TY - THES A1 - Unterstab, Gunhild T1 - Charakterisierung der viralen Genprodukte p10 und P des Borna Disease Virus T1 - Characterization of the viral gene products p10 and P of the Borna disease virus N2 - Das Borna Disease Virus (BDV, Bornavirus) besitzt ein einzelsträngiges RNA-Genom negativer Polarität und ist innerhalb der Ordnung Mononegavirales der Prototyp einer eigenen Virusfamilie, die der Bornaviridae. Eine außergewöhnliche Eigenschaft des Virus ist seine nukleäre Transkription und Replikation, eine weitere besteht in seiner Fähigkeit, als neurotropes Virus sowohl in vivo als auch in vitro persistente Infektionen zu etablieren. Die zugrunde liegenden Mechanismen sowohl der Replikation als auch der Persistenz sind derzeit noch unzureichend verstanden, auch deshalb, weil das Virus noch relativ „jung“ ist: Erste komplette Sequenzen des RNA-Genoms wurden 1994 publiziert und erst vor einigen Monaten gelang die Generierung rekombinanter Viren auf der Basis klonierter cDNA. Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen das p10 Protein und das Phosphoprotein (P), die von der gemeinsamen Transkriptionseinheit II in überlappenden Leserahmen kodiert werden. Als im Kern der Wirtszelle replizierendes Virus ist das Bornavirus auf zelluläre Importmechanismen angewiesen, um den Kernimport aller an der Replikation beteiligten viralen Proteine zu gewährleisten. Das p10 Protein ist ein negativer Regulator der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase (L). In vitro Importexperimente zeigten, dass p10 über den klassischen Importin alpha/beta abhängigen Kernimportweg in den Nukleus transportiert wird. Dies war unerwartet, da p10 kein vorhersagbares klassisches Kernlokalisierungssignal (NLS) besitzt und weist darauf hin, dass der zelluläre Importapparat offensichtlich flexibler ist als allgemein angenommen. Die ersten 20 N-terminalen AS vermitteln sowohl Kernimport als auch die Bindung an den Importrezeptor Importin alpha. Durch Di-Alanin-Austauschmutagenese wurden die für diesen Transportprozess essentiellen AS identifiziert und die Bedeutung hydrophober und polarer AS-Reste demonstriert. Die Fähigkeit des Bornavirus, persistente Infektionen zu etablieren, wirft die Frage auf, wie das Virus die zellulären antiviralen Abwehrmechanismen, insbesondere das Typ I Interferon (IFN)-System, unterwandert. Das virale P Protein wurde in dieser Arbeit als potenter Antagonist der IFN-Induktion charakterisiert. Es verhindert die Phosphorylierung des zentralen Transkriptionsfaktors IRF3 durch die zelluläre Kinase TBK1 und somit dessen Aktivierung. Der Befund, dass P mit TBK1 Komplexe bildet und zudem auch als Substrat für die zelluläre Kinase fungiert, erlaubt es, erstmalig einen Mechanismus zu postulieren, in dem ein virales Protein (BDV-P) als putatives TBK1-Pseudosubstrat die IRF3-Aktivierung kompetitiv hemmt. N2 - The Borna Disease Virus (BDV) harbors a single stranded RNA genome of negative polarity. Within the order of Mononegavirales it is the prototype of a new virus family named Bornaviridae. Unique features of this neurotrope virus are its nuclear transcription and replication as well as its ability to establish persistent infections both in vivo and in vitro. The underlying mechanisms of BDV replication and persistence are currently not well understood amongst others due to the fact that BDV is quite a young virus: First complete sequences of the RNA genome have been published in 1994. Only a few months ago the generation of a recombinant Bornavirus from cloned cDNA has been accomplished. The work presented here focused on the viral p10 protein and the phosphoprotein P that are both encoded by two overlapping reading frames of the transcription unit II. Nuclear replication of the Bornavirus relies on cellular import mechanisms to allow for nuclear import of viral proteins involved