TY - THES A1 - Born, Stephan T1 - Kartierung der Bindungstasche des humanen Bittergeschmacksrezeptors hTAS2R10 T1 - Mapping the binding site of the human bitter taste receptor hTAS2R10 N2 - Die Bittergeschmacksrezeptoren stellen in der Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren eine besondere Gruppe dar. Im Menschen können die 25 Rezeptoren eine große Anzahl unterschiedlichster Bittergeschmacksstoffe detektieren. Diese Substanzen können sowohl schädlich, wie etwa Strychnin, als auch der Gesundheit förderliche Arzneistoffe, wie etwa Chloramphenicol sein. Unter den Bittergeschmacksrezeptoren des Menschen gibt es eine Gruppe von drei Rezeptoren, die besonders viele Bitterstoffe detektieren können. Einer von ihnen ist der Rezeptor hTAS2R10. In dieser Arbeit konnte sowohl experimentell als auch durch computergestützte Modellierung gezeigt werden, dass der hTAS2R10 nur eine Bindungstasche besitzt. Das stimmt mit den bisher ausführlich experimentell und in silico untersuchten Rezeptoren hTAS2R1, -R16, -R38 und -R46 überein. Die für die Agonisteninteraktionen nachweislich wichtigen Transmembrandomänen sind in den bisher untersuchten Bittergeschmacksrezeptoren, wie auch im hTAS2R10, die Transmembrandomänen 3, 5, 6 und 7. Die Untersuchungen zeigten, dass die Bindungstasche des hTAS2R10 in der oberen Hälfte des zum extrazellulären Raum gerichteten Bereichs lokalisiert ist. Insbesondere konnte für die untersuchten Agonisten Strychnin, Parthenolid und Denatoniumbenzoat gezeigt werden, dass die Seitenketten der Aminosäuren in Position 3.29 und 5.40 ausgeprägte agonistenselektive Wechselwirkungen eingehen. Weitere Untersuchungen haben ergeben, dass das weitgefächerte Agonistenspektrum des hTAS2R10 zu Lasten der Sensitivität für einzelne Bitterstoffe geht. Der Vergleich wichtiger Positionen im hTAS2R10, hTAS2R46 und mTas2r105 hat deutlich gemacht, dass sich die Bindungsmodi zwischen diesen Rezeptoren unterscheiden. Dies deutet auf eine getrennte evolutionäre Entwicklung der Bindungseigenschaften dieser Rezeptoren hin. Gleichfalls zeigten die Untersuchungen, dass einige Positionen wie z.B. 7.39 die Funktion aller untersuchten Bittergeschmacksrezeptoren prägen, sich jedoch die genaue Bedeutung im jeweiligen Rezeptor unterscheiden kann. Einzelne dieser Positionen konnten auch bei der Agonisteninteraktion des Rhodopsins und des β2-adrenergen Rezeptors beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit helfen dabei die Wechselwirkungen zwischen Bitterstoffen und den Bittergeschmacksrezeptoren zu verstehen und geben erste Einblicke in die Entwicklung der Rezeptoren in Hinblick auf ihren Funktionsmechanismus. Diese Erkenntnisse können genutzt werden, um Inhibitoren zu entwickeln, die sowohl ein wichtiges Werkzeug in der Rezeptoranalytik wären, als auch dazu genutzt werden könnten, den unerwünschten bitteren Geschmack von Medikamenten oder gesundheitsfördernden sekundären Pflanzenstoffen zu mindern. Damit könnte ein Beitrag zur Gesundheit der Menschen geleistet werden. N2 - In the Superfamily of G protein-coupled receptors the bitter taste receptors form a notable group. The 25 human receptors are able to detect a large group of structurally diverse bitter compounds. These compounds can be toxic – like strychnine – or have beneficial effects on health – like the pharmacological agent chloramphenicol. Three of these bitter taste receptors show a strikingly broad agonist spectrum. One of them is the hTAS2R10. It was shown empirically and by computational modelling that the hTAS2R10 has only one binding pocket. This agrees with the findings of studies on the bitter taste receptors hTAS2R1, -R16, -R38 and -R46. The domains important for agonist interaction in these receptors, as well as in the hTAS2R10, are the transmembrane domains 3, 5, 6 and 7. The results of this thesis show that the binding pocket of the hTAS210 is located in the upper part of the receptor which points into the direction of the extracellular area. Interestingly, it has been shown for the amino acid side chains in the positions 3.29 and 5.40, that they can interact with the analysed agonists strychnine, parthenolide and denatonium benzoate in an agonist-selective way. Further analyses showed that the broad tuning of the hTAS2R10 goes at the expense of the sensitivity to single agonists. The comparison of crucial positions in the hTAS2R10, hTAS2R46 and the mTas2r105 reveal that these receptors differ in their binding mode. These could be evidence that the binding abilities of these receptors evolved independently. However, the results show that some positions, e.g. 7.39, influence the receptor activity in all analysed receptors, but the function of these positions in the receptors could be different. Some of these positions also have an influence on the agonist-receptor interaction of Rhodopsin and the β2-adrenergic receptor. The findings in this thesis contribute to the knowledge about interaction between bitter receptors and bitter compounds. The results also provide insight into the evolvement of receptor functions. These outcomes can be of use for the development of inhibitors which could serve as analytical tools in taste research. Furthermore, such inhibitors could be used to reduce the bitter taste of medicine and healthy plant compounds and thus increase palatability. This could contribute to improve human well-being. KW - Bittergeschmack KW - hTAS2R10 KW - Geschmack KW - Agonisteninteraktion KW - Homologiemodellierung KW - taste KW - hTAS2R10 KW - homology modelling KW - agonists interaction KW - bitter taste Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-61392 ER - TY - THES A1 - Wend, Korinna T1 - Konstruktion und toxikologische Nutzung von transgenen Mäusen mit den allelischen Varianten von humanen SULT1A-Genen T1 - Construction and characterisation of transgenic mice for human sulfotransferases with polymorphic SULT1A genes N2 - Eine besondere Rolle im Fremdstoffmetabolismus hat die SULT1A1 beim Menschen aufgrund der hohen Expression und breiten Gewebeverteilung. Während die humane SULT1A1 in sehr vielen Geweben exprimiert wird, wurde die murine SULT1A1 vor allem in der Leber, Lunge und Colon gefunden. Neben der Gewebeverteilung spielt auch der Polymorphismus im humanen SULT1A1-Gen eine bedeutende Rolle. Der häufigste Polymorphismus in diesem Gen führt zu einer Aminosäuresubstitution von Arginin zu Histidin an Position 213. Die Genvariante mit Histidin (auch als SULT1A1*2 bezeichnet) codiert für ein Protein mit einer geringen Enzymaktivität und einer reduzierten Enzymmenge in Thrombocyten. Über den Einfluss dieser allelischen Varianten in anderen Geweben ist bislang wenig bekannt. In vorausgegangenen epidemiologischen Studien wurden mögliche Korrelationen zwischen den Genvarianten und der Krebsentstehung in verschiedenen Geweben untersucht. Diese Daten liefern jedoch widersprüchliche Ergebnisse zum Krebsrisiko. Aufgrund der strittigen epidemiologischen Daten sollten Tiermodelle generiert werden, um die häufigsten SULT1A1-Allele hinsichtlich der Empfindlichkeit gegenüber Nahrungs- und Umweltkanzerogenen zu untersuchen. Zur Erzeugung transgener (tg) Mauslinien wurde mittels Mikroinjektion der codierenden Genbereich und große flankierende Humansequenzen stromaufwärts und stromabwärts in das Mausgenom integriert. Es wurden mehrere Mauslinien hergestellt. Zwei davon, die Mauslinie 31 mit dem SULT1A1*1-Allel und die Mauslinie 28 mit dem SULT1A1*2-Allel, wurden eingehend analysiert. In beiden Linien wurde eine identische Kopienzahl des Transgens ermittelt. Proteinbiochemische Charakterisierungen zeigten eine weitgehend dem Menschen entsprechende Gewebeverteilung und zelluläre und subzelluläre Lokalisation der humanen SULT1A1 in der Linie (Li) 28. In Li 31 wurden Unterschiede zu Li 28 sowohl in der Gewebeverteilung als auch in der zellulären Lokalisation des exprimierten humanen Proteins ermittelt. Dabei war die Expression auf Proteinebene in der SULT1A1*2-tg Linie generell stärker als in der SULT1A1*1-Linie. Dieses Ergebnis war überraschend, denn in humanen Thrombocyten führt das SULT1A1*1-Allel zu einem höheren Gehalt an SULT1A1-Protein als das SULT1A1*2-Allel. Zur Analyse der unterschiedlichen Proteinexpressionen in den tg Mauslinien wurde die cDNA und der 5´-flankierende Bereich des SULT1A1-Gens sequenziert. In beiden tg Linien entsprach die Sequenz der cDNA der Referenzsequenz aus der Gendatenbank (Pubmed). In der 5´-flankierenden Region wurden bekannte Polymorphismen analysiert und unterschiedliche Haplotypen in den tg Linien an den Positionen -624 und -396 ermittelt. Dabei wurde in der Li 31 der Haplotyp detektiert, der in der Literatur mit einer höheren SULT1A1-Enzymaktivität beschrieben wird. Der mögliche Zusammenhang zwischen Transkriptionsrate und Proteinexpression wurde in RNA-Expressionsanalysen im codierenden und 5´-nicht codierenden Bereich (mit den alternativen Exons 1B und 1A) untersucht. Im codierenden Bereich und im Exon 1B konnte in den untersuchten Organen eine höhere RNA-Expression in der Li 28 im Vergleich zur Li 31 ermittelt werden. Außer in der Lunge wurde für Exon 1B eine identische RNA-Expression detektiert. RNA, die Exon 1A enthielt, wurde in allen untersuchten Organen der Li 28, aber nur in der Lunge bei der Li 31 gefunden. In beiden tg Linien konnten mit den Exon 1A-Primern jedoch auch größere PCR-Produkte ermittelt werden. Dieser Unterschied im Exon 1A und mögliche Spleißvarianten könnten damit für die unterschiedliche Proteinexpression des humanen SULT1A1-Proteins in den beiden tg Mauslinien sein. Die in dieser Arbeit generierten und charakterisierten tg Mausmodelle wurden in einer toxikologischen Studie eingesetzt. Es wurde das heterozyklische aromatische Amin 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo-[4,5-b]pyridin (PhIP) verwendet. PhIP wird beim Erhitzen und Braten von Fleisch und Fisch gebildet und könnte mit der erhöhten Krebsentstehung im Colon in der westlichen Welt im Zusammenhang stehen. Mittels 32P-Postlabelling sollte der Einfluss der zusätzlichen Expression der humanen SULT-Proteine auf die PhIP-DNA-Adduktbildung analysiert werden. Dabei wurden mehr DNA-Addukte in den tg Tieren als in den Wildtyp-Mäusen ermittelt. Die Konzentration der gebildeten DNA-Addukte korrelierte mit der Expressionsstärke des humanen SULT1A1-Proteins in den tg Mäusen. An den in dieser Arbeit generierten tg Mauslinien mit den häufigsten allelischen Varianten des SULT1A1-Gens konnten Unterschiede auf RNA- und Protein-Ebene ermittelt werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Expression der humanen SULT1A1 eine Auswirkung sowohl auf die Stärke als auch das Zielgewebe der DNA-Adduktbildung in vivo hat. N2 - In humans, SULT1A1 and its polymorphic variants play an important role in xenobiotic metabolism and display a broad tissue distribution and high expression level. This enzyme is expressed in almost every human organ whereas in mice SULT1A1 can only be detected in liver, lung and colon. The most common polymorphism of this gene leads to an amino acid substitution from arginine to histidine at the position 213. In platelets, the allele encoding histidine (also designated as SULT1A1*2) is associated with both low activity and low thermal stability of the SULT protein. However, so far only little is known about the significance of these allelic variants in the other tissues with hSULT1A1 expression. Previous epidemiological studies have made attempts to correlate SULT1A1 allelic variants and cancer development, their data, however, have been contradictory for an appropriate cancer risk assessment. In this thesis, we addressed the effect of the hSULT1A1 genetic variability on the susceptibility to nutritional and environmental carcinogens using transgenic (tg) mouse models. We generated tg mice carrying the most common allelic variants of the human SULT1A1 gene. The coding region and large flanking human sequences upstream and downstream of the hSULT1A1 gene were integrated randomly into the mouse genome by microinjection. Several tg mouse lines were generated. Two of them, line (li) 31 with the SULT1A1*1 allele and li 28 with the SULT1A1*2 allele, were analysed in detail. At first, an identical transgene copy number was detected in both lines. Furthermore, biochemical characterization of li 28 showed that the tissue distribution, the cellular and subcellular localisation of the protein were very similar to those in humans. In contrast, li 31 exhibited differences in tissue distribution and cellular localisation of the human protein compared to li 28. The protein expression level in the tg line with SULT1A1*2 (li 28) was generally higher than in SULT1A1*1 (li 31) mice. These results were surprising since the SULT1A1*1 allele in human platelets usually leads to a higher amount of SULT1A1 protein compared to the SULT1A1*2 allele. To investigate these differences, we sequenced the cDNA and 5´-flanking region of the SULT1A1 gene. In both tg mouse lines, the cDNA sequence was identical to the reference sequence from the gene databank (Pubmed). We subsequently analysed the common polymorphisms of the 5´-flanking region, and determined different haplotypes at position -624 and -396 in the tg mouse lines. According to the literature, the haplotype associated with a higher SULT1A1 enzyme activity, we detected in li 31. We analyzed the possible correlation between gene transcription and protein expression by measuring RNA expression levels of the coding and the non-coding region (with alternative exons 1B and 1A). We detected a higher RNA expression level of the coding region and exon 1B in li 28 compared to li 31, whereas RNA for exon 1A was only found in li 28 in all investigated tissues, but only in lung in li 31. Furthermore we detected with exon 1A-primers larger RNA in both lines. These differences in exon 1A expression accompanied by potential splicing variants could be responsible for the different expression and activity of the human SULT1A1 protein in both tg mouse lines. In order to validate our generated and characterized tg mouse models as toxicological in vivo models, we used them for the evaluation of the heterocyclic aromatic amine 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo-[4,5-b]pyridine (PhIP). PhIP is typically generated during heating and roasting of meat and fish and is suggested to be associated with an increased colon cancer incidence in the western world. We measured the impact of the additionally expressed human SULT proteins on the PhIP-DNA adduct level by 32P-postlabelling. We detected significantly higher DNA adduct levels in tg compared to wildtype mice, which correlated positively with the expression pattern of the human