TY  - THES
A1  - Stöllner, Daniela
T1  - Neue biosensorische Prinzipien für die Hämoglobin-A1c Bestimmung
N2  - Hämoglobin-A1c (HbA1c) ist ein Hämoglobin (Hb)-Subtypus, der durch nicht-enzymatische Glykierung des N-terminalen Valinrestes der Hämoglobin-beta-Kette entsteht. Das gemessene Verhältnis von HbA1c zum Gesamt-Hämoglobin (5-20 % bei Diabetikern) repräsentiert den Mittelwert der Blutglucosekonzentration über einen zweimonatigen Zeitraum und stellt zur Beurteilung der diabetischen Stoffwechsellage eine Ergänzung zur Akutkontrolle der Glukosekonzentration dar. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen amperometrischen Biosensor für die Bestimmung des medizinisch relevanten Parameters HbA1c zu entwickeln. Durch Selektion geeigneter Bioerkennungselemente und deren Immobilisierung unter Erhalt der Bindungsfunktion für die Zielmoleküle Hämoglobin bzw. HbA1c wurden spezifische, hochaffine und regenerationsstabile Sensoroberflächen geschaffen. Für die Entwicklung des HbA1c-Biosensors wurden zwei Konzepte - Enzymsensor und Immunosensor - miteinander verglichen.  Die enzymatische Umsetzung von HbA1c erfolgte mit der Fructosylamin Oxidase (FAO) aus Pichia pastoris N 1-1 unter Freisetzung von H2O2, welches sowohl optisch über eine Indikatorreaktion als auch elektrochemisch nach Einschluss der FAO in PVA-SbQ und Fixierung des Immobilisats vor einer H2O2-Elektrode nachgewiesen wurde. Die Kalibration des Enzymsensors mit der HbA1c-Modellsubstanz Fructosyl-Valin ergab Nachweisgrenzen, die ausserhalb des physiologisch relevanten HbA1c-Konzentrationsbereich lagen. Aus der Umsetzung von glykierten Peptiden mit einer nicht HbA1c analogen Aminosäurensequenz, z.B. Fructosyl-Valin-Glycin wurde zudem eine geringe HbA1c-Spezifität abgeleitet. Für den Immunosensor wurden zwei heterogene Immunoassay-Formate unter Verwendung von hochaffinen und spezifischen Antikörpern in Kombination mit Glucose Oxidase (GOD) als Markerenzym zum Nachweis von HbA1c untersucht. Beim indirekt-kompetitiven Immunoassay wurde anstelle des kompletten HbA1c-Moleküls das glykierte Pentapeptid Fructosyl-Valin-Histidin-Leucin-Threonin-Prolin (glkPP) als Kompetitor und Affinitätsligand immobilisiert und so eine regenerierfähige Oberfläche geschaffen. Beim Sandwich-Immunoassay wurde im ersten Schritt Gesamt-Hämoglobin an die mit Haptoglobin (Hp) modifizierte Festphase angereichert und im zweiten Schritt der gebundene HbA1c-Anteil nachgewiesen.  Für die Konstruktion des HbA1c-Immunosensors wurden Affinitätsmatrizen durch Modifizierung von Cellulose-Dialysemembranen mit glkPP bzw. Hp hergestellt. Grundlegend studiert wurde die Aktivierung der Cellulose-Membranen mit 1,1'-Carbonyldiimidazol (CDI) und 1-Cyano-4-dimethylaminopyridintetrafluoroborat (CDAP) als Aktivierungsagenzien. Eine gerichtete Immobilisierung der Liganden wurde realisiert, indem glkPP über dessen C-Terminus (einzige Carboxylatgruppe) und Hp über dessen periodat-oxidiertem Kohlenhydratrest an die amino- oder hydrazidfunktionalisierte Membranen kovalent gekoppelt wurden.  Mit dem Einsatz der glkPP- und Hp-modifizierten Membranen in der elektrochemischen Messzelle war erstmalig der biosensorische Nachweis von HbA1c möglich. Als Transduktor diente eine Pt-Elektrode, an der das von der GOD generierte H2O2 umgesetzt und ein mit der HbA1c-Konzentration korrelierendes Stromsignal erzeugt wurde. Die Immunosensoren zeigten Ansprechzeiten von 3 s. Mit dem Immunosensor auf Basis des indirekt-kompetitiven Testprinzips wurde eine Kalibrationskurve für HbA1c im Bereich von 0,25-30 µg/ml (3,9-465 nM, CV 3-9 %) mit Assayzeiten von 60 min und mit dem Immunosensor im Sandwich-Format eine Kalibrationskurve im Bereich von 0,5-5 µg/ml (7,8-78 nM; 5-50 % HbA1c vom Gesamt-Hb, CV 6-10 %, 3 h) aufgenommen.
N2  - Hemoglobin-A1c (HbA1c) is a hemoglobin subtype formed by non-enzymatic reaction of glucose with the N-terminus of the beta-polypeptide chains. As it reflects the glycemic status of diabetics over the preceding 8-12 weeks, the determination of HbA1c has become an established procedure in the management of diabetes mellitus. It is measured as the percentage of total hemoglobin. Up to 5 % HbA1c are considered as normal whereas in diabetic subjects it could be elevated from 5-20 %. In addition to amperometric biosensors for glucose self monitoring which have been successfully applied in diabetes management, biosensors for HbA1c would be an useful supplement for a comprehensive diabetes control.   Objective of this work was to develop and compare amperometric biosensors for determination of HbA1c based on enzymatic and immunochemical methods.   For the enzyme based HbA1c assay a novel fructosamine oxidase (FAO) derived from marine yeast Pichia pastoris, strain N1-1 was utilized. It recognizes and oxidatively degrades fructosyl-valine (FV) which corresponds to the glycated N-terminus of the beta-chain of HbA1c and therefore is regarded as a model compound for HbA1c. Hydrogen peroxide which is liberated by the FAO during FV conversion was indicated optically in a horseradish peroxidase (POD) coupled reaction and electrochemically. For the biosensor the FAO was embedded in polyvinyl alcohol-stylbazole (PVA-SbQ) and fixed it in front of a Pt-electrode. So far, the measuring range of FV did not cover the clinically relevant range of HbA1c. Low specificity was assumed since enzyme activity also was obtained with glycated peptides, e.g. fructosyl-valine-glycine, not corresponding to the glycated N-terminus of the hemoglobin-beta-chain.  For the immunosensor two immunoassays formats - heterogeneous sandwich and heterogeneous competitive - were tested. The assays were designed as follows: The competitive immunoassay was based on the immobilized synthetic glycated pentapeptide fructosyl-valine-histidine-leucine-threonine-proline (glkPP) utilized as HbA1c analogue. The peptide has an amino acid sequence corresponding to the N-terminus of the hemoglobin beta-chains and is capable for competition together with the HbA1c of the sample for the amount of a glucose oxidase (GOD)-labelled anti-HbA1c antibody. In the sandwich-type assay haptoglobin (Hp), a natural hemoglobin binding molecule with antibody characteristic properties, was used as bioreceptor for enrichment of total hemoglobin onto the surface. In a subsequent step the HbA1c fraction was quantified by a GOD-labelled HbA1c specific antibody.   Cellulose dialysis membrane was used as the solid support for immobilization of Hp and glkPP near the sensor surface. For activation of the membrane two reagents, 1,1′-carbonyldiimidazole (CDI) and 1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate (CDAP), were compared with respect to the degree of activation and coupling efficiency. Site-directed immobilization of Hp and glkPP was achieved by coupling Hp via its carbohydrate residue and glkPP via its C-terminus to the activated membrane using a bis-amine or bis-hydrazide spacer.   The affinity membranes were placed in front of a modified Clark-type hydrogen peroxide electrode in an electrochemical measuring cell and HbA1c analysis was carried out within the stirred cell. Detection of the bound GOD-label was achieved by measurement of the electrocatalytic oxidation of hydrogen peroxide at +600 mV vs. Ag/AgCl. The indication was done in only 3 s. For the competitive principle a typical inhibition curve with a linear range between 0,25-30 µg/ml (3,9-465 nM, CV 3-9 %, 60 min per sample) HbA1c was obtained. Due to the high functional stability of the peptide multiple regeneration of the affinity surface was possible without loss of binding capacity. With the sandwich assay configuration the clinically relevant range could easily be covered (calibration curve: 5-50 % HbA1c corresponding to 7,8-78 nM, CV 6-10 %, 3 h per sample).
KW  - Hämoglobin A / Bestimmung / Biosensor / Amperometrie
KW  - Glykiertes Hämoglobin; HbA1c; Diabetes; Biosensor; Immunosensor; Enzymsensor; amperometrisch; elektrochemisch; Immunoassay; Diagnostik; Haptoglobin;
KW  - Glycated hemoglobin; HbA1c; diabetes; biosensor; immunosensor; enzyme sensor; electrochemical; amperometric; immunoassay; diagnostics; haptoglobin; im
Y1  - 2002
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000491
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TY  - THES
A1  - Hahn, Robert
T1  - Das Blüte-Bestäuber-Netz auf Brachflächen : biozönologische Untersuchung zur Bedeutung von Brachen in einer intensiv genutzten Agrarlandschaft
N2  - In der vorliegenden Dissertation wird die Bedeutung von Brachen für Artenvielfalt und Stabilität von Blüte-Bestäuber-Nahrungsnetzen in agrarisch genutzten Landschaften anhand ausgewählter blütenbesuchender Insektengruppen (Syrphidae, Lepidoptera) untersucht. Die Freilandarbeiten fanden von 1998-2000 im Raum der Feldberger Seenlandschaft, Mecklenburg-Vorpommern, statt. Es werden die beiden Hauptnahrungsquellen Nektar und Pollen betrachtet, dabei fanden Untersuchungen zur Intensität der Blüte-Bestäuber-Interaktion auf Stilllegungsflächen, zum flächenbezogenen quantitativen Nektarangebot im Jahresverlauf, zur individuellen Pollennutzung bei Syrphiden und zur Breite und Überlappung der Nahrungsnischen bei den dominanten Arten Episyrphus balteatus, Metasyrphus corollae, Syritta pipiens und Sphaerophoria scripta statt.  Im Ergebnis zeigt sich eine hohe Bedeutung der Brachflächen für die Stabilität des Blüte-Bestäuber-Netzes, während die Diversität von anderen, eher landschaftsbezogenen Faktoren abhängig ist.
N2  - This dissertation examines the importance of fallow land for the diversity and stability of pollination webs in agricultural landscapes as exemplified by selected groups of anthophilous insects (syrphidae and lepidoptera). The field studies were carried out between 1998 and 2000 in the Feldberg lakeland area in the north-east German State of Mecklenburg-Western Pomerania. Observations were made of nectar and pollen as the two main sources of food. Studies were conducted into the intensity of plant-pollinator interaction in set-aside areas, the site-specific quantity of nectar available during the vegetation period and the individual pollen intake of syrphid flies. Different methods were employed to establish the breadth of the trophic niches among the predominant species (Episyrphus balteatus, Metasyrphus corollae, Syritta pipiens and Sphaerophoria scripta) and the extent to which they overlapped.   The studies showed that, while fallow land is very important for the stability of plant-pollinator food webs, their diversity depends on other factors that are more closely related to the landscape.
KW  - Feldberger Seenlandschaft ; Agrarlandschaft ; Brache ; Samenpflanzen ; Bestäuber ; Artenreichtum
KW  - Brachfläche
KW  - Bestäubung
KW  - Blütenökologie
KW  - Blüte-Bestäuber-Interaktion
KW  - Nektar
KW  - Pollen
KW  - fallow land
KW  - pollination
KW  - flower ecology
KW  - flower-insect-interaction
KW  - nectar
KW  - pollen
Y1  - 2002
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000652
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TY  - THES
A1  - Neichel, Dajana
T1  - Charakterisierung und in vitro - Wirkung agonistischer AT1-Rezeptor Autoantikörper bei Präeklampsie-Patienten
N2  - Die Präeklampsie ist eine schwangerschaftsspezifische Bluthochdruck-Erkrankung, die im Allgemeinen nach der 20. Schwangerschaftswoche auftritt. Neben der Hypertonie sind die Proteinurie und die Ödembildung charakteristische Symptome der Präeklampsie. Obwohl heute die Pathophysiologie der Präeklampsie zum großen Teil verstanden ist, ist die Ätiologie dieser Erkrankung noch unklar. 1999 konnten wir in den Seren von Präeklampsie-Patientinnen agonistische Autoantikörper, die gegen den Angiotensin II AT1-Rezeptor gerichtet sind (AT1-AAK), nachweisen. Diese AT1-AAK gehören zur Antikörpersubklasse IgG3. Die AT1-AAK führen in Kulturen neonataler Rattenkardiomyozyten AT1-Rezeptor spezifisch zu einem positiv chronotropen Effekt. Mittels Immunpräzipitation wurde gezeigt, dass AT1-AAK spezifisch den AT1-Rezeptor präzipitieren. Kontrollproben, aus denen die AT1-AAK entfernt wurden, führen zu keiner Präzipitation des AT1-Rezeptors. Die Präzipitation des AT1-Rezeptors bleibt ebenfalls aus, wenn die AT1-AAK mit einem Peptid, welches der Aminosäuresequenz des zweiten extrazellulären Loops des humanen AT1-Rezeptors entspricht, behandelt wurden. Eine Langzeitbehandlung der Kulturen neonataler Rattenherzzellen mit AT1-AAK vermindert die funktionelle Ansprechbarkeit der Zellen auf einen erneuten AT1-Rezeptor-Stimulus. Eine veränderte AT1-Rezeptorexpression wurde nicht nachgewiesen. In guter Übereinstimmung mit den in vitro-Expressionsdaten wurde gezeigt, dass die plazentare AT1-Rezeptorexpression bei Präeklampsie-Patientinnen nicht verschieden von der plazentaren AT1-Rezeptorexpression gesunder Schwangerer mit nicht pathogen verändertem Blutdruck ist. Im Zellsystem der neonatalen Rattenherzzellen führen die AT1-AAK zur Aktivierung von Gi-Proteinen und zu verringerten intrazellulären cAMP-Spiegeln. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die AT1-AAK in Kulturen neonataler Rattenherzzellen die Transkriptionsfaktoren AP-1 und NFkB aktivieren. Die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkB wurde vornehmlich in den Nicht-Myozyten der Rattenherzzellkultur nachgewiesen. Generell wurde festgestellt, dass sich die AT1-AAK pharmakologisch wie der natürliche Agonist des AT1-Rezeptors, Angiotensin II, verhalten. Erste Daten dieser Arbeit deuten auf einen eventuellen Einfluss der AT1-AAK auf die Expression von Komponenten der extrazellulären Matrix bzw. assoziierter Faktoren (Kollagen III, MMP-2, TIMP-2, Colligin) hin. In allen in dieser Arbeit untersuchten Seren von klinisch diagnostizierten Präeklampsie-Patientinnen wurden agonistische AT1-AAK nachgewiesen. Wir vermuten daher, dass die AT1-AAK möglicherweise bedeutend in der Pathogenese der Präeklampsie sind.
N2  - Preeclampsia is a serious, pregnancy-specific disorder that usually occurs after week 20 of gestation and is characterized by hypertension, proteinuria, and oedema. While the pathophysiology is clear, little is known about etiology of preeclampsia. In 1999, we showed that sera from preeclamptic patients contain autoantibodies directed against angiotensin II AT1 receptor (AT1-AAB). These autoantibodies are immunoglobuliens of the IgG3 subclass. AT1-AAB accelerate the beating rate of neonatal rat cardiomyocytes. The agonistic effect can be blocked with the AT1 receptor blocker losartan. Co-immunoprecipitation studies have shown that AT1-AAB specifically precipitate the AT1 receptor while control samples lacking AT1-AAB do not. The AT1 receptor could not be precipitated following neutralization of the AT1-AAB by a peptide corresponding to the AT1 receptors second extracellular loop. In further studies on neonatal rat heart cells, we showed long-term stimulation of the AT1 receptor whereby AT1-AAB down-regulated the AT1 receptor-mediated response to a second agonistic receptor-stimulation. After long-term stimulation of neonatal rat heart cells, no changes in AT1 receptor expression could be identified. Corresponding to these in vitro-expression data, no difference was seen in placental AT1 receptor expression between patients with preeclampsia and healthy pregnant women. Next, we tested if the AT1-AAB lead to activation of AT1 receptor signaling in angiotensin II fashion. In neonatal rat heart cell cultures, AT1-AAB lead to activation of Gi-protein with reduced cAMP levels. AT1-AAB are able to activate the transcription factors AP-1 and NFkB in this cell system. In all observations, the agonistic AT1-AAB behave pharmacologically in a similar fashion to angiotensin II. Initial data suggest that AT1-AAB may have an effect on extracellular matrix components (ECM). We have found AT1-AAB in all women meeting the clinical criteria of preeclampsia and, therefore, suggest that AT1-AAB may be important to the pathogenesis of the disease.