in viral replication. The p10 protein has been described as a negative regulator of the viral RNA dependent RNA polymerase (L). In vitro import experiments revealed that p10 translocates into the nucleus via the classical importin alpha/beta; dependent pathway. This was unexpected since p10 does not contain a predictable classical nuclear localization signal (NLS) suggesting that the cellular import machinery is more flexible than generally believed. The first 20 amino acids mediate nuclear import and binding to the import receptor importin alpha. Analysis of di-alanine-exchange mutants identified essential amino acids and furthermore revealed the impact of hydrophobic and polar side chains in receptor binding and nuclear import. The ability of the Bornavirus to establish persistent infections rises the question of how the virus circumvents cellular antiviral defense mechanisms, in particular the type I interferon system. This work characterizes the viral P protein as a potent antagonist of IFN beta induction. It prevents the activation of the central transcription factor IRF3 by interfering with the cellular kinase TBK1. The finding that P forms complexes with TBK1 and moreover serves as a kinase substrate allows to postulate a mechanism for the first time, in which a viral protein (BDV-P) acts as a putative TBK1 pseudo-substrate and thereby competitively inhibits IRF3 activation. KW - Interferon KW - Borna Disease Virus KW - Kernlokalisierungssignal KW - Importin KW - IRF3 KW - TBK1 KW - Borna disease virus KW - nuclear localization signal KW - importin KW - IRF3 KW - TBK1 Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-6905 ER - TY - THES A1 - Bühning, Martin T1 - Charakterisierung des Zusammenspiels von FeS-Cluster-Assemblierung, Molybdänkofaktor-Biosynthese und tRNA-Thiolierung in Escherichia coli Y1 - 2018 ER - TY - THES A1 - Neichel, Dajana T1 - Charakterisierung und in vitro - Wirkung agonistischer AT1-Rezeptor Autoantikörper bei Präeklampsie-Patienten N2 - Die Präeklampsie ist eine schwangerschaftsspezifische Bluthochdruck-Erkrankung, die im Allgemeinen nach der 20. Schwangerschaftswoche auftritt. Neben der Hypertonie sind die Proteinurie und die Ödembildung charakteristische Symptome der Präeklampsie. Obwohl heute die Pathophysiologie der Präeklampsie zum großen Teil verstanden ist, ist die Ätiologie dieser Erkrankung noch unklar. 1999 konnten wir in den Seren von Präeklampsie-Patientinnen agonistische Autoantikörper, die gegen den Angiotensin II AT1-Rezeptor gerichtet sind (AT1-AAK), nachweisen. Diese AT1-AAK gehören zur Antikörpersubklasse IgG3. Die AT1-AAK führen in Kulturen neonataler Rattenkardiomyozyten AT1-Rezeptor spezifisch zu einem positiv chronotropen Effekt. Mittels Immunpräzipitation wurde gezeigt, dass AT1-AAK spezifisch den AT1-Rezeptor präzipitieren. Kontrollproben, aus denen die AT1-AAK entfernt wurden, führen zu keiner Präzipitation des AT1-Rezeptors. Die Präzipitation des AT1-Rezeptors bleibt ebenfalls aus, wenn die AT1-AAK mit einem Peptid, welches der Aminosäuresequenz des zweiten extrazellulären Loops des humanen AT1-Rezeptors entspricht, behandelt wurden. Eine Langzeitbehandlung der Kulturen neonataler Rattenherzzellen mit AT1-AAK vermindert die funktionelle Ansprechbarkeit der Zellen auf einen erneuten AT1-Rezeptor-Stimulus. Eine veränderte AT1-Rezeptorexpression wurde nicht nachgewiesen. In guter Übereinstimmung mit den in vitro-Expressionsdaten wurde gezeigt, dass die plazentare AT1-Rezeptorexpression bei Präeklampsie-Patientinnen nicht verschieden von der plazentaren AT1-Rezeptorexpression gesunder Schwangerer mit nicht pathogen verändertem Blutdruck ist. Im Zellsystem der neonatalen Rattenherzzellen führen die AT1-AAK zur Aktivierung von Gi-Proteinen und zu verringerten intrazellulären cAMP-Spiegeln. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die AT1-AAK in Kulturen neonataler Rattenherzzellen die Transkriptionsfaktoren AP-1 und NFkB aktivieren. Die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkB wurde vornehmlich in den Nicht-Myozyten der Rattenherzzellkultur nachgewiesen. Generell wurde festgestellt, dass sich die AT1-AAK pharmakologisch wie der natürliche Agonist des AT1-Rezeptors, Angiotensin II, verhalten. Erste Daten dieser Arbeit deuten auf einen eventuellen Einfluss der AT1-AAK auf die Expression von Komponenten der extrazellulären Matrix bzw. assoziierter Faktoren (Kollagen III, MMP-2, TIMP-2, Colligin) hin. In allen in dieser Arbeit untersuchten Seren von klinisch diagnostizierten Präeklampsie-Patientinnen wurden agonistische AT1-AAK nachgewiesen. Wir vermuten daher, dass die AT1-AAK möglicherweise bedeutend in der Pathogenese der Präeklampsie sind. N2 - Preeclampsia is a serious, pregnancy-specific disorder that usually occurs after week 20 of gestation and is characterized by hypertension, proteinuria, and oedema. While the pathophysiology is clear, little is known about etiology of preeclampsia. In 1999, we showed that sera from preeclamptic patients contain autoantibodies directed against angiotensin II AT1 receptor (AT1-AAB). These autoantibodies are immunoglobuliens of the IgG3 subclass. AT1-AAB accelerate the beating rate of neonatal rat cardiomyocytes. The agonistic effect can be blocked with the AT1 receptor blocker losartan. Co-immunoprecipitation studies have shown that AT1-AAB specifically precipitate the AT1 receptor while control samples lacking AT1-AAB do not. The AT1 receptor could not be precipitated following neutralization of the AT1-AAB by a peptide corresponding to the AT1 receptors second extracellular loop. In further studies on neonatal rat heart cells, we showed long-term stimulation of the AT1 receptor whereby AT1-AAB down-regulated the AT1 receptor-mediated response to a second agonistic receptor-stimulation. After long-term stimulation of neonatal rat heart cells, no changes in AT1 receptor expression could be identified. Corresponding to these in vitro-expression data, no difference was seen in placental AT1 receptor expression between patients with preeclampsia and healthy pregnant women. Next, we tested if the AT1-AAB lead to activation of AT1 receptor signaling in angiotensin II fashion. In neonatal rat heart cell cultures, AT1-AAB lead to activation of Gi-protein with reduced cAMP levels. AT1-AAB are able to activate the transcription factors AP-1 and NFkB in this cell system. In all observations, the agonistic AT1-AAB behave pharmacologically in a similar fashion to angiotensin II. Initial data suggest that AT1-AAB may have an effect on extracellular matrix components (ECM). We have found AT1-AAB in all women meeting the clinical criteria of preeclampsia and, therefore, suggest that AT1-AAB may be important to the pathogenesis of the disease. KW - AT1-Rezeptor / Präeklampsie / AT1-AAK / neonatale Rattenkardiomyozyten / Autoantikörper / Angiotensin II KW - AT1 receptor / preeclampsia / AT1-AAB / neonatal rat cardiomyocytes / autoantibody / angiotensin II Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001126 ER - TY - THES A1 - Pellengahr, Klaus T1 - Charakterisierung von ausgewählten Protein-Phosphatasen und MATE-Proteinen aus Arabidopsis thaliana T1 - Characterisation of Protein-Phosphatases and MATE-Proteins of Arabidopsis thaliana N2 - Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression der Protein Phosphatase-gene TOPP1, TOPP2, TOPP5, STH1 und STH2 analysiert. Alle fünf ausgewählten Gene kodieren für PP des PP1/PP2A-Typs. Es wurde untersucht, ob homologen PP-Isoformen individuelle Expressionsmuster zugewiesen werden konnten. Besonderes Augenmerk richtete sich dabei auf die Expression von PP-Genen in den Schließzellen von A. thaliana. In mehreren Inhibitorstudien