TY - THES A1 - Lengefeld, Jan T1 - Zirkulardichroismus-Messungen mit Synchrotronstrahlung am BESSY : Möglichkeiten und Grenzen bei der Untersuchung biologischer Proben T1 - Synchrotron radiation circular dichroism measurements at BESSY : potentials and limitations investigating biological samples N2 - In dieser Arbeit wurden die Möglichkeiten und Grenzen für Zirkulardichroismus-Messungen mit Synchrotronstrahlung untersucht. Dazu wurde ein Messaufbau für Zirkulardichroismus-Messungen an zwei Strahlrohren am Berliner Elektronenspeicherring für Synchrotronstrahlung eingesetzt, die für Messungen im Bereich des ultravioletten Lichts geeignet sind. Eigenschaften der Strahlrohre und des Messaufbau wurden in einigen wichtigen Punkten mit kommerziellen Zirkulardichroismus-Spektrometern verglichen. Der Schwerpunkt lag auf der Ausdehnung des zugänglichen Wellenlängenbereichs unterhalb von 180 nm zur Untersuchung des Zirkulardichroismus von Proteinen in diesem Bereich. In diesem Bereich ist es nicht nur die Lichtquelle sondern vor allem die Absorption des Lichts durch Wasser, die den Messbereich bei der Messung biologischer Proben in wässriger Lösung einschränkt. Es wurden Bedingungen gefunden, unter denen der Messbereich auf etwa 160 nm, in einigen Fällen bis auf 130 nm ausgedehnt werden konnte. Dazu musste die Pfadlänge deutlich reduziert werden und verschieden Probenküvetten wurden getestet. Der Einfluss der dabei auftretenden Spannungsdoppelbrechung in den Probenküvetten auf das Messsignal konnte mit einem alternativen Messaufbau deutlich reduziert werden. Systematische Fehler im Messsignal und auftretende Strahlenschäden begrenzen jedoch die Zuverlässigkeit der gemessenen Spektren. Bei Proteinfilmen schränkt die Absorption von Wasser den Messbereich kaum ein. Es wurden jedoch meist deutliche Unterschiede zwischen den Spektren von Proteinfilmen und den Spektren von Proteinen in wässriger Lösung festgestellt. Solange diese Unterschiede nicht minimiert werden können, stellen Proteinfilme keine praktikable Alternative zu Messungen in wässriger Lösung dar. N2 - The possibilities and limitations for synchrotron radiation circular dichroism measurements were investigated in this thesis. Therefore an experimental setup to measure circular dichroism was used at two beamlines at the “Berliner Elektronenspeicherring für Synchrotronstrahlung”(BESSY), which were suitable in the ultraviolet range of light. Properties of the beamlines and the experimental setup were compared to those of commercial circular dichroism spectrometer in some important points. The focus was on the extension of the accessible wavelength range below 180 nm, with the aim to investigate the circular dichroism of proteins in that range. It is not only the light source that limits measurements with aqueous solutions in that range, but mainly the absorption of the light by water. Conditions were found under which the wavelength range was extended to about 160 nm, in some cases even to 130 nm. To achieve this, a significant reduction of the pathlength was necessary. Several sample cells were tested for their usability. The effect of birefringence within the sample cells on the circular dichroism signal could be reduced strongly with an alternative experimental setup. However systematic errors in the circular dichroism signal and appearing radiation damage of the proteins limits the reliability of the measured spectra. By using protein films, the light absorption by water is not a problem anymore. However, significant differences between the circular dichroism spectra of protein films and proteins in aqueous solution occurred in most of the cases. Unless these differences can be eliminated, measuring protein films is not an alternative to measurements in aqueous solution. KW - Synchrotronstrahlung KW - Zirkulardichroismus KW - BESSY KW - Wasserabsorption KW - Protein KW - synchrotron radiation