KW  - AT1-Rezeptor / Präeklampsie / AT1-AAK / neonatale Rattenkardiomyozyten / Autoantikörper / Angiotensin II
KW  - AT1 receptor / preeclampsia / AT1-AAB / neonatal rat cardiomyocytes / autoantibody / angiotensin II
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001126
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TY  - THES
A1  - Bufe, Bernd
T1  - Identifizierung und Charakterisierung von Bitterrezeptoren
N2  - Menschen nehmen Tausende von Stoffen als bitter wahr. Die chemische Struktur der verschiedenen Bitterstoffe ist sehr vielfältig: Sie reicht von kleinen Molekülen wie Kaliumchlorid oder Harnstoff, bis zu sehr komplexen organischen Verbindungen. Die Größe der einzigen bekannten menschlichen Familie von Bitterrezeptoren (TAS2Rs) wurde auf nur ca. 80-120 Mitglieder geschätzt. In Anbetracht der hohen Zahl und Komplexität der Bitterstoffe erscheint die Zahl von Rezeptoren als sehr gering. Dies führt natürlich zu einer Reihe von Fragen: Wie viele Mitglieder hat die menschliche TAS2R-Genfamilie? Wie viele verschiedene Substanzen können denselben Rezeptor aktivieren? Scheint die Zahl der TAS2R-Rezeptoren ausreichend, alle Bitterstoffe wahrnehmen zu können oder muss es noch andere Bitterrezeptorfamilien geben? Diese Fragen zu beantworten, ist das Ziel der vorliegenden Arbeit.   Hier durchgeführte Analysen des menschlichen Genomprojektes zeigen, dass Menschen ca. 25 TAS2R-Rezeptoren besitzt, die eine sehr divergente Aminosäurestruktur aufweisen. Diese Rezeptoren wurden in eine neu entwickelte Expressionskassette kloniert, die den Transport des Rezeptors an die Zelloberfläche ermöglicht. Um Liganden für die menschliche TAS2R-Rezeptoren zu identifizieren, wurden die Rezeptoren in HEK293 Zellen exprimiert und mit verschiedenen Bitterstoffen stimuliert. Der Nachweis der Rezeptoraktivierung erfolgte durch Calcium-Imaging. Es konnte gezeigt werden, dass hTAS2R16 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Salicin und verwandten bitteren Pyranosiden ist. So wird hTAS2R16 in HEK293 Zellen durch Salicin und chemisch verwandte Substanzen aktiviert. Ein Vergleich der in diesem Messsystem erhaltenen Daten mit psychophysikalisch ermittelten Geschmackswahrnehmungen beim Menschen, ergab eine hohe Übereinstimmung. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die Desensitiverung einzelner Rezeptoren die Ursache für die Adaption des Bittergeschmacks ist. Der Nachweis der Expression des Rezeptors in menschlichen Geschmackspapillen, sowie die festgestellte Assoziation des G/A Polymorpphismus an Position 665 des hTAS2R16 Gens mit einer reduzierten Salicinwahrnehmung, sind weitere unabhängige Beweise für diese These. Ein anderer menschlicher Rezeptor, hTAS2R10, wird durch die Bitterstoffe Strychnin, Brucin und Denatonium aktiviert. Dies sowie die Tatsache, dass die zur Aktivierung benutzten Konzentrationen eine sinnvolle Korrelation zu dem menschlichen Geschmacksschwellwert von Strychnin zeigen, sind starke Hinweise, dass hTAS2R10 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Strychnin und verwandten Substanzen ist.   Die vorliegenden Daten zeigen eindeutig, dass die TAS2R-Rezeptoren auch beim Menschen Bitterrezeptoren darstellen. Sowohl hTAS2R16, als auch hTAS2R10 werden durch ein Spektrum strukturell sehr unterschiedlicher Bitterstoffe aktiviert. Falls die anderen Mitglieder der TAS2R-Familie ebenfalls dieses Verhalten zeigen, wäre es möglich, dass die nur ca. 25 Mitglieder umfassende TAS2R-Rezeptorfamilie des Menschen tatsächlich zur Wahrnehmung aller Bitterstoffe ausreicht.
N2  - Bitter taste generally is aversive and protects vertebrates from ingestion of toxic substances, but bitter tastants also contribute to the enjoyment and palatability of food influencing human nutritional habits. Although bitter taste has been extensively studied, receptor mechanisms are still poorly understood. Anatomic, functional and genetic evidence from rodents suggested, however, that the T2R genes encode a family of bitter receptors while definite proof is missing in humans 6. We here report that the hT2R16 receptor is present in vallate papilla taste buds of the human tongue and activated by bitter b-glucopyranosides. These phytonutrients did not activate any other human T2R and showed similar concentration-response relations and cross-desensitization in hT2R16 expressing cells and psychobiological experiments. hT2R16 is broadly tuned. It binds bitter compounds that share only a b-glycosidic bond and a glucose residue. The broad tuning of T2Rs could explain how a limited number of receptors permits the perception and coding of numerous and different bitter substances. Together our data identify the hT2R16 as a broadly tuned, genuine human bitter receptor for b-glucopyranosides.
KW  - Geschmack
KW  - Bitter
KW  - Rezeptoren
KW  - TAS2R
KW  - Salicin
KW  - HEK293
KW  - calcium imaging
KW  - taste
KW  - bitter
KW  - receptor
KW  - TAS2R
KW  - HEK293
KW  - Salicin
KW  - calcium imaging
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001130
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TY  - THES
A1  - Wende, Hagen
T1  - Genetische Charakterisierung des "Leukocyte Receptor Complex" und Entwicklung einer Methode zum Nachweis seiner Produkte im Einzelzellmaßstab
N2  - Der "Leukocyte Receptor Complex" (LRC) ist ein DNA-Sequenzabschnitt auf dem Chromosom 19 des Menschen, der eine Länge von über 900.000 Basenpaaren umfaßt. In diesem Chromosomenabschnitt ist eine Vielzahl von Genen lokalisiert, die für die Funktion verschiedener weißer Blutzellen (Leukozyten) von entscheidender Bedeutung sind. Bei den aus diesen Genen synthetisierten Proteinen (Eiweißen) handelt es sich um Strukturen, die auf der Oberfläche dieser Zellen lokalisiert sind und zur Interaktion der Leukozyten mit ihrer Umgebung dienen. Diese auch als Rezeptoren bezeichneten Proteine können mit Oberflächenproteinen auf anderen Körperzellen wechselwirken und daraus resultierende Signale in das Innere der Blutzelle weiterleiten.  In der vorliegenden Doktorarbeit wurde der LRC im Detail untersucht. Hierzu wurde zunächst der gesamte Chromosomenabschnitt aus kleineren, einander überlappenden DNA-Fragmenten rekonstruiert. Aufgrund der in diesen DNA-Fragmenten enthaltenen DNA-Sequenzen war es möglich, den gesamten Chromosomenabschnitt ähnlich einem Puzzle zusammenzusetzen. Die anschließende Analyse des LRC zeigte, daß sich dieser in drei Bereiche, sogenannte Cluster, unterteilen läßt. Diese Cluster sind dadurch gekennzeichnet, daß in ihnen jeweils nur Gene eines Rezeptortyps vorkommen. Hierbei handelt es sich um ‚immunoglobulin-like transcript′ -Gene (ILT) und ‚killer cell Ig-like receptor′-Gene (KIR). Die KIR- und ILT-Cluster werden von weiteren stammesgeschichtlich verwandten Genen unterbrochen und flankiert. Je nach Individuum können im LRC bis zu 31 solcher verwandten Rezeptorgene lokalisiert sein. Auf der Grundlage der Kartierungsdaten und von Daten des humanen Genomprojekts war es zudem möglich, evolutionäre Untersuchungen zur Entwicklung des LRC durchzuführen. Dabei wurde eine Hypothese zur Entstehung des LRC entworfen und zu anderen Spezies in Beziehung gesetzt.  Im zweiten Teil der Arbeit habe ich aufbauend auf der sogenannten HRCA-Methode eine Technik entwickelt, die es erlaubt kleinste Unterschiede zwischen DNA-Sequenzen, sogenannte Einzelbasenpaaraustausche, nachzuweisen. Die entwickelte Methode kann verwendet werden, um sehr ähnliche DNA-Sequenzen, wie z.B. verschiedene KIR-Sequenzen, zu unterscheiden und ihre Menge zu bestimmen. Sie ist außerdem geeignet Mutationen, die mit bestimmten Krankheiten assoziiert sind, nachzuweisen und könnte somit in der Diagnostik Anwendung finden.
N2  - The Leukocyte Receptor Complex (LRC) is a DNA region on human chromosome 19 with a length of approximately 900.000 base pairs. A number of genes, which are located in this chromosomal region, are known to be important for the function of some types of white blood cells (leukocytes). The products of theses genes are proteins, which are located on the surface of these cells and enable them to interact with their environment. These proteins are also called receptors. They can bind to cell surface proteins on other cells and transmit resulting signals into the leukocyte.  During my work I analyzed the chromosomal organization of the LRC in detail. To do so, I reconstructed the whole chromosomal region from smaller overlapping DNA fragments. Due to the DNA sequences contained within these fragments it was possible to put the whole chromosomal region together like a puzzle. The following analyses of the LRC showed that it is mainly composed of three regions, so called clusters. These clusters are characterised by the presence of only one receptor family. These are the immunoglobulin-like transcripts (ILTs) and the killer cell Ig-like receptors (KIR) respectively. In the LRC the KIR- and ILT-Clusters are flanked by additional receptor genes, which are evolutionary related to KIRs and ILTs. The number of receptor genes in the LRC varies between individuals, their can be up to 31 genes on each chromosome.  On the basis of the data obtained in this work as well as data from the human genome project it was also possible to draw conclusions concerning the evolutionary development of the LRC. I developed a hypothesis of the origin of the LRC and discussed this in comparison to other species.  In the second part of my thesis I developed a new technique based on the so-called ’hyper-branched rolling circle amplification′ (HRCA). This technique allows the detection of small differences between two or more DNA molecules, so called ’single nucleotide polymorphisms′ (SNPs). With this newly developed method it is possible to distinguish very similar variants of a gene, e.g. two KIR sequences, and to determine their relative concentration. The method can also be used to detect mutations, which are associated with certain diseases and could therefore be used for diagnostic purposes.
KW  - Leukocyte Receptor Complex LRC KIR ILT FCAR Immunglobulin Evolution Immunsystem SNP HRCA
KW  - Leukocyte Receptor Complex LRC KIR ILT FCAR immunoglobulin evolution SNP HRCA
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001298
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TY  - THES
A1  - Hoyer, Stephan W.
T1  - Prädiktiver Wert sensorischer Laboruntersuchungen für den Getränkekonsum älterer Menschen unter Alltagsbedingungen
N2  - Zur Ermittlung der Akzeptanz und ihres prädiktiven Wertes für den Verzehr von Lebensmitteln bzw. Getränken, sind Beliebtheitsprüfungen mit Konsumenten unter standardisierten Bedingungen im Sensoriklabor üblich. Die prädiktive Aussagekraft dieser Laboruntersuchungen wird jedoch durch folgende Aspekte eingeschränkt:  (1) Der situative Kontext wird ausgeschaltet, d.h. die Verzehrssituation, in der ein Produkt üblicherweise konsumiert wird, ist im Labor bewusst eliminiert und das zu bewertende Produkt wird nicht in einer kompletten Mahlzeit dargeboten (2) Der Produktkontakt im Labor ist im Gegensatz zu der anhaltenden Konfrontation unter alltäglichen Bedingungen nur kurzfristig, was Langzeitaussagen bzw. Dauerpräferenzen nicht zuläßt;  (3) Im Labortest ist die freie Auswahl auf eine geringe Anzahl angebotener Produkte beschränkt.  In dieser Arbeit soll daher die Frage beantwortet werden, welchen prädiktiven Wert sensorische Beliebtheitsuntersuchungen im Labor für Lebensmittelakzeptanz und -verzehr unter Alltagssituationen haben. Dies wird für verschiedene Altersgruppen gezeigt, die frei in ihrer Entscheidungsfindung sind. Dazu gaben 56 Studenten (23,1&#177;3,7 Jahre) und zwei Seniorengruppen, zum einen aus einer Begegnungsstätte (20 Probanden; 75,6&#177;8,1 Jahre) und zum anderen aus dem betreuten Wohnen (14 Probanden; 76,1&#177;12,5 Jahre), in einer ersten Laboruntersuchung Beliebtheitsbewertungen (Akzeptanz und Rangordnungsprüfung) zu 6 Erfrischungsgetränken ab. Anschließend folgte ein mindestens vierwöchiger Zeitraum, in denen die Probanden aus einem speziell für die Studie konzipierten Automaten Getränke in Einrichtungen der Gemeinschaftsverpflegung entnehmen konnten. Die Entnahme war via Chipkarte ad libitum möglich. Computergestützt wurden dabei individuelle Getränkewahl, Menge und Entnahmezeit aufgezeichnet. Unmittelbar nach der Automatenphase wurde eine erneute Laboruntersuchung durchgeführt. In allen Untersuchungsphasen wurden dieselben Erfrischungsgetränke aus Konzentrat, variiert in Apfel- oder Orangensaftgeschmack, ohne oder mit Zusatz von Zucker (20g/l) und Kohlensäure (4 g/l CO2), angeboten. Eine Quntitativ Deskriptive Analyse bestätigte unterschiedliche Profile bei den Produkten, so dass von sensorisch wahrnehmbaren Unterschieden zwischen den Produkten ausgegangen werden konnte. Die Probanden bekamen zu keiner Zeit Informationen über die exakte Zusammensetzung der Getränke. Sowohl in der Laborbewertung als auch nach Getränkekonsum via Automat, fanden sich unterschiede zwischen den Altersgruppen.   In der Akzeptanzprüfung bewerteten Studenten die Apfelvarianten besser als die Orangenvarianten. Senioren, die insgesamt höhere Akzeptanzwerte vergaben, bewerteten alle Getränke in fast allen Attributen gleichermaßen gut. Nach der 4-wöchigen Automatenphase hatte sich die Akzeptanz der sechs Getränke nicht wesentlich geändert.  Auch in beiden Rangordnungsprüfungen waren bei den Studenten &bdquo;Apfel&ldquo; und &bdquo;Apfel mit Kohlensäure&ldquo; auf den ersten Plätzen, &bdquo;Orange mit Zuckerzusatz&ldquo; auf dem letzten Platz. Nach Adjustierung auf die individuelle Trinkmenge (in Wenig-, Mittel- Vieltrinker) und wurde &bdquo;Apfel mit Kohlensäure&ldquo; in der Automatenphase von den Studenten am meisten getrunken. In der Vieltrinkergruppe wurde &bdquo;Orange mit Zuckerzusatz&ldquo; deutlich vernachlässigt. Der Automatenkonsum der Studenten bestätigte damit im Wesentlichen die Ergebnisse der Beliebtheitsprüfung im Labor. Bei den Senioren waren in der Rangordnungsprüfung, die eine Lieblingsreihenfolge erzwang, alle süßeren Getränke (mit Zuckerzusatz) auf den ersten Plätzen. In der Automatenphase wurden jedoch viele Getränke ohne Zuckerzusatz bevorzugt. Dies zeigte sich sowohl in der individuellen Präferenz, als auch im Gesamtkonsum. Aufgrund der Ergebnisse kann der prädiktive Wert von Laboruntersuchungen mit Senioren in Bezug auf die Auswahl und den Konsum unter alltäglichen Bedingungen als gering beurteilt werden. Die Getränke mit der individuell höchsten Laborpräferenz wurden unter Alltagsumgebung in der Gemeinschaftsverpflegung in deutlich geringeren Umfang als erwartet verzehrt. In der Vergleichsgruppe der Studenten ist die Übereinstimmung größer(p<0,05).   In Häufigkeitsfragebögen vor und nach der Automatenphase wurde das Trinkverhalten speziell von kohlensäurehaltigen Getränken erfragt. Der Anteil von kohlensäurehaltigen Getränken ist sehr variabel, und kann tagesabhängig von einem geringen bis zum Hauptanteil ausmachen. Senioren tranken von den Automatengetränken weniger kohlensäurehaltige Getränke als Studenten(p<0,001). Trotzdem zeigte nur eine Minderheit einen völligen Verzicht, wie sich durch Fragebogen und auch Automatenkonsum ermitteln ließ.  Die Verwendung eines computergestützten Getränkeautomaten bietet eine neue Möglichkeit, die Langzeitpräferenz und den tatsächlichen Konsum unter gewohnten Alltagsbedingungen und bei freier Produktauswahl zu ermitteln. Selbst bei Altersgruppen, die mit Laboruntersuchungen überfordert sind, können Vorlieben untersucht werden.
N2  - Background: For predicting consumption of food products consumer acceptance is usually measured by using hedonic scales in the sensory lab. However, the predictive value of such results is limited by different facts: (1) the real life context is missing, e.g. the tested product is not integrated into a meal, (2) only short confrontation with the product in lab in contrast to long-term exposure in the real life. Therefore, methods are needed which give a more reliable estimate of long-term preference and consumption.   Objective: To develop and to validate an automatic device to estimate the long-term acceptance of beverages in young and elderly people.  Methods: A new computerized vending machine was designed and established. The device is able to deliver 6 different types of beverages and can be placed in any public room. Study participants, after identifying themselves by a chip card, are free to select any quality and quantity of the offered beverages. The individual consumption data is registered. For comparing these consumption data with hedonic lab measurements a total of 56 students (mean age 23,1) and 34 seniors (mean age 76.1) were recruited for a 3-step experiment. In the first step they visited the sensory lab and rated on a 7 point hedonic scale and afterwards ranked 2 orange and 4 apple juices modified in their sugar and carbon dioxide content. In the second step the computerized vending machine was placed in a location, where the subjects usually eat, i.e. a university canteen or senior club or an assisted living home for seniors. Subjects were offered the same beverages as in lab test. The machine registered the individual choice and consumption (amount, time). In the third step the lab test was repeated.  Results: In seniors the lab acceptance test with similar products has no discriminatory power. The ranking test reveals to be more reliable for elderly people. Moreover, seniors prefer sweeter products in the lab. This is not found among younger people. The lab measurements with seniors are low in their value concerning their real life choice and intake via the device. The correlation coefficient between lab ranking and beverage choice was lower for seniors than students (p< 0.05). There was no difference between young and elderly people in the ability to handle the device. In general, students prefer more carbonated beverages than seniors(p<0.001)   Conclusion: The results obtained by the new device give better information on long-term beverage consumptions than preference measurements in the lab.