SULT1A1 protein in the tg mice. In conclusion, in this thesis, we have successfully generated and validated the transgenic mouse lines carrying the most common allelic variants of the human SULT1A1 gene. Interestingly, these lines exhibited differences in both the SULT1A1 RNA and protein levels. Using these transgenic mouse models as in vivo toxicological tools we have shown that the expression of human SULT1A1 in mice has a decisive impact on the strength and the target tissue of DNA adducts. KW - transgenes Mausmodell KW - Polymorphismus KW - Sulfotransferase KW - SULT1A1 KW - SULT1A2 KW - PhIP KW - heterocyclisches aromatisches Amin KW - transgenic mousemodel KW - polymorphism KW - sulfotransferase KW - SULT1A1 KW - SULT1A2 KW - PhIP KW - heterocyclic aromatic amine Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-42052 ER - TY - THES A1 - Thalmann, Sophie T1 - Korrelation zwischen der genetischen und der funktionellen Diversität humaner Bitterrezeptoren T1 - Correlation between the genetic and the functional diversity of bitter receptors N2 - Der Mensch besitzt ~25 funktionelle Bitterrezeptoren (TAS2R), die für die Wahrnehmung potenziell toxischer Substanzen in der Nahrung verantwortlich sind. Aufgrund der großen genetischen Variabilität der TAS2R-Gene könnte es eine Vielzahl funktionell unterschiedlicher TAS2R-Haplotypen geben, die zu Unterschieden der Bitterwahrnehmung führen. Dies konnte bereits in funktionellen Analysen und sensorischen Studien für einzelne Bitterrezeptoren gezeigt werden. In dieser Arbeit wurden die häufigsten Haplotypen aller 25 Bitterrezeptoren verschiedener Ethnien funktionell charakterisiert. Das Ziel war eine umfassende Aussage über die funktionelle Diversität der TAS2Rs, die die molekulare Grundlage für individuelle Bitterwahrnehmung bildet, treffen zu können. Fehlende Varianten wurden aus genomischer DNA kloniert oder durch gezielte Mutagenese bereits vorhandener TAS2R-Konstrukte generiert. Die funktionelle Analyse erfolgte mittels Expression der TAS2R-Haplotypen in HEK293TG16gust44 Zellen und anschließenden Calcium-Imaging-Experimenten mit zwei bekannten Agonisten. Die Haplotypen der fünf orphanen TAS2Rs wurden mit über hundert Bitterstoffen stimuliert. Durch die gelungene Deorphanisierung des TAS2R41 in dieser Arbeit, wurden für die 21 aktivierbaren TAS2Rs 36 funktionell-unterschiedliche Haplotypen identifiziert. Die tatsächliche funktionelle Vielfalt blieb jedoch deutlich hinter der genetischen Variabilität der TAS2Rs zurück. Neun Bitterrezeptoren wiesen funktionell homogene Haplotypen auf oder besaßen nur eine weltweit vorherrschende Variante. Funktionell heterogene Haplotypen wurden für zwölf TAS2Rs identifiziert. Inaktive Varianten der Rezeptoren TAS2R9, TAS2R38 und TAS2R46 sollten die Wahrnehmung von Bitterstoffen wie Ofloxacin, Cnicin, Hydrocortison, Limonin, Parthenolid oder Strychnin beeinflussen. Unterschiedlich sensitive Varianten, besonders der Rezeptoren TAS2R47 und TAS2R49, sollten für Agonisten wie Absinthin, Amarogentin oder Cromolyn ebenfalls zu phänotypischen Unterschieden führen. Wie für den TAS2R16 bereits gezeigt, traten Haplotypen des funktionell heterogenen TAS2R7 und TAS2R41 ethnien-spezifisch auf, was auf lokale Anpassung und verschiedene Phänotypen hinweisen könnte. Weiterführend muss nun eine Analyse der funktionell-variablen TAS2Rs in sensorischen Tests erfolgen, um ihre phänotypische Relevanz zu prüfen. Die Analyse der funktionsmodulierenden Aminosäurepositionen, z.Bsp. des TAS2R44, TAS2R47 oder TAS2R49, könnte weiterführend zum besseren Verständnis der Rezeptor-Ligand- und Rezeptor-G-Protein-Interaktion beitragen. N2 - Bitter taste perception varies markedly from person to person, due to a high number of polymorphisms present in the 25 known functional bitter receptors (TAS2Rs). These polymorphisms lead to a number of haplotypes for each receptor, which are common in different populations, but vary in frequency. The individual combination of receptor variants seems to determine the person’s sensitivity of bitter perception, as could already be shown for single TAS2Rs. Bitter is an aversive taste quality, indicating the ingestion of harmful substances. Different sensitivity could have an impact on food choice. In order to characterize functional consequences of the genetic diversity, we performed calcium imaging experiments with all main haplotypes for the 25 bitter receptors. The obtained information about receptor properties enables us on the one hand to analyze structure-function relationships and on the other hand gives us the functional diverse candidates to focus on in psychophysical studies. The overall aim is to show genotype-phenotype correlation for bitter taste perception and their impact on food choice and therefore diet and health. Our first aim was to identify agonists for the 5 receptors, which could not be deorphaned in previous screens. We challenged all main haplotypes of these TAS2Rs with 106 bitter compounds and could identify the antibiotic chloramphenicol as agonist for bitter receptor TAS2R41. In total we identified 36 functionally different receptor variants of the 21 deorphaned TAS2Rs. Main haplotypes of nine TAS2Rs were functionally homogeneous while twelve TAS2Rs possessed between two and three functionally heterogeneous receptor variants. In summary the observed functional diversity is not as big as expected. Based on our in vitro findings the shown functional diversity of these twelve bitter receptors might be the molecular basis for individual differences in bitter taste perception and will be further analyzed in psychophysical studies. KW - Bittergeschmack KW - TAS2R KW - heterologe Expression KW - funktionelle Variabilität KW - bitter taste KW - TAS2R KW - heterologous expression KW - functional diversity Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-66845 ER - TY - THES A1 - Schatz, Daniela T1 - LNA-clamp-PCR zum sensitiven Nachweis von Punktmutationen im Rahmen der Entwicklung eines Darmkrebsfrüherkennungstests T1 - LNA-clamp-PCR as a method for sensitive detection of point mutations as part of the development of an assay for the early diagnosis of colon cancer N2 - Darmkrebs ist die zweithäufigste malignombedingte Todesursache in den westlichen Industrieländern. Durch eine frühzeitige Diagnose besteht jedoch eine hohe Chance auf Heilung. Der Goldstandard zur Darmkrebsfrüherkennung ist gegenwärtig die Koloskopie. Eine Darmspiegelung ist jedoch invasiv und mit Unannehmlichkeiten für den Patienten verbunden. Die Akzeptanz in der Bevölkerung ist daher gering. Ziel des BMBF- Projektes „Entwicklung eines nichtinvasiven Nachweissystems zur Früherkennung von humanem Darmkrebs“, in dessen Rahmen diese Arbeit entstand, ist die Bereitstellung eines nichtinvasiven Nachweisverfahrens zur Darmkrebsfrüherkennung. Der Nachweis soll über die Detektion von aus neoplastischen Zellen stammender DNA in Stuhl erfolgen. Die Entartung dieser Zellen beruht auf Veränderungen im Erbgut, welches unter anderem Mutationen sind. Im ersten Teil des BMBF-Projektes wurde ein Set von Mutationen zusammengestellt, welches eine hohe Sensitivität für Vorstufen von Darmkrebs aufweist. Ziel dieser Arbeit war es, eine Nachweismethode für die zuvor identifizierten Punktmutationen zu entwickeln. Das Nachweisverfahren musste dabei unempfindlich gegen einen hohen Hintergrund nichtmutierter DNA sein, da im Stuhl geringe Mengen DNA aus neoplastischen Zellen bei einem hohen Hintergrund von DNA aus gesunden Zellen vorliegen. Hierzu wurden Plasmidmodellsysteme für die aus dem Marker-Set stammenden Genfragmente BRAF und dessen Mutante V600E, CTNNB1 und T41I, T41A, S45P und K-ras G12C hergestellt. Mit Hilfe dieser Plasmidmodellsysteme wurde dann das Nachweissystem entwickelt. Der entscheidende Schritt für die Detektion von Punktmutationen bei hohem Wildtypüberschuss ist eine vorhergehende Anreicherung. In der vorliegenden Arbeit wurde dazu die Methode der LNA-clamp-PCR (locked nucleic acid) etabliert. Die Bewertung der erzielten Anreicherung erfolgte über das relative Detektionslimit. Zur Bestimmung des Detektionslimits wurde die Schmelzkurvenanalyse von Hybridisierungssonden eingesetzt; diese wurde im Rahmen dieser Arbeit für die drei oben genannten Genfragmente und ihre Mutanten entwickelt. Die LNA-clamp-PCR wird in Anwesenheit eines LNA-Blockers durchgeführt. Das Nukleotidanalogon LNA weist im Vergleich zu DNA eine erhöhte Affinität zu komplementären DNA-Strängen auf. Gleichzeitig kommt es bei Anwesenheit einer Basenfehlpaarung zu einer größeren Destabilisierung der Bindung. Als Blocker werden kurze LNA-DNA-Hybridoligonukleotide eingesetzt, die den mutierten Sequenzbereich überspannen und selbst der Wildtypsequenz entsprechen. Durch Bindung an die Wildtypsequenz wird deren Amplifikation während der PCR verhindert (clamp = arretieren, festklemmen). Der Blocker selbst wird dabei nicht verlängert. Der Blocker bindet unter optimalen Bedingungen jedoch nicht an die mutierte Sequenz. Die Mutante wird daher ungehindert amplifiziert und somit gegenüber dem Wildtyp-Fragment angereichert. Die Position des Blockers kann im Bindungsbereich eines der Primer sein und hier dessen Hybridisierung an dem Wildtyp-Fragment verhindern oder zwischen den beiden Primern liegen und so die Synthese durch die Polymerase inhibieren. Die Anwendbarkeit beider Systeme wurde in dieser Arbeit gezeigt. Die LNA-clamp-PCR mit Primerblocker wurde für BRAF etabliert. Es wurde ein Detektionslimit von mindestens 1:100 erzielt. Die LNA-clamp-PCR mit Amplifikationsblocker wurde erfolgreich für BRAF, K-ras und CTNNB1: T41I, T41A mit einem Detektionslimit von 1:1000 bis 1:10 000 entwickelt. In Stuhlproben liegt DNA aus neoplastischen Zellen nach Literaturangaben zu einem Anteil von 1% bis 0,1% vor. Die LNA-clamp-PCR weist also mit Amplifikationsblockern ein ausreichend hohes Detektionslimit für die Analyse von Stuhlproben auf. Durch die erfolgreiche Etablierung der Methode auf drei verschiedenen Genfragmenten und vier unterschiedlichen Punktmutationen konnte deren universelle Einsetzbarkeit gezeigt werden. Für die Ausweitung der LNA-clamp-PCR auf die übrigen Mutationen des Marker-Sets wurden Richtlinien ausgearbeitet und die Blockereffizienz als Kennzahl eingeführt. Die LNA-clamp-PCR ist ein schnelles, kostengünstiges Verfahren, welches einen geringen Arbeitsaufwand erfordert und wenig fehleranfällig ist. Sie ist somit ein geeignetes Anreicherungsverfahren für Punktmutationen in einem diagnostischen System zur Darmkrebsfrüherkennung. Darüber hinaus kann die LNA-clamp-PCR auch in anderen Bereichen, in denen die Detektion von Punktmutationen in einem hohen Wildtyphintergrund erforderlich ist, eingesetzt werden. N2 - Colon cancer is the second leading cause of cancer related deaths in the western world. However if diagnosed early there is a great chance curing the disease. Coloscopy is the gold standard for early detection of colorectal cancer today. Its greatest disadvantage is the fact that it is an invasive technique and provides some discomfort for the patients. Therefore, the compliance to undergo such a procedure is extremely low. This work was generated in the context of the BMBF-project „Development of a non-invasive assay for the early detection of preneoplastic and neoplastic lesions in the human colon“. The aim of the work described here is the development of a non-invasive assay for the early detection of colon cancer. The assay should detect DNA from neoplastic cells in feces samples. The transformation of these cells is based on alterations in the genome predominantly mutations. In the first part of the BMBF-project a mutation panel with high sensitivity for preneoplastic lesions of colon cancer was determined. The aim of this work was to develop a detection method for the point mutations of the determined mutation panel. The rare mutant DNA needs to be detected in the presence of a great amount of wild-type DNA shed from healthy tissue. The assay system needs to be insensitive to this high background of healthy DNA. Therefore a model system of plasmid DNA containing gene fragments of BRAF and its mutation V600E, CTNNB1 and T41I, T41A, S45P and K-ras G12C obtained from the marker panel was established. Using these plasmid system the detection method was developed. The most critical parameter for the detection of rare point mutations is an enrichment of these rare DNA molecules. In this work LNA-clamp-PCR (locked nucleic acid) technology was used to enrich the mutant DNA.. For the estimation of the achieved enrichment the relative detection limit was used. The detection limit was determined by melting curve analysis of hybridization probes. These assays were established in the present work for the three above mentioned gene fragments. LNA-clamp-PCR is performed in the presence of an LNA blocker. LNA is a synthetic DNA analog. LNA nucleotide analog bind to complementary DNA strands with higher affinity. In addition a single mismatch in the LNA-DNA duplex causes a much greater destabilization compared to a DNA-DNA duplex. Short LNA-DNA-hybrids were used as clamp, which cover the mutated region and represent the wild-type sequence. Within an appropriate temperature range, LNA can specifically bind to wild type template and can inhibit its amplification. The clamp itself will not be elongated. Under optimal conditions the LNA clamp will not interfere with the amplification of the mismatched template. Therefore the mutated gene fragment will be enriched in comparison to the wild-type. The position of the LNA clamp can either be at the primer binding site inhibiting primer hybridization on the wild-type fragment or the LNA clamp is positioned between the two primer binding sites inhibiting chain elongation of the perfectly matched template. In the present work both systems were applied. For the gene fragment BRAF the LNA was used at the primer binding site. The achieved detection limit was at least 1:100. The LNA-clamp-PCR with LNA inhibiting the chain elongation were developed successfully for BRAF, K-ras and CTNNB1: T41I, T41A achieving a detection limit of 1:1000 to 1:10 000. According to the literature 1% to 0.1% of the DNA in feces derives from neoplastic cells. Therefore the detection limit achieved by LNA-clamp-PCR with LNA inhibiting chain elongation would be sufficient for analyzing feces samples. LNA-clamp-PCR protocols were established for three different gene fragments and four diverse point mutations indicating that the technology can generally be used for high sensitive detection of DNA mutations. For the development of LNA-clamp-PCR protocols for the other mutations of the marker panel development guidelines were established. Clamp efficiency