TY - THES A1 - Mörbt, Nora T1 - Differential proteome analysis of human lung epithelial cells following exposure to aromatic volatile organic compounds T1 - Differentielle Proteomeanalyse humaner Lungenepithelzellen nach Exposition mit aromatischen flüchtigen Substanzen N2 - The widespread usage of products containing volatile organic compounds (VOC) has lead to a general human exposure to these chemicals in work places or homes being suspected to contribute to the growing incidence of environmental diseases. Since the causal molecular mechanisms for the development of these disorders are not completely understood, the overall objective of this thesis was to investigate VOC-mediated molecular effects on human lung cells in vitro at VOC concentrations comparable to exposure scenarios below current occupational limits. Although differential expression of single proteins in response to VOCs has been reported, effects on complex protein networks (proteome) have not been investigated. However, this information is indispensable when trying to ascertain a mechanism for VOC action on the cellular level and establishing preventive strategies. For this study, the alveolar epithelial cell line A549 has been used. This cell line, cultured in a two-phase (air/liquid) model allows the most direct exposure and had been successfully applied for the analysis of inflammatory effects in response to VOCs. Mass spectrometric identification of 266 protein spots provided the first proteomic map of A549 cell line to this extent that may foster future work with this frequently used cellular model. The distribution of three typical air contaminants, monochlorobenzene (CB), styrene and 1,2 dichlorobenzene (1,2-DCB), between gas and liquid phase of the exposure model has been analyzed by gas chromatography. The obtained VOC partitioning was in agreement with available literature data. Subsequently the adapted in vitro system has been successfully employed to characterize the effects of the aromatic compound styrene on the proteome of A549 cells (Chapter 4). Initially, the cell toxicity has been assessed in order to ensure that most of the concentrations used in the following proteomic approach were not cytotoxic. Significant changes in abundance and phosphorylation in the total soluble protein fraction of A549 cells have been detected following styrene exposure. All proteins have been identified using mass spectrometry and the main cellular functions have been assigned. Validation experiments on protein and transcript level confirmed the results of the 2-DE experiments. From the results, two main cellular pathways have been identified that were induced by styrene: the cellular oxidative stress response combined with moderate pro-apoptotic signaling. Measurement of cellular reactive oxygen species (ROS) as well as the styrene-mediated induction of oxidative stress marker proteins confirmed the hypothesis of oxidative stress as the main molecular response mechanism. Finally, adducts of cellular proteins with the reactive styrene metabolite styrene 7,8 oxide (SO) have been identified. Especially the SO-adducts observed at both the reactive centers of thioredoxin reductase 1, which is a key element in the control of the cellular redox state, may be involved in styrene-induced ROS formation and apoptosis. A similar proteomic approach has been carried out with the halobenzenes CB and 1,2-DCB (Chapter 5). In accordance with previous findings, cell toxicity assessment showed enhanced toxicity compared to the one caused by styrene. Significant changes in abundance and phosphorylation of total soluble proteins of A549 cells have been detected following exposure to subtoxic concentrations of CB and 1,2-DCB. All proteins have been identified using mass spectrometry and the main cellular functions have been assigned. As for the styrene experiment, the results indicated two main pathways to be affected in the presence of chlorinated benzenes, cell death signaling and oxidative stress response. The strong induction of pro-apoptotic signaling has been confirmed for both treatments by detection of the cleavage of caspase 3. Likewise, the induction of redox-sensitive protein species could be correlated to an increased cellular level of ROS observed following CB treatment. Finally, common mechanisms in the cellular response to aromatic VOCs have been investigated (Chapter 6). A similar number (4.6-6.9%) of all quantified protein spots showed differential expression (p<0.05) following cell exposure to styrene, CB or 1,2-DCB. However, not more than three protein spots showed significant regulation in the same direction for all three volatile compounds: voltage-dependent anion-selective channel protein 2, peroxiredoxin 1 and elongation factor 2. However, all of these proteins are important molecular targets in stress- and cell death-related signaling pathways. N2 - Die vermehrte Verwendung von Produkten, welche flüchtige organische Substanzen (VOC - volatile organic compound) enthalten, hat eine generelle Exposition der Bevölkerung mit diesen Substanzen an Arbeitsplätzen aber auch in Wohnräumen bedingt. VOCs stehen im Verdacht, zur zunehmenden Inzidenz umweltbedingter Erkrankungen beizutragen. Da die molekularen Ursachen dieser Erkrankungen bisher noch unverstanden sind, war es ein übergeordnetes Ziel dieser Arbeit, VOC-vermittelte molekulare Effekte in menschlichen Lungenepithelzellen anhand eines in vitro Modells zu untersuchen. Dabei sollten vor allem Konzentrationen unterhalb der gültigen Arbeitsplatzgrenzwerte untersucht werden. Obwohl Effekte auf einzelne Proteine bekannt sind, wurden bisher keine Effekte der VOC-Exposition auf das komplexe Netzwerk der zellulären Proteine (Proteom) untersucht. Dieses