KW - circular dichroism KW - BESSY KW - water absorbance KW - protein Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-44263 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Andreas T1 - Charakterisierung der Lipopolysaccharid-Bindungseigenschaften von Adhäsionsproteinen aus Salmonella-Bakteriophagen T1 - Characterization of lipopolysaccharide-binding properties of adhesion proteins from Salmonella-bacteriophages N2 - Die Interaktionen von komplexen Kohlenhydraten und Proteinen sind ubiquitär. Sie spielen wichtige Rollen in vielen physiologischen Prozessen wie Zelladhäsion, Signaltransduktion sowie bei viralen Infektionen. Die molekularen Grundlagen der Interaktion sind noch nicht komplett verstanden. Ein Modellsystem für Kohlenhydrat-Protein-Interaktionen besteht aus Adhäsionsproteinen (Tailspikes) von Bakteriophagen, die komplexe Kohlenhydrate auf bakteriellen Oberflächen (O-Antigen) erkennen. Das Tailspike-Protein (TSP), das in dieser Arbeit betrachtet wurde, stammt aus dem Bakteriophagen 9NA (9NATSP). 9NATSP weist eine hohe strukturelle Homologie zum gut charakterisierten TSP des Phagen P22 (P22TSP) auf, bei einer niedriger sequenzieller Ähnlichkeit. Die Substratspezifitäten beider Tailspikes sind ähnlich mit Ausnahme der Toleranz gegenüber den glucosylierten Formen des O-Antigens. Die Struktur der beiden Tailspikes ist bekannt, sodass sie ein geeignetes System für vergleichende Bindungsstudien darstellen, um die strukturellen Grundlagen für die Unterschiede der Spezifität zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der ELISA-like tailspike adsorption assay (ELITA) etabliert, um Binderpaare aus TSPs und O-Antigen zu identifizieren. Dabei wurden 9NATSP und P22TSP als Sonden eingesetzt, deren Bindung an die intakten, an die Mikrotiterplatte adsorbierten Bakterien getestet wurde. Beim Test einer Sammlung aus 44 Salmonella-Stämmen wurden Stämme identifiziert, die bindendes O-Antigen exprimieren. Gleichzeitig wurden Unterschiede in der Bindung der beiden TSPs an Salmonella-Stämme mit gleichem O-Serotyp beobachtet. Die Ergebnisse der ELITA-Messung wurden qualitativ durch eine FACS-basierte Bindungsmessung bestätigt. Zusätzlich ermöglichte die FACS-Messung bei Stämmen, die teilweise modifizierte O-Antigene herstellen, den Anteil an Zellen mit und ohne Modifikation zu erfassen. Die Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-basierten Interaktionsmessungen wurden eingesetzt, um Bindungsaffinitäten für eine TSP-O-Antigen Kombination zu quantifizieren. Dafür wurden zwei Methoden getestet, um die Oligosaccharide auf einem SPR-Chip zu immobilisieren. Zum einen wurden die enzymatisch hergestellten O-Antigenfragmente mit einem bifunktionalen Oxaminadapter derivatisiert, der eine primäre Aminogruppe für die Immobilisierung bereitstellt. Ein Versuch, diese Oligosaccharidfragmente zu immobilisieren, war jedoch nicht erfolgreich. Dagegen wurde das nicht derivatisierte Polysaccharid, bestehend aus repetitivem O-Antigen und einem konservierten Kernsaccharid, erfolgreich auf einem SPR-Chip immobilisiert. Die Immobilisierung wurde durch Interaktionsmessungen mit P22TSP bestätigt. Durch die Immobilisierung des Polysaccharids sind somit quantitative SPR-Bindungsmessungen mit einem polydispersen Interaktionspartner möglich. Eine Auswahl von Salmonella-Stämmen mit einer ausgeprägt unterschiedlichen Bindung von 9NATSP und P22TSP im ELITA-Testsystem wurde hinsichtlich der Zusammensetzung des O-Antigens mittels HPLC, Kapillargelelektrophorese und MALDI-MS analysiert. Dabei wurden nicht-stöchiometrische Modifikationen der O-Antigene wie Acetylierung und Glucosylierung detektiert. Das Ausmaß der Glucosylierung korrelierte negativ mit der Effizienz der Bindung und des Verdaus durch die beiden TSPs, wobei der negative Effekt bei 9NATSP weniger stark ausgeprägt war als bei P22TSP. Dies stimmt mit den Literaturdaten zu Infektivitätsstudien