KW  - Getränkeauswahl
KW  - Konsum
KW  - Getränkeautomat
KW  - Alltagsbedingungen
KW  - vending machine
KW  - food choice
KW  - beverage
KW  - situation
KW  - real life context
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001057
ER  - 
TY  - THES
A1  - Teubner, Wera
T1  - Charakterisierung von Sulfotransferasen im Gastrointestinaltrakt von Mensch und Ratte und Aktivierung von Promutagenen in V79-Zellen, die eine intestinale Form (1B1) des Menschen und der Ratte exprimieren
N2  - Die Ausstattung der gastrointestinalen Mukosa des Menschen und der Ratte mit Sulfotransferasen wurde mit Hilfe von Immunodetektion und Enzymaktivitätsmessungen untersucht. In Proben aus Colon und Rektum von 39 Personen wurden die Formen h1A1, h1A3 und h1B1 identifiziert, wobei in einer weiteren Probe, die als einzige von einem an Colitis Ulcerosa erkrankten Patienten stammte, keine Sulfotransferasen nachgewiesen werden konnten. Bei der Immunblot-Analyse war das Expressionsmuster der einzelnen Formen in allen Proben ähnlich. In wenigen Proben waren die relativen Signalintensitäten der h1A1 und der h1B1 um die Hälfte erniedrigt. Der Gehalt von SULT an zytosolischem Protein zeigte einen bis zu 8 - 10fachen Unterschied, er betrug jedoch bei zwei Dritteln der Proben zwischen 0,15 und 0,3 (h1A1 und h1A3) bzw. 0,6 und 0,8 Promille (h1B1). Die Variation konnte nicht auf Alter, Geschlecht oder Krankheitsbild der Patienten zurückgeführt werden. Auch der für die allelischen Varianten der h1A1 beschriebene Effekt auf die Enzymaktiviät bzw. Stabilität konnte in der Menge an immunreaktivem Protein nicht in diesem Ausmaß detektiert werden. Die Allelhäufigkeit von h1A1*R und h1A1*H war gegenüber der gesunden Bevölkerung nicht verändert.  In den sieben Proben aus dem Dünndarm (Coecum, viermal Ileum, Jejunum) konnten zusätzlich die Formen h1E1 und h2A1 identifiziert werden. Ein möglicherweise der Form h1C1 entsprechendes Protein wurde im Magen detektiert. Im Vergleich zum Menschen war die Expression in der Ratte stärker auf die Leber konzentriert. Während beim Menschen in allen untersuchten Abschnitten Sulfotransferasen in Mengen detektiert wurden, die in zwei Fällen (h1B1 und h1A3) sogar den Gehalt in der Leber überstiegen, beschränkte sich die Expression in der Ratte auf im Vergleich zur Leber geringe Mengen im Magen und Dickdarm. Nachgewiesen wurden die r1B1, r1A1 sowie eine nicht identifizierte Form von 35kD, bei der es sich vermutlich um die r1C2 handelt. Im Vergleich zur Leber enthielt der Dickdarm der Ratte 20 - 30 % an r1B1 und 3 % an r1A1, während im Dickdarm des Menschen die 3 - 5fache Menge an h1B1 und 25 - 50 % an h1A1 gefunden wurden. Die nicht identifizierte Form verhielt sich wie die r1B1. Die für die Leber der Ratte bekannte geschlechtsabhängige Expression wurde im Gastrointestinaltrakt nicht beobachtet.  Die Verteilung der Sulfotransferasen im Colon und Ileum des Menschen wurde immunhistochemisch untersucht; für die Gewebe der Ratte war die Spezifität der zur Verfügung stehenden Antiseren nicht ausreichend. Im Colon traten h1B1-spezifische Färbungen in den differenzierten Enterozyten am oberen Ende der Krypten auf, im Dünndarm wurden die Epithelzellen der Zotten gefärbt. Die Färbung konzentrierte sich auf das Zytoplasma. Eine ähnliche Verteilung zeigte sich für h1A1 und h1A3, außer daß zusätzlich eine intensive Färbung der Endothelzellen der Kapillaren in der Submukosa des Ileums auftrat. Im Dickdarm war dies nur bei den Kapillaren in den Lymphfollikeln zu erkennen. Die h2A1 war lediglich im Zytoplasma der Epithelzellen der Zotten des Ileums nachzuweisen, während im Colon keine Farbreaktion auftrat.  Durch die Verwendung der rekombinanten Indikatorstämme TA1538-h1A1, -h1A3 und -h1B1 und des Ausgangsstammes Salmonella typhimurium TA1538 im Ames-Test wurde gezeigt, daß verschiedene benzylische und allylische Alkohole durch im humanen Colon exprimierte Sulfotransferasen zu Mutagenen aktiviert werden. In den meisten Fällen erwies sich eine der drei Sulfotransferasen als besonders effizient in der Bioaktivierung, während durch die anderen Formen kein oder nur ein schwacher Effekt verursacht wurde. Die Bioaktivierung von Promutagenen durch Sulfotransferasen im Colon muß im Zusammenhang mit der Lokalisation diskutiert werden. Die Zellen im Darm, in denen immunhistochemisch Sulfotransferasen detektiert wurden, haben mit Ausnahme des Endothels je nach Abschnitt eine Lebensdauer von maximal fünf Tagen und machen keine weiteren Zellteilungen mehr durch. Daher sind DNA-Schäden in diesen Zellen ein sehr geringes Risiko für den Organismus. Soweit die reaktiven Metabolite in diesen Zellen gefangen bleiben, kann die Bioaktivierung in diesen Zellen und die Bildung von Addukten als protektiv betrachten werden, da letztere nach wenigen Tagen mit den toten Zellen in das Darmlumen abgegeben werden. Für den Vergleich der Bioaktiverung von Promutagenen durch die Form 1B1 des Menschen und der Ratte wurden aus V79 Lungenfibroblasten des Chinesischen Hamsters abgeleitete Zellinien hergestellt, die je eine der beiden Formen stabil exprimieren. Damit standen 1B1-profiziente Indikatorzellen für den HPRT-Genmutationstest zur Verfügung, und die 1B1-abhängige Bioaktivierung konnte in einem System untersucht werden, die dem eukaryontischen Organismus näher steht als die für die Ames-Tests verwendeten Bakterien. So war z.B. die Sulfotransferase wie im Gewebe im Zytoplasma lokalisiert. Als Modellsubstanzen wurden hierbei die bereits in TA1538-h1B1 mutagen wirkenden benzylischen Alkohole 6-Hydroxymethylbenzo[a]pyren und 4-Hydroxycyclopenta-[def]chrysen getestet. Da die Sensitivität einer Sulfotransferase-exprimierenden V79-Zellinie sowohl durch die Menge an Sulfotransferase als auch durch die Verfügbarkeit des Sulfodonors limitiert sein könnte, wurden die Mutagenitätsexperimente mit V79-r1B1-Zellinien durchgeführt, die sich in ihrer Enzymaktivität um das Zwanzigfache unterschieden: V79-r1B1/A und -/B. Eine starke Erhöhung der Mutantenfrequenz wurde nur in der hoch exprimierenden Zellinie V79-r1B1/A (1019 &#177; 224 pmol/mg/min) beobachtet, so daß eine gravierende Beeinträchtigung der Sensitivität durch einen Mangel an Kosubstrat ausgeschlossen wurde. In der niedriger exprimierenden Zellinie V79-r1B1/B (57 &#177; 9 pmol/mg/min) war nur mit 6-Hydroxymethylbenzo[a]pyren ein schwacher Anstieg der Mutantenfrequenz zu erkennen, der mit 0,3 &#181;M bei einer in etwa 100fach höheren Konzentration begann als bei V79-r1B1/A. Die zytosolische Fraktion aus V79-r1B1/B-Zellen enthielt in etwa die dreifache Menge an r1B1-Protein wie die aus Colonmucosa der Ratte. Da zumindest für die humane Mukosa gezeigt wurde, daß die 1B1 nur im einschichtigen Epithel, nicht aber in allen Zellen der Mukosa exprimiert wird, repräsentiert die zytosolische Fraktion aus der Mukosa nur bedingt die Expression in den Epithelzellen und der Vergleich mit den V79-1B1-Zellen ist grob. Im Gegensatz zu V79-r1B1/B war die Zellinie V79-h1B1, die ebenfalls nur mit Darm und Leber vergleichbare Mengen an h1B1 exprimierte, in der Lage, beide benzylischen Alkohole zu aktivieren. Der Erhöhung der Mutantenfrequenz im Vergleich zur KontrollZellinie war ähnlich wie bei der stark exprimierenden Zellinie V79-r1B1/A, erforderte aber 10fach höhere Konzentrationen.  Somit unterscheiden sich Mensch und Ratte nicht nur insgesamt in ihrer Ausstattung des Gastrointestinaltrakts mit Sulfotransferasen, auch bei Betrachtung einer einzelnen Form zeigten sich deutliche Unterschiede in der Aktivierung von zwei Promutagenen. Die Ratte ist daher ein ungeeignetes Modell, um die Rolle von Sulfotransferasen bei tumorinitiierenden Prozessen im Darm zu untersuchen. Dies unterstreicht die Bedeutung von rekombinanten in-vitro-Systemen für die Erfassung des humanen Metabolismus von Fremdstoffen.  Insgesamt kennt man nur eine geringe Anzahl von Substanzen, die im Tierexperiment Colontumore erzeugen, und mit Ausnahme der heterozyklischen aromatischen Amine sind diese lediglich von experimenteller Bedeutung. Dies spricht für effiziente Schutzmechanismen der Darmmukosa gegenüber Mutagenen und läßt die Frage nach der hohen Inzidenz des Kolorektalkarzinoms offen.
N2  - Cytosolic fractions of human and rat gastro-intestinal mucosa were electrophoresed, blotted and probed with six antibodies with differing specificities for sulfotransferase (SULT) forms. Using SULTs heterologously expressed in bacteria for comparison of electrophoretic and immunoreactive properties the following SULTs could be identified in the different parts of the human (h) gastro-intestinal tract: h1A1, h1A3 and h1B1 were detected in all parts analyzed (rectum, colon, caecum, ileum, jejunum, stomach), h1E1 and h2A1 only in the small intestine and h1C1 only in stomach.  The presence of h2A1 and h1E1 in the small intestine was also confirmed by enzyme activity measurements using radiolabelled dehydroepiandrosterone and b-estradiol as substrates.  SULTs were detected in almost all of the samples analyzed (rectum: 8 of 8, colon: 22 of 23, ileum 5 of 5 and one each of coecum, jejunum and stomach). The colon sample void of SULT protein was the only one taken from a patient suffering from ulcerative colitis. Using an antibody which crossreacts with all human SULT1 forms, a similar pattern of immunoreactivity was observed for all positive samples of rectum and colon mucosa. However, the total amount of immunoreactive protein varied 8 - 10 fold. SULT content in two thirds of the samples was between 0.15 and 0.3 &permil; (h1A1 and h1A3) and 0.6 and 0.8 &permil; (h1B1). This variation could neither be related to age, gender nor disease. The distribution of the allelic variants h1A1*Arg and h1A1*His was analyzed by restriction fragment length polymorphism and the allele frequency in patients suffering from colorectal carcinoma (n = 39) was found not to differ from the values published for normal population. The reduced enzyme activity and stability that has been described for h1A 1*His in platelats was not reflected in the amount of h1A1 protein in the samples of colon and rectum mucosa. Expression of h1A1 and h1A3 was approximately four times higher in ileum than in colon, whereas amounts of h1B1 were comparable in both parts of the intestine. Some of these forms were also expressed at similar, or higher levels in the liver. However, the level of h1B1 protein was higher in the gut than in the liver, and h1A3 was hardly expressed in liver.  In rat (r), unlike human, SULTs were poorly expressed in the intestine. r1B1 and an unidentified immunoreactive protein of 35kD were found in the large intestine (rectum, colon, coecum), the proximal jejunum and glandular stomach. r1A1 protein was detected in the large intestine and forestomach. However, the highest levels of these forms in the intestine reached only 3% (r1A1) and 20% (r1B1 and 35kD-protein) of those detected in liver. Unlike in liver, SULT expression in the intestine was independent on gender. Immunohistochemical analysis of human colon and ileum using antibodies specific for either h1B1, h2A1 or all forms of h1A showed that all forms were expressed in the cytosol of the short-lived absorptive cells. In ileum, expression was restricted to villus cells with no staining of crypt cells; except for h1A forms, which were also detected in the endothelial cells of capillaries in the submucosa. In colon, h1B1 and h1A forms, but not h2A1 were detected in the upper third of the crypts. Sensitivities of the antibodies were insufficient for analysis of rat intestine. As 1B1 was the most prominent form in the intestine of both species, Ames tests and hprt gene mutation assays were performed using indicator cells constructed for heterologous expression of 1B1. 6-Hydroxymethylbenzo[a]pyrene and 4-hydroxycyclo-penta[def]chrysene were detected as strong mutagens in Salmonella typhimurium TA1538-h1B1 but neither in the SULT-deficient parental strain nor in bacteria expressing h1A1 or h1A3. Other benzylic or allylic alcohols were mutagenic in Salmonella typhimurium TA1538-h1A1 or h1A3, but not in the h1B1-expressing strain. For the mammalian system, one cell line with high 1B1 activity as determined by turnover of a-naphthol at 1&#181;M and two cell lines with lower activity were established: V79-r1B1/A (1019 &#177; 224 pmol/mg/min), V79-r1B1/B (57 &#177; 9 pmol/mg/min) and V79-h1B1 (19 &#177; 5 pmol/mg/min). 1B1 expression in cytosolic fractions was comparable to rat liver and human colon for V79-r1B1/B and V79-h1B1 respectively. Subcellular distribution was analyzed by immunostaining of cultured cells fixed with methanol. Strong staining of the cytosol was observed in most, but not all of the V79-r1B1/A cells. No staining was observed in V79-r1B1/B, V79-h1B1 or the parental V79 cells. In all cell lines, expression was stable over at least 25 passages and could be detected after 24, 48 and 72 h of cultivation. Population doubling times were 13,1 &#177; 0.6 h for V79-h1B1 (n = 4), 14.1 &#177; 1.3 h for V79-r1B1/A (n = 6) and 14.1 &#177; 1.7 h (n = 3) for V79-r1B1/B.  6-Hydroxymethylbenzo[a]pyrene and 4-hydroxycyclopenta[def]chrysene were detected as strong mutagens in V79-1B1 cells, but not in SULT-deficient control cells. The effect was strong in V79-r1B1/A and V79-h1B1, but weak and occurring at higher concentrations in V79-r1B1/B. Comparing immunoreactivity in cytosolic fractions and fixed cells, h1B1 was expressed more strongly in colonic epithelial cells than in V79-h1B1. It is therefore probable that the compounds tested are also activated in the human gut; however, due to the cellular localization of the enzyme, differentiated cells may be affected primarily. Since these cells are discarded into the gut lumen after a few days and do not undergo further cell divisions, the risk of causing mutations should be low. This mechanism may lead to a presystemic elimination of dangerous compounds.  For the study of SULT1B1 mediated mutagenicity in human intestine, rat is a poor model since rat 1B1 was much less capable of activating the benzylic alcohols and was also found to be present in this organ in lower amounts than the human form.
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000084
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schmidt, Ruth Maria
T1  - Signalkaskaden und Steuermechanismen in den Speicheldrüsen von Dipteren
T1  - Signalling pathways and control mechanisms in the salivary glands of Diptera
N2  - Flüssigkeitssekretion und Proteinsekretion werden in Speicheldrüsen von Insekten über Hormone und Neurotransmitter gesteuert. Diese entfalten ihre physiologische Wirkung in den sekretorischen Drüsenzellen hauptsächlich über den zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Signalweg und den Inositoltrisphosphat (IP<SUB>3</SUB>) / Ca<sup>2+-Signalweg. Die Mechanismen möglicher Wechselwirkungen zwischen diesen Signalwegen und ihre physiologischen Auswirkungen sind unzureichend bekannt. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Frage, ob und wie sich der Ca<sup>2+-Signalweg und der cAMP-Signalweg in der Speicheldrüse der Diptere Calliphora vicina beeinflussen. Substanzen wie 5-Fluoro-α-Methyltryptamin und Histamin wurden in früheren Arbei-ten als Agonisten genutzt, um in den Speicheldrüsen von C. vicina selektiv den cAMP-Signalweg (getrennt vom IP<SUB>3</SUB>/Ca<sup>2+-Signalweg) zu aktivieren. Es zeigte sich in transepithelialen Potentialmessungen und mikrofluorometrischen Ca<sup>2+-Untersuchungen, dass beide Substanzen sowohl den cAMP-Weg als auch den Ca<sup>2+-Signalweg aktivierten. Die physiologischen Ursachen der Histamin-induzierten Ca<sup>2+-Erhöhung wurden genauer untersucht.  Zusammengefasst zeigten diese Untersuchungen, dass Histamin wie 5-HT den cAMP-Weg und die Phosphoinositidkaskade aktivierte. Im Gegensatz zu den 5-HT-induzierten Ca<sup>2+-Oszillationen, welche durch interzelluläre Ca<sup>2+-Wellen synchronisiert werden, verursachte Histamin bei niedrigen Konzentrationen lokale Ca<sup>2+-Oszillationen in einzelnen Zellen (keine Wellen). Bei höheren Histamin-Konzentrationen war eine anhaltende Ca<sup>2+-Erhöhung oder ein synchrones <quote>Ca<sup>2+-beating</quote> in der gesamten Drüse zu beobachten.  Des Weiteren wurde die Frage untersucht, ob eine Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration den IP<SUB>3</SUB> Ca<sup>2+-Signalweg in den Epithelzellen der Speicheldrüse beeinflussen kann. Es zeigte sich, dass cAMP den durch schwellennahe 5-HT-Konzentrationen induzierten Ca<sup>2+-Anstieg verstärkte. Diese Verstärkung wurde durch eine PKA-vermittelte Sensitivierung des IP<SUB>3</SUB>-Rezeptor/Ca<sup>2+-Kanals für IP<SUB>3</SUB> verursacht. Immunzytochemische Untersuchungen deuten dar-auf hin, dass die Proteinkinase A eng mit dem IP<SUB>3</SUB>-Rezeptor/Ca<sup>2+-Kanal assoziiert ist. Diese Messungen zeigen erstmals, dass auch bei Invertebraten der Botenstoff cAMP, PKA-vermittelt, den IP<SUB>3</SUB>-Rezeptor/Ca<sup>2+-Kanal des ER für IP<SUB>3</SUB> sensitiviert.
