is positioned between the two primer binding sites inhibiting chain elongation of the perfectly matched template. In the present work both systems were applied. For the gene fragment BRAF the LNA was used at the primer binding site. The achieved detection limit was at least 1:100. The LNA-clamp-PCR with LNA inhibiting the chain elongation were developed successfully for BRAF, K-ras and CTNNB1: T41I, T41A achieving a detection limit of 1:1000 to 1:10 000. According to the literature 1% to 0.1% of the DNA in feces derives from neoplastic cells. Therefore the detection limit achieved by LNA-clamp-PCR with LNA inhibiting chain elongation would be sufficient for analyzing feces samples. LNA-clamp-PCR protocols were established for three different gene fragments and four diverse point mutations indicating that the technology can generally be used for high sensitive detection of DNA mutations. For the development of LNA-clamp-PCR protocols for the other mutations of the marker panel development guidelines were established. Clamp efficiency was identified as a quantitative parameter for protocol optimization. The LNA-clamp-PCR is a robust, fast and cost-saving technique which needs low labor input. Therefore the method is adequate for enriching point mutated gene fragments in a diagnostic assay for the detection of early colon cancer stages. In addition LNA-clamp-PCR can be applied in other fields where rare sequence variations need to be detected in the presence of high wild-type DNA background. KW - LNA-clamp-PCR KW - Darmkrebsdiagnostik KW - Punktmutation KW - BRAF KW - K-ras KW - LNA- clamp-PCR KW - colon cancer diagnosis KW - point mutation KW - BRAF KW - K-ras Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-52308 ER - TY - THES A1 - Lietz, Andreas T1 - Mechanismen der Apoptoseresistenz der Tumorzellen des klassischen Hodgkin Lymphoms T1 - Mechanisms of resistance to apoptosis in classical Hodgkin Lymphoma tumor cells N2 - Apoptose, der programmierte Zelltod, spielt eine wichtige Rolle für das Gleichgewicht zwischen Proliferation und Sterben von Zellen und ist außerdem an der Beseitigung von infizierten und geschädigten Zellen beteiligt. Apoptose kann durch Stimulation von Rezeptoren aus der Familie der TNF-Rezeptoren wie CD95, ausgelöst werden. Nach Liganden-induzierter Trimerisierung der Rezeptoren bindet FADD an den zytoplasmatischen Teil des Rezeptors und rekrutiert Caspase-8 und/oder -10. Die räumliche Nähe der Caspasen in diesem als DISC bezeichneten Komplex führt zu ihrer auto- und transkatalytischen Spaltung und damit Aktivierung. Dadurch wird das apoptotische Programm gestartet, welches zum Tod der Zelle führt. Kontrolliert wird dieser Vorgang von einer Vielzahl anti-apoptotischer Proteine. Störungen in diesem System sind an der Entstehung einer Reihe von Krankheiten beteiligt. Die Blockade der Apoptoseinduktion kann zur Entstehung von Tumoren beitragen. Das klassische Hodgkin Lymphom ist eine maligne Erkrankung des lymphatischen Systems. Die Tumorzellen sind große, einkernige Hodgkin- oder mehrkernige Reed/Sternbergzellen (HRS-Zellen). Sie leiten sich von Keimzentrum-B-Zellen ab. In HRS-Zellen fehlt die Expression einer Vielzahl von typischen B-Zellmarkern, darunter die des B-Zellrezeptors. Solche B-Zellen sterben normalerweise während der Keimzentrumsreaktion durch Apoptose. An diesem Prozess ist CD95 beteiligt. In einer Reihe von malignen Erkrankungen wurden eine Herunterregulation der CD95-Expression oder Mutationen im CD95-Gen beobachtet. Es wird daher vermutet, dass CD95-induzierte Apoptose zur Entfernung von Tumorzellen beiträgt. Im Gegensatz dazu exprimieren sowohl primäre HRS-Zellen als auch etablierte HRS-Zelllinien in der Regel Wildtyp-CD95, sind aber trotzdem CD95-resistent. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Komponenten des CD95-Systems, im Gegensatz zu anderen malignen Erkrankungen, in den HRS-Zellen hochreguliert sind, darunter CD95 selbst. In immunpräzipitierten DISCs von CD95-stimulierten HRS-Zellen wurde neben FADD und Caspase-8/-10 auch c-FLIP nachgewiesen. c-FLIP ist ein Caspase-8/-10-Homolog, das ebenfalls an FADD bindet, aber aufgrund fehlender katalytischer Aktivität die Aktivierung der Caspasen im DISC und damit die Apoptoseinduktion verhindert. Eine starke c-FLIP-Expression konnte in allen HRS-Zelllinien und in den HRS-Zellen nahezu aller untersuchter primärer Hodgkinfälle (55/59) gezeigt werden. Durch siRNA-vermittelte Herunterregulation von c-FLIP war es möglich, HRS-Zelllinien gegenüber CD95-induzierter Apoptose zu sensitivieren. Dies zeigt, dass die CD95-Rezeptor-induzierte Apoptose in den HRS-Zellen nicht strukturell, sondern funktionell inhibiert ist und c-FLIP stark zu dieser Inhibition beiträgt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die c-FLIP-Expression in den HRS-Zellen von der konstitutiven Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB abhängt, die charakteristisch für diese Zellen ist. Normalerweise wird NF-κB von Inhibitorproteinen, den IκBs, im Zytoplasma zurückgehalten. Diverse Stimuli können den IKK-Komplex aktivieren, der die IκBs an bestimmten Serinresten phosphoryliert. Dies hat die Ubiquitinylierung und den Abbau der IκBs zur Folge, wodurch NF-κB frei wird, in den Kern wandert und dort seine Zielgene aktiviert. Es wird angenommen, dass in HRS-Zellen ein konstitutiv aktiver IKK-Komplex und teilweise Mutationen der IκB-Proteine zur konstitutiven NF-κB-Aktivität beitragen. Zu den NF-κB-abhängigen Genen in den HRS-Zellen gehören solche mit anti-apoptotischer und Zellzyklus-treibender Wirkung. Die Inhibition der NF-κB-Aktivität in den HRS-Zellen führt zu Apoptose und eingeschränkter Proliferation. Von dreiwertigem Arsen ist bekannt, dass es die Induzierbarkeit des IKK-Komplexes inhibieren kann und damit letztendlich die Aktivierung von NF-κB. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Arsen in HRS-Zellen den konstitutiv aktiven IKK-Komplex inhibiert. In Zelllinien mit intakten IκB-Proteinen führte dies zur NF-κB-Inhibition und Apoptoseinduktion. Die Reduktion der NF-κB-Aktivität ging mit der Herunterregulation von anti-apoptotischen und Proliferations-fördernden Zielgenen einher. Die ektope Überexpression von NF-κB hob die Apoptose-induzierende Wirkung von Arsen teilweise auf. Durch Arsen-Behandlung von Mäusen konnte das Tumorwachstum xenotransplantierter HRS-Zellen stark verlangsamt werden. In explantierten Tumorzellen konnte ebenfalls eine NF-κB-Inhibition nachgewiesen werden. Die NF-κB-Inhibition durch Arsen trägt also stark zur Apoptoseinduktion in den HRS-Zellen bei. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Modulation der Apoptoseresistenz neue therapeutische Ansätze für die Behandlung des Hodgkin Lymphoms bieten könnte. Der Einsatz von Arsen ist dabei besonders interessant, da Arsen schon für die Behandlung anderer maligner Erkrankungen eingesetzt wird. N2 - Apoptosis, the programmed cell death, is important for the balance between proliferation and dying of cells. It is also involved in the removal of infected and damaged cells. Apoptosis can be induced by stimulation of receptors of the TNF-receptor family like CD95. After ligand-induced trimerisation of these receptors, FADD binds to the cytoplasmic part of the receptor and recruits Caspase-8 and/or -10. The induced proximity of the caspases in this complex, called DISC, leads to their auto- and transcatalytic cleavage and subsequently to their activation. This starts the apoptotic program which leads to the death of the cell. A number of anti-apoptotic proteins control this process. The deregulation of this system is involved in a variety of diseases. The disruption of the apoptotic program can contribute to the development of tumors. Classical Hodgkin Lymphoma is a malignant disease of the lymphatic system, characterized by mononucleated Hodgkin or multinucleated Reed/Sternberg (HRS) cells. These tumor cells are derived from germinal-center B-cells. However, HRS cells lack the expression of typical B cell markers, such as the B-cell receptor. Usually, B-cells without B-cell receptor expression die by apoptosis during the germinal-center reaction. CD95 is involved in this process. It has been shown previously that in many malignant diseases CD95 is down-regulated or mutated, indicating that CD95 is involved in the removal of tumor cells. In opposite to these findings, primary