wurde beschrieben, dass PP1/PP2A-Proteine eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion pflanzlicher Schließzellen spielen. Bisher konnte allerdings noch keine der entsprechenden katalytischen Untereinheiten auf molekularer Ebene identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum ersten Mal nachgewiesen, dass mit TOPP1 ein Protein des PP1-Typs präferenziell in den Schließzellen von A. thaliana exprimiert wird. Ein Vergleich der Genexpression von TOPP1, TOPP2 und TOPP5 zeigte für die drei homologen Gene sehr Isoform-spezifische Expressionsmuster. Dies war ein deutlicher Hinweis, dass diese eng verwandten PP trotz großer Übereinstimmung auf Aminosäureebene vermutlich unterschiedliche Funktionen in planta haben. Die Untersuchung der Genexpression von STH1 und STH2 zeigte, dass die fast identischen Proteine zum Teil in unterschiedlichen Geweben vorkommen. Die Transkripte der beiden Gene, welche eine eigene Untergruppe von PP2A-verwandten Sequenzen bilden, konnten aus EF isoliert werden. Der in dieser Arbeit entwickelte Screeningansatz ermöglichte es, die sehr ähnlichen cDNA-Fragmente eindeutig voneinander zu unterscheiden. Die gefundenen Isoform-spezifischen Expressionsmuster waren ein deutlicher Hinweis auf unterschiedliche Funktionen in planta. Zur weiteren Untersuchung der PP-Funktionen in planta wurden Pflanzen mit veränderter Genaktivität von TOPP2 oder STH1 untersucht. In Pflanzen mit RNAi-vermittelter Reduktion des TOPP2-Transkriptgehalts ließ sich ein deutlich verändertes Blattwachstum beobachten. Die eingerollten oder asymmetrisch entwickelten Blätter waren vermutlich ein Hinweis, dass diese PP1-Isoform auch in A. thaliana eine Rolle bei der Zellteilung spielt. Für TOPP2-Expression in Hefen wurde diese Funktion schon nachgewiesen. Die Analyse von Insertions-mutanten mit T-DNA Insertionen in beiden STH1-Allelen waren neben den Expressions-studien ein weiterer Hinweis, dass sich STH1 nicht funktionell durch STH2 ersetzen lässt. Die Experimente in dieser Arbeit zeigten, dass das Fehlen der STH1-Genaktivität zu einem deutlichen Blattphänotyp mit gezahnten Blatträndern führte. Für STH2-Insertionsmutanten wurde dieses veränderte Wachstum nicht beschrieben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das Gen NIC1, welches für ein MATE-Membranprotein kodiert, identifiziert und charakterisiert. Die Sequenzierung des Genoms von A. thaliana hatte gezeigt, dass mindestens 56 MATE-Gene in dieser Pflanze vorhanden sind. Zum Zeitpunkt der Identifikation von NIC1 war keines dieser Gene charakterisiert. Außer für das MATE-Protein ERC1 aus S. cerevisiae gab es keine Studien zu eukaryotischen Mitgliedern dieser großen Familie von Membranproteinen. Anhand NIC1 wurden heterologe Expressionssysteme zur funktionellen Charakterisierung von MATE-Proteinen aus Pflanzen etabliert. Die cDNA von NIC1 wurde nach ihrer Klonierung in X. laevis Oozyten und S. cerevisiae exprimiert. In S. cerevisiae erhöhte die NIC1-Expression die Lithumtoleranz der Hefen und führte zu einer Verminderung der Natriumtoleranz. Parallele Versuche mit NIC2 und NIC4 (in den Diplomarbeiten von Blazej Dolniak und Mandy Kursawe) zeigten, dass auch diese beiden Proteine die Salztoleranz von S. cerevisiae beeinflussten. Während NIC2 die Lithium- und Natriumtoleranz erhöhte, führte NIC4-Expresion zu einer höheren Sensibilität gegenüber diesen beiden Kationen. Die unterschiedlichen Eigenschaften der drei homologen Proteine zeigten sich auch bei ihrer Expression in X. laevis Oozyten. NIC1 induzierte in den Oozyten auswärts gerichtete Chloridströme, die spannungsabhängig waren und durch mikromolare Konzentrationen der trivalenten Kationen Lanthan oder Gadolinium inhibiert werden konnten. NIC4 induzierte Barium-inhibierbare Kaliumströme, die spannungsunabhängig waren. Für NIC2 ließ sich in diesem Expressionssystem