Wissen ist essentiell, um induzierte zelluläre Mechanismen zu verstehen und Strategien zu deren Vermeidung zu entwickeln. Für die hier durchgeführten Untersuchungen wurde die Lungenepithelzelllinie A549 in einem Zweiphasenexpositionsmodell eingesetzt. Dieses ermöglichte eine möglichst direkte zelluläre Exposition und wurde bereits erfolgreich verwendet, um durch VOC hervorgerufene Entzündungseffekte zu identifizieren. Die massen-spektrometrische Identifikation von 266 Proteinflecken lieferte die erste umfassende Proteomkarte der A549 Zelllinie, welche nachfolgende Untersuchungen mit diesem häufig verwendeten Zelltyp erleichtern wird. Zusätzlich wurde die Verteilung der drei gängigen Luftkontaminanten Chlorbenzol (CB), Styrol and 1,2-Dichlorobenzol (1,2-DCB) zwischen den beiden Phasen (gas/flüssig) des Expositionsmodells gaschromatographisch bestimmt. Die Verteilung entsprach den verfügbaren Literaturdaten. Anschließend wurde das modifizierte Expositionsmodell erfolgreich eingesetzt, um styrol-vermittelte Effekte auf das Proteom der A549 Zellen zu charakterisieren (Kapitel 4). Zu Beginn erfolgte die Erfassung der Zelltoxizität der Substanz, um sicher zu stellen, daß der überwiegende Teil der späteren Expositionsexperimente mit subtoxischen Konzentrationen durchgeführt wird. Es konnte eine signifikant veränderte Expression und Phosphorylierung der löslichen Proteinfraktion der A549 Zellen als Reaktion auf die Styrolexposition festgestellt werden. Die regulierten Proteine wurden massenspektrometrisch identifiziert und ihre wichtigsten Funktionen wurden zugewiesen. Validierungsexperimente auf Protein- und auf Transkriptebene bestätigten die 2-DE Ergebnisse. Insgesamt konnte die zelluläre Reaktion durch die styrol-vermittelte Induktion zweier zentraler Mechanismen erklärt werden: oxidativer zellulärer Stress und beginnende Apoptose. Folgeexperimente wie die Messung der Menge der zellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und die Induktion von redox-sensitiven Markerproteinen konnte die Hypothese eines styrol-induzierten oxidativen Milieus bestätigen. Schließlich wurden Proteinaddukte des reaktiven Styrolmetaboliten Styrol 7,8 epoxide (SO) identifiziert. Besonders die SO-Addukte, welche and den beiden aktiven Zentren der Thioredoxin Reduktase 1 gefunden wurden könnten eine wichtige Rolle bei der styrol-induzierten ROS-Bildung sowie der beginnenden Apoptose spielen. In Analogie zum Styrolexperiment wurden die Effekte der halogenierten Benzole CB und 1,2-DCB untersucht (Kapitel 5). Es konnten ebenfalls sämtliche Proteine identifiziert und die wichtigsten zellulären Funktionen zugewiesen werden. Diese Substanzen modulierten ebenfalls apoptotische Signalwege und die zelluläre Antwort auf oxidativen Streß. Der beobachtete starke pro-apoptotische Effekt konnte für beide Substanzen mit der Spaltung der Caspase 3 nachgewiesen werden. Weiterhin konnte für CB die Induktion redox-sensitiver Proteinspezies mit einem beobachteten höherem Gehalt an ROS erklärt werden. Schließlich wurden ähnliche Mechanismen der zellulären Antwort auf die Exposition mit den drei untersuchten aromatischen VOCs diskutiert (Kapitel 6). Alle getesteten VOCs verursachten eine vergleichbare differentielle Expression (p<0,05) von 4,6-6,9% aller quantifizierten Proteinspezies. Nur drei Proteinspots wurden dabei gemeinsam für alle VOCs reguliert: voltage-dependent anion-selective channel protein 2, peroxiredoxin 1 and elongation factor 2. Allerdings gehören diese drei Proteine zu wichtigen zellulären Zielstrukturen der Signalwege für Stressantwort und Zelltod. KW - VOC KW - Proteom KW - Styrol KW - chlorbenzol KW - dichlorbenzol KW - VOC KW - proteome KW - styrene KW - monochlorobenzene KW - dichlorobenzene Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-49257 ER - TY - JOUR A1 - Poltz, Nadine A1 - Quandte, Sabine A1 - Kohn, Juliane A1 - Kucian, Karin A1 - Wyschkon, Anne A1 - von Aster, Michael A1 - Esser, Günter T1 - Does It Count? Pre-School Children’s Spontaneous Focusing on Numerosity and Their Development of Arithmetical Skills at School JF - Brain Sciences N2 - Background: Children’s spontaneous focusing on numerosity (SFON) is related to numerical skills. This study aimed to examine (1) the developmental trajectory of SFON and (2) the interrelations between SFON and early numerical skills at pre-school as well as their influence on arithmetical skills at school. Method: Overall, 1868 German pre-school children were repeatedly assessed until second grade. Nonverbal intelligence, visual attention, visuospatial working memory, SFON and numerical skills were assessed at age five (M = 63 months, Time 1) and age six (M = 72 months, Time 2), and arithmetic was assessed at second grade (M = 95 months, Time 3). Results: SFON increased significantly during pre-school. Path analyses revealed interrelations between SFON and several numerical skills, except number knowledge. Magnitude estimation and basic calculation skills (Time 1 and Time 2), and to a small degree number knowledge (Time 2), contributed directly to arithmetic in second grade. The connection between SFON and arithmetic was fully mediated by magnitude estimation and calculation skills at pre-school. Conclusion: Our results indicate that SFON first and foremost influences deeper understanding of numerical concepts at pre-school and—in contrast to previous findings –affects only indirectly children’s arithmetical development at school. KW - SFON KW - school mathematics KW - mathematical precursor KW - counting KW - number knowledge KW - magnitude estimation KW - transformation KW - pre-school KW - longitudinal KW - development Y1 - 2022 U6 - https://doi.org/10.3390/brainsci12030313 SN - 2076-3425 VL - 12 SP - 1 EP - 