HRS cells and Hodgkin-derived cell lines usually express wild type CD95, but are resistant to CD95 induced apoptosis. In this work, it could be demonstrated that in contrast to other malignant diseases components of the CD95 system are up-regulated in HRS cells, including CD95 itself. By immunoprecipitation it was shown that, in addition to FADD and Caspase-8/-10, c-FLIP is a component of the DISC in CD95-stimulated cells. c-FLIP is a caspase homolog which, like caspases, binds to FADD, but lacks proteolytic activity. It inhibits the activation of caspases in the DISC and thus prevents apoptosis induction. A strong c-FLIP expression was shown in all HRS cell lines and in HRS cells of nearly all investigated primary cases of Hodgkin Lymphoma (55/59). siRNA-mediated (small interfering RNA) down-regulation of c-FLIP sensitized HRS cell lines to CD95-induced apoptosis. This shows that the CD95 receptor-induced apoptosis in HRS cells is not structurally but functionally inhibited and that c-FLIP strongly contributes to this inhibition. In addition, it was shown that c-FLIP expression depends on the constitutive activity of the transcription factor NF-κB which is characteristic for HRS cells. Usually, NF-κB is sequestered in the cytoplasm by inhibitor proteins, the IκBs. A variety of stimuli can activate the IKK-complex which subsequently phosphorylates the IκBs, leading to their ubiquitinylation and degradation. The released NF-κB translocates to the nucleus where it activates the transcription of target genes. It is supposed that a constitutively activated IKK complex and, in some cases, mutated IκB proteins contribute to the constitutive NF-κB activity in HRS cells. To the NF-κB dependent genes in HRS cells belong those with anti-apoptotic and cell cycle promoting activities. Inhibition of the NF-κB activity in HRS cells leads to apoptosis and decreased proliferation. Trivalent arsenic is known to inhibit the induction of the IKK complex and thus the activation of NF-κB. In this work, it was shown that arsenic inhibits the constitutively active IKK complex in HRS cells. This led to an inhibition of NF-κB and induction of apoptosis in HRS cell lines with non-mutated IκB proteins. The NF-κB inhibition was accompanied by the down-regulation of anti-apoptotic and cell cycle promoting genes. Ectopic overexpression of NF-κB partially reverted the apoptotic effect of arsenic. Treatment of mice with arsenic reduced the growth of subcutaneously xenotransplanted HRS cells. In explanted tumor cells, a reduced NF-κB activity could be demonstrated following treatment with arsenic. Thus, the inhibition of NF-κB by arsenic contributes to the induction of apoptosis in HRS cells. Taken together, the results indicate that modulation of the apoptosis resistance may offer new strategies for the treatment of Hodgkin Lymphoma. Of particular interest is the application of arsenic because it is already used in the treatment of other malignant disorders. KW - c-FLIP KW - Arsen KW - NF-kappaB KW - DISC KW - CD95 KW - c-FLIP KW - Arsenic KW - NF-kappaB KW - DISC KW - CD95 Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-11219 ER - TY - THES A1 - Loew, Noya T1 - Meerrettich Peroxidase : Modifikationen und Anwendungen in Biosensoren T1 - Horseradish Peroxidase : modifications and applications in biosensors N2 - Biosensoren werden oft für die Messung einzelner Substanzen in komplexen Medien verwendet, wie z.B. bei der Blutzuckerbestimmung. Sie bestehen aus einem physikochemischen Sensor, dem Transduktionselement, und einer darauf immobilisierten biologischen Komponente, dem Erkennungselement. In dieser Arbeit wurde als Transduktionselement eine Elektrode und als Biokomponente das Enzym „Meerrettich Peroxidase“ (engl. horseradish peroxidase, HRP) verwendet. Solche HRP-Elektroden werden für die Messung von Wasserstoffperoxid (H2O2) eingesetzt. H2O2 wird im Körper von weißen Blutkörperchen produziert, um Bakterien abzutöten, wird teilweise ausgeatmet und kann in kondensierter Atemluft nachgewiesen werden. Da viele weiße Blutkörperchen bei einer Chemotherapie abgetötet und dadurch die Patienten anfälliger für Infektionen werden, muss ihre Anzahl regelmäßig