N2  - Fluid- and protein-secretion in the salivary glands of insects are controlled by hormones or neurotransmitters. These agonists activate two signalling cascades: the cAMP-pathway and the IP>sub>3/Ca-pathway. The functional crosstalk between these two signalling pathways is poorly understood.  Functional crosstalk between cAMP-pathway and IP3/Ca<sup>2+-pathway was investigated in the salivary glands of the blowfly, Calliphora vicina. Histamine and 5-alpha-methyltryptamine were used in an attempt to activate the cAMP-pathway selectively, as suggested previously. By using transepithelial potential-measurements and microfluorometric Ca<sup>2+-imaging it was demonstrated that both substances activate the cAMP- and the IP3/Ca<sup>2+-pathway. The physiological effects of histamine were investigated in detail. These experiments show that histamine causes an intracellular Ca<sup>2+-elevation that, in some preparations exhibits oscillations with concentration-dependent frequencies. In contrast to 5-HT induced intracellular Ca<sup>2+-oscillations and propagating intercellular Ca<sup>2+-waves histamine produces local Ca<sup>2+-oscillations in single cells or synchronous <quote>Ca<sup>2+-beating</quote> in the whole gland. In addition the effects of increasing cAMP on the IP3/Ca<sup>2+-pathway in the salivary glands of the blowfly were studied. It could be demonstrated that cAMP augments the 5-HT-induced Ca<sup>2+-increase in glands stimulated with low doses of 5-HT. This potentiation is the result of a PKA-mediated sensitisation of the IP3-receptor/Ca<sup>2+-channel for IP3. Results of immunocytochemical analyses show that the PKA is spatially associated with the ER. These results show for the first time that in invertebrates as well as in vertebrates the second messenger cAMP sensitises the IP3-receptor/Ca<sup>2+-channel for IP3 by the action of a PKA.
KW  - Speichel
KW  - Speicheldrüse
KW  - Insekten
KW  - Calcium-Imaging
KW  - transepitheliales Potential
KW  - Signalkakaden
KW  - IP3
KW  - cAMP
KW  - PKA
KW  - IP3-Rezeptor
KW  - salivary gland
KW  - blowfly
KW  - signalling pathways
KW  - IP3
KW  - cyclic AMP
KW  - IP3-receptor
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-7714
ER  - 
TY  - THES
A1  - Jurrmann, Nadine
T1  - Die Hemmung der Bildung des Interleukin-1-Rezeptorkomplexes als redoxregulierter antiinflammatorischer Mechanismus
T1  - The inhibition of the Interleukin-1 receptor complex formation as a redox regulated antiinflammatory mechanism
N2  - Das proinflammatorische Zytokin Interleukin-1 (IL-1) spielt eine zentrale Rolle bei Entzündungen und Infektionen. Die zellulären Antworten von IL-1 werden über den IL-1-Rezeptor Typ I (IL-1RI) vermittelt. Adapterproteine und die IL-1RI-assoziierte Kinase IRAK werden nach Ligandenbindung an den Rezeptor rekrutiert. Nach ihrer Phosphorylierung dissoziiert die IRAK vom IL-1RI-Komplex und aktiviert weitere Kinasen, was letztendlich zur Aktivierung von NF-κB und zur Induktion der Transkription von Genen führt. Für eine adäquate Immunantwort ist ein intrazellulärer reduzierter Status von Proteinthiolen essentiell. Vorausgegangene Untersuchungen an der murinen Thymomzelllinie EL-4 zeigten, dass die IL-1-Signalkaskade durch thiolmodifizierende Substanzen wie Menadion (MD) oder Phenylarsinoxid (PAO) gehemmt wird. Eine IL-1-abhängige Aktivierung von IL-1RI-assoziierte Kinasen oder NF-κB fand nicht mehr statt. Ziele dieser Arbeit waren: (i) mögliche Proteine, die für den Angriff von thiolmodifizierenden Agenzien ein Ziel sein könnten, zu identifizieren und (ii) den Einfluss nahrungsrelevanter und redoxaktiver Substanzen auf frühe Ereignisse der IL-1-Signaltransduktion wie der Bildung des IL-1RI-Komplexes zu untersuchen. Als Zellmodell wurden EL-4-Zellen mit stabil überexprimierter IRAK (EL-4<sup>IRAK) verwendet. Um die Bildung des IL-1RI-Komplexes, anschließende Phosphorylierungsereignisse und somit Kinase-Aktivitäten nachzuweisen, wurden Co-Präzipitations-Experimente und in vitro Kinase Tests durchgeführt. Die Markierung von Proteinthiolen erfolgte mit dem thiolspezifischen Reagenz Iodoacetyl-[<sup>125I]-Iodotyrosin ([<sup>125I]-IAIT). Die Vorbehandlung von EL-4<sup>IRAK-Zellen mit MD oder PAO führte zu einer Hemmung der Rekrutierung der IRAK an den IL-1RI und der anschließenden Phosphorylierungen. Zur Identifikation weiterer IL-1RI-assoziierter Proteine wurden IL-1RI-Immunpräzipitate zweidimensional aufgetrennt, Colloidal-Coomassie gefärbte Proteinspots ausgeschnitten und anschließend massenspektrometrisch mittels ESI-Q-TOF analysiert. Bei der Analyse wurden Proteine des Cytoskeletts wie z. B. Actin identifiziert. In Analogie zu den synthetischen Substanzen MD und PAO wurden nahrungsrelevante und redoxaktive Substanzen wie Curcumin (Gelbwurz) und Sulforaphan (Broccoli) eingesetzt, um zu untersuchen, ob sie bereits früh die IL-1-Signaltransduktion beeinflussen. Bislang sind antiinflammatorische Effekte dieser beiden Nahrungsinhaltsstoffe nur auf der Ebene der Zytokin-vermittelten Aktivierung von NF-κB beschrieben. Sowohl Curcumin als auch Sulforaphan blockierten konzentrationsabhängig die Assoziation der IRAK an den IL-1RI in EL-4<sup>IRAK-Zellen, wobei beide Substanzen unterschiedlich wirkten. Curcumin beeinflusste die IRAK-Aktivierung durch direkte Modifikation von Thiolen der IRAK ohne die Bindung von IL-1 mit dem IL-1RI zu beeinträchtigen. Sulforaphan hingegen induzierte auf mRNA- und Proteinebene die Expression von Tollip, welches durch PCR bzw. Western Blot nachgewiesen wurde. Tollip, ein negativer Regulator in TLR/IL-1RI-Signalkaskaden, könnte somit nach Induktion die IRAK-Aktivierung unterdrücken. Die Sulforaphan-abhängige Induktion der Tollip-Expression erfolgte jedoch nicht über Nrf2 und "antioxidant response element" (ARE)-regulierte Transkription, obwohl Sulforaphan ein bekannter Nrf2-Aktivator ist. Diese Ergebnisse veranschaulichen, dass die IRAK ein redoxsensitives Protein ist und für die Bildung des IL-1RI-Komplexes reduzierte Proteinthiole eine Voraussetzung sind. Der Angriffspunkt für die antiinflammatorische Wirkung der beiden Nahrungsbestandteile Curcumin und Sulforaphan ist die Bildung des IL-1RI-Komplexes als ein frühes Ereignis in der IL-1-Signalkaskade. Die Hemmung dieses Prozesses würde die in der Literatur beobachteten Inhibitionen der abwärts liegenden Signale wie die Aktivierung von NF-κB und die Induktion proinflammatorischer Proteine erklären.
N2  - The pro-inflammatory cytokine Interleukin-1 (IL-1) generates cellular responses in infection and inflammation. Effects of IL-1 are mediated by the IL-1-receptor type I (IL-1RI). Following ligand binding the IL-1RI-associated kinase IRAK is recruited to the IL-1RI. After phosphorylation and dissociation of IRAK from the receptor different adapter proteins and kinases are activated finally leading to translocation of NF-κB into the nucleus and induction of gene expression. An intracellular reduced state of cysteine residues (thiols) of proteins is necessary for an appropriate IL-1 response. It was shown recently, that preincubation of murine thymoma EL-4 cells with the thiol modifying agents menadione (MD) or phenylarsine oxide (PAO) completely abolished e. g. the IL-1-induced activation of NF-κB.  The question to answer therefore was: (i) what are the proteins requiring free thiols and (ii) is the complex formation also influenced by dietary compounds exhibiting anti-inflammatory effects and being able to react with thiols in proteins. As a model the EL-4-cell line stably overexpressing IRAK (EL-4<sup>IRAK) was used. Recruitment of IRAK was followed by its co-precipitation with the IL-1RI by means of Western blotting with an IRAK antibody. IRAK phosphorylation was demonstrated by in vitro kinase assays with the co-precipitates. Free thiols of IL-1RI complex-associated proteins were made visible by Iodo-acetyl-[<sup>125I]-Iodotyrosine ([<sup>125I]-IAIT).  By combining these methods with pretreatment of cells with MD or PAO, inhibition of recruitment of IRAK was identified as the first step in the IL-1 signaling cascade sensitive to thiol modification. To detect further redox-sensitive IL-1RI-associated proteins, receptor immunoprecipitates were separated by two dimensional gel electrophoresis and protein spots were analyzed by ESI-Q-TOF. In this way proteins of the cytoskeleton, including actin, were identified.  In addition to the synthetical compounds MD or PAO the effects of dietary agents were investigated on the IL-1 signaling pathway. Curcumin as a component of turmeric and sulforaphane from broccoli have been described to be redox-active and anti-inflammatory by an impairment of late events in IL-1- and Toll-like receptor (TLR) signaling. Increasing doses of curcumin and sulforaphane blocked the recruitment of IRAK to the IL-1RI in EL-4<sup>IRAK cells, but these dietary compounds acted by different mechanisms. Curcumin exerted this inhibition not due to an interference with ligand binding to the receptor, it rather modified protein thiols of IRAK. In contrast, sulforaphane had an indirect effect by an induction of Tollip expression, as shown by mRNA (PCR) and protein (Western blot) analysis. Tollip is known as a negative regulator of IL-1- and TLR-mediated signaling and enhanced expression of Tollip mediated by sulforaphane might therefore inhibit IRAK activation. The induction of Tollip expression was not initiated by Nrf2 and antioxidant response element (ARE)-regulated transcription, which is known to be activated by sulforaphane.  These results demonstrate that IRAK is a redox-sensitive protein and the complex formation requires a reduced state of proteins involved. Curcumin and sulforaphane act anti-inflammatory by blocking IL-1 signaling pathway at the most early step, explaining its inhibitory effect on further downstream events in pro-inflammatory pathways.
KW  - Interleukin-1
KW  - IRAK
KW  - Redoxregulation
KW  - Thiolmodifikation
KW  - Curcumin
KW  - Sulforaphan
KW  - interleukin-1
KW  - IRAK
KW  - redox regulation
KW  - thiol modification
KW  - curcumin
KW  - sulforaphan
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-7584
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gromelski, Sandra
T1  - Wechselwirkung zwischen Lipiden und DNA : auf dem Weg zum künstlichen Virus
T1  - Interaction between lipids and DNA : on the way to the artificial virus
N2  - Weltweit versuchen Wissenschaftler, künstliche Viren für den Gentransfer zu konstruieren, die nicht reproduktionsfähig sind. Diese sollen die Vorteile der natürlichen Viren besitzen (effizienter Transport von genetischem Material), jedoch keine Antigene auf ihrer Oberfläche tragen, die Immunreaktionen auslösen.  Ziel dieses Projektes ist es, einen künstlichen Viruspartikel herzustellen, dessen Basis eine Polyelektrolytenhohlkugel bildet, die mit einer Lipiddoppelschicht bedeckt ist. Um intakte Doppelschichten zu erzeugen, muss die Wechselwirkung zwischen Lipid und Polyelektrolyt (z.B. DNA) verstanden und optimiert werden. Dazu ist es notwendig, die strukturelle Grundlage der Interaktion aufzuklären. Positiv geladene Lipide gehen zwar starke Wechselwirkungen mit der negativ geladenen DNA ein, sie wirken jedoch toxisch auf biologische Zellen. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die durch zweiwertige Kationen vermittelte Kopplung von genomischer oder Plasmid-DNA an zwitterionische oder negativ geladene Phospholipide an zwei Modellsystemen untersucht.  1. Modellsystem: Lipidmonoschicht an der Wasser/Luft-Grenzfläche  Methoden: Filmwaagentechnik in Kombination mit IR-Spektroskopie (IRRAS), Röntgenreflexion (XR), Röntgendiffraktion (GIXD), Brewsterwinkel-Mikroskopie (BAM), Röntgenfluoreszenz (XRF) und Oberflächenpotentialmessungen  Resultate: A) Die Anwesenheit der zweiwertigen Kationen Ba2+, Mg2+, Ca2+ oder Mn2+ in der Subphase hat keinen nachweisbaren Einfluss auf die Struktur der zwitterionischen DMPE- (1,2-Dimyristoyl-phosphatidyl-ethanolamin) Monoschicht.  B) In der Subphase gelöste DNA adsorbiert nur in Gegenwart dieser Kationen an der DMPE-Monoschicht.  C) Sowohl die Adsorption genomischer Kalbsthymus-DNA als auch der Plasmid-DNA pGL3 bewirkt eine Reduktion des Neigungswinkels der Alkylketten, die auf einen veränderten Platzbedarf der Kopfgruppe zurückzuführen ist. Durch die Umorientierung der Kopfgruppe wird die elektrostatische Wechselwirkung zwischen den positiv geladenen Stickstoffatomen der Lipidkopfgruppen und den negativ geladenen DNA-Phosphaten erhöht. D) Die adsorbierte DNA weist eine geordnete Struktur auf, wenn sie durch Barium-, Magnesium-, Calcium- oder Manganionen komplexiert ist. Der Abstand zwischen parallelen DNA-Strängen hängt dabei von der Größe der DNA-Fragmente sowie von der Art des Kations ab. Die größten Abstände ergeben sich mit Bariumionen, gefolgt von Magnesium- und Calciumionen. Die kleinsten DNA-Abstände werden durch Komplexierung mit Manganionen erhalten. Diese Ionenreihenfolge stellt sich sowohl für genomische DNA als auch für Plasmid-DNA ein.  E) Die DNA-Abstände werden durch die Kompression des Lipidfilms nicht beeinflusst. Zwischen der Lipidmonoschicht und der adsorbierten DNA besteht demnach nur eine schwache Wechselwirkung. Offensichtlich befindet sich die durch zweiwertige Kationen komplexierte DNA als weitgehend eigenständige Schicht unter dem Lipidfilm.   2. Modellsystem: Lipiddoppelschicht an der fest/flüssig-Grenzfläche Methoden: Neutronenreflexion (NR) und Quarzmikrowaage (QCM-D) Resultate: A) Das zwitterionische Phospholipid DMPC (1,2-Dimyristoyl-phosphatidylcholin) bildet keine Lipiddoppelschicht auf planaren Polyelektrolytmultischichten aus, deren letzte Lage das positiv geladene PAH (Polyallylamin) ist.  B) Hingegen bildet DMPC auf dem negativ geladenen PSS (Polystyrolsulfonat) eine Doppelschicht aus, die jedoch Defekte aufweist.  C) Eine Adsorption von genomischer Kalbsthymus-DNA auf dieser Lipidschicht findet nur in Gegenwart von Calciumionen statt. Andere zweiwertige Kationen wurden nicht untersucht. D) Das negativ geladene Phospholipid DLPA (1,2-Dilauryl-phosphatidsäure) bildet auf dem positiv geladenen PAH eine Lipiddoppelschicht aus, die Defekte aufweist.  E) DNA adsorbiert ebenfalls erst in Anwesenheit von Calciumionen in der Lösung an die DLPA-Schicht. F) Durch die Zugabe von EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) werden die Calciumionen dem DLPA/DNA-Komplex entzogen, wodurch dieser dissoziiert. Demnach ist die calciuminduzierte Bildung dieser Komplexe reversibel.