18 PB - MDPI CY - Basel, Schweiz ET - 3 ER - TY - JOUR A1 - Hering, Robert A1 - Hauptfleisch, Morgan A1 - Jago, Mark A1 - Smith, Taylor A1 - Kramer-Schadt, Stephanie A1 - Stiegler, Jonas A1 - Blaum, Niels T1 - Don't stop me now: Managed fence gaps could allow migratory ungulates to track dynamic resources and reduce fence related energy loss JF - Frontiers in Ecology and Evolution N2 - In semi-arid environments characterized by erratic rainfall and scattered primary production, migratory movements are a key survival strategy of large herbivores to track resources over vast areas. Veterinary Cordon Fences (VCFs), intended to reduce wildlife-livestock disease transmission, fragment large parts of southern Africa and have limited the movements of large wild mammals for over 60 years. Consequently, wildlife-fence interactions are frequent and often result in perforations of the fence, mainly caused by elephants. Yet, we lack knowledge about at which times fences act as barriers, how fences directly alter the energy expenditure of native herbivores, and what the consequences of impermeability are. We studied 2-year ungulate movements in three common antelopes (springbok, kudu, eland) across a perforated part of Namibia's VCF separating a wildlife reserve and Etosha National Park using GPS telemetry, accelerometer measurements, and satellite imagery. We identified 2905 fence interaction events which we used to evaluate critical times of encounters and direct fence effects on energy expenditure. Using vegetation type-specific greenness dynamics, we quantified what animals gained in terms of high quality food resources from crossing the VCF. Our results show that the perforation of the VCF sustains herbivore-vegetation interactions in the savanna with its scattered resources. Fence permeability led to peaks in crossing numbers during the first flush of woody plants before the rain started. Kudu and eland often showed increased energy expenditure when crossing the fence. Energy expenditure was lowered during the frequent interactions of ungulates standing at the fence. We found no alteration of energy expenditure when springbok immediately found and crossed fence breaches. Our results indicate that constantly open gaps did not affect energy expenditure, while gaps with obstacles increased motion. Closing gaps may have confused ungulates and modified their intended movements. While browsing, sedentary kudu's use of space was less affected by the VCF; migratory, mixed-feeding springbok, and eland benefited from gaps by gaining forage quality and quantity after crossing. This highlights the importance of access to vast areas to allow ungulates to track vital vegetation patches. KW - veterinary cordon fence KW - ungulate KW - fence ecology KW - resource-tracking KW - energy expenditure KW - accelerometer KW - GPS KW - wildlife and habitat management Y1 - 2022 U6 - https://doi.org/10.3389/fevo.2022.907079 SN - 2296-701X SP - 1 EP - 18 PB - Frontiers CY - Lausanne, Schweiz ER - TY - THES A1 - Kluth, Oliver T1 - Einfluss von Glucolipotoxizität auf die Funktion der β-Zellen diabetessuszeptibler und –resistenter Mausstämme T1 - Effects of glucolipotoxicity on beta-cells of diabetes-susceptible and diabetes-resistant mouse strains N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Auswirkungen von Glucose- und Lipidtoxizität auf die Funktion der β-Zellen von Langerhans-Inseln in einem diabetesresistenten (B6.V-Lepob/ob, ob/ob) sowie diabetessuszeptiblen (New Zealand Obese, NZO) Mausmodell zu untersuchen. Es sollten molekulare Mechanismen identifiziert werden, die zum Untergang der β-Zellen in der NZO-Maus führen bzw. zum Schutz der β-Zellen der ob/ob-Maus beitragen. Zunächst wurde durch ein geeignetes diätetisches Regime in beiden Modellen durch kohlenhydratrestriktive Ernährung eine Adipositas(Lipidtoxizität) induziert und anschließend durch Fütterung einer kohlenhydrathaltigen Diät ein Zustand von Glucolipotoxizität erzeugt. Dieses Vorgehen erlaubte es, in der NZO-Maus in einem kurzen Zeitfenster eine Hyperglykämie sowie einen β-Zelluntergang durch Apoptose auszulösen. Im Vergleich dazu blieben ob/ob-Mäuse längerfristig normoglykämisch und wiesen keinen β-Zelluntergang auf. Die Ursache für den β-Zellverlust war die Inaktivierung des Insulin/IGF-1-Rezeptor-Signalwegs, wie durch Abnahme von phospho-AKT, phospho-FoxO1 sowie des β-zellspezifischen Transkriptionsfaktors PDX1 gezeigt wurde. Mit Ausnahme des Effekts einer Dephosphorylierung von FoxO1, konnten ob/ob-Mäuse diesen Signalweg aufrechterhalten und dadurch einen Verlust von β-Zellen abwenden. Die glucolipotoxischen Effekte wurden in vitro an isolierten Inseln beider Stämme und der β-Zelllinie MIN6 bestätigt und zeigten, dass ausschließlich die Kombination hoher Glucose und Palmitatkonzentrationen (Glucolipotoxizität) negative Auswirkungen auf die NZO-Inseln und MIN6-Zellen hatte, während ob/ob-Inseln davor geschützt blieben. Die Untersuchung isolierter Inseln ergab, dass beide Stämme unter glucolipotoxischen Bedingungen keine Steigerung der Insulinexpression aufweisen und sich bezüglich ihrer Glucose-stimulierten Insulinsekretion nicht unterscheiden. Mit Hilfe von Microarray- sowie immunhistologischen Untersuchungen wurde gezeigt, dass ausschließlich ob/ob-Mäuse nach Kohlenhydratfütterung eine kompensatorische transiente Induktion der β-Zellproliferation aufwiesen, die in einer nahezu Verdreifachung der Inselmasse nach 32 Tagen mündete. Die hier erzielten Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, dass der β-Zelluntergang der NZO-Maus auf eine Beeinträchtigung des Insulin/IGF-1-Rezeptor-Signalwegs sowie auf die Unfähigkeit zur β- Zellproliferation zurückgeführt werden kann. Umgekehrt ermöglichen der Erhalt