was identified as a quantitative parameter for protocol optimization. The LNA-clamp-PCR is a robust, fast and cost-saving technique which needs low labor input. Therefore the method is adequate for enriching point mutated gene fragments in a diagnostic assay for the detection of early colon cancer stages. In addition LNA-clamp-PCR can be applied in other fields where rare sequence variations need to be detected in the presence of high wild-type DNA background. KW - LNA-clamp-PCR KW - Darmkrebsdiagnostik KW - Punktmutation KW - BRAF KW - K-ras KW - LNA- clamp-PCR KW - colon cancer diagnosis KW - point mutation KW - BRAF KW - K-ras Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-52308 ER - TY - THES A1 - Batke, Monika T1 - Metabolismus von alkylierten polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen : Einfluss der Struktur auf benzylische Hydroxylierung und Sulfonierung in vitro und Modulation des Metabolismus in vivo T1 - Metabolism of alcylated polycyclic aromatic hydrocarbons : influence of the structure on benzylic hydroxylation and sulfonation in vitro and modulation of the metabolism in vivo N2 - Die Toxizität und Kanzerogenität von rein aromatischen polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) ist seit Jahrzehnten bekannt und umfassend erforscht. Die alkylierten PAK (alkPAK) besitzen jedoch aufgrund ihrer Alkylgruppe eine weitere Möglichkeit zur Bioaktivierung und müssen daher gesondert betrachtet werden. Die Alkylgruppe wird zunächst hydroxyliert, anschließend zur Säure oxidiert oder direkt konjugiert. Entstehen hierbei instabile benzylische Sulfokonjugate, so können diese DNA-Addukte bilden und zu Mutationen führen. In Hinblick auf die Bioaktivierung von alkPAK galt es daher zu klären welchen Einfluss die Struktur auf die benzylische Hydroxylierung hat und welche humanen Formen der löslichen Sulfotransferasen besonders an der Umsetzung der alkPAK-Derivate beteiligt sind. Die Untersuchung der Albuminbindung von Schwefelsäureestern sowie ihre Aufnahme in Nierenzellen sollten Aufschluss hinsichtlich möglicher Transportvorgänge geben. Für die in-vivo-Situation wurde weiterhin die Modulation des Metabolismus ausgewählter benzylischer Alkohole durch verschiedene Nahrungsmittelbestandteile, Arzneimittel und Fremdstoffe an Ratten untersucht. Als Biomarker wurden benzylische Carbonsäuren im Urin und die entsprechenden Mercaptursäuren in Urin und Fäzes betrachtet. Zunächst wurde anhand von Inkubationen mit Rattenlebermikrosomen festgestellt, dass insbesondere größere Ringsystemen wie etwa alkylierte Benzo[a]pyrene im Gegensatz zu Methylpyrenen in wesentlich geringerem Umfang zum benzylischen Alkohol umgesetzt werden. Dies wurde auch in Untersuchungen mit humanen Lebermikrosomen bestätigt. Untersuchungen an einzelnen humanen Cytochromen P450 zeigten, dass insbesondere die durch PAK induzierbaren Formen hCYP1A1 und 1B1 hohe Umsatzraten aufwiesen. Die hepatisch exprimierten Formen hCYP1A2 und 3A4 waren jedoch auch zur Bildung der benzylischen Alkohole in der Lage. Für die anschließende Sulfonierung der benzylischen Alkohole wurden besonders hohe Aktivitäten mit den humanen Sulfotransferasen hSULT1A1, 1A2, 1C2 und 1E1 festgestellt. Aufgrund der Enzymexpression und der guten Durchblutung, die eine gute Substratversorgung ermöglicht, ist die Leber als Hauptort der benzylischen Hydroxylierung und Sulfonierung anzusehen. Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe zeigen jedoch, dass nach 1-Hydroxymethylpyren-Applikation bei Ratten die Niere die höchste Zahl an DNA-Addukten aufweist. Wegen der Fokussierung der Sulfonierung auf die Leber ist die systemische Verteilung der Schwefelsäureester die einzig plausible Erklärung. So wurde im Rahmen dieser Arbeit eine hochaffine Bindungsstelle für 2-Sulfoxymethylpyren an Albumin beschrieben und die Aufnahme von benzylischen Sulfaten durch die humanen organischen Anionentransporter hOAT1, 3 und 4 in Nierenzellen in vitro gezeigt. Für die in-vivo-Situation wurde der Einfluss von Ethanol, 4-Methylpyrazol, Pentachlorphenol, Quercetin und Disulfiram untersucht. Neben der durch die Detoxifizierung mittels Alkoholdehydrogenase und Aldehyddehydrogenase entstandenen benzylischen Carbonsäure kann als Biomarker die entsprechende Mercaptursäure herangezogen werden. Sie ist ein indirekter Nachweis für die reaktiven und toxischen benzylischen Sulfate der alkPAK. Für die beiden im Tierversuch eingesetzten benzylischen Alkohole (1-Hydroxymethylpyren und 1-Hydroxymethyl-8-methylpyren) konnte sie in Urin und Fäzes nachgewiesen werden. Es wurde jedoch ein deutlicher Unterschied in der gebildeten Menge sowie der Verteilung zwischen Urin und Fäzes für die beiden Mercaptursäuren festgestellt. Hierfür sind wahrscheinlich Unterschiede im Transport der benzylischen Schwefelsäureester sowie der Spezifität der an der Mercaptursäurebildung beteiligten Enzyme verantwortlich. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass der humane organische Anionentransporter hOAT1 1,8-Dimethylpyrenmercaptursäure nicht und der hOAT3 nur mit niedrigen Umsatzraten transportiert. Bei den Modulatoren zeigte die Gabe der kompetitiven Alkoholdehydrogenase-Hemmstoffe Ethanol und 4-Methylpyrazol die Bedeutung der Alkoholdehydrogenasen für die Entgiftung der benzylischen Alkohole: Die Oxidation zur entsprechenden Carbonsäure war reduziert und die Bildung der Mercaptursäure erhöht. Eine Hemmung der Toxifizierung vermittelt durch Sulfotransferase-Inhibitoren konnte nur für Pentachlorphenol beim Metabolismus des 1-Hydroxymethylpyrens beobachtet werden. Gleichzeitig erwies sich Pentachlorphenol als kompetitiver Alkoholdehydrogenase-Inhibitor, da eine signifikant geminderte Carbonsäureausscheidung zu beobachten war. Bei 1-Hydroxymethyl-8-methylpyren traten diese Effekte nicht auf. Die unterschiedlichen bzw. unterschiedlich starken Effekte der Modulatoren beim Metabolismus der verschiedenen benzylischen Alkohole bestätigen die Beobachtungen aus den in-vitro-Untersuchungen, dass unterschiedliche Enzym- und Transporteraffinitäten und –aktivitäten vorliegen. N2 - The toxicity and carcinogenicity of purely aromatic polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) is known since decades and has been thoroughly investigated. Compared to the purely aromatic PAH the alcylated PAH (alcPAH) can additionally be biologically activated because of their alcyl group. The alcyl group is hydroxylated and subsequently oxidised to the corresponding acid or conjugated. If unstable benzylic sulfoconjugates arrise from this bioactivation DNA adducts may be formed and could induce mutations. Concering the bioactivation of alcPAH this work should help to get to know which influence the structure has on the benzylic hydroxylation and it should be clarified which forms of human soluble sulfotransferases catalyse the sulfonation of benzylic alcohols. Furthermore the albumin binding of sulfuric acid esters and the uptake into kidney cells by human organic anion transporters in vitro have been analysed to get inside into transport processes. For the in vivo situation the modulation of enzyme activities by food compounds, pharmaceuticals and xenobiotics is of interest. As biomarkers the respective benzylic carboxylic acid and mercapturic acid were measured in urine only and feces. By the use of incubations with rat liver microsomes it turned out that larger ring systems were benzylically hydroxylated to a remarkable less extent then alcyl pyrenes. This observation was also made for human liver microsomes. In vitro experiments addressing the activity of single human cytochromes P450 revealed that PAH inducable forms hCYP1A1 and 1B1 had highest hydroxylation rates, but also the hepatically expressed forms hCYP3A4 and CYP1A2 catalysed the benzylic hydroxylation. The subsequently following sulfonation of the benzylic alcohols was found to be catalysed with high formation rates by human sulfotransferase hSULT1A1, 1A2, 1C2 and 1E1. Due to the enzyme expression and the high blood circluation ensuring the substrate supply it can be assumed that liver is the main organ for benzylic hydroxylation and sulfonation. Nevertheless results from our group showed that after 1-hydroxy methyl pyrene exposure, rats had higher levels of DNA adducts in kidneys than in liver. Thus, it has to be assumed that the sulfuric acid esters are systemically distributed. In the course of this work a high affinity albumin binding site for 2-sulfoxy methyl pyrene was identified and the uptake of sulfuric acid esters mediated by human organic anion tranporter 1, 3 and 4 to kidneys cells in vitro was shown. For the further estimation of the in vivo bioactivation of alcPAH the modulation of enzyme activities by ethanol, 4-methylpyrazole, quercetin, pentachlorophenol and disulfiram was explored. The carboxylic acids formed via alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase were used as biomarkers as well as the respective mercapturic acids. The occurence of the mercapturic acids is an indirect proof for the reactive and toxic benzylic sulfo conjugates. In the urine and fecal samples of rats treated with either 1-hydroxymethyl pyrene or 1-hydroxymethyl 8-methyl pyrene the corresponding mercapturic acids of the sulfuric acid esters were found. Even though the absolute amount excreted and the distribution in urine and fecal samples were quite different. This observation may be explained by differences in transport of the sulfuric acid esters as well as by different specificities of the enzymes responsable for mercapturic acid formation. Additionally it was shown that the human organic anion transporter 1 does not transport 1,8-dimethyl pyrenyl mercapturic acid and the human organic anion transporter 3 only with very little turnover. Whereas 1-methyl pyrenyl mercapturic acid was well transported by both of these proteins. With regard to the modulation the concurrent application of ethanol or 4-methyl pyrazole to rats revealed the important role of alcohol dehydrogenase for the detoxification of benzylic alcohols: The oxidation leading to the corresponding carboxylic acid was remarkably reduced and the excretion of the mercapturic acid via urine and feces was enhanced. In order to observe an inhibition of sulfotransferases pentachlorophenol and quercetine were concurrently applied to rats. An inhibitory effect by the means of an reduced excretion of mercapturic acid was only observed for pentachlorophenol in animals treated with 1-hydroxymethyl pyrene. In addition it turned out, that pentachlorophenol was a potent competitive alcohol dehydrogenase inhibitor as the renal excretion of the corresponding carboxylic acid was remarkably reduced. For 1-hydroxymethyl 8-methyl pyrene this modulation was not observed. These differences in effects and strenght of effects may be ascribed to different enzymatic and transport affinities and activities which have already been observed in in vitro experiments. KW - alkylierte polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe KW - benzylischer Alkohol KW - benzylisches Sulfat KW - 1-Hydroxymethylpyren KW - Mercaptursäure KW - alcylated polycyclic aromatic hydrocarbons KW - benzylic alcohol KW - benzylic sulfate KW - 1-hydroxy methyl pyrene KW - mercapturic acid Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-26939 ER - TY - THES A1 - Strohm, Daniela T1 - Modulation der Insulinsignalgebung durch Prostaglandin E2 und Endocannabinoide T1 - Modulation of insulin signaling by prostaglandin E2 and endocannabinoids N2 - Die adipositasbedingte Insulinresistenz geht mit einer unterschwelligen Entzündungsreaktion einher. Als Antwort auf dieses Entzündungsgeschehen wird PGE2 unter anderem von Kupffer Zellen der Leber freigesetzt und kann seine Wirkung über vier PGE2-Rezeptorsubtypen (EP1-EP4) vermitteln. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass PGE2 in Rattenhepatozyten über den EP3 R ERK1/2-abhängig die intrazelluläre Weiterleitung des Insulinsignals hemmt. Über die Modulation der Insulinrezeptorsignalkette durch andere EP-Rezeptoren war bisher nichts bekannt. Daher sollte in stabil transfizierten Zelllinien, die jeweils nur einen der vier EP-Rezeptorsubtypen exprimierten, der Einfluss von PGE2 auf die Insulinrezeptorsignalkette untersucht werden. Es wurden HepG2-Zellen, die keinen funktionalen EP-Rezeptor aufwiesen, sowie HepG2-Zellen, die stabil den EP1-R (HepG2-EP1), den EP3β-R (HepG2 EP3β) oder den EP4-R (HepG2 EP4) exprimierten, sowie die humane fötale Hepatozytenzelllinie, Fh hTert, die den EP2- und den EP4-R exprimierte, für die Untersuchungen verwendet. Die Zellen wurden für 330 min mit PGE2 (10 µM) vorinkubiert, um die pathophysiologische Situation nachzustellen und anschließend mit Insulin (10 nM) für 15 min stimuliert. Die insulinabhängige Akt- und ERK1/2-Phosphorylierung wurde im Western-Blot bestimmt. In allen Hepatomzelllinien die EP-R exprimierten, nicht aber in der Zelllinie, die keinen EP R exprimierte, hemmte PGE2 die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung. In allen drei stabil transfizierten Zelllinien, nicht jedoch in den Fh-hTert-Zellen, steigerte PGE2 die basale und insulinstimulierte Phosphorylierung der Serin/Threoninkinase ERK1/2. In den HepG2 EP1- und den HepG2-EP3β-Zellen steigerte PGE2 mutmaßlich über die ERK1/2-Aktivierung die Serinphosphorylierung des IRS, welche die Weiterleitung des Insulinsignals blockiert. Die Hemmung der Aktivierung von ERK1/2 hob in EP3 R-exprimierenden Zellen die Abschwächung der Insulinsignalübertragung teilweise auf. In diesen Zellen scheint die ERK1/2-Aktivierung die größte Bedeutung für die Hemmung der insulinstimulierten Akt-Phosphorylierung zu haben. Da durch die Hemmstoffe die PGE2-abhängige Modulation nicht vollständig aufgehoben wurde, scheinen darüber hinaus aber noch andere Mechanismen zur Modulation beizutragen. In den Fh hTert-Zellen wurde die Insulinrezeptorsignalkette offensichtlich über einen ERK1/2-unabhängigen, bisher nicht identifizierten Weg unterbrochen. Eine gesteigerte PGE2-Bildung im Rahmen der Adipositas ist nicht auf die peripheren Gewebe beschränkt. Auch im Hypothalamus können bei Adipositas Zeichen einer Entzündung nachgewiesen werden, die mit einer gesteigerten PGE2-Bildung einhergehen. Daher wurde das EP R-Profil von primären hypothalamischen Neuronen und neuronalen Modellzelllinien charakterisiert, um zu prüfen, ob PGE2 in hypothalamischen Neuronen die Insulinsignalkette in ähnlicher Weise unterbricht wie in Hepatozyten. In allen neuronalen Zellen hemmte die Vorinkubation mit PGE2 die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung nicht. In der neuronalen hypothalamischen Zelllinie N 41 wirkte PGE2 eher synergistisch mit Insulin. In durch Retinsäure ausdifferenzierten SH SY5Y-Zellen waren die Ergebnisse allerdings widersprüchlich. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass die Expression der EP Rezeptoren im Verlauf der Kultur stark schwankte und somit die EP R-Ausstattung der Zellen zwischen den Zellversuchen variierte. Auch in den primären hypothalamischen Neuronen variierte die EP R-Expression abhängig vom Differenzierungszustand und PGE2 beeinflusste die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung nicht. Obwohl in allen neuronalen Zellen die Akt-Phosphorylierung durch Insulin gesteigert wurde, konnte in keiner der Zellen eine insulinabhängige Regulation der Expression von Insulinzielgenen (POMC und AgRP) nachgewiesen werden. Das liegt wahrscheinlich an dem niedrigen Differenzierungsgrad der untersuchten Zellen. Im Rahmen der Adipositas kommt es zu einer Überaktivierung des Endocannabinoidsystems. Endocannabinoidrezeptoren sind mit den EP Rezeptoren verwandt. Daher wurde geprüft, ob Endocannabinoide die Insulinsignalweiterleitung in ähnlicher Weise beeinflussen können wie PGE2. Die Vorinkubation der N 41-Zellen für 330 min mit einem Endocannabinoidrezeptoragonisten steigerte die insulinstimulierte Akt-Phosphorylierung, was auf einen insulinsensitiven Effekt von Endocannabinoiden hindeutet. Dies steht im Widerspruch zu der in der Literatur beschriebenen endocannabinoidabhängigen Insulinresistenz, die aber auf indirekte, durch Endocannabinoide ausgelöste Veränderungen zurückzuführen sein könnte. N2 - The obesity related insulin resistance is accompanied by a low grade inflammation. In response to inflammatory stimuli, PGE2 is released from Kupffer cells and signals through four G-Protein coupled PGE2-receptors (EP1-EP4). Previous work showed that PGE2 attenuated insulin signaling in rat hepatocytes through an EP3ß- and ERK1/2-dependent mechanism. Since EP-receptor expression on hepatocytes varies between species and physiological conditions, the effect of the individual EP receptor subtypes on insulin signaling was studied in hepatoma cell lines expressing individual EP receptor subtypes. HepG2 cells lacking functional EP-receptors, and derivatives stably expressing either EP1 receptor (HepG2-EP1), EP3ß receptor (HepG2-EP3ß) or EP4 receptor (HepG2-EP4) and Fh-hTert cells expressing EP2- and EP4-receptor were pre-incubated with PGE2 for 330 min to mimic the sub-acute inflammation. The cells were subsequently stimulated with insulin for 15 min. Akt and ERK1/2 activation was determined by Western Blotting with phospho-specific antibodies. PGE2 inhibited insulin stimulated Akt phosphorylation in all cell lines expressing EP receptors, except in HepG2 cells which are lacking functional EP receptors. PGE2 increased insulin stimulated phosphorylation of the serine/threonine kinase ERK1/2 in all EP R expressing HepG2 cell lines except in Fh-hTert cells. In HepG2-EP1 and HepG2 EP3ß cells PGE2 increased the serine phosphorylation of the insulin receptor substrate, presumably through an ERK1/2 activation. This IRS-serine phosphorylation leads to attenuation of insulin signal transduction. Inhibiting ERK1/2 activation with a specific inhibitor attenuated the PGE2-dependent inhibition of insulin signal transmission in HepG2 EP3ß cells to some extent. ERK1/2 activation in these cells seems to be of major importance for the observed attenuation of insulin stimulated Akt phosphorylation. Application of inhibitors in the other cell lines stably expressing EP receptors provided evidence that other mechanisms contributed to the attenuation of insulin signaling. Insulin signal transduction in Fh-hTert cells by PGE2 was apparently blocked by an ERK1/2-independent mechanism. Increased PGE2 production during obesity is not limited to the periphery. Signs of inflammation have been detected in the hypothalamus, which might be associated with an increased PGE2 production. Therefore, the EP receptor profile of primary neurons as well as neuronal cell models was characterised in order to investigate, whether PGE2 attenuates insulin signal transduction in neuronal cells similar to what was observed in hepatocytes. Pre-incubation with PGE2 did not attenuate insulin stimulated Akt phosphorylation in all neuronal cells. The EP receptor profile in SH SY5Y cells and in primary neurons varied depending on the differentiation status of the cells. Although Akt-kinase was phosphorylated in response to insulin stimulation in all neuronal cells studied, gene expression of insulin target genes (POMC, AgRP) was not modulated by insulin. This might be due to the low level of differentiation of the investigated cells. In the course of obesity, an over-activation of the endocannabinoid system is detected. Since endocannabinoid receptors are related to EP receptors, it was investigated whether endocannabinoids can interfere with insulin signaling in a similar way as PGE2. Pre-incubation of the neuronal cell line N 41 for 330 min with an endocannabinoid receptor agonist, increased insulin stimulated Akt phosphorylation. This implies an insulin sensitising effect of endocannabinoids. This is contradictory to the endocannabinoid-dependent insulin resistance described in the literature and might be caused by indirect endocannabinoid-triggered mechanisms. KW - Insulin KW - Prostaglandin E2 KW - Endocannabinoide KW - Signalübertragung KW - Insulin KW - prostaglandin E2 KW - endocannabinoids KW - signal transduction Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-49678 ER - TY - THES A1 - Töle, Nadine T1 - Molekulare und histologische Untersuchungen zur gustatorischen Fettwahrnehmung des Menschen T1 - Molecular and histological analyses of human gustatory fat perception N2 - Die hohe Energieaufnahme durch Fette ist ein Hauptfaktor für die Entstehung von Adipositas, was zu weltweiten Bestrebungen führte, die Fettaufnahme zu verringern. Fettreduzierte Lebensmittel erreichen jedoch, trotz ihrer Weiterentwicklung, nicht die Schmackhaftigkeit ihrer Originale. Die traditionelle Sichtweise, dass die Attraktivität von Fetten allein durch Textur, Geruch, Aussehen und postingestive Effekte bestimmt wird, wird nun durch das Konzept einer gustatorischen Wahrnehmung ergänzt. Bei Nagetieren zeigte sich, dass Lipide unabhängig von den vorgenannten Eigenschaften erkannt werden, sowie, dass Fettsäuren, freigesetzt durch linguale Lipasen, als gustatorische Stimuli fungieren und Fettsäuresensoren in Geschmackszellen exprimiert sind. Die Datenlage für den Menschen erwies sich jedoch als sehr begrenzt, daher war es Ziel der vorliegenden Arbeit molekulare und histologische Voraussetzungen für eine gustatorische Fettwahrnehmung beim Menschen zu untersuchen. Zunächst wurde humanes Geschmacksgewebe mittels RT-PCR und immunhistochemischen Methoden auf die Expression von Fettsäuresensoren untersucht, sowie exprimierende Zellen in Kofärbeexperimenten charakterisiert und quantifiziert. Es wurde die Expression fettsäuresensitiver Rezeptoren nachgewiesen, deren Agonisten das gesamte Spektrum an kurz- bis langkettigen Fettsäuren abdecken (GPR43, GPR84, GPR120, CD36, KCNA5). Ein zweifelsfreier Nachweis des Proteins konnte für den auf langkettige Fettsäuren spezialisierten Rezeptor GPR120 in Typ-I- und Typ-III-Geschmackszellen der Wallpapillen erbracht werden. Etwa 85 % dieser GPR120-exprimierenden Zellen enthielten keine der ausgewählten Rezeptoren der Geschmacksqualitäten süß (TAS1R2/3), umami (TAS1R1/3) oder bitter (TAS2R38). Somit findet sich in humanen Geschmackspapillen nicht nur mindestens ein Sensor, sondern möglicherweise auch eine spezifische, fettsäuresensitive Zellpopulation. Weitere RT-PCR-Experimente und Untersuchungen mittels In-situ-Hybridisierung wurden zur Klärung der Frage durchgeführt, ob Lipasen in den Von-Ebner-Speicheldrüsen (VED) existieren, die freie Fettsäuren aus Triglyceriden als gustatorischen Stimulus freisetzen können. Es zeigte sich zwar keine Expression der bei Nagetieren gefundenen Lipase F (LIPF), jedoch der eng verwandten Lipasen K, M und N in den serösen Zellen der VED. In-silico-Untersuchungen der Sekundär- und Tertiärstrukturen zeigten die hohe Ähnlichkeit zu LIPF, erwiesen aber auch Unterschiede in den Bindungstaschen der Enzyme, welche auf ein differenziertes Substratspektrum hinweisen. Die Anwesenheit eines spezifischen Signalpeptids macht eine Sekretion der Lipasen in den die Geschmacksporen umspülenden Speichel wahrscheinlich und damit auch eine Bereitstellung von Fettsäuren als Stimuli für Fettsäuresensoren. Die Übertragung des durch diese Stimuli hervorgerufenen Signals von Geschmackszellen auf gustatorische Nervenfasern über P2X-Rezeptormultimere wurde mit Hilfe einer vorherigen Intervention mit einem P2X3 /P2X2/3-spezifischen Antagonisten an der Maus als Modellorganismus im Kurzzeit-Präferenztest untersucht. Es zeigte sich weder eine Beeinträchtigung der Wahrnehmung einer Fettsäurelösung, noch einer zuckerhaltigen Kontrolllösung, wohingegen die Wahrnehmung einer Bitterstofflösung reduziert wurde. Somit ist anhand der Ergebnisse dieser Arbeit eine Beteiligung des P2X3-Homomers bzw. des P2X2/3-Heteromers unwahrscheinlich, jedoch die des P2X2-Homomers und damit der gustatorischen Nervenfasern nicht ausgeschlossen. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen auf die Erfüllung grundlegender Voraussetzungen für die gustatorische Fett(säure)wahrnehmung hin und tragen zum Verständnis der sensorischen Fettwahrnehmung und der Regulation der Fettaufnahme bei. Das Wissen um die Regulation dieser Mechanismen stellt eine Grundlage zur Aufklärung der Ursachen und damit der Bekämpfung von Adipositas und assoziierten Krankheiten dar. N2 - High consumption of energy from fat is considered one of the main factors that evoke obesity which led to a worldwide effort to reduce dietary fat intake. However, despite their continuous improvement, fat-reduced foods do not yet reach the palatability of their originals. The traditional view that the attraction to fats is only determined by texture, odor, appearance as well as postingestive effects is now challenged by the concept of gustatory sensation of fats. After excluding or masking the aforementioned features, rodents showed continuous attraction towards lipid solutions. Also long-chain fatty acids liberated from triglycerides by lingual lipases as the main stimulus and the expression of fatty acid-sensitive receptors in taste buds was shown. In contrast, only little data exists for humans. Therefore, this thesis aimed at elucidating the molecular and cellular prerequisites for a gustatory detection of fat. First, human taste tissue was examined by RT-PCR and immunohistochemical methods for the expression of fatty acid sensors and the expressing cells were characterized and quantified by co-staining procedures. The expression of fatty acid-sensitive receptors was shown whose agonists cover the whole range of short- to long-chain fatty acids (GPR43, GPR84, GPR120, CD36, and KCNA5). Protein expression of the long-chain fatty acid receptor GPR120 in type I and type III taste cells was unambiguously demonstrated. About 85 % of the GPR120-expressing cells did not co-express receptors for sweet (TAS1R2/3), umami (TAS1R1/3) or bitter (TAS2R38) taste. Hence, not only does at least one fatty acid sensor exist in human taste papillae, but possibly also a special fatty acid-sensitive cell population. Additional RT-PCR experiments and in situ hybridization analyses were used to address the question, if lipases in the Von-Ebner-salivary glands (VEG) produce free fatty acids from triglycerides as gustatory stimuli. Unlike mice which express lipase F, lipases K, M and N, which are highly related to lipase F, were found to be expressed in the serous cells of the VEG. In silico approaches confirmed high similarities of the secondary and tertiary structures of these lipases to lipase F. Also a marked difference in the binding pocket of the enzymes was observed, which suggests differential substrate specificity. The presence of a signal peptide sequence proposes that the lipases K, M, and N are secreted into the trenches of gustatory papillae. This would result in lipolysis of dietary triglycerides and generation of stimuli for the fatty acid sensor GPR120. Next the hypothesis was tested whether GPR120-generated signals are conveyed to gustatory nerves via P2X-receptor-multimers. To this end short term preference tests were performed in mice after intervention with a P2X3-/P2X2/3-specific antagonist. However, this treatment did not affect the preference of mice for the fatty acid or for a sweet control solution, whereas recognition of a bitter solution was impaired. Thus, an involvement of the P2X3-homomer or the P2X3-/P2X2/3-heteromer seems unlikely. However, these results do not exclude a contribution of P2X2-receptor-heteromers and in turn gustatory nerves for the preference of fatty acid solutions. In summary, the results of this thesis give new insights into the molecular and cellular prerequisites for a gustatory component for fat detection in humans. They also help understanding fat sensation and the regulation of fat intake which in turn may eventually promote novel concepts for the treatment of obesity and related diseases. KW - Geschmack KW - Fettwahrnehmung KW - Fettsäuren KW - Sensorik KW - Lipasen KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - taste KW - fat perception KW - fatty acids KW - lipases KW - G-protein coupled receptors KW - sensory analysis Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-93180 ER - TY - THES A1 - Wagner, Karen T1 - nTOBEC - eine neue Methode zur Erfassung der Körperzusammensetzung T1 - nTOBEC - a new method to estimate the human body composition N2 - Als Resultat überhöhter Energieaufnahme und zu geringen Energieverbrauchs beobachten wir eine über das normale Maß hinausgehende Akkumulation von Fettgewebe, die sich als Adipositas manifestiert. Sie gilt als einer der Hauptrisikofaktoren für Krankheiten des metabolischen Syndroms. Im Rahmen von Prävention, Diagnose und Therapie der Adipositas, muss ihr wesentliches Charakteristikum; der individuelle Körperfettanteil; einer Messung zugänglich gemacht werden. Eine direkte Bestimmung der Körperzusammensetzung erlauben die Neutronenaktivierungsanalyse und die chemische Analyse. Beide Verfahren sind sehr genau, aber aufwendig und kostenintensiv und darüber hinaus die chemische Analyse nur am menschlichen Cadaver praktizierbar. Um dennoch die Körperzusammensetzung hinreichend genau bestimmen zu können, wurden zahlreiche indirekte Messverfahren entwickelt. Man kann sie in Labor- und Feldmethoden untergliedern. Die Labormethoden bestechen durch hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit, sind