N2  - All over the world scientists are trying to engineer artificial viruses, which do not replicate, for gene delivery. These artificial viruses should have the advantages of natural viruses such as efficient transport of genetic material, but they should not carry antigens, which cause immune reactions, on their top portion. The aim of this project is to develop an artificial virus particle that is based on a polyelectrolyte hollow capsule which is covered by a lipid bilayer. To create intact bilayers, it is crucial to understand and optimize the interaction between lipids and polyelectrolytes (e. g. DNA). Therefore the structural basis of that interaction must be elucidated. Positively charged lipids interact strongly with the negatively charged DNA but they cause toxic reactions in biological cells. Hence the present work used two model systems to study the coupling of genomic or plasmid DNA to zwitterionic or negatively charged phospholipids induced by divalent cations.  1. Model system: Lipid monolayer at the air/water-interface  Methods:  Langmuir filmbalance in combination with IR-spectroscopy (IRRAS), X-ray reflectometry (XR), X-ray diffraction (GIXD), Brewster angle microscopy (BAM), X-ray fluorescence (XRF), and surface potential measurements Results: A) The presence of the divalent cations Ba2+, Mg2+, Ca2+ or Mn2+ in the subphase has no traceable influence on the structure of a zwitterionic DMPE (1,2-dimyristoyl-phosphatidyl-ethanolamine) monolayer. B) DNA which is dissolved in the subphase adsorbs to the DMPE-monolayer only if divalent cations are present. C) The adsorption of genomic calf thymus DNA as well as of the plasmid DNA pGL3 causes a reduction of the tilt angle of the lipid alkyl chains. The tilt reduction can be ascribed to a change in the space required by the lipid head group. This change in head group orientation increases the electrostatic interaction between the positively charged nitrogen atoms in the lipid head and the negatively charged DNA phosphates. D) The adsorbed DNA exhibits an ordered structure if it is complexed by barium, magnesium, calcium or manganese ions. The spacing between parallel DNA strands depends on the size of the DNA fragments as well as on the kind of cation. The largest DNA-spacings are observed with barium ions, followed by magnesium and calcium ions. DNA-complexation with manganese ions causes the smallest spacings. This order of ions is observed for both genomic and plasmid DNA. E) Compression of the monolayer does not influence the DNA spacings. Thus the interaction between the lipid monolayer and adsorbed DNA is only weak. The DNA must exist as a more or less separate layer under the lipid film.  2. Model system: Lipid bilayer at the solid/fluid-interface Methods:  Neutron reflectometry (NR), and Quartz crystal microbalance (QCM-D) Results: A) The zwitterionic phospholipid DMPC (1,2-dimyristoyl phosphatidylcholine) does not form lipid bilayers on top of planar polyelectrolyte multilayers covered with the positively charged PAH (polyallylamine). B) In contrast, DMPC forms a lipid bilayer with defects on top of the negatively charged PSS (polystyrolsulfonate) terminated polyelectrolyte cushion. C) Genomic calf thymus DNA adsorbs only to the DMPC layer in presence of calcium ions. Different ions were not examined. D) The negatively charged phospholipid DLPA (1,2-dilauryl-phosphatidic acid) also forms a lipid bilayer with defects on top of the PAH-terminated cushion. E) The DNA adsorbs also to the DLPA layer only in the presence of calcium ions in the solution. F) By addition of EDTA (ethylenediaminetretraacetic acid) the calcium cations are removed from the DLPA/DNA-complex and the complex dissociates. Thus the calcium induced formation of that complex is reversible.
KW  - Lipide / Doppelschicht
KW  - DNA
KW  - Monoschicht
KW  - Gentransfer
KW  - Phospholipide
KW  - DNA-Lipid-Wechselwirkung
KW  - künstlicher Virus
KW  - zwitterionische Phospholipide
KW  - zweiwertige Kationen
KW  - zwitterionic phospholipids
KW  - DNA-lipid-interaction
KW  - divalent cations
KW  - artificial virus
KW  - lipid monolayer
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-7629
ER  - 
TY  - THES
A1  - Unterstab, Gunhild
T1  - Charakterisierung der viralen Genprodukte p10 und P des Borna Disease Virus
T1  - Characterization of the viral gene products p10 and P of the Borna disease virus
N2  - Das Borna Disease Virus (BDV, Bornavirus) besitzt ein einzelsträngiges RNA-Genom negativer Polarität und ist innerhalb der Ordnung Mononegavirales der Prototyp einer eigenen Virusfamilie, die der Bornaviridae. Eine außergewöhnliche Eigenschaft des Virus ist seine nukleäre Transkription und Replikation, eine weitere besteht in seiner Fähigkeit, als neurotropes Virus sowohl in vivo als auch in vitro persistente Infektionen zu etablieren. Die zugrunde liegenden Mechanismen sowohl der Replikation als auch der Persistenz sind derzeit noch unzureichend verstanden, auch deshalb, weil das Virus noch relativ „jung“ ist: Erste komplette Sequenzen des RNA-Genoms wurden 1994 publiziert und erst vor einigen Monaten gelang die Generierung rekombinanter Viren auf der Basis klonierter cDNA. Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen das p10 Protein und das Phosphoprotein (P), die von der gemeinsamen Transkriptionseinheit II in überlappenden Leserahmen kodiert werden.  Als im Kern der Wirtszelle replizierendes Virus ist das Bornavirus auf zelluläre Importmechanismen angewiesen, um den Kernimport aller an der Replikation beteiligten viralen Proteine zu gewährleisten. Das p10 Protein ist ein negativer Regulator der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase (L). In vitro Importexperimente zeigten, dass p10 über den klassischen Importin alpha/beta abhängigen Kernimportweg in den Nukleus transportiert wird. Dies war unerwartet, da p10 kein vorhersagbares klassisches Kernlokalisierungssignal (NLS) besitzt und weist darauf hin, dass der zelluläre Importapparat offensichtlich flexibler ist als allgemein angenommen. Die ersten 20 N-terminalen AS vermitteln sowohl Kernimport als auch die Bindung an den Importrezeptor Importin alpha. Durch Di-Alanin-Austauschmutagenese wurden die für diesen Transportprozess essentiellen AS identifiziert und die Bedeutung hydrophober und polarer AS-Reste demonstriert.  Die Fähigkeit des Bornavirus, persistente Infektionen zu etablieren, wirft die Frage auf, wie das Virus die zellulären antiviralen Abwehrmechanismen, insbesondere das Typ I Interferon (IFN)-System, unterwandert. Das virale P Protein wurde in dieser Arbeit als potenter Antagonist der IFN-Induktion charakterisiert. Es verhindert die Phosphorylierung des zentralen Transkriptionsfaktors IRF3 durch die zelluläre Kinase TBK1 und somit dessen Aktivierung. Der Befund, dass P mit TBK1 Komplexe bildet und zudem auch als Substrat für die zelluläre Kinase fungiert, erlaubt es, erstmalig einen Mechanismus zu postulieren, in dem ein virales Protein (BDV-P) als putatives TBK1-Pseudosubstrat die IRF3-Aktivierung kompetitiv hemmt.
N2  - The Borna Disease Virus (BDV) harbors a single stranded RNA genome of negative polarity. Within the order of Mononegavirales it is the prototype of a new virus family named Bornaviridae. Unique features of this neurotrope virus are its nuclear transcription and replication as well as its ability to establish persistent infections both in vivo and in vitro. The underlying mechanisms of BDV replication and persistence are currently not well understood amongst others due to the fact that BDV is quite a young virus: First complete sequences of the RNA genome have been published in 1994. Only a few months ago the generation of a recombinant Bornavirus from cloned cDNA has been accomplished.  The work presented here focused on the viral p10 protein and the phosphoprotein P that are both encoded by two overlapping reading frames of the transcription unit II.  Nuclear replication of the Bornavirus relies on cellular import mechanisms to allow for nuclear import of viral proteins involved in viral replication. The p10 protein has been described as a negative regulator of the viral RNA dependent RNA polymerase (L). In vitro import experiments revealed that p10 translocates into the nucleus via the classical importin alpha/beta; dependent pathway. This was unexpected since p10 does not contain a predictable classical nuclear localization signal (NLS) suggesting that the cellular import machinery is more flexible than generally believed. The first 20 amino acids mediate nuclear import and binding to the import receptor importin alpha. Analysis of di-alanine-exchange mutants identified essential amino acids and furthermore revealed the impact of hydrophobic and polar side chains in receptor binding and nuclear import.  The ability of the Bornavirus to establish persistent infections rises the question of how the virus circumvents cellular antiviral defense mechanisms, in particular the type I interferon system. This work characterizes the viral P protein as a potent antagonist of IFN beta induction. It prevents the activation of the central transcription factor IRF3 by interfering with the cellular kinase TBK1. The finding that P forms complexes with TBK1 and moreover serves as a kinase substrate allows to postulate a mechanism for the first time, in which a viral protein (BDV-P) acts as a putative TBK1 pseudo-substrate and thereby competitively inhibits IRF3 activation.
KW  - Interferon <beta->
KW  - Borna Disease Virus
KW  - Kernlokalisierungssignal
KW  - Importin
KW  - IRF3
KW  - TBK1
KW  - Borna disease virus
KW  - nuclear localization signal
KW  - importin
KW  - IRF3
KW  - TBK1
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-6905
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TY  - THES
A1  - Schlenstedt, Jana
T1  - Molekulare und pharmakologische Charakterisierung von Serotonin-Rezeptoren der Honigbiene Apis mellifera
T1  - Molecular and pharmacological characterization of serotonin receptors of the honeybee Apis mellifera
N2  - Die Honigbiene Apis mellifera gilt seit langem als Modell-Organismus zur Untersuchung von Lern- und Gedächtnisvorgängen sowie zum Studium des Sozialverhaltens und der Arbeitsteilung. Bei der Steuerung und Regulation dieser Verhaltensweisen spielt das Indolalkylamin Serotonin eine wesentliche Rolle. Serotonin entfaltet seine Wirkung durch die Bindung an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs). In der vorliegenden Arbeit wird der erste Serotonin-Rezeptor aus der Honigbiene molekular charakterisiert.  Durch die Anwendung zwei verschiedener Klonierungsstrategien konnten drei cDNA-Sequenzen isoliert werden, die für potentielle Serotonin-Rezeptoren kodieren. Die Sequenzen weisen die größte Ähnlichkeit zu dem 5-HT7- und 5-HT2-Rezeptor von Drosophila melanogaster bzw. dem 5-HT1-Rezeptor von Panulirus interruptus auf. Die isolierten Serotonin-Rezeptoren der Honigbiene wurden dementsprechend Am(Apis mellifera)5-HT1, Am5-HT2 und Am5-HT7 benannt.  Das Hydropathieprofil des Am5-HT1-, Am5-HT2- und Am5-HT7-Rezeptors deutet auf das Vorhandensein des charakteristischen heptahelikalen Aufbaus G-Protein-gekoppelter Rezeptoren hin. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigen typische Merkmale biogener Amin-Rezeptoren. Aminosäuren, die eine Bedeutung bei der Bildung der Liganden-Bindungstasche, der Rezeptor-Aktivierung und der Kopplung eines G-Proteins an den Rezeptor haben, sind in allen drei Rezeptoren konserviert. Interessanterweise ist jedoch das in den meisten biogenen Amin-Rezeptoren vorhandene DRY-Motiv in dem Am5-HT2- und Am5-HT7-Rezeptor nicht konserviert. Das Vorhandensein einer PDZ-Domäne in dem Am5-HT1- und Am5-HT7-Rezeptor lässt vermuten, dass diese Rezeptoren als Adapterproteine fungieren, die Signalmoleküle zu einem Signaltransduktionskomplex vereinigen.  RT-PCR-Experimente zeigen die Expression der Rezeptoren in verschiedenen Geweben der Honigbiene. Auffallend ist die hohe Expression im Zentralgehirn. Des Weiteren konnte die Expression der Serotonin-Rezeptoren in den optischen Loben, Antennalloben sowie in der Peripherie, d.h. in der Flugmuskulatur und den Malpighischen Gefäßen nachgewiesen werden. Durch in situ Hybridisierungen wurde die Expression in Gefrierschnitten von Gehirnen adulter Sammlerinnen im Detail untersucht. Transkripte der Rezeptoren sind in den Somata von intrinsischen Pilzkörperzellen, Neuronen der optischen Loben und Neuronen der Antennalloben vorhanden.  In einem heterologen Expressionssystem wurde der intrazelluläre Signalweg des Am5-HT7-Rezeptors untersucht. Die Aktivierung des stabil exprimierten Rezeptors durch Serotonin führt zur Bildung von cAMP. Der 5-HT7-Rezeptor spezifische Agonist 5-CT zeigt eine mit Serotonin vergleichbare Fähigkeit, die intrazelluläre cAMP-Konzentration zu erhöhen. Am5-HT7 gehört daher funktionell zu der Gruppe der 5-HT7-Rezeptoren. Der EC50-Wert von 1,06~nM (5-HT), ist im Vergleich zu anderen 5-HT7-Rezeptoren äußert niedrig. Des Weiteren wurde gezeigt, dass das basale cAMP-Niveau in den transfizierten Zellen im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen deutlich erhöht ist. Das heißt, dass der Rezeptor auch in der Abwesenheit eines Liganden aktiv ist. Diese konstitutive Aktivität ist auch von anderen biogenen Amin-Rezeptoren bekannt. Methiothepin wurde als wirksamer inverser Agonist des Am5-HT7-Rezeptors identifiziert, da es in der Lage ist, der konstitutiven Aktivität entgegenzuwirken. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten darauf hin, dass die Serotonin-Rezeptoren in verschiedenen Regionen des ZNS der Honigbiene an der Informationsverarbeitung beteiligt sind. Es kann eine Beeinflussung von Lern- und Gedächtnisprozessen sowie des olfaktorischen und visuellen Systems durch diese Rezeptoren vermutet werden. Mit der Klonierung und funktionellen Charakterisierung des ersten Serotonin-Rezeptors der Honigbiene ist eine Grundlage für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der serotonergen Signaltransduktion geschaffen worden.
N2  - The honeybee Apis mellifera is a model organism for studying insect division of labor, learning and memory. An important substance that has been implicated in the control and regulation of these phenomena is the indolalkylamine serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) Pharmacological and functional studies indicate, that serotonin activates various receptor subtypes which predominantly belong to the family of G protein-coupled receptors (GPCRs). Using a homology based screening approach on a brain-specific cDNA library of the honeybee and a PCR-based strategy we have isolated cDNAs encoding three putative serotonin receptors. The deduced amino acid sequences of these putative honeybee serotonin receptors show the highest homology to a 5-HT7 and a 5-HT2 receptor from Drosophila melanogaster and a 5-HT1 receptor from Panulirus interruptus, respectively. We have studied the distribution of the respective 5-HT receptor mRNAs in several tissues of the honeybee by RT-PCR. The analysis revealed a high amount in the central brain. By using in situ-hybridization we detected receptor encoding mRNA in cryostat sections of honeybee brain. We could prove receptor transcripts in neurons of the optic lobes, intrinsic mushroom body neurons, and deutocerebral neurons.  In a HEK 293 cell line, stably expressing the 5-HT7 receptor protein, we investigated the intracellular signalling pathway. When activated by serotonin, the heterologous expressed 5-HT7 receptor induces an increase in intracellular cAMP levels ([cAMP]i). The stimulation with other biogenic amines (octopamine, tyramine, and dopamine) did not induce a significant change in [cAMP]i Furthermore, Am5-HT7 causes a significant increase in the non-agonist stimulated cAMP levels relative to those of non-transfected cells. Therefore, the Am5-HT7 receptor displays agonist-independent (constitutive) activity which has also been demonstrated for many other GPCRs.  A specific affinity-purified anti-Am5-HT7 antibody detected a protein band of the expected size of ~66 kDa in homogenates of honeybee brains and HEK 293 cells expressing the Am5-HT7 receptor.
KW  - Biogene Amine
KW  - Serotonin
KW  - Serotoninrezeptor
KW  - Biene
KW  - Pharmakologie
KW  - Lernen und Gedächtnis
KW  - pharmakologisches Profil
KW  - Gewebsverteilung
KW  - serotonin
KW  - biogenic amine
KW  - receptor
KW  - honeybee
KW  - pharmacology
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-7203
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TY  - THES
A1  - Kühnel, Dana
T1  - Histologische und molekulargenetische Analyse von Darmgeweben aus mit dem humanrelevanten Kanzerogen 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP) behandelten F344-Ratten
T1  - Histological and moleculargenetical analysis of colon tissue from rats treated with the humanrelevant cancinogen 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP)
N2  - Die Entwicklung von Dickdarmkrebs wird durch eine Reihe von Lebens- und Essgewohnheiten sowie Umweltfaktoren begünstigt. Den letzteren beiden sind Substanzen zuzurechnen, die bei der Zubereitung der Nahrung entstehen und mit ihr aufgenommen werden. Zu diesen Verbindungen gehört das 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridin (PhIP) aus der Substanzklasse der heterozyklischen aromatischen Amine. Es entsteht bei der Erhitzung zahlreicher proteinhaltiger Nahrungsmittel und die Zielorgane in Nagerstudien stimmen mit der Häufung von Krebsinzidenzen in westlichen Industrienationen überein. Dieser Zusammenhang konnte jedoch bis heute nicht endgültig bewiesen werden. Fütterungsversuche mit Ratten wurden mit Konzentrationen der Substanz durchgeführt, die weit über der menschlichen Exposition liegen. Durch das Verfüttern einer humanrelevanten Dosis PhIP sollte geklärt werden, ob auch geringe Konzentrationen dickdarmkrebstypische Mutationen, präneoplastische Läsionen oder Tumore induzierten. Die mit humanrelevanten Dosen gefütterten Tiere wiesen weniger Läsionen als die Hoch-Dosis-PhIP-Gruppe auf, in der allerdings keinerlei maligne Tumoren des Dickdarms auftraten. Hinweise auf dickdarmkrebstypische Mutationen fanden sich ebenfalls in beiden Gruppen, wobei hier keine Dosisabhängigkeit beobachtet werden konnte. Die Sequenzierung ergab ein deutlich von Literaturdaten abweichendes Spektrum. In Bezug auf das verwendete Tiermodell wurden erhebliche Abweichungen in der Empfindlichkeit der Tiere gegenüber der Substanz im Vergleich zu ähnlichen Studien festgestellt. Beide Fütterungsgruppen zeigten deutlich weniger Läsionen; als mögliche Gründe wurden Unterschiede in der Futterzusammensetzung und –zubereitung sowie in der Tierhaltung und –herkunft ausgemacht. Es konnte erstmalig ein Zusammenhang zwischen PhIP in niedrigen Dosen in der Nahrung und der Induktion von Entzündungen gezeigt werden. Diese waren sowohl makroskopisch als auch histologisch sichtbar, der genaue Mechanismus ihrer Entstehung ist jedoch unbekannt. Die zusammenfassende Betrachtung aller Ergebnisse lässt vermuten, dass PhIP allein über lange Zeiträume aber in geringen Dosen verabreicht nicht für die hohe Zahl an Krebserkrankungen in westlichen Industrienationen ursächlich ist.