des Insulin/IGF-1-Rezeptor-Signalwegs und die Induktion der β-Zellproliferation in der ob/ob-Maus den Schutz vor einer Hyperglykämie und einem Diabetes. N2 - The aim of the project was to investigate the impact of glucose- and fatty acid toxicity on β-cell function in a diabetes susceptible (New Zealand Obese, NZO) and resistant (B6.V-Lepob/ob, ob/ob)mouse model. Specifically, the molecular mechanisms of glucolipotoxicity-induced β-cell failure in the NZO mouse and pathways which contribute to protection of ob/ob mice against diet-induced type 2 diabetes should be elucidated. First, the animals were fed a fat-enriched carbohydrate-free diet which resulted in severe obesity and insulin resistance (lipotoxicity). Subsequently, mice were exposed to a carbohydrate-containing diet to induce conditions of glucolipotoxicity. This sequential dietary regimen provides a convenient method to induce rapid hyperglycaemia with β-cell destruction by apoptosis in a short time frame in NZO mice. In contrast, long-term exposure of ob/ob mice to the same dietary regimen leads to normoglycaemia and a protection against β-cell failure. The molecular mechanism behind carbohydrate-mediated β-cell destruction in NZO mice was an inactivation of the insulin/IGF-1 receptor signaling pathway including loss of phospho-AKT, phospho-FoxO1 and of the β-cell specific transcription factor PDX1. With the exception of FoxO1-dephosphorylation, ob/ob mice maintained this survival pathway and therefore were protected against loss of β-cells. The adverse effects of glucolipotoxicity on β-cells were verified in vitro by treatment of isolated NZO-islets and MIN6-cells under glucolipotoxic conditions. Only the combination of high glucose in the presence of palmitate caused deterioration of NZO-islets and MIN6-cells whereas ob/ob-islets were protected. The investigation of the insulin expression pattern showed, that glucolipotoxic conditions inhibited a glucose-induced increase in insulin expression in both, NZO and ob/ob islets. Furthermore, NZO and ob/ob-islets did not differ in glucose-stimulated insulin secretion. Expression profiling and immunohistochemical analyses of islets from NZO and ob/ob mice before and after carbohydrate intervention revealed a transient induction of a compensatory β-cell proliferation. During a 32 day carbohydrate feeding islet mass of ob/ob mice increased almost 3-fold. In conclusion, β-cell failure in NZO mice was induced via impairment of the insulin/IGF-1 signaling pathway and the inability to adequately increase β-cell mass by proliferation. Conversely, maintenance of the insulin/IGF-1 receptor signaling pathway and the induction of β-cell proliferation protected ob/ob mice against hyperglycaemia and type 2 diabetes. KW - Glucolipotoxizität KW - Beta-Zelle KW - NZO KW - ob/ob KW - Diabetes KW - glucolipotoxicity KW - beta-cell KW - NZO KW - ob/ob KW - diabetes Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-61961 ER - TY - THES A1 - Wenk, Sebastian T1 - Engineering formatotrophic growth in Escherichia coli N2 - To meet the demands of a growing world population while reducing carbon dioxide (CO2) emissions, it is necessary to capture CO2 and convert it into value-added compounds. In recent years, metabolic engineering of microbes has gained strong momentum as a strategy for the production of valuable chemicals. As common microbial feedstocks like glucose directly compete with human consumption, the one carbon (C1) compound formate was suggested as an alternative feedstock. Formate can be easily produced by various means including electrochemical reduction of CO2 and could serve as a feedstock for microbial production, hence presenting a novel entry point for CO2 to the biosphere and a storage option for excess electricity. Compared to the gaseous molecule CO2, formate is a highly soluble compound that can be easily handled and stored. It can serve as a carbon and energy source for natural formatotrophs, but these microbes are difficult to cultivate and engineer. In this work, I present the results of several projects that aim to establish efficient formatotrophic growth of E. coli – which cannot naturally grow on formate – via synthetic formate assimilation pathways. In the first study, I establish a workflow for growth-coupled metabolic engineering of E. coli. I demonstrate this approach by presenting an engineering scheme for the PFL-threonine cycle, a synthetic pathway for anaerobic formate assimilation in E. coli. The described methods are intended to create a standardized toolbox for engineers that aim to establish novel metabolic routes in E. coli and related organisms. The second chapter presents a study on the catalytic efficiency of C1-oxidizing enzymes in vivo. As formatotrophic growth requires generation of both energy and biomass from formate, the engineered E. coli strains need to be equipped with a highly efficient formate dehydrogenase, which provides reduction equivalents and ATP for formate assimilation. I engineered a strain that cannot generate reducing power and energy for cellular growth, when fed on acetate. Under this condition, the strain depends on the introduction of an enzymatic system for NADH regeneration, which could further produce ATP via oxidative phosphorylation. I show that the strain presents a valuable testing platform for C1-oxidizing enzymes by testing different NAD-dependent formate and methanol dehydrogenases in the energy auxotroph strain. Using this platform, several candidate enzymes with high in vivo activity, were identified and characterized as potential energy-generating systems for synthetic formatotrophic or methylotrophic growth in E. coli.   