aber zumeist aufwendig und teuer. Feldmethoden sind im Gegensatz dazu leicht anwendbar, transportabel und preiswert, weisen aber eine weniger hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit auf. In der vorgestellten Arbeit wird über eine jüngere Entwicklung, die das Prinzip der unterschiedlichen Leitfähigkeit für den elektrischen Strom durch die verschiedenen Gewebe des Körpers nutzt, berichtet. Der Prototyp eines Gerätes wurde innerhalb eines von der EU geförderten multizentrischen Projekts entwickelt und auf seine Einsatzfähigkeit und Qualität hin geprüft. Der Schwerpunkt der Arbeit liegt auf der Einschätzung der Körperzusammensetzung normal- und übergewichtiger Probanden mit der neu entwickelten Technik. Das vorliegende Studiendesign diente nicht nur der Beurteilung der neuen Technik die Körperzusammensetzung und Veränderungen dieser zu erfassen, sondern darüber hinaus, etablierte Methoden hinsichtlich ihrer Genauigkeit zu bewerten. Bezüglich ihrer Anwendbarkeit und Reproduzierbarkeit hat die neue Methode Hoffnung geweckt, sich als eine Feldmethode zu etablieren. Auf der anderen Seite zeigte sich in Abhängigkeit der Gesamtkörperfettmasse eine Überschätzung der Zielgröße im Vergleich zur Referenzmethode (dual energy x ray absorptiometry (DXA)). Die Abweichungen waren dabei gerade für das einzelne Individuum sehr groß. Technische Verbesserungen und die Entwicklung spezifischer Regressionsgleichungen könnten in Zukunft zu einer wesentlichen Verbesserung der neuen Methode beitragen. Die Labormethode "Air Displacement Plethysmography" konnte durch die guten Übereinstimmungen der Ergebnisse mit denen der Referenzmethode DXA und die einfache Anwendung überzeugen. Sie stellt eine durchaus konkurrenzfähige Alternative zur Hydrodensitometrie dar, die noch heute als "goldener Standard" zur Erfassung der Körperzusammensetzung akzeptiert wird. Im Verlauf der durchgeführten Studie stellte sich heraus, dass die Hydrodensitometrie sehr hohe Anforderungen an den Probanden stellt. Das Untertauchen des gesamten Körpers unter Wasser in Kombination mit einer maximalen Ausatmung erwies sich als sehr problematisch. Die dabei auftretenden Fehler schlugen sich in der Berechnung der Gesamtkörperfettmasse des einzelnen Individuums wieder und führten zu zum Teil erheblichen Abweichungen der Ergebnisse von denen der Referenzmethode. Die Feldmethoden bioelektrische Impedanzanalyse und Hautfaltendickenmessung erwiesen sich als kostengünstige und leicht anwendbare Methoden. Die Ergebnisse beider Methoden stimmten im Mittel gut mit den Ergebnissen der Referenzmethoden überein. Dennoch zeigte die BIA größere Abstriche in der Beurteilung der Gesamtkörperfettmasse des einzelnen Individuums und bei der Dokumentation von Veränderungen der Gesamtkörperfettmasse. Die Hautfaltendickenmessung stellt – wendet man sie korrekt an – eine Methode dar, die sowohl die Gesamtkörperfettmasse als auch Veränderungen dieser gut erfassen kann. In Abhängigkeit der geforderten Genauigkeit kann diese Methode für die Erfassung der Körperzusammensetzung empfohlen werden. Demnach bleibt die Frage unbeantwortet, inwieweit die indirekten Methoden in der Lage sind, die "wahre" Körperzusammensetzung adäquat zu erfassen. Jede neu entwickelte Methode – die möglichst viele Vorteile in sich vereint – wird wieder vor dem Problem stehen: eine geeignete und dabei praktikable Referenzmethode zu finden, die die wahre Körperzusammensetzung zu bestimmen in der Lage ist. Daher sollte neben dem Streben nach der Entwicklung einer Methode, die genau und leicht anwendbar ist, das Hauptaugenmerk auf die Überarbeitung der zugrunde liegenden Modellvorstellungen und die Verbesserung von Regressionsgleichungen gelegt werden. N2 - Western industrial countries are characterized by sedentary lifestyle and a high-fat and simple carbohydrate diet. Decrease physical activity and increase energy intake are leading to an epidemic increase of overweight and obesity. Obesity is defined as the presence of excess adipose tissue and has been associated with an increased risk for diseases of the metabolic syndrome. Thus, the importance of obtaining reliable and accurate body fat estimates is essential not only for the prevention, but also for the diagnosis and therapy of obesity. Direct chemical analysis is the most definitive method for determining human body composition. The few data obtained on the composition of adult bodies stemmed from cadaver analyses, dated back to 1945 and 1956. These results contributed greatly to the actual fundamental knowledge about human body composition. Obviously, the method is limited by the precondition of needing the human cadaver and the high complexity of the analyses. Because of this limitation, indirect methods have been developed during the last decades. To date more than ten methods to estimate body composition in vivo are available. The methods can be generally organized into two groups: laboratory and fields methods. Laboratory methods have high accuracy and reproducibility, but are complex and very expensive, whereas field methods are easy to use and economically priced, but less accurate. A new device that combines the positive features of both, laboratory and field methods is needed . An already existing method - Total Body Electrical Conductivity (TOBEC) - meets the requirements for such new device. The technique is based on the principle, that lean tissue is far more electrically conductive than fat, due to the higher content of electrolytes in the fat-free mass. The difference between impedance when a subject is inside and outside of the generated field is an index of the total electrical conductivity of the body, which, in turn is proportional to the lean body mass of the subject. Within the European Project BodyLife (IST - 2000 - 25410) a new field method for estimation the human body composition was developed. To assess the suitability of the new technique the present study aimed to evaluate the reliability of nTOBEC and to validate it against established laboratory and field methods. Within the project the development of the new method (nTOBEC) succeeded to combine the TOBEC-principle, and additionally, to be transportable and easy to use. The high reliability coefficients found in this investigation indicate that nTOBEC is an extremely reliable instrument. By application the new technique we observed a significant overestimation of total body fat mass compared the reference method dual energy x ray absorptiometry (DXA) in both, males and females. However, nTOBEC could document changes in total body fat mass during a weight loss intervention trial. Our data suggest nTOBEC deserves further investigation with the intention of establishing nTOBEC as a non-invasive method for accurately quantifying total body fat mass. Aside from these results we observed accurate results for the easy to use laboratory method "air displacement plethysmography" compared to the results measured by DXA. Furthermore, the field methods - bioelectrical impedance analysis and skinfold thickness measurement – produced good results compared to the reference method. KW - Fettsucht KW - Metabolisches Syndrom KW - Körperfett KW - Körperzusammensetzung KW - adiposity KW - metabolic syndrom KW - human body composition KW - total body fat Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5702 ER - TY - THES A1 - Kipp, Anna Patricia T1 - Physiologische und Tumor-Assoziierte Funktionen von Selen und Selenoproteinen Y1 - 2014 ER - TY - THES A1 - Nieschalke, Kai T1 - Proteinaddukte und Urinmetaboliten des Nagetierkanzerogens Methyleugenol als Biomarker der Exposition Y1 - 2021 ER - TY - THES A1 - Hoyer, Stephan W. T1 - Prädiktiver Wert sensorischer Laboruntersuchungen für den Getränkekonsum älterer Menschen unter Alltagsbedingungen N2 - Zur Ermittlung der Akzeptanz und ihres prädiktiven Wertes für den Verzehr von Lebensmitteln bzw. Getränken, sind Beliebtheitsprüfungen mit Konsumenten unter standardisierten Bedingungen im Sensoriklabor üblich. Die prädiktive Aussagekraft dieser Laboruntersuchungen wird jedoch durch folgende Aspekte eingeschränkt: (1) Der situative Kontext wird ausgeschaltet, d.h. die Verzehrssituation, in der ein Produkt üblicherweise konsumiert wird, ist im Labor bewusst eliminiert und das zu bewertende Produkt wird nicht in einer kompletten Mahlzeit dargeboten (2) Der Produktkontakt im Labor ist im Gegensatz zu der anhaltenden Konfrontation unter alltäglichen Bedingungen nur kurzfristig, was Langzeitaussagen bzw. Dauerpräferenzen nicht zuläßt; (3) Im Labortest ist die freie Auswahl auf eine geringe Anzahl angebotener Produkte beschränkt. In dieser Arbeit soll daher die Frage beantwortet werden, welchen prädiktiven Wert sensorische Beliebtheitsuntersuchungen im Labor für Lebensmittelakzeptanz und -verzehr unter Alltagssituationen haben. Dies wird für verschiedene Altersgruppen gezeigt, die frei in ihrer Entscheidungsfindung sind. Dazu gaben 56 Studenten (23,1±3,7 Jahre) und zwei Seniorengruppen, zum einen aus einer Begegnungsstätte (20 Probanden; 75,6±8,1 Jahre) und zum anderen aus dem betreuten Wohnen (14 Probanden; 76,1±12,5 Jahre), in einer ersten Laboruntersuchung Beliebtheitsbewertungen (Akzeptanz und Rangordnungsprüfung) zu 6 Erfrischungsgetränken ab. Anschließend folgte ein mindestens vierwöchiger Zeitraum, in denen die Probanden aus einem speziell für die Studie konzipierten Automaten Getränke in Einrichtungen der Gemeinschaftsverpflegung entnehmen konnten. Die Entnahme war via Chipkarte ad libitum möglich. Computergestützt wurden dabei individuelle Getränkewahl, Menge und Entnahmezeit aufgezeichnet. Unmittelbar nach der Automatenphase wurde eine erneute Laboruntersuchung durchgeführt. In allen Untersuchungsphasen wurden dieselben Erfrischungsgetränke aus Konzentrat, variiert in Apfel- oder Orangensaftgeschmack, ohne oder mit Zusatz von Zucker (20g/l) und Kohlensäure (4 g/l CO2), angeboten. Eine Quntitativ Deskriptive Analyse bestätigte unterschiedliche Profile bei den Produkten, so dass von sensorisch wahrnehmbaren Unterschieden zwischen den Produkten ausgegangen werden konnte. Die Probanden bekamen zu keiner Zeit Informationen über die exakte Zusammensetzung der Getränke. Sowohl in der Laborbewertung als auch nach Getränkekonsum via Automat, fanden sich unterschiede zwischen den Altersgruppen. In der Akzeptanzprüfung bewerteten Studenten die Apfelvarianten besser als die Orangenvarianten. Senioren, die insgesamt höhere Akzeptanzwerte vergaben, bewerteten alle Getränke in fast allen Attributen gleichermaßen gut. Nach der 4-wöchigen Automatenphase hatte sich die Akzeptanz der sechs Getränke nicht wesentlich geändert. Auch in beiden Rangordnungsprüfungen waren bei den Studenten „Apfel“ und „Apfel mit Kohlensäure“ auf den ersten Plätzen, „Orange mit Zuckerzusatz“ auf dem letzten Platz. Nach Adjustierung auf die individuelle Trinkmenge (in Wenig-, Mittel- Vieltrinker) und wurde „Apfel mit Kohlensäure“ in der Automatenphase von den Studenten am meisten getrunken. In der Vieltrinkergruppe wurde „Orange mit Zuckerzusatz“ deutlich vernachlässigt. Der Automatenkonsum der Studenten bestätigte damit im Wesentlichen die Ergebnisse der Beliebtheitsprüfung im Labor. Bei den Senioren waren in der Rangordnungsprüfung, die eine Lieblingsreihenfolge erzwang, alle süßeren Getränke (mit Zuckerzusatz) auf den ersten Plätzen. In der Automatenphase wurden jedoch viele Getränke ohne Zuckerzusatz bevorzugt. Dies zeigte sich sowohl in der individuellen Präferenz, als auch im Gesamtkonsum. Aufgrund der Ergebnisse kann der prädiktive Wert von Laboruntersuchungen mit Senioren in Bezug auf die Auswahl und den Konsum unter alltäglichen Bedingungen als gering beurteilt werden. Die Getränke mit der individuell höchsten Laborpräferenz wurden unter Alltagsumgebung in der Gemeinschaftsverpflegung in deutlich geringeren Umfang als erwartet verzehrt. In der Vergleichsgruppe der Studenten ist die Übereinstimmung größer(p<0,05). In Häufigkeitsfragebögen vor und nach der Automatenphase wurde das Trinkverhalten speziell von kohlensäurehaltigen Getränken erfragt. Der Anteil von kohlensäurehaltigen Getränken ist sehr variabel, und kann tagesabhängig von einem geringen bis zum Hauptanteil ausmachen. Senioren tranken von den Automatengetränken weniger kohlensäurehaltige Getränke als Studenten(p<0,001). Trotzdem zeigte nur eine Minderheit einen völligen Verzicht, wie sich durch Fragebogen und auch Automatenkonsum ermitteln ließ. Die Verwendung eines computergestützten Getränkeautomaten bietet eine neue Möglichkeit, die Langzeitpräferenz und den tatsächlichen Konsum unter gewohnten Alltagsbedingungen und bei freier Produktauswahl zu ermitteln. Selbst bei Altersgruppen, die mit Laboruntersuchungen überfordert sind, können Vorlieben untersucht werden. N2 - Background: For predicting consumption of food products consumer acceptance is usually measured by using hedonic scales in the sensory lab. However, the predictive value of such results is limited by different facts: (1) the real life context is missing, e.g. the tested product is not integrated into a meal, (2) only short confrontation with the product in lab in contrast to long-term exposure in the real life. Therefore, methods are needed which give a more reliable estimate of long-term preference and consumption. Objective: To develop and to validate an automatic device to estimate the long-term acceptance of beverages in young and elderly people. Methods: A new computerized vending machine was designed and established. The device is able to deliver 6 different types of beverages and can be placed in any public room. Study participants, after identifying themselves by a chip card, are free to select any quality and quantity of the offered beverages. The individual consumption data is registered. For comparing these consumption data with hedonic lab measurements a total of 56 students (mean age 23,1) and 34 seniors (mean age 76.1) were recruited for a 3-step experiment. In the first step they visited the sensory lab and rated on a 7 point hedonic scale and afterwards ranked 2 orange and 4 apple juices modified in their sugar and carbon dioxide content. In the second step the computerized vending machine was placed in a location, where the subjects usually eat, i.e. a university canteen or senior club or an assisted living home for seniors. Subjects were offered the same beverages as in lab test. The machine registered the individual choice and consumption (amount, time). In the third step the lab test was repeated. Results: In seniors the lab acceptance test with similar products has no discriminatory power. The ranking test reveals to be more reliable for elderly people. Moreover, seniors prefer