N2  - The development of colon cancer is associated with several nutritional, life style, and environmental factors. Among the environmental factors probably involved are substances formed during food processing and taken up with food. One of these substances is the heterocyclic aromatic amine (HAA) 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP), which is formed during the heating of proteinaceous food such as meat and fish. In rodent studies the target organs for HAA-derived cancer development are identical with human organs showing high tumor incidences in western countries. Whether there is an association between exposure to PhIP and high tumor incidences in humans is still uncertain. The amount of PhIP administred to rodents in several studies was far above the levels of human exposure towards HAA. Thus, the aim of this study was to elucidate whether low concentrations of the substance are able to induce finger-print colon cancer gene mutations, preneoplastic lesions or tumors in rats. Animals fed with high amounts of PhIP developed fewer lesions than animals fed with a human-relevant concentration of PhIP. However none of the groups developed tumors of the colon. Both groups showed finger-print mutations for colon cancer, but not in a dose-dependent manner. Sequencing showed that the mutations were different from the known mutation spectum of PhIP. The susceptibility of the F344 rats to PhIP used in this study differed from that in previous feeding studies, with both groups showing much less lesions of the colon. Differences in composition and processing of the animal diets as well as animal maintenance and –origin may explain this discrepancy. For the first time an association between low doses of PhIP in the diet and induction of inflammation was shown. Signs of inflammation were observed macroscopically as well as in histological slices, but the mechanism of its induction remains to be clarified. Taken together the results suggest that a chronical exposure to low doses of PhIP alone is not sufficient to explain the high incidences of colon cancer in western countries.
KW  - Dickdarmkrebs
KW  - Kanzerogenese
KW  - APC
KW  - b-Catenin
KW  - ki-ras
KW  - SSCP
KW  - colon cancer
KW  - carcinogenesis
KW  - APC
KW  - b-Catenin
KW  - ki-ras
KW  - SSCP
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-6956
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kanwischer, Marion
T1  - Phytol aus dem Chlorophyllabbau ist limitierend für die Tocopherol (Vitamin E)-Synthese
T1  - Phytol from chlorophyll degradation is limiting for tocopherol (vitamin E)-synthesis
N2  - Phytol aus dem Chlorophyllabbau ist limitierend für die Tocopherol (Vitamin E)-Synthese Als Bestandteil von Chlorophyll ist Phytol das am häufigsten vorkommende Isoprenoid in der Biosphäre. Große Mengen an Chlorophyll werden jährlich degradiert und dabei wird Phytol freigesetzt, über dessen Verbleib jedoch wenig bekannt ist. Es sollte der Nachweis erbracht werden, dass im Zuge des Chlorophyllabbaus hydrolysiertes Phytol Eingang in die Synthese anderer Phytylderivate findet. Während der Gehalt an Tocopherol, Chlorophyll und Fettsäurephytylester entwicklungs- bzw. seneszenzabhängig ist, bleibt der Gehalt an Phyllochinon etwa gleich. Auch in Samen ist der Gehalt von Tocopherol, Chlorophyll und Fettsäurephytylester entwicklungsabhängig. Es wurde gefolgert, dass nur die Synthesen von Tocopherol und Fettsäurephytylester während des Chlorophyllabbaus stimuliert werden. Daher sollten Mutanten analysiert werden, welche im Chlorophyllabbau inhibiert sind. Da Chlorophyllase den ersten Schritt des Chlorophyllabbaus katalysiert, wurden zwei unabhängige T-DNA-Insertionsmutanten für Chlorophyllase1 (CHL1) und eine T-DNA-Insertionsmutante für Chlorophyllase2 (CHL2) identifiziert und eine chl1-1chl2-Doppelmutante erzeugt. Die Analyse der Chlorophyllidanteile ergab eine im Vergleich zum Wildtyp starke Reduktion in den chl1-Mutanten, während der Chlorophyllidanteil von chl2 ähnlich hoch dem Wildtyp ist. Der Chlorophyllidanteil sich entwickelnder chl1-1chl2-Pflanzen nahm in der Seneszenz zu. Die Chlorophyllasemutanten zeigten kein verändertes Seneszenzverhalten im Vergleich zu den Wildtypen. Ferner konnte in den chl1-Linien nur geringfügig weniger Tocopherol und Fettsäurephytylester als in den Wildtypen nachgewiesen werden. Auch der Tocopherolgehalt der Samen war in den Chlorophyllasemutanten unverändert zu den Wildtypen. Aufgrund dessen wurde gefolgert, dass neben den Chorophyllasen CHL1 und CHL2 weitere Chlorophyllhydrolasen in Samen und Blättern von Arabidopsis existieren. Daher wurde auf andere Mutanten zurückgegriffen, in denen der Chlorophyllabbau stark inhibiert ist und die Seneszenz nach Dunkelinkubation im Vergleich zum Wildtyp deutlich verzögert ist. Eine deutliche Korrelation zwischen vermindertem Chlorophyllabbau und Gehalt an Tocopherol und Fettsäurephytylester konnte in den staygreen-Mutanten pao1 und zwei unabhängigen SGR (staygreen)-RNAi-Linien nachgewiesen werden. Damit konnte eindeutig gezeigt werden, dass die Synthese von Tocopherol und der Fettsäurephytylester durch die Chlorophyllhydrolyse induziert wird. Es wurde gefolgert, dass vor allem unter Seneszenz- bzw. Stressbedingungen dieser alternative Syntheseweg von Phytol eine Rolle spielt. Dennoch kommt der Phytylsynthese durch die de novo-Isoprenoidsynthese auch eine Bedeutung zu. Nach Behandlung von stickstoffmangelgestressten Wildtyppflanzen mit dem Inhibitor Fosmidomycin, welcher die plastidäre de novo-Isoprenoidsynthese hemmt, war der Tocopherolgehalt gegenüber stickstoffmangelgestressten Kontrollpflanzen stark reduziert. Ferner konnte eine T-DNA-Insertionsmutante der Geranylgeranylreduktase (GGR) identifiziert werden. Diese Mutante kann nur auf Nährmedium überleben, hat nur wenige grüne Blätter und bildet keine Samen. Es konnte kein Phyllochinon, Chlorophyll und keine Fettsäurephytylester, jedoch geringe Mengen Tocopherol nachgewiesen werden. Der Resttocopherolgehalt wird auf die Nebenaktivität einer anderen Reduktase zurückgeführt. Weiterhin wurde nur das Geranylgeranylderivat des Chlorophylls identifiziert. Diese Ergebnisse erlauben den Schluss, dass die phytylgruppenübertragenen Enzyme der Tocopherol-, Phyllochinon- und Fettsäurephytylestersynthese eine hohe Substratspezifität für die Phytylgruppe aufweisen. Nach Fütterung von Phytol konnte in ggr Tocopherol und Chlorophyll bestimmt werden. Aufgrund dessen kann gefolgert werden, dass Chlorophyllsynthetase aus Arabidopsis sowohl Geranylgeranyl-, als auch Phytylpyrophosphat als Substrat nutzen kann und damit ein breiteres Substratspektrum aufweist.
N2  - Phytol from chlorophyll degradation is limiting for tocopherol (vitamin E)-synthesis As a part of the chlorophyll molecule phytol belongs to the most abundant isoprenoid of the biosphere. Huge amounts of chlorophyll are degraded annually. During this process phytol is released, but only little is known about the fate of phytol. The goal of the project was to provide evidence that during chlorophyll degradation released phytol enters the pathway of the synthesis of further phytyl derivatives. While the content of tocopherol, chlorophyll and fatty acid phytyl esters are growth and stress related the content of phylloquinone does not change during development or under stress conditions. Also in seeds the content of these phytyl derivates are dependent on development. Hence only tocopherol and fatty acid phytyl ester synthesis are induced during chlorophyll degradation. Therefore mutants were analysed that are inhibited in chlorophyll degradation. Chorophyllase catalyses the first step during chlorophyll degradation. Two independent T-DNA insertion mutants of Chlorophyllase1 (CHL1) and one for Chlorophyllase2 (CHL2) were identified. Furthermore chl1-1 and chl2 were crossed to produce the chl1-1chl2 double mutant. The mutation resulted in a strong reduction of the chlorophyllide fraction in chl1 mutants while the chlorophyllide fraction of chl2 was similar to wild type. The chlorophyllide fraction in developing chl1-1chl2 plants increased during senescence. For all chlorophyllase mutants no retardation of senescence was observed. Compared to wild type only marginal reductions in tocopherol and fatty acid phytyl ester contents could be observed for the chl1 mutants. The seed tocopherol content of the chlorophyllase mutants was similar to wild type. Therefore, it was concluded that in leaves and seeds of Arabidopsis besides CHL1 and CHL2 further chlorophyll hydrolases exist that induce chlorophyll degradation. Thus, staygreen mutants exhibiting strongly inhibited chlorophyll degradation were analysed. Compared to wild type the staygreen mutants pao1 and two independent SGR (staygreen)-RNAi-lines show a strong retardation of senescence under dark incubation. A clear correlation between reduced chlorophyll degradation and tocopherol and fatty acid phytyl ester content could be demonstrated. With this it was possible to verify that tocopherol and fatty acid phytyl ester synthesis are induced by chlorophyll hydrolysis. This alternative pathway seems to play an important role in particular under stress and senescence conditions. Nevertheless, after application of Fosmidomycin, an inhibitor of the plastidic de novo isoprenoid synthesis pathway, to nitrogen starved wild type plants the tocopherol content was strongly reduced compared to nitrogen starved control plants. Therefore, also the plastidic de novo isoprenoid synthesis plays a significant role for tocopherol synthesis. Moreover, a T-DNA insertion mutant for Geranylgeranyl reductase (ggr) was identified and isolated. This mutant can survive only on nutrition medium, contains only a few green leaves and produces no seeds. There was no phylloquinone, chlorophyll and fatty acid phytyl ester detectable, but minor amounts of tocopherol. The residual amounts of tocopherol were attributed to side activities of another reductase. Obviously, the phytyl transferring enzymes of tocopherol, phylloquinone and fatty acid phytyl ester synthesis exhibit a strong substrate specificity of the phytyl group. After feeding phytol to ggr tocopherol and chlorophyll were detectable in this mutant. Therefore, it was concluded that chlorophyll synthetase from Arabidopsis can use geranylgeranyl pyrophosphate as well as phytyl pyrophosphate as substrates.
KW  - Phytol
KW  - Chlorophyll
KW  - Tocopherol
KW  - Vitamin E
KW  - phytol
KW  - chlorophyll
KW  - tocopherol
KW  - vitamin E
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-15957
ER  - 
TY  - THES
A1  - Dreher, Nicolas Sébastien
T1  - Entwicklung des pelagischen Nahrungsnetzes in einem neu entstandenen Tagebausee
T1  - Development of the pelagic community in a newly flooded mining lake
N2  - Im Rahmen der Untersuchung zur Entwicklung der pelagischen Gemeinschaft des ehemals sauren Tagebauseenkomplexes Goitsche (pH~3) während dessen Flutung und Neutralisierung wurden Wechselwirkungen zwischen der Zusammensetzung von Organismengemeinschaften und der Variabilität des abiotischen Umfeldes untersucht.Im Mittelpunkt standen zwei von ihrer Kausalität her unterschiedliche Aspekte: • Der erste Aspekt betraf die Reifung von Ökosystemen: War der Reifungsprozess von pelagischen Gemeinschaften anhand der von Odum (1969) formulierten Kriterien zur Energetik der Gemeinschaft, zu den Nährstoffkreisläufen sowie zu strukturellen Merkmalen auf Ökosystem- und Individuenebene zu erfassen? Führten der physiologische Stress durch den niedrigen pH und physikalische Störungen der Schichtung durch das einströmende Flutungswasser zu einer Umkehr des Reifungsprozesses? Auf welchen Organisationsebenen der Lebensgemeinschaften waren die Auswirkungen dieser Stressoren erkennbar? • Der zweite Aspekt behandelte die Entwicklung der Artenzahl, die Gleichverteilung der Dominanz von Arten (Eveness) und die Diversität von Planktongemeinschaften entlang des Produktivitätsgradienten. Speziell wurde untersucht, ob die Artenzahl und die Diversität eine monoton positive oder eine unimodale Funktion der Produktivität waren und ob die Eveness eine monoton abnehmende Funktion der Produktivität war. Zur besseren Vorhersagbarkeit der Entwicklung dieser Indizes wurden in einem nächsten Schritt zusätzliche biotische und abiotische Faktoren (z.B. Konsumenteneffekte, physikalische Störung, Immigration) berücksichtigt. Zuletzt wurde die Hypothese getestet, dass unter dem Einfluss von extremem physiologischem Stress keine Abhängigkeit zwischen den betrachteten Indizes und der Produktivität von Ökosystemen besteht. Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit führten zu folgenden Ergebnissen und Schlussfolgerungen: 1) Der Reifungsprozess der Planktongemeinschaft war unter neutralen Bedingungen nicht eindeutig an einzelnen Kriterien festzumachen. Vielmehr schienen idiosynkratische Effekte einzelner Arten auf die Zusammensetzung und Funktion der Organismengemeinschaft von Bedeutung. Coenobiumbildende Kieselalgen sowie größere Cladoceren und Copepoden dominierten sehr rasch die Planktongemeinschaft und vermittelten den Eindruck eines reifen Ökosystems fast unmittelbar nach der Neutralisierung des Tagebausees. 2) Der Einfluss von physiologischem Säurestress und physikalischer Störung der Schichtung durch das eintretende Flutungswasser war gegenüber einem neutralen, ungestörten Teilbecken des Tagebausees (Referenzzustand) eindeutig zu erkennen. Die isolierte Betrachtung der Wirkung der Stressoren lieferte hinsichtlich fast aller Kriterien Anzeichen einer Verjüngung des Systems sensu Odum (1969, 1985). 3) Im betrachteten Ökosystem existierte eine Hierarchie innerhalb der Stressoren. Der Einfluss des Säurestresses dominierte gegenüber dem Einfluss der physikalischen Störung, wahrscheinlich indem er die Reaktionsmöglichkeiten der Planktongemeinschaft einschränkte. 4) Für Primärproduzenten war die Artenzahl eine monoton positive Funktion der realisierten Biomasse (einem Surrogatparameter für die Produktivität des Systems). Die Eveness war eine monoton negative Funktion der Produktivität. Die beobachtete unimodale Beziehung zwischen der Diversität und der Produktivität der Primärproduzenten muss als eine Folge der mathematischen Formulierung dieser Indizes betrachtet werden. 5) Die Ergebnisse multivariater Modelle zur Vorhersage der Artenzahl und der Eveness der Primärproduzenten in Abhängigkeit zusätzlicher erfassbarer biotischer und abiotischer Faktoren ermöglichten eine differenziertere Betrachtung der Ergebnisse: • Im Tagebausee Goitsche war die Eveness hauptsächlich von dichteabhängigen Prozessen gesteuert (negative Abhängigkeit zum Quadrat der Biomassen und zu den Lichtverhältnissen). • Die Entwicklung der Artenzahl war neben dem primären Einfluss der zunehmenden Biomasse auch durch qualitative und quantitative Aspekte der Konsumentengemeinschaft (Diversität und Biomasse des Zooplanktons) beeinflusst. Der Einfluss einer erhöhten Immigration auf die Artenzahl wurde nur zu Beginn der Flutung des Tagebausees beobachtet. 6) Auf Ebene der Konsumenten war die einzige eindeutig feststellbare Abhängigkeit ein Anstieg der Artenzahl mit steigender Biomasse. Das Fehlen von weiteren Beziehungen zwischen Diversitätsindizes und dem Produktivitätsgradienten wird darauf zurückgeführt, dass auf den unteren trophischen Ebenen der Primärproduzenten Ressourceneffekte (Bottom-Up) stärker ausgeprägt sind, wohingegen auf höheren trophischen Ebenen Konsumenteneffekte (Top-Down) dominieren. 7) In durch physiologischen Stress beeinflussten Systemen bestand keine Abhängigkeit zwischen den Diversitätsindizes (Artenzahl, Eveness und Diversität) und der Produktivität.