mit 9NA und P22 überein, die mit Stämmen mit vergleichbaren O-Antigenvarianten durchgeführt wurden. Die Korrelation zwischen der Glucosylierung und Bindungseffizienz konnte strukturell interpretiert werden. Auf Grundlage der O-Antigenanalysen sowie der Ergebnisse der ELITA- und FACS-Bindungstests wurden die Salmonella-Stämme Brancaster und Kalamu identifiziert, die annähernd quantitativ glucosyliertes O-Antigen exprimieren. Damit eignen sich diese Stämme für weiterführende Studien, um die Zusammenhänge zwischen der Spezifität und der Organisation der Bindestellen der beiden TSPs zu untersuchen. N2 - Interactions between complex carbohydrates and proteins are ubiquitous. They play a major role in plenty of physiological processes as cell adhesion, signal transduction, as well as viral infections. The molecular details of the interaction are not completely understood. A model system for protein-carbohydrate interactions consists of adhesion proteins (Tailspikes) of bacteriophages, which recognize complex carbohydrates on the bacterial surface (O-antigen). A Tailspike primary used in this work originates from the bacteriophage 9NA (9NATSP). 9NATSP shows a remarkable structural similarity to the extensively studied TSP of the bacteriophage P22 (P22TSP), showing a low sequential similarity. Since structures of both TSP's are known, they provide an appropriate system for comparative interaction studies. An ELISA-like Tailspike-adsorbtion assay (ELITA) was established in this work which allows identification of binding pairs consisting of TSP's and O-antigens. In this approach 9NATSP and P22TSP were used as probes. Their binding to intact bacteria adsorbed to a multi-well plate was tested. In a collection of 44 Salmonella-strains a set of strains was identified which express a binding O-antigen. Additionally different binding efficiencies were observed among the strains of the same O-serotype. Binding data of the ELITA were qualitatively resembled in a FACS-based binding test. Additionally FACS-measurements allowed estimation of the extent of non-stoichiometric modifications of the O-antigens in strains expressing modified O-antigen variants. The surface plasmone resonance (SPR) interaction-measurements were used to quantify affinities of TSP-O-antigen binding. For this, two carbohydrate immobilization strategies were tested. An O-antigen fragment, produced by enzymatic digestion, was derivatized by a bi-functional Oxamine-spacer. The spacer provides a primary amine-functionality for the immobilization. Despite the successful derivatization, sufficient amount of the O-antigen fragment could not be immobilized. Oppositely, the non-derivatized whole polysaccharide was successfully immobilized. The immobilization was confirmed by SPR-measurements with P22TSP. This approach allows quantitative measurements with polysaccharide as ligand, despite of its polydisperse characteristics. A set of Salmonella-strains with a distinctively different binding to 9NATSP and P22TSP in ELITA were characterized in terms of the content of their O-antigen by HPLC, capillary gel electrophoresis and MALDI-MS. Non-stoichiometric modifications of the O-antigens as acetylation and glucosylation were identified. The extent of glucosylation correlated negatively with the binding efficiencies to both TSP's, identifying 9NATSP as more susceptible to the glucosylation. That finding resembles with published data from early studies on the infectivity of bacteriophages 9NA and P22. Observed data could be interpreted in a structural context. The results of the O-antigen analysis as well as the results of ELITA and FACS-based interaction tests two Salmonella-strains, were identified, which produce almost completely glucosylated O-antigen: Salmonella Brancaster and Salmonella Kalamu. These strains are suitable for further studies to investigate the interdependence of the specificity