sweeter products in the lab. This is not found among younger people. The lab measurements with seniors are low in their value concerning their real life choice and intake via the device. The correlation coefficient between lab ranking and beverage choice was lower for seniors than students (p< 0.05). There was no difference between young and elderly people in the ability to handle the device. In general, students prefer more carbonated beverages than seniors(p<0.001) Conclusion: The results obtained by the new device give better information on long-term beverage consumptions than preference measurements in the lab. KW - Getränkeauswahl KW - Konsum KW - Getränkeautomat KW - Alltagsbedingungen KW - vending machine KW - food choice KW - beverage KW - situation KW - real life context Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001057 ER - TY - THES A1 - Schraplau, Anne T1 - Regulation der Expression von Xenobiotika-metabolisierenden Enzymen und Deiodasen durch die Xenobiotika-abhängige wechselseitige Induktion von Xenosensor-Transkriptionsfaktoren und Prostaglandin E2 BT - Auswirkung auf die Aktivierung und Inaktivierung von Schilddrüsenhormonen Y1 - 2017 ER - TY - THES A1 - Coleman Mac Gregor of Inneregny, Charles Dominic T1 - Rolle von mPGES1-abhängig gebildetem Prostaglandin E2 bei der Ausbildung von Insulinresistenz und nicht-alkoholischer Fettlebererkrankung durch die Modulation der Funktion von Lebermakrophagen N2 - Eine Störung des Leberstoffwechsels durch die Ausbildung einer Insulinresistenz kann zu Folgeerkrankungen wie der nicht alkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD) bis hin zur Steatohepatitis (NASH) und zur Entwicklung eines Diabetes Typ II führen. Am Krankheitsverlauf sind residente (Kupfferzellen) sowie infiltrierende Makrophagen beteiligt, die durch inflammatorische Stimuli aktiviert werden und zur Progression von Lebererkrankungen führen können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle von mPGES1-abhängig gebildetem Prostaglandin E2 (PGE2) an der Modulation von aktivierten Lebermakrophagen untersucht. Dazu wurden Kupfferzellen und Peritonealmakrophagen (als Modell für infiltrierende Makrophagen) aus Wildtyp und mPGES1-defizienten Mäusen isoliert. Beide Makrophagen­populationen wurden in Zellkulturversuchen mit Lipopolysacchariden (LPS) aktiviert und auf ihre PGE2-Synthese, Genexpression und Sekretion von verschiedenen Cytokinen hin untersucht. Die beiden Makrophagenpopulationen unterschieden sich hinsichtlich der PGE2-Synthese bei mPGSE1-Defizienz. Während bei Peritonealmakrophagen die LPS-abhängige PGE2-Synthese bei Abwesenheit der mPGES1 fast vollständig reprimiert war, war bei Kupfferzellen nur eine 25%ige Abnahme zu verzeichnen. Die postulierte selbstverstärkende Rückkopplungsschleife von PGE2 im Hinblick auf seine eigene Synthese konnte in isolierten Peritonealmakrophagen, nicht jedoch in Kupfferzellen, bestätigt werden. In Kupfferzellen führte exogenes PGE2 ferner zu einer Repression von den pro-inflammatorischen Cytokinen TNFα und IL-1β und für endogenes PGE2 konnte in diesem Zelltyp kein Effekt festgestellt werden. In Peritonealmakrophagen konnte hingegen auch für endogenes PGE2 eine reprimierende Wirkung auf die Expression von TNFα beobachtet werden. Das ist eventuell auf eine höhere Sensitivität gegenüber PGE2 von Peritonealmakrophagen im Vergleich zu Kupfferzellen zurückzuführen. PGE2 wirkte unter den gewählten Versuchsbedingungen in vitro somit eher anti-inflammatorisch. Cholesterolkristalle induzierten in Kupfferzellen die Expression der PGE2-synthetisierenden Enzyme und verschiedener pro-inflammatorische Cytokine. Sie könnten somit zu einer Progression von NAFL zu NASH beitragen. Die Daten aus dieser Arbeit deuten darauf hin, dass PGE2 im Rahmen von entzündlichen Leberveränderungen eine eher protektive Wirkung im Hinblick auf die Progression von NAFLD und Insulinresistenz haben könnte. KW - Insulinresistenz KW - Prostaglandin E2 KW - NAFLD KW - Kupfferzellen Y1 - ER - TY - THES A1 - Kipp, Anna Patricia T1 - Selen, Selenoproteine und der Wnt-Signalweg : Regulation der gastrointestinalen Glutathionperoxidase durch β-Catenin und Beeinflussung des Wnt-Signalwegs durch den Selenstatus T1 - Selenium, selenoproteins, and the Wnt pathway : regulation of the gastrointestinal glutathione peroxidase via the Wnt pathway and influence of the selenium status on the activity of the Wnt pathway N2 - Das seit 1957 als essentiell klassifizierte Spurenelement Selen vermittelt seine Funktion hauptsächlich durch seinen Einbau in Selenoproteine in Form der 21. proteinogenen Aminosäure Selenocystein. Insgesamt wurden 25 humane Gene für Selenoproteine identifiziert, deren genaue Funktion häufig noch nicht bekannt ist. Selen ist das einzige Mitglied aus der Gruppe der Mikronährstoffe, für das nach wie vor eine antikanzerogene Funktion vor allem in Bezug auf Darmkrebs postuliert wird. Die Grundlage dafür liefert eine Interventionsstudie, bei der 1.312 Probanden für 4,5 Jahre mit 200 μg Selen/Tag supplementiert wurden. Dies resultierte in einer Senkung der Gesamtkrebsmortalität um 50 %. Die Fragen einer optimalen Selenzufuhr, die nicht nur den Bedarf deckt, sondern auch die Entfaltung der antikanzerogenen Wirkung von Selen gewährleistet und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch ungeklärt. Zudem liegt die Selenzufuhr bei einem Großteil der europäischen Bevölkerung unter den Empfehlungen. Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit vier Wochen alte Mäuse für sechs Wochen marginal defizient (0,086 mg/kg Futter) bzw. selenadäquat (0,15 mg/kg Futter) gefüttert. Dieser geringe Unterschied im Selengehalt resultierte in einer Senkung des Plasmaselenspiegels der selenarmen Tiere auf 13 % und der GPx-Aktivität in der Leber auf 35 %. Zunächst wurde der Einfluss von Selen auf die globale Genexpression im murinen Colon mittels Microarray untersucht. Von den im Colon exprimierten Selenoproteinen reagierte die mRNA von SelW, SelH, GPx1 und SelM im Selenmangel besonders deutlich mit Expressionsverlust. Da diese Selenoproteine nicht nur im Colon, sondern auch in Leukozyten reguliert waren, sind sie auch als humane Biomarker für die in dieser Studie gewählte Schwankung des Selengehalts geeignet. Des Weiteren wurde auf Basis der Microarraydaten eine Signalweganalyse durchgeführt, die der Identifizierung krebsrelevanter Signalwege diente, um mögliche molekularbiologische Erklärungsansätze für die Rolle von Selen im Krebsgeschehen zu finden. Es zeigte sich, dass die mRNA von Schlüsselgenen des Wnt-Signalwegs wie β-Catenin, Gsk3β, Dvl2, Tle2, Lef1 und c-Myc auf Schwankungen des Selengehalts reagiert. Vor allem die Induktion von c-Myc, einem Zielgen des Wnt-Signalwegs, deutet darauf hin, dass dieser im Selenmangel tatsächlich aktiver ist als bei selenadäquater Versorgung. Ein weiterer möglicher Erklärungsansatz für die postulierte präventive Funktion von Selen gegenüber Darmkrebs ist die gastrointestinale Glutathionperoxidase (GPx2), die physiologisch in den proliferierenden Zellen des Kryptengrunds exprimiert wird. Die Regulation dieses Enzyms durch den Wnt-Signalweg, der ebenfalls in proliferierenden Zellen aktiv ist, konnte mittels Reportergenanalyse und endogen auf mRNA- und Proteinebene in Zellkultur gezeigt werden. Die Aktivierung verkürzter Promotorkonstrukte und die Mutation eines potentiellen Bindeelements identifizierten den für die Bindung von TCF und β-Catenin verantwortlichen Bereich. Als Zielgen des Wnt-Signalwegs scheint GPx2 zu den an Proliferationsprozessen beteiligten Genen zu gehören, was unter physiologischen Bedingungen die Aufrechterhaltung des intestinalen Epithels gewährleistet. Bei der Entstehung intestinaler Tumore, die in der Initiationsphase zu über 90 % mit einer konstitutiven Aktivierung des Wnt-Signalwegs einhergeht, wirkt GPx2 möglicherweise prokanzerogen. Die genaue Funktion von GPx2 während der Kanzerogenese bleibt weiter zu untersuchen. N2 - Suboptimal selenium (Se) status has been suggested to be associated with a higher risk of developing various cancers, especially colon cancer. In mammals, Se exerts its functions through selenoproteins into which it is incorporated as selenocysteine. Since the function of many selenoproteins has not been identified the underlying mechanisms of the anti-carcinogenic function of Se remains unclear. Therefore, mice were fed either a marginal Se-deficient diet (0.086 mg Se/kg) or a Se-adequate diet (0.15 mg Se/kg) for six weeks. The plasma Se level was reduced to 13 % in the Se-deficient group while GPx activity in the liver was reduced to 35 %. The influence of Se on the global gene expression pattern was analysed using microarray technology. Among selenoproteins SelW, GPx1, SelH and SelM were consistently lower expressed in animals fed with the Se-deficient diet. As the mRNA of these genes was regulated in leucocytes as well, they are possible new biomarkers for the Se status in human studies. In addition, pathway analysis revealed that the cancer-relevant Wnt pathway was affected by the Se status, indicated by changes in the mRNA expression of key proteins like β-catenin, Gsk3β, Dvl2, Tle2, Lef1 and the Wnt target gene c-Myc. The regulation of these genes by Se points to a slightly increased basal activity level of the Wnt pathway in the Se poor state and may therefore contribute to the higher cancer risk in a marginal Se deficiency. Another possible explanation for anti-carcinogenic effects of Se is the gastrointestinal glutathione peroxidase GPx2, a selenoprotein predominantly expressed in proliferating cells at the crypt grounds of the intestine. The regulation of GPx2 via the Wnt pathway was confirmed by reporter gene experiments and by analysing endogenous GPx2 expression on the mRNA as well as on the protein level in different cell culture systems. Shortened promoter constructs and the mutation of a potential TCF binding element identified the area responsible for β-catenin/TCF binding. GPx2 is the first selenoprotein identified as a target of the Wnt pathway. This finding suggests a function of GPx2 in the maintenance of normal renewal of the intestinal epithelium as well as in cancer development. KW - Selen KW - Biomarker KW - Wnt-Signalweg KW - GPx2 KW - Selenium KW - biomarker KW - Wnt pathway KW - GPx2 Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-30484 ER - TY - THES A1 - Banning, Antje T1 - Selenabhängige Glutathionperoxidasen als Mediatoren und Ziele der intrazellulären Redoxregulation : Identifizierung der GI-GPx als Ziel für Nrf2 und der PHGPx ... T1 - Selenium-dependent glutathione peroxidases as mediators and targets of intracellular redox regulation N2 - Das 1817 erstmals schriftlich erwähnte Selen galt lange Zeit nur als toxisch und sogar als procancerogen, bis es 1957 von Schwarz und Foltz als essentielles Spurenelement erkannt wurde, dessen biologische Funktionen in Säugern durch Selenoproteine vermittelt werden. Die Familie der Glutathionperoxidasen nimmt hierbei eine wichtige Stellung ein. Für diese sind konkrete Funktionen und die dazugehörigen molekularen Mechanismen, welche über die von ihnen katalysierte Hydroperoxidreduktion und damit verbundene antioxidative Kapazität hinausgehen, bislang nur unzureichend beschrieben worden. Die Funktion der gastrointestinalen Glutathionperoxidase (GI-GPx) wird als Barriere gegen eine Hydroperoxidabsorption im Gastrointestinaltrakt definiert. Neuen Erkenntnissen zufolge wird die GI-GPx aber auch in verschiedenen Tumoren verstärkt exprimiert, was weitere, bis dato unbekannte, Funktionen dieses Enzymes wahrscheinlich macht. Um mögliche neue Funktionen der GI-GPx, vor allem während der Cancerogenese, abzuleiten, wurde hier die transkriptionale Regulation der GI-GPx detaillierter untersucht. Die Sequenzanalyse des humanen GI-GPx-Promotors ergab das Vorhandensein von zwei möglichen "antioxidant response elements" (ARE), bei welchen es sich um Erkennungssequenzen des Transkriptionsfaktors Nrf2 handelt. Die meisten der bekannten Nrf2-Zielgene gehören in die Gruppe der Phase-II-Enzyme und verfügen über antioxidative und/oder detoxifizierende Eigenschaften. Sowohl auf Promotorebene als auch auf mRNA- und Proteinebene konnte die Expression der GI-GPx durch typische, in der Nahrung enthaltene, Nrf2-Aktivatoren wie z.B. Sulforaphan oder Curcumin induziert werden. Eine direkte Beteiligung von Nrf2 wurde durch Cotransfektion von Nrf2 selbst bzw. von Keap1, das Nrf2 im Cytoplasma festhält, demonstriert. Somit konnte die GI-GPx eindeutig als Nrf2-Zielgen identifiziert werden. Ob sich die GI-GPx in die Gruppe der antiinflammatorischen und anticancerogenen Phase-II-Enzyme einordnen lässt, bleibt noch zu untersuchen. Die Phospholipidhydroperoxid Glutathionperoxidase (PHGPx) nimmt aufgrund ihres breiten Substratspektrums, ihrer hohen Lipophilie und ihrer Fähigkeit, Thiole zu modifizieren, eine Sonderstellung innerhalb der Familie der Glutathionperoxidasen ein. Mit Hilfe eines PHGPx-überexprimierenden Zellmodells wurden deshalb Beeinflussungen des zellulären Redoxstatus und daraus resultierende Veränderungen in der Aktivität redoxsensitiver Transkriptionsfaktorsysteme und in der Expression atheroskleroserelevanter Adhäsionsmoleküle untersucht. Als Transkriptionsfaktoren wurden NF-kB und Nrf2 ausgewählt. Die Bindung von NF-kB an sein entsprechendes responsives Element in der DNA erfordert das Vorhandensein freier Thiole, wohingegen Nrf2 durch Thiolmodifikation von Keap1 freigesetzt wird und in den Kern transloziert. Eine erhöhte Aktivität der PHGPx resultierte in einer Erhöhung des Verhältnisses von GSH zu GSSG, andererseits aber in einer verminderten Markierbarkeit freier Proteinthiole. PHGPx-Überexpression reduzierte die IL-1-induzierte NF-kB-Aktivität, die sich in einer verminderten NF-kB-DNA-Bindefähigkeit und Transaktivierungsaktivität ausdrückte. Auch war die Proliferationsrate der Zellen vermindert. Die Expression des NF-kB-regulierten vaskulären Zelladhäsionsmoleküls, VCAM-1, war ebenfalls deutlich verringert. Umgekehrt war in PHGPx-überexprimierenden Zellen eine erhöhte Nrf2-Aktivität und Expression der Nrf2-abhängigen Hämoxygenase-1 zu verzeichnen. Letzte kann für die meisten der beobachteten Effekte verantwortlich gemacht werden. Die hier dargestellten Ergebnisse verdeutlichen, dass eine Modifizierung von Proteinthiolen als wichtige Determinante für die Regulation der Expression und Funktion von Glutathionperoxidasen angesehen werden kann. Entgegen früheren Vermutungen, welche oxidative Vorgänge generell mit pathologischen Veränderungen assoziierten, scheint ein moderater oxidativer Stress, bedingt durch eine transiente Thiolmodifikation, durchaus günstige Auswirkungen zu haben, da, wie hier dargelegt, verschiedene, miteinander interagierende, cytoprotektive Mechanismen ausgelöst werden. Hieran wird deutlich, dass sich "antioxidative Wirkung" oder "oxidativer Stress" keineswegs nur auf "gute" oder "schlechte" Vorgänge beschränken lassen, sondern im Zusammenhang mit den beeinflussten (patho)physiologischen Prozessen und dem Ausmaß der "Störung" des physiologischen Redoxgleichgewichtes betrachtet werden müssen. N2 - Selenium was discovered in 1817 by the Swedish chemist Berzelius and was for a long time considered as being toxic and even procarcinogenic. In 1957, however, Schwarz and Foltz realized that selenium is an essential trace element which elicits its biological functions in mammals as a structural component of selenoproteins among which the family of glutathione peroxidases plays a dominant role. Glutathione peroxidases reduce hydroperoxides to the corresponding alcohols and contribute to the antioxidative capacity of a cell. However, other functions of glutathione peroxidases and the according molecular mechanisms have hardly been described.