N2  - The objective of this study was to investigate the development of the pelagic plankton community of the formerly acidic open mining lake Goitsche (pH~3) during its flooding and neutralization. The emphasis was on the interaction between the community composition of an ecosystem and the variability of the abiotic environment. The focus was on two aspects, differing in their causality: • The first aspect concerned the maturation process of the studied ecosystem: Was it possible to picture the development of the pelagic community, based on the criteria formulated by Odum (1969) about the energetics of communities, the nutrient cycling and the structural characteristics at the level of the whole system and of individuals? Do the physiological stress and the physical disturbances, caused by the acidic environment and the inflowing water, induce a reversal of the maturation process? And on which levels of organization can the effect of these stressors be detected? • The second aspect concerned the relationship between selected diversity indices of the community (Species richness, Eveness and Diversity) and the whole-system productivity gradient. I looked whether the Species richness and the Diversity were a monotonous increasing or a unimodale function of the productivity, and if the Eveness was a monotonous decreasing function of the productivity. In a next step, to assure a better predictability of these indices, I took additional biotic and abiotic variables (e.g. consumer effect, physical disturbance, and immigration) into consideration. Lastly, I tested the hypothesis that under the influence of extreme physiological stress there would be no relationship between the diversity indices and the productivity. Main results and conclusions are as follows: 1) The maturation process of the plankton community under neutral conditions could not clearly be depicted by single criteria alone. The structure and function of the community seemed much more driven by idiosyncratic effects of individual species. Coenobial diatoms as well as larger Cladocera and Copepoda, which rapidly dominated the plankton community, made the ecosystem look mature almost immediately after the neutralization of the mining lake. 2) The influence of the physiological stress and the physical disturbances on the maturation process was observed, when compared to an unimpaired reference basin of the open mining lake. When the effects of the two stressors were considered alone, nearly all criteria confirmed a reversal of the maturation process sensu Odum (1969, 1985). 3) In the ecosystem there existed a hierarchy within stressors. The influence of the acid stress dominated over the influence of the physical disturbance, probably by restraining the reaction potential of the plankton community. 4) For primary producers, the Species richness was a monotonous positive function of the realized biomass (a surrogate for the productivity of the ecosystem), and the Eveness a monotonous negative function of the productivity. The observed unimodale relationship between the Diversity and the productivity of primary producers must be seen as a consequence of the mathematical formulation of these indices. 5) The results of multivariate models regarding the forecast of both Species richness and Eveness of the primary producers in relation to the additionally considered biotic and abiotic factors revealed following dependences: • In the mining lake Goitsche the realized Eveness was mainly explained by density dependent processes (negative dependence to the square of the producer biomass and to the light level). • Besides the main influence of increasing biomasses, the Species richness was a function of qualitative and quantitative aspects of the consumer community (Diversity and biomass of the zooplankton). A significant impact of species immigration from the regional pool on the realized Species richness was observed only at the beginning of the flooding of the mining lake. 6) At the consumer level, the only significant relationship was an increase of the Species richness with increasing biomass. The absence of further dependencies between diversity indices and the productivity gradients is attributed to the fact that on lower trophic levels Bottom-Up effects play a major role in the regulation of the community structure, whereas on higher trophic levels Top-Down effects dominate. 7) In ecosystems affected by physiological stress no relationship existed between the diversity indices (Species richness, Eveness and Diversity) of the plankton community and the productivity.
KW  - Ökosystementwicklung
KW  - Stress
KW  - Störung
KW  - Diversitäts-Produktivitäts-Beziehung
KW  - Tagebauseen
KW  - Ecosystem development
KW  - Stress
KW  - Disturbance
KW  - Diversity-Productivity relationship
KW  - mining lakes
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-15098
ER  - 
TY  - THES
A1  - Drechsel, Oliver
T1  - Untersuchungen zu Struktur und Expression des Plastidengenoms höherer Pflanzen
T1  - Investigation of structure and expression of the plastid genome of higher plants
N2  - Auf dem Weg der genetischen Information stellt die Translation der RNA in eine Aminosäuresequenz den letzten Schritt dar. In Chloroplasten, den grünen Organellen der Pflanzenzellen, findet ein Großteil der Regulation der Genexpression auf Ebene der Initiation dieses Schrittes statt. Eine Vielzahl von Eigenschaften der RNA und von Faktoren, die an die RNA binden, entfalten einen Einfluss auf diesen Schritt. Bisher unvollständig aufgeklärt ist die Rolle einer konservierten Nukleotidsequenz in der untranslatierten Region der RNA -- der Shine-Dalgarno-Sequenz. Diese stellt in Bakterien, wie z.B. E. coli als Ribosomenbindestelle sicher, dass Ribosomen den Anfang der zu translatierenden Sequenz zuverlässig erkennen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden diverse DNA-Konstrukte in Plastiden von Tabak eingebracht. Hierzu zählten Konstrukte, die sowohl eine erhöhte Anzahl von Ribosomenbindestellen enthielten als auch vermehrte Startpunkte der Translation. Zusätzlich wurden Konstrukte hergestellt, die die Situation von mehreren zu translatierenden Regionen in der RNA nachstellten. Es konnte festgestellt werden, dass plastidäre Ribosomen die strangaufwärts gelegenen Translationsstartpunkte bevorzugen -- im Gegensatz zu E. coli, wo alle Startpunkte gleichmäßig genutzt wurden. Hierdurch zeigten die prokaryotischen Ribosomen aus Chloroplasten, die sich aus bakteriellen Systemen ableiten, Eigenschaften von eukaryotischen Ribosomen. Ein zweites Teilprojekt dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Inkompatibilität von Chloroplasten mit dem Kerngenom. In Kreuzungen von Arten der Gattung Pelargonium fielen Kombinationen auf, bei denen die Tochterpflanzen bleiche Blattbereiche bis hin zu vollständig weißen Pflanzen zeigten. Dieses Phänomen wird als Bastardbleichheit bezeichnet. In der Gattung Pelargonium werden Chloroplasten von beiden Elternteilen an die Tochterpflanzen vererbt. Da das Phänomen der Bastardbleichheit nur in einem der Plastiden vorkommt, nicht jedoch im anderen in der gleichen Pflanze, muss von einem Effekt ausgegangen werden, der von Plastiden ausgeht. Die Interaktionen zwischen Zellkern und Chloroplasten sind offensichtlich stark gestört. Zur detaillierten Untersuchung dieses Effekts wurde die Nukleotidsequenz von drei Chloroplastengenomen aufgeklärt. Es konnte eine Reihe von Sequenzunterschieden der Genome ermittelt werden. Aus diesen wurde eine Reihe von Unterschieden beobachtet, die einen solchen Effekt zur Folge haben können. Aus diesen Unterschieden wurde eine Reihe von potentiellen Kandidatengenen zusammengestellt, die in weiteren Arbeiten auf ihre Rolle in der Entstehung der Bastardbleichheit untersucht werden.
N2  - Chloroplasts are the green organelles of plants with a evolutionary prokaryotic background. During evolution chloroplasts established translation initiation as the major step in regulation of gene expression. A vast number of factors, e.g. sequence elements, secondary structures or RNA binding proteins, influences the regulation of translation initiation. A conserved sequence – Shine-Dalgarno sequence – can be identified both in prokaryotes as well as chloroplasts. In prokaryotes this sequence provides a faithful means for positioning of the ribosome to the start codon. Due to lower conservation of Shine-Dalgarno sequences the role of this sequence in translation initiation is not completely understood. We designed a series of constructs that contain different arrangements of these sequences in the 5’ UTR resulting in an increased number of potential ribosome binding sites or translation initiation sites. Additionally we constructed a series of 5’ UTRs that resembled polycistronic transcripts. The results showed a dramatic effect of the different constructs on the translation efficiency of the reporter protein. It could be shown that numerous translation initiation sites increase translation efficiency, whereas increased numbers of ribosome binding sites do not. Additionally it could be shown, that plastidic ribosomes preferentially initiate on 5’ translations initiation sites in contrast to prokaryotic ribosomes that recognize initiation sites equally. This illustrates that plastidic ribosomes in contrast to prokaryotic ribosomes show a scanning like mechanism. Hence plastidic ribosomes gained some eukaryotic properties during evolution. A second project was dealing with hybrid variegation. This phenomenon is based on plastid-nuclear genome incompatibility. Due to biparental plastid inheritance in Pelargonium hybrids may show chimeric phenotypes with bleached (incompatible) and green (compatible) sectors. This points to the plastome as cause for the hybrid variegation. To this end the nucleotide sequence of three plastid genomes was determined and an array of candidate genes causing the incompatibility could be compiled.
KW  - Shine-Dalgarno-Sequenzen
KW  - Translationsinitiation
KW  - Plastid
KW  - Bastardbleichheit
KW  - Shine-Dalgarno sequences
KW  - translation initiation
KW  - plastid
KW  - hybrid variegation
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-31056
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schewe, Bettina
T1  - Räumliche und zeitliche Aspekte der intrazellulären pH-Regulation in Epithelien
T1  - Spatial and temporal characteristics of intracellular pH-regulation in epithelial cells
N2  - Die Speicheldrüsen der Schmeißfliege Calliphora vicina produzieren bei Stimulierung mit dem Neurohormon Serotonin (5-Hydroxytryptamine, 5-HT) einen KCl-reichen Primärspeichel. Der transepitheliale K+-Transport wird durch eine apikal lokalisierte vakuoläre H+-ATPase (V-ATPase) energetisiert. Stimulierung der Speicheldrüsen mit 5-HT aktiviert die apikale V-ATPase, die Protonen aus der Zelle in das Drüsenlumen transportiert. Trotz des auswärts gerichteten Protonentransportes führt die 5-HT-Stimulierung kurioserweise zu einer intrazellulären Ansäuerung. Die Ursachen dieser 5-HT-induzierten Ansäuerung waren unzureichend untersucht. Deshalb war das Ziel dieser Arbeit die Identifikation aller Transporter, die an der intrazellulären pH-(pHi)-Regulation in unstimulierten Speicheldrüsen von Calliphora vicina beteiligt sind und an der Entstehung und Regulation der 5-HT-induzierten pHi-Änderungen mitwirken. Von besonderem Interesse war hierbei die funktionelle Mitwirkung der V-ATPase, deren Beteiligung an der pHi-Regulation in tierischen Zellen bisher wenig untersucht war. Wesentliche Ergebnisse dieser Arbeit waren: • Messungen des pHi-Wertes in der unstimulierten Drüse zeigten, dass vor allem die V-ATPase und mindestens ein Na+-abhängiger HCO3--Transporter an der Aufrechterhaltung des Ruhe-pHi beteiligt sind. • Zur Wiederherstellung des Ruhe-pHi nach einer intrazellulären Ansäuerung (NH4Cl-Vorpuls) tragen ebenfalls im Wesentlichen die V-ATPase und mindestens ein Na+-abhängiger HCO3--Transporter bei. Der Na+/H+-Antiporter hat in der unstimulierten Drüse keinen messbaren Einfluss auf den Ruhe-pHi. • Die Wiederherstellung des Ruhe-pHi nach einer intrazellulären Alkalisierung (Na-acetat-Vorpuls) ist Cl--abhängig, aber auch unter extremen Bedingungen waren die Zellen noch in der Lage sich vollständig von einer intrazellullären Alkalisierung zu erholen. Einen entscheidenden Anteil daran hat offenbar die hohe intrazelluläre Pufferkapazität. • Ein Na+-abhängiger Glutamat-Transporter ist per se kein pHi-regulierender Transporter, seine Aktivität hat jedoch Einfluss auf den Ruhe-pHi in der unstimulierten Speicheldrüse von Calliphora vicina. • 10 nM 5-HT induzieren in den Calliphora Speicheldrüsen eine intrazelluläre Ansäuerung. An dieser Ansäuerung ist der Na+/H+-Antiporter entscheidend beteiligt. Auch eine klare Cl--Abhängigkeit der 5-HT-induzierten Ansäuerung konnte beobachtet werden. Wahrscheinlich ist eine gekoppelte Aktivität von Na+/H+-Antiporter und Cl-/HCO3--Antiporter. • Messungen mit einem O2-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoff zeigten, dass Stimulierung der Speicheldrüsen mit 5-HT die Zellatmung aktivierte. Der cAMP- und der IP3/Ca2+-Weg tragen auf komplexe Weise zu der 5-HT-induzierten Aktivierung der Zellatmung und damit auch zu den 5-HT-induzierten pHi-Änderungen bei. • Mit molekularbiologischen Untersuchungen ist es gelungen den Na+-abhängigen Glutamat-Transporter, den Na+/H+-Antiporter, die Carboanhydrase und die Untereinheit C der V-ATPase in den Calliphora Speicheldrüsen direkt nachzuweisen. Zudem konnte erstmals der direkte Nachweis für die Expression eines nH+/K+-Antiporters in den Speicheldrüsen von Calliphora vicina erbracht werden. Diese Arbeit trug ganz wesentlich zum Verständnis der pHi-Regulation in der unstimulierten und stimulierten Speicheldrüse von Calliphora vicina bei. Mechanismen die zur Aufrechterhaltung und Wiederherstellung des Ruhe-pHi nach einer intrazellulären Ansäuerung bzw. Alkalisierung beitragen, konnten mit pHi-Messungen und auch molekularbiologisch nachgewiesen werden. Die Mechanismen, welche die 5-HT-induzierte intrazelluläre Ansäuerung verursachen, konnten ebenfalls aufgeklärt werden. Zudem wurde an den Calliphora Speicheldrüsen eine neue optische Methode zur Messung des O2-Verbrauchs in tierischen Geweben etabliert.
N2  - The tubular salivary glands of the blowfly Calliphora vicina consist of a single layer of epithelial cells. Stimulation with the neurohormone serotonin (5-hydroxytryptamine,5-HT) induces the secretion of a KCl-rich primary saliva. Transepithelial K+-transport is energized by a vacuolar-type H+-ATPase (V-ATPase) which is located in the apical membrane. 5-HT stimulates the apical V-ATPase which transports protons out of the cells into the lumen of the glands. Despite this outward directed proton transport, 5-HT stimulation leads to an intracellular acidification. The causes of this intracellular acidification were poorly understood. Therefore the aim of this thesis was the identification of all pHi regulating transporters which are involved in pHi regulation in the unstimulated salivary glands of Calliphora vicina and which contribute to the 5-HT-induced pHi changes. Of special interest was the functional role of the V-ATPase,whose contribution to pHi regulation in animal cells is, as yet, not well studied. Key results were: • pHi measurements in unstimulated glands showed that mainly the V-ATPase and at least one Na+-dependent HCO3--transporter are involved in maintenance of resting pHi. • V-ATPase and at least one Na+-dependent HCO3--transporter are also necessary for the recovery from an intracellular acidification (NH4Cl prepulse). • Recovery from an intracellular alkali load (Na-acetate prepulse) is partially Cl--dependent. • A Na+ dependent gluatamate-transporter is present in Calliphora salivary glands and its activity affects the resting pHi. • 10 nM 5-HT induce an intracellular acidification. This acidification is Na+-dependent, EIPA-sensitive and also Cl--dependent. No DIDS-sensitivity was observed. A coupled activity of a Na+/H+-antiporter and a Cl-/HCO3- -antiporter was suggested. • Using O2-sensitive fluorescent microbeads I could show that 5-HT stimulation of the Calliphora salivary glands activates cellular respiration. The cAMP and Ca2+-signalling pathways contribute in a complex manner to the 5-HT-induced activation of cellular respiration and consequently, also to the 5-HT-induced intracellular acidification. • The expression of a Na+ dependent glutamate-transporter, a Na+/H+-antiporter, a carbonic anhydrase, subunit C of the V-ATPase and a nH+/K+-antiporter were determined on mRNA level by RT-PCR. This thesis contributes significantly to the understanding of pHi regulation in unstimulated and stimulated salivary glands of Calliphora vicina. Mechanisms which contribute to the maintenance and recovery of resting pHi were identified by using pHi measurements and molecular biological techniques. Mechanisms which are responsible for the 5-HT-induced intracellular acidification were also clarified. Furthermore a new optical method for measuring O2 consumption in animals cells was established by using the Calliphora salivary glands as a model.