and the structure of the binding sites of both TSP's. KW - Lipopolysaccharid KW - O-Antigen KW - nicht-stöchiometrische Modifikationen KW - Glycosylierung KW - Bakteriophagen KW - Adhäsionsproteine KW - Tailspike KW - Protein-Kohlenhydrat Interaktionen KW - lipopolysaccharide KW - O-antigen KW - non-stoichiometric modifications KW - glycosylation KW - bacteriophages KW - adhesion proteins KW - Tailspikes KW - protein-carbohydrate interactions Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-79529 ER - TY - THES A1 - Kreibich, Christoph T1 - Erucasäure in Brassica napus L. - ein phänotypisches Merkmal im Genetikunterricht und ihr Nachweis mit Hilfe von Papierchromatographie T1 - Erucic acid in Brassica napus L. - a phenotypic trait in genetics and their detection by paper chromatography N2 - Erucic acid is a mono-unsaturated fatty acid that is naturally found in large quantities in seeds of rapeseed (Brassica napus L.) and other Brassica species. Erucic acid represents an important resource in the industry, however, due to its injurious effects on the heart muscle, this fatty acid is considered to be nutritionally harmful. Therefore, new high quality rapeseed cultivars were bred in order to eliminate the content of erucic acid in rapeseed oil at the end of the 20th century. In the breeding process, paper chromatography was used for the distinction between seeds with high and low content of erucic acid. Here, this outdated method was revised and optimized for educational purposes. By means of paper chromatography the qualitative content of erucic acid and four other unsaturated fatty acids was analyzed in rapeseed and linseed. The character ‘erucic acid content’, determined by two additive genes, can be used as a practical example of a phenotypic marker in school lessons, for instance, in the course 'achievement of plant breeding'. Thus, this qualitative analysis of erucic acid content enables the teacher to connect classical genetics with modern methods of plant genetics. N2 - Erucasäure ist eine einfach ungesättigte Fettsäure, die sich in großer Menge im Samen von Raps und anderen Kreuzblütlern findet. Ernährungsphysiologisch gilt sie als problematisch, da sie eine nachweislich schädliche Wirkung auf die Herzmuskulatur hat. Daher wurde sie im Laufe des 20. Jahrhunderts zum größten Teil aus dem Deutschen Winterraps durch Züchtung fast vollständig eliminiert. In einigen Zweigen der Industrie ist sie jedoch weiterhin ein bedeutender Rohstoff. In dieser Arbeit wird die Papierchromatographie als kostengünstige Methode zur Trennung von Fettsäuren vorgestellt, welche auch im Schulunterricht angewendet werden kann. Diese veraltete Methode wurde reaktiviert und für die vorliegenden Zwecke optimiert. Mit Hilfe der hier beschriebenen Papierchromatographie lassen sich sowohl Rapssamen auf ihren qualitativen Gehalt an Erucasäure untersuchen, als auch eine Vielzahl von ungesättigten Fettsäuren in Raps- und auch Leinsamen qualitativ nachweisen. Es ist so möglich erucasäurefreie und erucasäurehaltige Rapssamen auf dem Papier zu unterscheiden. Der Gehalt an Erucasäure, welcher von nur zwei additiv wirkenden Genen gesteuert wird, kann im Schulunterricht z.B. im Themenbereich „Errungenschaften der Pflanzenzüchtung“ als praktisches Beispiels herangezogen werden. Durch die hier beschriebene Methode können die Mendelschen Regeln anhand dieses phänotypischen Merkmals erarbeitet oder vertieft werden. Zudem ermöglicht die praktische Untersuchung von Erucasäure themenübergreifendes Arbeiten im Biologieunterricht, da sie klassische Genetik mit moderner Pflanzenzüchtung verbindet. KW - Erucasäure KW - Genetik KW - Fettsäure KW - Papierchromatographie KW - Brassica napus L. KW - Rapssamen KW - erucic acid KW - genetic KW - fatty acid KW - paper chromatography KW - Brassica napus L. KW - rape seed Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-93341 ER -