>br> The gastrointestinal glutathione peroxidase (GI-GPx) is believed to build a barrier against the absorption of foodborne hydroperoxides. In addition, GI-GPx expression is increased in different tumors. This indicates further, still unknown, functions of this enzyme. In order to elucidate new possible functions of GI-GPx, especially during carcinogenesis, the transcriptional regulation of GI-GPx was analyzed in more detail. An analysis of the GI-GPx promoter sequence revealed the presence of two putative "antioxidant response elements" (ARE) which are recognition sites for the transcription factor Nrf2. Most of the known Nrf2 target genes either belong to the group of phase-II detoxification enzymes or possess antioxidative and/or detoxifying properties. On promoter level as well as on mRNA- and protein level the expression of GI-GPx was induced by typical Nrf2-activating compounds such as sulforaphane or curcumin that are contained in the diet. A direct involvement of Nrf2 was demonstrated by cotransfection of Nrf2 itself or by cotransfection of Keap1 which retains Nrf2 in the cytosol. Thus, the GI-GPx gene was unequivocally identified as a new target for Nrf2. Whether GI-GPx also belongs in the category of antiinflammatory and anticarcinogenic enzymes remains to be elucidated. The phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx) is exceptional among the glutathione peroxidases because of its broad range of substrates, its high lipophilicity, and its ability to modify protein thiols. With PHGPx-overexpressing cells, the influence of PHGPx on the cellular redox state and on resulting changes in the activity of redox-sensitive transcription factors and on the expression of proatherogenic adhesion molecules was analyzed. For this, the redox-sensitive transcription factors NF-kB and Nrf2 were chosen. NF-kB requires free thiols for being able to bind to its responsive element within the DNA, whereas Nrf2 is released from Keap1 and translocates to the nucleus upon a modification of protein thiols. PHGPx-overexpression resulted in an increase in the ratio of GSH to GSSG, in a reduced amount of intracellular protein thiols, and in a diminished proliferation rate. Furthermore, PHGPx-overexpressing cells displayed a reduced IL-1-dependent NF-kB activity as was assessed by a reduced NF-kB DNA-binding ability and activity of a NF-kB-driven reporter gene. In addition, the expression of the NF-kB-dependent vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) was also inhibited by overexpression of PHGPx. On the other hand, PHGPx-overexpressing cells displayed an increased activity of Nrf2 that was accompanied by an increased expression of the Nrf2-dependent heme oxygenase-1. Heme oxygenase-1 most likely is responsible for most of the aforementioned effects. The data presented here show that a modification of protein thiols can be regarded as an important determinant for the regulation and for the functions of glutathione peroxidases. In contrast to the previous assumption that oxidative processes are always linked to pathologic changes, a moderate oxidative stress seems to have beneficial effects, because it triggers different cytoprotective mechanisms. It can be concluded that the terms "antioxidative effect" or "oxidative stress" cannot simply be restricted to "good" or "bad" processes, but need to be seen in context with the modulated (patho)physiological processes and the degree of "disturbance" of the physiologic redox balance. KW - Selen KW - Transkriptionsfaktor KW - Selenoprotein KW - Glutathionperoxidase KW - GI-GPx KW - PHGPx KW - Redoxregulation KW - Nrf2 KW - NF-kB KW - VCAM-1 KW - selenium KW - selenoprotein KW - glutathione peroxidase KW - GI-GPx KW - PHGPx KW - redox regulation KW - transcription factor KW - NF-kB KW - Nrf2 KW - VCAM-1 Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5436 ER - TY - THES A1 - Pabel, Ulrike T1 - Stabile Expression von Sulfotransferasen - allein oder in Kombination mit Cytochrom P450 - in Zelllinien für Mutagenitätsuntersuchungen N2 - Aromatische Amine und Amide (aAA) sind aufgrund ihrer starken Verbreitung in der menschlichen Umwelt und ihres kanzerogenen Potenzials von großer toxikologischer Bedeutung. Die Kanzerogenität der aAA wird durch die Mutagenität hochreaktiver Stoffwechselprodukte vermittelt, die in zwei sequenziellen katalytischen Reaktionen entstehen. Die erste ist meistens eine N-Hydroxylierung, die oft durch Cytochrom P450 1A2 (CYP1A2) katalysiert wird. Daran schließt sich eine O-Konjugation durch Sulfotransferasen (SULT) oder N-Acetyltransferasen (NAT) an. Die Bioaktivierung ist ein kritischer Parameter für die Übertragbarkeit von Ergebnissen aus Tiermodellen auf den Menschen. Rekombinante in vitro Systeme, die fremdstoffmetabolisierende Enzyme verschiedener Spezies exprimieren, ermöglichen die vergleichende Untersuchung der Bioaktivierung im Menschen und in Versuchstieren. Ziel des Projektes war die Aufklärung der Bioaktivierung der aAA durch humane Enzyme. Im Vordergrund stand die Untersuchung der Rolle humaner SULT in diesem Prozess. Es wurden rekombinante in vitro Systeme, konstruiert, die CYP1A2 und SULT des Menschen koexprimieren. SULT-cDNAs wurden in den Säugerzell Expressionsvektor pMPSV kloniert und in Standardindikatorzellen für Mutagenitätsuntersuchungen (V79 Zellen aus dem Chinesischen Hamster) transfiziert. Das Expressionsniveau von CYP1A2 und SULT wurde mittels Immunblotanalyse und radiometrischen Aktivitätsmessungen charakterisiert. In den rekombinanten Zellen wurden vier aAA als Modellsubstanzen (2-Acetylaminofluoren, 2-Aminoanthracen, 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol, 2,4-Diaminotoluol) auf ihre Mutagenität am hprt-Locus hin untersucht.Die aAA waren in Zellen, die keine rekombinanten Enzyme oder lediglich CYP1A2 exprimierten, nicht mutagen. In Zellen, die CYP1A2 und SULT der Subfamilie 1A koexprimierten, erzeugten sie bereits in geringen Konzentrationen klare mutagene Effekte (0,3 µM für 2-Acetylaminofluoren und 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol; 0,1 µM für 2-Aminoanthracen; 10 µM für 2,4-Diaminotoluol). Die stärkste Aktivierung von 2-Acetylaminofluoren und 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol erfolgte in der Zelllinie, die CYP1A2 und SULT1A2 koexprimierte; die stärkste Aktivierung von 2,4-Diaminotoluol und 2-Aminoanthracen erfolgte in der Zelllinie, die CYP1A2 und SULT1A1 koexprimierte. Sowohl SULT1A1 als auch SULT1A2 sind im Menschen genetisch polymorph. Ein unterschiedlich starkes Aktivierungspotenzial der Alloenzyme könnte eine individuell unterschiedliche Suszeptibilität für die durch aAA ausgelöste Kanzerogenese bedingen. In HPRT-Mutationsuntersuchungen mit rekombinanten Zellen zeigten die allelischen Varianten der SULT1A2 starke Unterschiede in ihrem Aktivierungpotenzial. Nur in der Zelllinie, die das Alloenzym SULT1A2*1 mit CYP1A2 koexprimierte, wurde 2-Acetylaminofluoren zum Mutagen aktiviert. Zur Aktivierung von 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol waren jedoch sowohl das Alloenzym SULT1A2*1 als auch das Alloenzym SULT1A2*2 in der Lage. Die Alloenzyme der SULT1A1 zeigten ein ähnlich gutes Aktivierungspotenzial für aAA. In früheren Studien wurde gezeigt, dass die SULT1C1 der Ratte eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der aAA in dieser Spezies spielt. Dahingegen war die humane SULT1C1 nicht in der Lage die untersuchten aAA zu aktivieren. Die Kenntnis solcher Spezieunterschiede könnte wichtig sein um unterschiedliche Organotropismen aAA in Menschen und Tiermodellen zu erklären, da SULT mit starker Gewebespezifität exprimiert werden und das Expressionsmuster für die einzelnen SULT-Formen in Menschen und Ratten sich stark unterscheidet. N2 - Aromatic amines and amides (aAA) represent a group of chemicals with great toxicological importance due to their wide distribution in the environment and their carcinogenic potency. The carcinogenicity of aAA is mediated by the mutagenic action of highly reactive metabolites. They are frequently formed by N-hydroxylation of the exocyclic amino group, usually catalysed by cytochrome P450 1A2 (CYP1A2) and subsequent O-conjugation by phase-II enzymes e.g. sulfotransferases (SULT) or N-acetyltransferases. The bioactivation constitutes a critical parameter for the transfer of results from animal models on man. Recombinant in vitro systems expressing xenobiotic metabolizing enzymes of different species allow the comparative study of the bioactivation in humans and animal models.
The aim of this project was to elucidate the bioactivation of aAA by human xenobiotic enzymes. The investigation focused on the role of SULT in this process. SULT-cDNAs were cloned into the mammalian expression vector pMPSV and transfected in V79 Chinese Hamster cells, which represent standard indicator cells for mutagenicity tests. Selected SULT-cDNAs were also co-expressed with human CYP1A2. These cells were able to catalyse internally both enzymatic reactions that are necessary for the bioactivation of aAA. The expression level of CYP1A2 and SULT in the co-expressing cell clones was characterised by immunoblot analysis and radiometric SULT-activity measurement. The mutagenicity of four aAA model compounds, 2-aminoanthracene, 2-acetylaminofluorene, 3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzene and 2,4-diaminotoluene, at the hprt locus of the recombinant cell lines was investigated. These aAA were not or only marginally mutagenic in wild type cells or in recombinant cells expressing CYP1A2 alone. If CYP1A2 was co-expressed with SULT forms of the 1A subfamily clear mutagenic effects occured in low concentrations of the aAA (0,3 µM for 2-acetylaminofluorene and 3′-methyl-4-dimethylaminoazobenzene; 0,1 µM for 2-aminoanthracene; 10 µM for 2,4-diaminotoluene). The strongest activation of 2-acetylaminofluorene and 3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzene was mediated by SULTA2 and of 2-aminoanthracene and 2,4-diaminotoluene by SULT1A1. SULT1A1 and SULT1A2 are expressed polymorphically in humans. Differences in the activation potency of distinct alloenzymes for aAA may cause divergent individual susceptibilities for cancer induced by aAA. Briefly, the allelic variants of SULT1A2 showed substantial differences regarding their activation potencies for the investigated aAA. Only alloenzyme SULT1A2*1 was able to activate 2-acetylaminofluorene to a mutagen whereas 3′-methyl-4-di-methylaminoazobenzene was activated by alloenzymes SULT1A2*1 and SULT1A2*2. The investigated alloenzymes of SULT1A1 showed equal activation potencies for aAA. In previous studies it had been shown that the SULT1C1 plays an important role in the activation of aAA in rats. However, the human SULT1C1 was not able to activate the investigated aAA in the study presented here. Such species differences might be important for the elucidation of divergent organotropisms of aAA in humans and animal models, since SULT are expressed with strong tissue specificities and the pattern of expression in humans and rats is severely different. KW - aromatische Amine; Sulfotransferasen; Mutagenität; Bioaktivierung KW - aromatic amines; sulfotransferases; mutagenicity; bioactivation Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000900 ER - TY - THES A1 - Löwinger, Maria T1 - Sulforaphan und Selen : Einfluss auf Phase II Enzyme und Selenoproteine sowie deren Effekt auf die entzündungsvermittelte Dickdarmkanzerogenese T1 - Sulforaphane and Selenium : impact on phase II enzymes and selenoproteins, and the effect on the inflammation triggered colon carcinogenesis N2 - Das ITC SFN und der Mikronährstoff Se sind bekannt als chemopräventive Inhaltsstoffe von Gemüse der Brassica-Familie, welcher auch Brokkoli angehört. Die Wirkungen von sowohl SFN als auch Se beruhen auf zahlreichen verschiedenen Mechanismen. Es existieren jedoch Schnittstellen, an welchen Interaktionen beider Substanzen möglich sind. Basierend auf diesem Wissen wurden in dieser Arbeit Wechselwirkungen zwischen SFN und Se auf die Aktivität sowie Expression von Phase II Enzymen und Selenoproteinen untersucht. Der Einfluss der Kombination von SFN und Se auf die unter physiologischen Bedingungen stattfindende Proliferation und Apoptose war ebenso Gegenstand der Arbeit wie die Modulation von Entzündungsprozessen sowie der Tumorentstehung während der entzündungsverstärkten Colonkanzerogenese im Mausmodell. Das hinsichtlich seiner Wirksamkeit mit aus GRA hydrolysiertem SFN zunächst als vergleichbar befundene synthetische SFN wurde für die Untersuchung im AOM/DSS-induzierten Colontumormodell gewählt und in Kombination mit 3 verschiedenen Selendiäten verabreicht. Der Einfluss von SFN und Se auf Phase II Enzyme und Selenoproteine entlang des GIT war organabhängig und nach 4 Wochen geringer als nach 7 Tagen. Die schwächere Induktion deutet auf eine Anpassung des Organismus hin. Ein SFN-vermittelter Effekt auf NQO1 war im Selenmangel am deutlichsten. Die Aktivität des Selenoproteins TrxR wurde hingegen erst bei ausreichender Selenversorgung durch SFN beeinflusst. Die als Nrf2-Zielgen bekannte und in der Hierarchie der Selenoproteine einen hohen Rang einnehmende GPx2 konnte in bestimmten Organen bereits unter selenarmen Bedingungen durch SFN induziert werden. Eine Überexpression des Enzyms war jedoch nicht möglich. SFN steigerte, unabhängig vom Selenstatus, im oberen Abschnitt des GIT und im Colon die Aktivität der GST. Eine Induktion des eigenen Metabolismus wäre somit denkbar. Im Falle eines Mangels an GPx2 wurde GPx1 bei hinreichender Selenversorgung stärker exprimiert, allerdings konnte