In the third chapter, I present the establishment of the serine threonine cycle (STC) – a synthetic formate assimilation pathway – in E. coli. In this pathway, formate is assimilated via formate tetrahydrofolate ligase (FtfL) from Methylobacterium extorquens (M. extorquens). The carbon from formate is attached to glycine to produce serine, which is converted into pyruvate entering central metabolism. Via the natural threonine synthesis and cleavage route, glycine is regenerated and acetyl-CoA is produced as the pathway product. I engineered several selection strains that depend on different STC modules for growth and determined key enzymes that enable high flux through threonine synthesis and cleavage. I could show that expression of an auxiliary formate dehydrogenase was required to achieve growth via threonine synthesis and cleavage on pyruvate. By overexpressing most of the pathway enzymes from the genome, and applying adaptive laboratory evolution, growth on glycine and formate was achieved, indicating the activity of the complete cycle. The fourth chapter shows the establishment of the reductive glycine pathway (rGP) – a short, linear formate assimilation route – in E. coli. As in the STC, formate is assimilated via M. extorquens FtfL. The C1 from formate is condensed with CO2 via the reverse reaction of the glycine cleavage system to produce glycine. Another carbon from formate is attached to glycine to form serine, which is assimilated into central metabolism via pyruvate. The engineered E. coli strain, expressing most of the pathway genes from the genome, can grow via the rGP with formate or methanol as a sole carbon and energy source. N2 - Um den steigenden Bedarf einer wachsenden Weltbevölkerung zu decken und gleichzeitig die CO2-Emissionen zu reduzieren, ist es notwendig, CO2 aufzufangen und zu recyceln. Durch gentechnische Veränderungen von Mikroorganismen ist es möglich diese zur Produktion wertvoller organischer Verbindungen zu nutzen. Da mikrobielle Kulturen primär mit Glucose gefüttert werden und somit mit menschlicher Nahrungsversorgung konkurrieren, wurde die C1-Verbindung Formiat als alternativer bakterieller Nährstoff vorgeschlagen.. Formiat kann durch unterschiedliche Verfahren hergestellt werden, unter anderem durch elektrochemische Reduktion von CO2. Dieses Verfahren ermöglicht das Recycling von CO2 und weiterhin eine Speichermöglichkeit für überschüssige Elektrizität. Formiat ist im Vergleich zum gasförmigen CO2 gut wasserlöslich, was den Transport und die Verwendung als mikrobiellen Nährstoff erleichtert. Natürlich vorkommende formatotrophe Mikroorganismen nutzen Formiat als Kohlenstoff- und Energiequelle. Diese lassen sich allerdings meist schwierig kultivieren und genetisch verändern. In dieser Arbeit stelle ich die Ergebnisse verschiedener Projekte vor, die gemeinsam darauf abzielen, effizientes formatotrophes Wachstum von E. coli – welches natürlicherweise nicht auf Formiat wachsen kann – mittels synthetischer Formiat-Assimilierungswege zu ermöglichen. In der ersten Studie stelle ich eine Strategie für wachstumsgekoppeltes Stoffwechsel-Engineering in E. coli vor. Ich erläutere diese Strategie anhand eines Beispiels, der schrittweisen Etablierung eines synthetischen Formiat- Assimilierungswegs, des PFL-Threonin-Zyklus. Die in diesem Kapitel beschriebenen Methoden sollen einen Leitfaden für Ingenieure bereitstellen, die neue Stoffwechselwege in E. coli und verwandten Organismen etablieren wollen. Im zweiten Kapitel stelle ich eine Studie über die katalytische Effizienz von C1-oxidierenden Enzymen vor. Da formatotrophes Wachstum sowohl die Erzeugung von Energie als auch von Biomasse aus Formiat erfordert, müssen synthetisch formatotrophe E. coli Stämme mit einer hocheffizienten Formiat-Dehydrogenase ausgestattet werden, welche Reduktionsäquivalente und ATP für die Assimilierung von Formiat liefert. Um die Effizienz verschiedener Enzyme testen und vergleichen zu können, entwickelte ich einen E. coli Stamm, der aus Acetat weder Reduktionsäquivalente noch Energie für das Zellwachstum erzeugen kann. Dieser „energie-auxotrophe“ Stamm benötigt eines zusätzlichen enzymatischen Systems zur NADH-Regenerierung, um auf Acetat wachsen zu können. Ich testete verschiedene NAD-abhängige Formiat- und Methanol-Dehydrogenasen in diesem Stamm und konnte zeigen, dass Wachstum auf Acetat durch Zugabe von Formiat oder Methanol ermöglicht wurde. Dies zeigt, dass der Stamm eine zuverlässige Testplattform für C1-oxidierende Enzyme darstellt. Unter Verwendung dieser Plattform wurden mehrere Kandidatenenzyme mit hoher in vivo-Aktivität identifiziert und als Kandidatenenzyme für synthetisches formatotrophes oder methylotrophes Wachstum in E. coli charakterisiert.   Im dritten Kapitel stelle ich die Etablierung des Serin-Threonin-Zyklus (STZ) – eines synthetischen Formiat-Assimilationswegs – in E. coli vor. In diesem Stoffwechselweg wird Formiat über die Formiat-Tetrahydrofolat-Ligase (FtfL) aus Methylobacterium extorquens (M. extorquens) assimiliert. Der Kohlenstoff aus Formiat wird an Glycin gebunden, um Serin zu produzieren, welches im nächsten Schritt in Pyruvat umgewandelt wird und so in den zentralen Kohlenstoffmetabolismus gelangt. Über den natürlichen Threonin-Synthese- und Spaltweg wird Glycin regeneriert und Acetyl-CoA als Produkt des Stoffwechselwegs generiert. Ich entwickelte mehrere E. coli Selektionsstämme, deren Wachstum von verschiedenen STZ-Modulen abhängt, und konnte Schlüsselenzyme bestimmen, die einen hohen Reaktionsfluss durch die Threonin-Synthese und -Spaltung ermöglichen. Ich konnte zeigen, dass die Expression einer Formiat-Dehydrogenase erforderlich ist, um Wachstum auf Pyruvat über Threonin zu erreichen. Durch Integration und Überexpression der meisten Enzyme des STZ auf Genomebene und Anwendung