KW  - pH-Regulation
KW  - V-ATPase
KW  - Speichelsekretion
KW  - Epithelien
KW  - Calliphora
KW  - pH-regulation
KW  - V-ATPase
KW  - saliva secretion
KW  - epithelia
KW  - Calliphora
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-26879
ER  - 
TY  - THES
A1  - Batke, Monika
T1  - Metabolismus von alkylierten polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen : Einfluss der Struktur auf benzylische Hydroxylierung und Sulfonierung in vitro und Modulation des Metabolismus in vivo
T1  - Metabolism of alcylated polycyclic aromatic hydrocarbons : influence of the structure on benzylic hydroxylation and sulfonation in vitro and modulation of the metabolism in vivo
N2  - Die Toxizität und Kanzerogenität von rein aromatischen polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) ist seit Jahrzehnten bekannt und umfassend erforscht. Die alkylierten PAK (alkPAK) besitzen jedoch aufgrund ihrer Alkylgruppe eine weitere Möglichkeit zur Bioaktivierung und müssen daher gesondert betrachtet werden. Die Alkylgruppe wird zunächst hydroxyliert, anschließend zur Säure oxidiert oder direkt konjugiert. Entstehen hierbei instabile benzylische Sulfokonjugate, so können diese DNA-Addukte bilden und zu Mutationen führen. In Hinblick auf die Bioaktivierung von alkPAK galt es daher zu klären welchen Einfluss die Struktur auf die benzylische Hydroxylierung hat und welche humanen Formen der löslichen Sulfotransferasen besonders an der Umsetzung der alkPAK-Derivate beteiligt sind. Die Untersuchung der Albuminbindung von Schwefelsäureestern sowie ihre Aufnahme in Nierenzellen sollten Aufschluss hinsichtlich möglicher Transportvorgänge geben. Für die in-vivo-Situation wurde weiterhin die Modulation des Metabolismus ausgewählter benzylischer Alkohole durch verschiedene Nahrungsmittelbestandteile, Arzneimittel und Fremdstoffe an Ratten untersucht. Als Biomarker wurden benzylische Carbonsäuren im Urin und die entsprechenden Mercaptursäuren in Urin und Fäzes betrachtet. Zunächst wurde anhand von Inkubationen mit Rattenlebermikrosomen festgestellt, dass insbesondere größere Ringsystemen wie etwa alkylierte Benzo[a]pyrene im Gegensatz zu Methylpyrenen in wesentlich geringerem Umfang zum benzylischen Alkohol umgesetzt werden. Dies wurde auch in Untersuchungen mit humanen Lebermikrosomen bestätigt. Untersuchungen an einzelnen humanen Cytochromen P450 zeigten, dass insbesondere die durch PAK induzierbaren Formen hCYP1A1 und 1B1 hohe Umsatzraten aufwiesen. Die hepatisch exprimierten Formen hCYP1A2 und 3A4 waren jedoch auch zur Bildung der benzylischen Alkohole in der Lage. Für die anschließende Sulfonierung der benzylischen Alkohole wurden besonders hohe Aktivitäten mit den humanen Sulfotransferasen hSULT1A1, 1A2, 1C2 und 1E1 festgestellt. Aufgrund der Enzymexpression und der guten Durchblutung, die eine gute Substratversorgung ermöglicht, ist die Leber als Hauptort der benzylischen Hydroxylierung und Sulfonierung anzusehen. Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe zeigen jedoch, dass nach 1-Hydroxymethylpyren-Applikation bei Ratten die Niere die höchste Zahl an DNA-Addukten aufweist. Wegen der Fokussierung der Sulfonierung auf die Leber ist die systemische Verteilung der Schwefelsäureester die einzig plausible Erklärung. So wurde im Rahmen dieser Arbeit eine hochaffine Bindungsstelle für 2-Sulfoxymethylpyren an Albumin beschrieben und die Aufnahme von benzylischen Sulfaten durch die humanen organischen Anionentransporter hOAT1, 3 und 4 in Nierenzellen in vitro gezeigt. Für die in-vivo-Situation wurde der Einfluss von Ethanol, 4-Methylpyrazol, Pentachlorphenol, Quercetin und Disulfiram untersucht. Neben der durch die Detoxifizierung mittels Alkoholdehydrogenase und Aldehyddehydrogenase entstandenen benzylischen Carbonsäure kann als Biomarker die entsprechende Mercaptursäure herangezogen werden. Sie ist ein indirekter Nachweis für die reaktiven und toxischen benzylischen Sulfate der alkPAK. Für die beiden im Tierversuch eingesetzten benzylischen Alkohole (1-Hydroxymethylpyren und 1-Hydroxymethyl-8-methylpyren) konnte sie in Urin und Fäzes nachgewiesen werden. Es wurde jedoch ein deutlicher Unterschied in der gebildeten Menge sowie der Verteilung zwischen Urin und Fäzes für die beiden Mercaptursäuren festgestellt. Hierfür sind wahrscheinlich Unterschiede im Transport der benzylischen Schwefelsäureester sowie der Spezifität der an der Mercaptursäurebildung beteiligten Enzyme verantwortlich. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass der humane organische Anionentransporter hOAT1 1,8-Dimethylpyrenmercaptursäure nicht und der hOAT3 nur mit niedrigen Umsatzraten transportiert. Bei den Modulatoren zeigte die Gabe der kompetitiven Alkoholdehydrogenase-Hemmstoffe Ethanol und 4-Methylpyrazol die Bedeutung der Alkoholdehydrogenasen für die Entgiftung der benzylischen Alkohole: Die Oxidation zur entsprechenden Carbonsäure war reduziert und die Bildung der Mercaptursäure erhöht. Eine Hemmung der Toxifizierung vermittelt durch Sulfotransferase-Inhibitoren konnte nur für Pentachlorphenol beim Metabolismus des 1-Hydroxymethylpyrens beobachtet werden. Gleichzeitig erwies sich Pentachlorphenol als kompetitiver Alkoholdehydrogenase-Inhibitor, da eine signifikant geminderte Carbonsäureausscheidung zu beobachten war. Bei 1-Hydroxymethyl-8-methylpyren traten diese Effekte nicht auf. Die unterschiedlichen bzw. unterschiedlich starken Effekte der Modulatoren beim Metabolismus der verschiedenen benzylischen Alkohole bestätigen die Beobachtungen aus den in-vitro-Untersuchungen, dass unterschiedliche Enzym- und Transporteraffinitäten und –aktivitäten vorliegen.
N2  - The toxicity and carcinogenicity of purely aromatic polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) is known since decades and has been thoroughly investigated. Compared to the purely aromatic PAH the alcylated PAH (alcPAH) can additionally be biologically activated because of their alcyl group. The alcyl group is hydroxylated and subsequently oxidised to the corresponding acid or conjugated. If unstable benzylic sulfoconjugates arrise from this bioactivation DNA adducts may be formed and could induce mutations. Concering the bioactivation of alcPAH this work should help to get to know which influence the structure has on the benzylic hydroxylation and it should be clarified which forms of human soluble sulfotransferases catalyse the sulfonation of benzylic alcohols. Furthermore the albumin binding of sulfuric acid esters and the uptake into kidney cells by human organic anion transporters in vitro have been analysed to get inside into transport processes. For the in vivo situation the modulation of enzyme activities by food compounds, pharmaceuticals and xenobiotics is of interest. As biomarkers the respective benzylic carboxylic acid and mercapturic acid were measured in urine only and feces. By the use of incubations with rat liver microsomes it turned out that larger ring systems were benzylically hydroxylated to a remarkable less extent then alcyl pyrenes. This observation was also made for human liver microsomes. In vitro experiments addressing the activity of single human cytochromes P450 revealed that PAH inducable forms hCYP1A1 and 1B1 had highest hydroxylation rates, but also the hepatically expressed forms hCYP3A4 and CYP1A2 catalysed the benzylic hydroxylation. The subsequently following sulfonation of the benzylic alcohols was found to be catalysed with high formation rates by human sulfotransferase hSULT1A1, 1A2, 1C2 and 1E1. Due to the enzyme expression and the high blood circluation ensuring the substrate supply it can be assumed that liver is the main organ for benzylic hydroxylation and sulfonation. Nevertheless results from our group showed that after 1-hydroxy methyl pyrene exposure, rats had higher levels of DNA adducts in kidneys than in liver. Thus, it has to be assumed that the sulfuric acid esters are systemically distributed. In the course of this work a high affinity albumin binding site for 2-sulfoxy methyl pyrene was identified and the uptake of sulfuric acid esters mediated by human organic anion tranporter 1, 3 and 4 to kidneys cells in vitro was shown. For the further estimation of the in vivo bioactivation of alcPAH the modulation of enzyme activities by ethanol, 4-methylpyrazole, quercetin, pentachlorophenol and disulfiram was explored. The carboxylic acids formed via alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase were used as biomarkers as well as the respective mercapturic acids. The occurence of the mercapturic acids is an indirect proof for the reactive and toxic benzylic sulfo conjugates. In the urine and fecal samples of rats treated with either 1-hydroxymethyl pyrene or 1-hydroxymethyl 8-methyl pyrene the corresponding mercapturic acids of the sulfuric acid esters were found. Even though the absolute amount excreted and the distribution in urine and fecal samples were quite different. This observation may be explained by differences in transport of the sulfuric acid esters as well as by different specificities of the enzymes responsable for mercapturic acid formation. Additionally it was shown that the human organic anion transporter 1 does not transport 1,8-dimethyl pyrenyl mercapturic acid and the human organic anion transporter 3 only with very little turnover. Whereas 1-methyl pyrenyl mercapturic acid was well transported by both of these proteins. With regard to the modulation the concurrent application of ethanol or 4-methyl pyrazole to rats revealed the important role of alcohol dehydrogenase for the detoxification of benzylic alcohols: The oxidation leading to the corresponding carboxylic acid was remarkably reduced and the excretion of the mercapturic acid via urine and feces was enhanced. In order to observe an inhibition of sulfotransferases pentachlorophenol and quercetine were concurrently applied to rats. An inhibitory effect by the means of an reduced excretion of mercapturic acid was only observed for pentachlorophenol in animals treated with 1-hydroxymethyl pyrene. In addition it turned out, that pentachlorophenol was a potent competitive alcohol dehydrogenase inhibitor as the renal excretion of the corresponding carboxylic acid was remarkably reduced. For 1-hydroxymethyl 8-methyl pyrene this modulation was not observed. These differences in effects and strenght of effects may be ascribed to different enzymatic and transport affinities and activities which have already been observed in in vitro experiments.
KW  - alkylierte polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe
KW  - benzylischer Alkohol
KW  - benzylisches Sulfat
KW  - 1-Hydroxymethylpyren
KW  - Mercaptursäure
KW  - alcylated polycyclic aromatic hydrocarbons
KW  - benzylic alcohol
KW  - benzylic sulfate
KW  - 1-hydroxy methyl pyrene
KW  - mercapturic acid
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-26939
ER  - 
TY  - THES
A1  - Lettau, Kristian
T1  - Katalytische molekular geprägte Polymere : Herstellung und Anwendung in einem Thermistor
T1  - Catalytically molecular imprinted polymers : synthesis and application in a thermistor
N2  - Biomakromoleküle sind in der Natur für viele Abläufe in lebenden Organismen verantwortlich. Dies reicht vom Aufbau der extrazellulären Matrix und dem Cytoskelett über die Erkennung von Botenstoffen durch Rezeptoren bis hin zur Katalyse der verschiedensten Reaktionen in den Zellen selbst. Diese Aufgaben werden zum größten Teil von Proteinen übernommen, und besonders das spezifische Erkennen der Interaktionspartner ist für alle diese Moleküle äußerst wichtig, um eine fehlerfreie Funktion zu gewährleisten. Als Alternative zur evolutiven Erzeugung von optimalen Bindern und Katalysatoren auf der Basis von Aminosäuren und Nukleotiden wurden von Wulff, Shea und Mosbach synthetische molekular geprägte Polymere (molecularly imprinted polymers, MIPs) konzipiert. Das Prinzip dieser künstlichen Erkennungselemente beruht auf der Tatsache, dass sich funktionelle Monomere spezifisch um eine Schablone (Templat) anordnen. Werden diese Monomere dann vernetzend polymerisiert, entsteht ein Polymer mit molekularen Kavitäten, in denen die Funktionalitäten komplementär zum Templat fixiert sind. Dadurch ist die selektive Bindung des Templats in diese Kavitäten möglich. Aufgrund ihrer hohen chemischen und thermischen Stabilität und ihrer geringen Kosten haben “bio-inspirierte” molekular geprägte Polymere das Potential, biologische Erkennungselemente in der Affinitätschromatographie sowie in Biosensoren und Biochips zu ersetzen. Trotz einiger publizierter Sensorkonfigurationen steht der große Durchbruch noch aus. Ein Hindernis für Routineanwendungen ist die Signalgenerierung bei Bindung des Analyten an das Polymer. Eine Möglichkeit für die markerfreie Detektion ist die Benutzung von Kalorimetern, die Bindungs- oder Reaktionswärmen direkt messen können. In der Enzymtechnologie wird der Enzym-Thermistor für diesen Zweck eingesetzt, da enzymatische Reaktionen eine Enthalpie in einer Größenordnung von 5 – 100 kJ/mol besitzen. In dieser Arbeit wird die Herstellung von katalytisch geprägten Polymeren nach dem Verfahren des Oberflächenprägens erstmalig beschrieben. Die Methode zur Immobilisierung des Templats auf der Oberfläche von porösem Kieselgel sowie die Polymerzusammensetzung wurden optimiert. Weiter wird die Evaluation der katalytischen Eigenschaften über einen optischen Test, sowie das erste Mal die Kombination eines kalorimetrischen Transduktors – des Thermistors – mit der Analyterkennung durch ein katalytisch aktives MIP gezeigt. Bei diesen Messungen konnte zum ersten Mal gleichzeitig die Bindung/Desorption, sowie die katalytische Umwandlung des Substrats durch konzentrationsabhängige Wärmesignale nachgewiesen werden.
N2  - Bio macromolecules are responsible in nature for many reactions in living organisms. This reaches from the structure of the extra cellular matrix and the cytoskeleton over the recognition of ligands by receptors up to the catalysis of the most diverse reactions in the cells themselves. These tasks are taken over to the largest part by proteins, and particularly specific recognizing of the interaction partners is extremely important for all these molecules, in order to ensure an error free function. As alternative to the evolutionary production of optimal binders and catalysts on the basis of amino acids and nucleotides, synthetic molecularly imprinted polymer (MIPs) were invented by Wulff, Shea and Moosbach. The principle of these artificial recognition elements is based on the fact that functional monomers specifically arrange themselves around a template. If these monomers are copolymerized with crosslinking monomers, a polymer with molecular cavities is created, in which the functionalities are fixed complementary to the template. Thus the selective binding of the template is possible into these cavities. Due to their high chemical and thermal stability and their small costs "bioinspired" molecularly imprinted polymers have the potential to replace biological recognition elements in affinity chromatography as well as in biosensors and biochips. Despite some published sensor configurations the large break-through is still pending. An obstacle for routine application of is the signal generation on connection of the analyte to the polymer. A possibility for marker-free detection is the use of calorimeters, which can measure heats of reaction or adsorption directly. In enzyme technology the enzyme thermistor is used for this purpose, as enzymatic reactions possess enthalpies in an order of 5 - 100 kJ/mol. In this work the production of catalytically imprinted polymers is described for the first time by the procedure of surface imprinting. The method for immobilization of the template on the surface of porous silicagel as well as the polymer composition were optimized. The evaluation of the catalytic characteristics is shown by an optical test, as well as the first time the combination of a calorimetric transducer - the thermistor - with the analyte recognition by a catalytically active MIP. With these measurements for the first time the binding/desorption, as well as the catalytic transformation of the substrate could be proven at the same time by concentration-dependent heat signals.
KW  - Katalyse
KW  - molekular geprägte Polymere
KW  - Kalorimetrie
KW  - Enzymmodelle
KW  - Biosensoren
KW  - catalysis
KW  - molecularly imprinted polymers
KW  - calorimetry
KW  - enzyme models
KW  - biosensors
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-14804
ER  - 
TY  - THES
A1  - Krach, Christian
T1  - Biogene Aminrezeptoren der Schabe Periplaneta americana : Identifizierung, Charakterisierung und Lokalisierung von PeaTYR1 und PeaDOP2
T1  - Biogenic amine receptors of Periplaneta americana : identification, characterization and localization of PeaTYR1 and PeaDOP2
N2  - Biogene Amine sind eine Substanzklasse, die bei Vertebraten und Invertebraten eine wichtige Komponente des endokrinen Systems darstellen. Sie binden an spezifische Rezeptoren der Gruppe der G-Protein gekoppelten Rezeptoren. In dieser Arbeit wurden zwei neue Rezeptoren aus der Schabe Periplaneta americana kloniert. Durch verschiedene Ansätze konnten zwei vollständige cDNA-Sequenzen isoliert werden. Die Aminosäuresequenzen weisen die größte Ähnlichkeit zu bereits bekannten Tyraminrezeptoren aus Locusta/Bombyx bzw. zu Dopaminrezeptoren aus Apis/Drosophila auf. Entsprechend wurden diese Rezeptoren Pea (P. americana) TYR1 und PeaDOP2 genannt. Deutliche Hinweise auf ihre Funktion lassen sich an den abgeleiteten Aminosäuresequenzen ablesen. Aminosäuren, die wichtig bei der Bildung der Bindungstasche, der Rezeptoraktivierung und der Kopplung eines G-Proteins sind, treten bei beiden Rezeptoren auf. Sequenzalignments stellen die Rezeptoren in die Gruppe anderer Tyraminrezeptoren bzw. der Invertebraten-Typ Dopaminrezeptoren. Das Transkript der beiden Rezeptoren konnte durch RT-PCR in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden. Ein Ziel der Arbeit war die Gewinnung eines polyklonalen Antiserums gegen PeaTYR1. Dieses Serum detektiert im Homogenat von Gehirnen mehrere Banden, darunter auch eine mit der kalkulierten Masse von PeaTYR1. Präabsorption des Serums mit dem Peptid, welches zur Reinigung verwendet wurde, zeigt dessen Spezifität. An Gehirnschnitten markiert das Serum große Teile des Protocerebrums aber auch feinere Strukturen der Antennalloben, der optischen Loben und des Zentralkomplexes. Ein weiteres Serum gegen Tyramin führte zu einer Markierung von mehreren Neuronengruppen, welche sich in die optischen Loben und den Zentralkomplex verzweigen. Der αPeaTYR1-CPL3 Antikörper markierte die Plasmamembran von transfizierten HEK293-Zellen. Die Lokalisierung von Rezeptor und Ligand deuten darauf hin, dass Tyramin die optische und olfaktorische Wahrnehmung beeinflussen könnte.
N2  - Biogenic amines form a group of substances which play an important role in the endocrine system of invertebrates and vertebrates. They bind to specific receptors of the G-protein coupled type. In this work two new receptors from Periplaneta americana were cloned. By several approaches two full-length cDNA sequences were obtained. The amino acid sequence is very similar to known tyramine receptors of Locusta/Bombyx or dopamine receptors from Apis/Drosophila, respectively. Therefore they were named PeaTYR1 and PeaDOP2. Residues which are important for forming the binding pocket, activation of the receptor or G-protein coupling could be identified in both receptors. Sequence alignments group them together with other tyramine receptors or insect-type dopamine receptors. The corresponding mRNA can be detected in different tissues by RT-PCR. One aim of this work was the preparation of a polyclonal antiserum against PeaTYR1. This serum detects several bands in a brain homogenate; one has the calculated mass of PeaTYR1. Its specificity was proven by praeabsorption. On brain slices the serum labels large regions in the protocerebrum, but also fine structures in the antennal lobes, the optic lobes or the central complex. Another serum against tyramine labels several cell clusters, which ramify within the optic lobes and the central complex. On transfected HEK293 cells the receptor can be detected on the plasma membrane. The localization of receptor and ligand may indicate a role of tyramine in optical/olfactory perception.
KW  - Rezeptor
KW  - Tyramin
KW  - Dopamin
KW  - Periplaneta americana
KW  - receptor
KW  - tyramine
KW  - dopamine
KW  - Periplaneta americana
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-15561
ER  -