sie die Funktion von GPx2 nicht völlig erset-zen. Im Selenmangel kann die Aktivitätssteigerung der TrxR im Dünndarm, dem Ab-schnitt der Selenabsorption, als ein Versuch der GPx2-Kompensation angesehen werden. SFN war nicht in der Lage, über eine Aktivierung des Nrf2/ARE-Signalweges kompensatorische Effekte zu induzieren. Apoptotische Prozesse wurden unter physiologischen Bedingungen nur marginal durch SFN und Se moduliert. Das elektrophile ITC konnte lediglich im Selenmangel Apoptose im luminalen Bereich der Colonkrypten induzieren. Die durch supranutritive Selenkonzentration induzierte Apoptose im Kryptengrund wurde nicht durch SFN beeinflusst. Einer bei Abwesenheit der GPx2 erhöhten Apoptoserate im Kryptengrund wirkte SFN bei adäquater Selenversorgung entgegen, war indessen proapoptotisch unter selendefizienten Konditionen. Der Einfluss von SFN auf die Entzündung war deutlich abhängig vom Selenstatus. Während SFN im Selenmangel anscheinend prooxidative Prozesse induzierte und die Entzündungssymptome verschlimmerte, wirkte es unter adäquatem Selenstatus an-tiinflammatorisch. Den vergleichsweise milden Grad der Entzündung im selensupplementierten Status konnte SFN nicht zusätzlich beeinflussen. SFN veränderte die Inzi-denz colorektaler Tumore nicht. Ein, die Tumorinitiation blockierender SFN-Effekt durch direkte Hemmung der metabolischen Aktivierung des Prokanzerogens im selenadäquaten Zustand scheint offensichtlich. Eine Überversorgung mit Se kann protektiv im Hinblick auf Entzündung oder Colonkanzerogenese sein, jedoch bewirkt SFN keinen zusätzlichen Schutz. Kombinationseffekte von SFN und Se in Bezug auf Phase II Enzyme, Selenoproteine und Apoptose sowie die entzündungsverstärkte Colonkanzerogenese sind nicht eindeutiger Natur und können, abhängig vom Endpunkt, synergistische oder antagonistische Züge aufweisen. Eine bei Selendefizienz deutlichere Wirkung von SFN kann mit Hilfe der gesteigerten Aktivierung von Nrf2 erklärt werden, dies muss jedoch nicht von Vorteil sein. Bei adäquater Selenversorgung kann SFN kurzfristig antiinflammatorische und antikanzerogene Prozesse induzieren. Von einer längerfristigen ständigen SFN-Aufnahme in Form von GRA-reichen Brassicacea ist jedoch abzuraten, da von einer Adaptation auszugehen ist. Die Wirkung von SFN innerhalb der komplexen Pflanzenmatrix bleibt Gegenstand zukünftiger Untersuchungen. N2 - Sulforaphane (SFN), a versatile actor derived from broccoli or other brassicaceae, is proposed to be a dietary anticarcinogen. Together with an adequate selenium status, it has been associated with a decreased risk for developing certain forms of cancer. In our mouse model, we investigate the influence of SFN and Se on the expression and activity of selenoproteins and phase II enzymes as well as the effects on inflammation triggered colon carcinogenesis. SFN increased NQO1 activity and protein expression significantly in the ileum, in both, Se-deficiently and Se-adequately fed animals. TrxR activity was increased in Se-adequately compared to Se-deficiently fed mice, SFN positively affected TrxR activity only in the former ones. An increase of GPx2 protein expression by SFN was observed in the ileum of mice of both diets. GPx1 reacts sensitively on Se supply. GST was the only enzyme analyzed being significantly increased by SFN on activity level in the colon. All AOM/DSS treated animals showed an inflammation, which was attenuated by SFN within Se-adequacy. In contrast, Se-deficient animals showed a more severe inflammation. The administration of SFN therefore seemed to enhance this even more and to be not beneficial in this case. SFN inhibited colon carcinogenesis in Se-adequate mice when being administered together with AOM. To summarize, both, GPx2 and TrxR, require selenium in order to be synthesized. In contrast to TrxR, the SFN-mediated induction of GPx2, the highest ranking selenoprotein, does not depend on additional selenium supply. Whereas distinct effects by SFN were observed in the ileum, only GST was influenced by SFN in the colon. SFN seems to induce its own metabolism. In conclusion, SFN and Se attenuate inflammation and colon carcinogenesis, preferably by means of up-regulating the endogenous defense system and inhibiting the metabolic activation of AOM. KW - Sulforaphan KW - Selen KW - Dickdarmkanzerogenese KW - Phase II Enzyme KW - Selenoproteine KW - sulforaphane KW - selenium KW - colon carcinogenesis KW - phase II enzymes KW - selenoproteins Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-51862 ER - TY - THES A1 - Donath, Claudia T1 - Sulfotransferase-vermittelte Genotoxizität von benzylischen Metaboliten alkylierter polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe T1 - Sulfotransferase-mediated genotoxicity of benzylic metabolites of alkylated polycyclic aromatic hydrocarbons N2 - Alkylierte polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe werden in vielen Matrizes wie Fahrzeugabgasen und Tabakrauch und auch als Kontaminanten in Nahrungsmitteln neben rein aromatischen Kongeneren gefunden. Alkylierte PAK können über die Alkylseitenkette über benzylische Hydroxylierung und nachfolgende Sulfonierung katalysiert über Sulfotransferasen (SULT) zu reaktiven Schwefelsäureestern umgesetzt werden. Die SULT-vermittelte Bioaktivierung zu einem genotoxischen Schwefelsäureester wurde für den benzylischen Alkohol 1-Hydroxymethylpyren des Hepatokanzerogens 1-Methylpyren in früheren Arbeiten gezeigt. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, ob die benzylischen Alkohole weiterer alkylierter PAK über Sulfonierung zu genotoxischen Schwefelsäureestern umgesetzt werden. Hierzu wurde eine Gruppe von 17 Modellsubstanzen ausgewählt, um die Ableitung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen zu ermöglichen. Das genotoxische Potenzial authentischer benzylischer Schwefelsäureester der Modellsubstanzen wurde zunächst in vitro über DNA-Adduktbildung im zellfreien System und Mutagenität im Salmonella-Rückmutationstest untersucht. Die Sulfate zeigten große Reaktivitätsunterschiede in Abhängigkeit von der Struktur des aromatischen Systems und der Position der Alkylseitenkette, wobei die Endpunkte DNA-Adduktbildung und Mutagenität gut korrelierten. Des Weiteren wurde der Salmonella-Mutagenitätstest mit den benzylischen Alkoholen der untersuchten alkylierten PAK und gentechnisch veränderten S. typhimurium-Stämmen, die SULT-Formen des Menschen heterolog exprimieren, durchgeführt. Bis auf die Alkohole 2- und 4-HMP zeigten alle untersuchten benzylischen Alkohole deutliche mutagene Effekte in einem oder mehreren humane SULT exprimierenden Stämmen. Die durchgeführten in vitro-Versuche zeigten das Potenzial der benzylischen Metabolite alkylierter PAK für genotoxische Wirkungen. Nachfolgend musste geklärt werden, welche Relevanz die beobachteten Effekte für die komplexere in vivo-Situation haben. Nach Verabreichung verschiedener benzylischer Schwefelsäureester und Alkohole an männliche Ratten konnten DNA-Addukte in den untersuchten Organen detektiert werden, was im Fall der Schwefelsäureester deren systemische Bioverfügbarkeit und im Fall der benzylischen Alkohole deren Umsatz durch SULT der männlichen Ratte zeigte. Da im Gegensatz zum Menschen die SULT-Expression in der Ratte auf die Leber fokussiert ist, musste ein Großteil des Umsatzes zu genotoxischen Sulfaten in der Leber stattgefunden haben. DNA-Addukte wurden jedoch auch in extrahepatischen Organen gefunden, was über einen hepatischen Export der gebildeten reaktiven Sulfate und deren Transport über den Blutkreislauf zu diesen Geweben erklärt werden kann. Für die weiterführenden in vivo-Studien wurden die benzylischen Alkohole 1-HMP und 1-HM-8-MP ausgewählt, die trotz großer struktureller Ähnlichkeit toxikodynamische Unterschiede zeigten. Zur Untersuchung der Bedeutung des SULT-vermittelten Toxifizierungsweges als auch konkurrierender detoxifizierender oxidativer Stoffwechselprozesse, wurden für 1-HMP und 1-HM-8-MP in vivo-Inhibitionsstudien mit SULT-Inhibitoren und für 1-HM-8-MP auch mit ADH/ALDH-Inhibitoren durchgeführt. Eine Vorbehandlung mit dem SULT-Hemmstoff Pentachlorphenol führte zu einer Reduktion der DNA-Adduktniveaus in Organen 1-HMP- und 1-HM-8-MP-behandelter Tiere. Die Verabreichung von Quercetin hatte keine Auswirkung auf die DNA-Adduktniveaus. Die Hemmung der DNA-Adduktbildung bei Verabreichung von Pentachlorphenol verdeutlichte jedoch, dass benzylische Alkohole alkylierter PAK in vivo über Sulfonierung bioaktiviert werden. Eine Vorbehandlung mit dem ADH-Inhibitor 4-Methylpyrazol und dem ADH-Substrat Ethanol führte zu erhöhten DNA-Adduktniveaus in Organen 1-HM-8-MP-behandelter Tiere. Den gleichen Effekt, jedoch in geringerem Ausmaß, hatte auch die Vorbehandlung mit dem ALDH-Inhibitor Disulfiram. Dies deutet darauf hin, dass oxidative Modifikationen an der Seitenkette des 1-HM-8-MP einen Detoxifizierungsmechanismus darstellen. Nach Verabreichung benzylischer Metabolite alkylierter PAK wurden oftmals hohe Adduktniveaus in der Niere detektiert. Als mögliche Ursache hierfür wurde eine Transporter-vermittelte renale Sekretion reaktiver Sulfate postuliert, die über Vorbehandlung mit Probenecid vor Verabreichung von 1-HMP und 1-HM-8-MP überprüft wurde. Der Haupteffekt der Probenecid-Behandlung wurde jedoch nicht in der Niere, sondern in der Leber beobachtet, die stark erhöhte Adduktniveaus zeigte. Eine mögliche Erklärung hierfür ist die Hemmung des Exportes in der Leber gebildeter reaktiver Sulfate über Inhibition hepatischer organischer Anionentransporter. N2 - Alkylated polycyclic aromatic hydrocarbons are found besides purely aromatic congeners in numerous matrices like car engine exhausts and tobacco smoke and as contaminants in foods. Alkylated PAH can be converted at the alkyl side chain to reactive sulfuric acid esters via benzylic hydroxylation and subsequent sulfonation catalysed by sulfotransferases (SULT). The SULT-mediated bioactivation to a genotoxic sulfuric acid ester was shown for the benzylic alcohol 1-hydroxymethylpyrene of the hepatocarcinogen 1-methylpyrene in previous studies. In the thesis at hand it was studied if the benzylic alcohols of further alkylated PAH are converted to genotoxic sulfuric acid esters via sulfonation. For this purpose a group of 17 model substances was chosen to allow for deduction of structure activity relationships. The genotoxic potential of authentic benzylic sulfuric acid esters of the model substances was initially investigated in vitro via DNA adduct formation in a cell free system and mutagenicity in the Salmonella reverse mutation test. The sulfates showed large differences in reactivity depending on the structure of the aromatic system and the position of the alkyl side chain whereupon the endpoints DNA adduct formation and mutagenicity correlated well. Furthermore, the Salmonella mutagenicity test was carried out with the benzylic alcohols of the alkylated PAH studied and S. typhimurium strains genetically engineered for the heterologous expression of human SULT forms. Except for the alcohols 2- and 4-HMP all benzylic alcohols studied showed clear mutagenic effects in one or more SULT-expressing strains. The studies performed in vitro demonstrated the potential of benzylic metabolites of alkylated PAH for genotoxic effects. Consecutively, the relevance of the observed effects for the more complex in vivo situation had to be clarified. After administration of different benzylic sulfuric acid esters and alcohols to male rats DNA adducts were detected in the organs studied, in case of the sulfuric acid esters showing their systemic bioavailability and in case of the benzylic alcohols demonstrating their conversion to the corresponding reactive benzylic sulfuric acid esters by SULT of the male rat. Since in contrast to man SULT expression in the rat is focused on the liver, a large part of the conversion to genotoxic sulfates must have been taken place in the liver. However, DNA adducts were also found in extrahepatic tissues which can be attributed to a hepatic export of the reactive sulfates formed and their transport to these tissues via circulation. For the continuative in vivo studies the benzylic alcohols 1-HMP and 1-HM-8-MP were chosen that demonstrated toxicodynamic differences in spite of their great structural resemblance. To investigate the importance of the SULT-mediated toxification pathway as well as competing detoxifying oxidative metabolic pathways, in vivo inhibition studies with SULT inhibitors were performed for 1-HMP and 1-HM-8-MP and with ADH/ALDH inhibitors also for 1-HM-8-MP. A pretreatment with the SULT inhibitor pentachlorophenol led to a reduction of DNA adduct levels in organs of animals treated with 1-HMP and 1-HM-8-MP. Administration of quercetin had no impact on the DNA adduct levels. However, inhibition of DNA adduct formation at administration of pentachlorophenol demonstrated that benzylic alcohols of alkylated PAH are bioactivated via sulfonation in vivo. A pretreatment with the ADH inhibitor 4-methylpyrazole and the ADH substrate ethanol led to increased DNA adduct levels in organs of animals treated with 1-HM-8-MP. The same effect but to a lesser extent was caused by a pretreatment with the ALDH inhibitor disulfiram. This indicates that oxidative modifications at the side chain of 1-HM-8-MP represent a detoxification mechanism. After administration of benzylic metabolites of alkylated PAH often high DNA adduct levels were detected in kidney. A transporter-mediated renal secretion was postulated as possible cause which was investigated using a pretreatment with probenecid before administration of 1-HMP and 1-HM-8-MP. However, the main effect of the treatment with probenecid was not observed in kidney but in liver that showed strongly increased adduct levels. A possible explanation for this effect is the inhibition of the export of reactive sulfates formed in liver via inhibition of hepatic organic anion transporters. KW - alkylierte polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe KW - Sulfotransferase KW - benzylischer Alkohol KW - benzylischer Schwefelsäureester KW - DNA-Addukte KW - alkylated polycyclic aromatic hydrocarbons KW - sulfotransferase KW - benzylic alcohol KW - benzylic sulfuric acid ester KW - DNA adducts Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-29717 ER - TY - THES A1 - Nowotny, Kerstin T1 - The impact of collagen modifications by methylglyoxal on fibroblast function and the role in aging Y1 - 2016 ER - TY - THES A1 - Finke, Hannah T1 - Toxicological Characterization of Arsenolipids in vitro and Analysis of Global DNA (Hydroxy)methylation in the Context of Aging, Trace Element Status, and Genomic Stability Y1 - 2020 ER -