adaptiver Laborevolution wurde Wachstum auf Glycin und Formiat erreicht, was bedeutet, dass der gesamte Serin-Threonin-Zyklus in E. coli aktiv ist. Das vierte Kapitel zeigt die Etablierung des reduktiven Glycinwegs (rGW) – eines kurzen, linearen Formiat-Assimilierungswegs – in E. coli. Wie im STZ wird Formiat über M. extorquens FtfL assimiliert. Dabei wird das Kohlenstoffatom aus Formiat mit CO2 über die umgekehrte Reaktion des Glycin-Spaltungssystems zu Glycin kondensiert. Ein weiteres Kohlenstoffatom aus Formiat wird an Glycin gebunden, um Serin zu bilden, welches über Pyruvat in den Zentralstoffwechsel gelangt. Durch Expression der rGW Enzyme auf Genomebene und adaptive Laborevolution wurde ein E. coli Stamm erzeugt welcher über den rGW auf Formiat oder Methanol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen kann. KW - metabolic engineering KW - E. coli KW - formate assimilation KW - methanol assimilation KW - energy metabolism Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Yishai, Oren T1 - Engineering the reductive glycine pathway in Escherichia coli Y1 - 2019 ER - TY - JOUR A1 - Pandey, Yogesh T1 - Enriched cell-free and cell-based native membrane derived vesicles (nMV) enabling rapid in-vitro electrophysiological analysis of the voltage-gated sodium channel 1.5. JF - Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes N2 - Here, we demonstrate the utility of native membrane derived vesicles (nMVs) as tools for expeditious electrophysiological analysis of membrane proteins. We used a cell-free (CF) and a cell-based (CB) approach for preparing protein-enriched nMVs. We utilized the Chinese Hamster Ovary (CHO) lysate-based cell-free protein synthesis (CFPS) system to enrich ER-derived microsomes in the lysate with the primary human cardiac voltage-gated sodium channel 1.5 (hNaV1.5; SCN5A) in 3 h. Subsequently, CB-nMVs were isolated from fractions of nitrogen-cavitated CHO cells overexpressing the hNaV1.5. In an integrative approach, nMVs were micro-transplanted into Xenopus laevis oocytes. CB-nMVs expressed native lidocaine-sensitive hNaV1.5 currents within 24 h; CF-nMVs did not elicit any response. Both the CB- and CF-nMV preparations evoked single-channel activity on the planar lipid bilayer while retaining sensitivity to lidocaine application. Our findings suggest a high usability of the quick-synthesis CF-nMVs and maintenance-free CB-nMVs as ready-to-use tools for in-vitro analysis of electrogenic membrane proteins and large, voltage-gated ion channels. KW - Cell-free protein synthesis KW - Electrophysiology KW - Membrane proteins KW - Micro-translantation KW - Protein expression Y1 - 2023 U6 - https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2023.184144 SN - 1879-2642 SN - 0005-2736 VL - 1865 IS - 5 PB - Elsevier CY - Amsterdam ER - TY - JOUR A1 - Hermanussen, Michael A1 - Scheffler, Christiane A1 - Pulungan, Aman B. A1 - Bandyopadhyay, Arup Ratan A1 - Ghosh, Jyoti Ratan A1 - Özdemir, Ayşegül A1 - Koca Özer, Başak A1 - Musalek, Martin A1 - Lebedeva, Lidia A1 - Godina, Elena A1 - Bogin, Barry A1 - Tutkuviene, Janina A1 - Budrytė, Milda A1 - Gervickaite, Simona A1 - Limony, Yehuda A1 - Kirchengast, Sylvia A1 - Buston, Peter A1 - Groth, Detlef A1 - Rösler, Antonia A1 - Gasparatos, Nikolaos A1 - Erofeev, Sergei A1 - Novine, Masiar A1 - Navazo, Bárbara A1 - Dahinten, Silvia A1 - Gomuła, Aleksandra A1 - Nowak-Szczepańska, Natalia A1 - Kozieł, Sławomir T1 - Environment, social behavior, and growth BT - Proceedings of the 30th Aschauer Soiree, held at Krobielowice, Poland, June 18th 2022 JF - Human biology and public health N2 - Twenty-four scientists met for the annual Auxological conference held at Krobielowice castle, Poland, to discuss the diverse influences of the environment and of social behavior on growth following last year’s focus on growth and public health concerns (Hermanussen et al., 2022b). Growth and final body size exhibit marked plastic responses to ecological conditions. Among the shortest are the pygmoid people of Rampasasa, Flores, Indonesia, who still live under most secluded insular conditions. Genetics and nutrition are usually considered responsible for the poor growth in many parts of this world, but evidence is accumulating on the prominent impact of social embedding on child growth. Secular trends not only in the growth of height, but also in body proportions, accompany the secular changes in the social, economic and political conditions, with major influences on the emotional and educational circumstances under which the children grow up (Bogin, 2021). Aspects of developmental tempo and aspects of sports were discussed, and the impact of migration by the example of women from Bangladesh who grew up in the UK. Child growth was considered in particular from the point of view of strategic adjustments of individual size within the network of its social group. Theoretical considerations on network characteristics were presented and related to the evolutionary conservation of growth regulating hypothalamic neuropeptides that have been shown to link behavior and physical growth in the vertebrate species. New statistical approaches were presented for the evaluation of short term growth measurements that permit monitoring child growth at intervals of a few days and weeks. KW - St. Nicolas House Analysis KW - child growth KW - body proportions KW - social network KW - public health KW - migration Y1 - 2023 U6 - https://doi.org/10.52905/hbph2023.1.59 SN - 2748-9957 VL - 1 PB - Universitätsverlag Potsdam CY - Potsdam ER - TY - JOUR A1 - Hermanussen, Michael A1 - Scheffler, Christiane T1 - Evidence of chronic undernutrition in late 19th century German infants of all social classes JF - Human biology and public