überwacht werden. Dazu wird zurzeit Blut abgenommen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, ob eine Überwachung der Anzahl an weißen Blutkörperchen ohne Blutabnahme durch eine H2O2-Messung erfolgen kann. Ein direkter Zusammenhang zwischen der ausgeatmeten H2O2-Menge und der Zahl der weißen Blutkörperchen konnte dabei nicht festgestellt werden. Für empfindliche H2O2-Messungen mit einer HRP-Elektrode ist ein schneller Austausch von Elektronen zwischen der Elektrode und dem Enzym notwendig. Eine Vorraussetzung dafür ist eine kurze Distanz zwischen dem aktiven Zentrum des Enzyms und der Elektrodenoberfläche. Um einen kurzen Abstand zu erreichen wurden im zweiten Teil dieser Arbeit verschiedene poröse graphitähnliche Materialien aus pyrolysierten Kobalt-Porphyrinen für die Elektrodenherstellung verwendet. Dabei stellte sich heraus, dass eines der untersuchten Materialien, welches Poren von etwa der Größe eines Enzyms hat, Elektronen etwa 200mal schneller mit dem Enzym austauscht als festes Graphit. Die HRP selbst enthält in seinem aktiven Zentrum ein Eisen-Protoporphyrin, also ein aus vier Ringen bestehendes flaches Molekül mit einem Eisenatom im Zentrum. Reagiert die HRP mit H2O2, so entzieht es dem Peroxid zwei Elektronen. Eines dieser Elektronen wird am Eisen, das andere im Ringsystem zwischengespeichert, bevor sie an ein anderes Molekül oder an die Elektrode weitergegeben werden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde das Eisen durch Osmium ausgetauscht. Das so veränderte Enzym entzieht Peroxiden nur noch ein Elektron. Dadurch reagiert es zwar langsamer mit Wasserstoffperoxid, dafür aber schneller mit tert-Butylhydroperoxid, einem organischen Vertreter der Peroxid-Familie. N2 - Biosensors are often used for the measurement of specific substances in complex media, e.g. glucose in blood. They consist of a physicochemical sensor, the transducer, onto which a biological component, the recognition element, is immobilised. In this work, an electrode was used as transducer and the enzyme “horseradish peroxidase” (HRP) as biological component. Such HRP electrodes are used for the measurement of hydrogen peroxide (H2O2). H2O2 is produced in the body by white blood cells to destroy bacteria, is partially exhaled and can be measured in breath condensate. Since a lot of white blood cells are destroyed during chemotherapy and patients get more prone to infections, their amount must be checked regularly. Currently blood samples are taken for this purpose. In the first part of this work it was investigated, if the amount of white blood cells can be checked without taking blood by measuring H2O2. A correlation between the amount of exhaled H2O2 and the number of white blood cells could not be found. For a sensitive H2O2 measurement with an HRP electrode a quick exchange of electrons between electrode and enzyme is needed. One condition for this is a short distance between the active centre of the enzyme and the electrode surface. In order to achieve a short distance, several porous graphite-like materials made of pyrolysed cobalt porphyrins where used in the second part of this work for the electrode production. It turned out that one of the tested materials, which had pores about the same size as the enzyme, did exchange electrons with the enzyme about 200 times faster than solid graphite. HRP itself contains an iron protoporphyrin, i.e. a planar molecule consisting of four rings with an iron atom in the middle, its active centre. When HRP reacts with H2O2, it takes two electrons from the peroxide. One of these electrons is stored at the iron, the other in the ring system, until they are passed on to another molecule or the electrode. In the last part of this work, the iron was exchanged with osmium. The modified enzyme takes only one electron from peroxides. Thus it reacts slower with hydrogen peroxide, but faster with tert-butylhydroperoxide, an organic member of the peroxide family. KW - Peroxidase KW - Biosensor KW - Elektrochemie KW - Porphyrin KW - Peroxid KW - Peroxidase KW - Biosensor KW - Electrochemistry KW - Porphyrin KW - Peroxide Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-18430 ER -