health N2 - 125 years ago, European infants grew differently from modern infants. We show weight gains of 20 healthy children weighed longitudinally from birth to age 1 year, published by Camerer in 1882. The data illustrate the historically prevalent concepts of infant nutrition practiced by German civil servants, lawyers, merchants, university professors, physicians, foresters and farmers. Breastfeeding by the mother was not truly appreciated in those days; children were often breastfed by wet nurses or received bottled milk. Bottle feeding mainly used diluted cow’s milk with some added carbohydrates, without evidence that appropriate amounts of oil, butter or other fatty components were added. French children from 1914 showed similar weight gain patterns suggesting similar feeding practices. The historical data suggest that energy deficient infant formula was fed regularly in the late 19th and early 20th century Europe, regardless of wealth and social class. The data question current concerns that temporarily feeding energy deficient infant formula may warrant serious anxieties regarding long-term cognitive, social and emotional behavioral development. KW - chronic undernutrition KW - breastfeeding KW - historical growth KW - social class KW - translation Y1 - 2022 U6 - https://doi.org/10.52905/hbph2022.2.42 SN - 2748-9957 VL - 2022 IS - 2 PB - Universitätsverlag Potsdam CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Schütte, Moritz T1 - Evolutionary fingerprints in genome-scale networks T1 - Evolutionäre Spuren in genomskaligen Netzwerken N2 - Mathematical modeling of biological phenomena has experienced increasing interest since new high-throughput technologies give access to growing amounts of molecular data. These modeling approaches are especially able to test hypotheses which are not yet experimentally accessible or guide an experimental setup. One particular attempt investigates the evolutionary dynamics responsible for today's composition of organisms. Computer simulations either propose an evolutionary mechanism and thus reproduce a recent finding or rebuild an evolutionary process in order to learn about its mechanism. The quest for evolutionary fingerprints in metabolic and gene-coexpression networks is the central topic of this cumulative thesis based on four published articles. An understanding of the actual origin of life will probably remain an insoluble problem. However, one can argue that after a first simple metabolism has evolved, the further evolution of metabolism occurred in parallel with the evolution of the sequences of the catalyzing enzymes. Indications of such a coevolution can be found when correlating the change in sequence between two enzymes with their distance on the metabolic network which is obtained from the KEGG database. We observe that there exists a small but significant correlation primarily on nearest neighbors. This indicates that enzymes catalyzing subsequent reactions tend to be descended from the same precursor. Since this correlation is relatively small one can at least assume that, if new enzymes are no "genetic children" of the previous enzymes, they certainly be descended from any of the already existing ones. Following this hypothesis, we introduce a model of enzyme-pathway coevolution. By iteratively adding enzymes, this model explores the metabolic network in a manner similar to diffusion. With implementation of an Gillespie-like algorithm we are able to introduce a tunable parameter that controls the weight of sequence similarity when choosing a new enzyme. Furthermore, this method also defines a time difference between successive evolutionary innovations in terms of a new enzyme. Overall, these simulations generate putative time-courses of the evolutionary walk on the metabolic network. By a time-series analysis, we find that the acquisition of new enzymes appears in bursts which are pronounced when the influence of the sequence similarity is higher. This behavior strongly resembles punctuated equilibrium which denotes the observation that new species tend to appear in bursts as well rather than in a gradual manner. Thus, our model helps to establish a better understanding of punctuated equilibrium giving a potential description at molecular level. From the time-courses we also extract a tentative order of new enzymes, metabolites, and even organisms. The consistence of this order with previous findings provides evidence for the validity of our approach. While the sequence of a gene is actually subject to mutations, its expression profile might also indirectly change through the evolutionary events in the cellular interplay. Gene coexpression data is simply accessible by microarray experiments and commonly illustrated using coexpression networks where genes are nodes and get linked once they show a significant coexpression. Since the large number of genes makes an illustration of the entire coexpression network difficult, clustering helps to show the network on a metalevel. Various clustering techniques already exist. However, we introduce a novel one which maintains control of the cluster sizes and thus assures proper visual inspection. An application of the method on Arabidopsis thaliana reveals that genes causing a severe phenotype often show a functional uniqueness in their network vicinity. This leads to 20 genes of so far unknown phenotype which are however suggested to be essential for plant growth. Of these, six indeed provoke such a severe phenotype, shown by mutant analysis. By an inspection of the degree distribution of the A.thaliana coexpression network, we identified two characteristics. The distribution deviates from the frequently observed power-law by a sharp truncation which follows after an over-representation of highly connected nodes. For a better understanding, we developed an evolutionary model which mimics the growth of a coexpression network by gene duplication which underlies a strong selection criterion, and slight mutational changes in the expression profile. Despite the simplicity of our assumption, we can reproduce the observed properties in A.thaliana as well as in E.coli and S.cerevisiae. The over-representation of high-degree nodes could be identified with mutually well connected genes of similar functional families: zinc fingers (PF00096), flagella, and ribosomes respectively. In conclusion, these four manuscripts demonstrate the usefulness of mathematical models and statistical tools as a source of new biological insight. While the clustering approach of gene coexpression data leads to the phenotypic characterization of so far unknown genes and thus supports genome annotation, our model approaches offer explanations for observed properties of the coexpression network and furthermore substantiate punctuated equilibrium as an evolutionary process by a deeper understanding of an underlying molecular mechanism. N2 - Die biologische Zelle ist ein sehr kompliziertes Gebilde. Bei ihrer Betrachtung gilt es, das Zusammenspiel von Tausenden bis Millionen von Genen, Regulatoren, Proteinen oder Molekülen zu beschreiben und zu verstehen. Durch enorme Verbesserungen experimenteller Messgeräte gelingt es mittlerweile allerdings in geringer Zeit enorme Datenmengen zu messen, seien dies z.B. die Entschlüsselung eines Genoms oder die Konzentrationen der Moleküle in einer Zelle. Die Systembiologie nimmt sich dem Problem an, aus diesem Datenmeer ein quantitatives Verständnis für die Gesamtheit der Wechselwirkungen in der Zelle zu entwickeln. Dabei stellt die mathematische Modellierung und computergestützte Analyse ein eminent wichtiges Werkzeug dar, lassen sich doch am Computer in kurzer Zeit eine Vielzahl von Fällen testen und daraus Hypothesen generieren, die experimentell verifiziert werden können. Diese Doktorarbeit beschäftigt sich damit, wie durch mathematische Modellierung Rückschlüsse auf die Evolution und deren Mechanismen geschlossen werden können. Dabei besteht die Arbeit aus zwei Teilen. Zum Einen wurde ein Modell entwickelt, dass die Evolution des Stoffwechsels nachbaut. Der zweite Teil beschäftigt sich mit der Analyse von Genexpressionsdaten, d.h. der Stärke mit der ein bestimmtes Gen in ein Protein umgewandelt, "exprimiert", wird. Der Stoffwechsel bezeichnet die Gesamtheit der chemischen Vorgänge in einem Organismus; zum Einen werden Nahrungsstoffe für den Organismus verwertbar zerlegt, zum Anderen aber auch neue Stoffe aufgebaut. Da für nahezu jede chemische Reaktion ein katalysierendes Enzym benötigt wird, ist davon auszugehen, dass sich der Stoffwechsel parallel zu den Enzymen entwickelt hat. Auf dieser Annahme basiert das entwickelte Modell zur Enzyme-Stoffwechsel-Koevolution. Von einer Anfangsmenge von Enzymen und Molekülen ausgehend, die etwa in einer primitiven Atmosphäre vorgekommen sind, werden sukzessive Enzyme und die nun katalysierbaren Reaktionen hinzugefügt, wodurch die Stoffwechselkapazität anwächst. Die Auswahl eines neuen Enzyms geschieht dabei in Abhängigkeit von der Ähnlichkeit mit bereits vorhandenen und ist so an den evolutionären Vorgang der Mutation angelehnt: je ähnlicher ein neues Enzym zu den vorhandenen ist, desto schneller kann es hinzugefügt werden. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis der Stoffwechsel die heutige Form angenommen hat. Interessant ist vor allem der zeitliche Verlauf dieser Evolution, der mittels einer Zeitreihenanalyse untersucht wird. Dabei zeigt sich, dass neue Enzyme gebündelt in Gruppen kurzer Zeitfolge auftreten, gefolgt von Intervallen relativer Stille. Dasselbe Phänomen kennt man von der Evolution neuer Arten, die ebenfalls gebündelt auftreten, und wird Punktualismus genannt. Diese Arbeit liefert somit ein besseres Verständnis dieses Phänomens durch eine Beschreibung auf molekularer Ebene. Im zweiten Projekt werden Genexpressionsdaten von Pflanzen analysiert. Einerseits geschieht dies mit einem eigens entwickelten Cluster-Algorithmus. Hier läßt sich beobachten, dass Gene mit einer ähnlichen Funktion oft auch ein ähnliches Expressionsmuster aufweisen. Das Clustering liefert einige Genkandidaten, deren Funktion bisher unbekannt war, von denen aber nun vermutet werden konnte, dass sie enorm wichtig für das Wachstum der Pflanze sind. Durch Experimente von Pflanzen mit und ohne diese Gene zeigte sich, dass sechs neuen Genen dieses essentielle Erscheinungsbild zugeordnet werden kann. Weiterhin wurden Netzwerke der Genexpressionsdaten einer Pflanze, eines Pilzes und eines Bakteriums untersucht. In diesen Netzwerken werden zwei Gene verbunden, falls sie ein sehr ähnliches Expressionsprofil aufweisen. Nun zeigten diese Netzwerke sehr ähnliche und charakteristische Eigenschaften auf. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher ein weiteres evolutionäres Modell entwickelt, das die Expressionsprofile anhand von Duplikation, Mutation und Selektion beschreibt. Obwohl das Modell auf sehr simplen Eigenschaften beruht, spiegelt es die beobachteten Eigenschaften sehr gut wider, und es läßt sich der Schluss ziehen, dass diese als Resultat der Evolution betrachtet werden können. Die Ergebnisse dieser Arbeiten sind als Doktorarbeit in kumulativer Form bestehend aus vier veröffentlichten Artikeln vereinigt. KW - Systembiologie KW - Modellierung KW - Evolution KW - Stoffwechsel KW - Gen-Koexpression KW - Systems Biology KW - Modeling KW - Evolution KW - Metabolism KW - Gene co-expression Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-57483 ER -