keine Aktivität detektieren. Zur Untersuchung der NIC1-Funktion in planta wurde die Genaktivität in transgenen Pflanzen lokalisiert und reduziert. Die NIC1-Genexpression war hauptsächlich in den vaskulären Geweben der Pflanze detektierbar und einer Verminderung des NIC1-Transkriptgehalts beeinflusste die Entwicklungsgeschwindigkeit der Pflanzen. Sie entwickelten sich deutlich langsamer als der parallel kultivierte Wildtyp. Der deutliche Phänotyp bei Veränderung der Genaktivität von nur einem der mindestens 56 vorhandenen MATE-Gene in A. thaliana zeigte, dass vermutlich keine weitere MATE-Isoform in der Lage ist, die Funktion von NIC1 zu übernehmen. N2 - Gene expression analysis of the protein phosphatase (PP) genes, TOPP1, TOPP2, TOPP5, STH1 and STH2, of Arabidopsis thaliana was investigated in the first part of this thesis. All five genes encode PP of subgroups PP1 or PP2A. It was determined that homologous isoforms show individual and differing expression patterns. The PP-expression in guard cells was analysed further, because previous inhibitor studies showed an important influence of PP1/PP2A on signal transduction processes in these specialised cells. The previous studies had not addressed molecular identification of the inhibited PP1-/PP2A-subunits. This work demonstrates for the first time a preferential expression of a PP1 isoform, TOPP1, in guard cells. Further analysis of TOPP1, TOPP2 and TOPP5 gene expression also revealed isoform-specific expression patterns, suggesting non-redundant functions in planta. Characterisation of the nearly identical PP2A-related genes, STH1 and STH2, also revealed individual expression patterns. An established screening approach (this work) for the identification of PP-genes from EF (epidermal fragments; a preparation enriched for guard cells) made it possible to distinguish the cDNAs of STH1 and STH2. The two genes form a subgroup of PP2A-related sequences. Differences in their expression patterns suggest that STH1 and STH2 have different functions in A. thaliana. The analysis of plants with altered gene expression of TOPP2 and STH1 gave further insights into the roles of individual PP isoforms. The RNAi-mediated reduction of TOPP2-expression led to changed morphology of leaves, which showed curling and asymmetric development. The reason for this phenotype is probably due to changes of the cell cycle in certain parts of the leaf. Previous studies have already shown that heterologously expressed TOPP2 complements yeast cell cycle mutants. The selection and characterisation of plants with insertions in both STH1-allels revealed the individual roles of STH1 and STH2 in planta. Although STH2 was not affected, plants developed an extreme phenotype with reduced growth and altered leave shape. Previous studies with STH2 loss-of-function mutants did not show this morphology. The second part of this thesis includes the identification and characterisation of a MATE (multidrug and toxic extrusion) membrane protein in plants. Described is NIC1, the first of at least 56 MATE proteins in A. thaliana. Indeed a study of the MATE protein, ERC1, of Saccharomyces cerevisiae was the only description of a eukaryotic member of this large family of membrane proteins. KW - Biologie KW - Molekularbiologie KW - molecular biology Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-2500 ER - TY - THES A1 - Hille, Carsten T1 - Charakterisierung von Transportmechanismen in der Speicheldrüse der Schabe Periplaneta americana T1 - Characterisation of transport mechanisms in salivary glands of the cockroach Periplaneta americana N2 - Die Aktivierung der Speichelsekretion erfolgt in der innervierten Speicheldrüse der Schabe Periplaneta americana durch die biogenen Amine Dopamin (DA) und Serotonin (5-HT). Die Acini der Speicheldrüse sezernieren einen Primärspeichel, der in den Ausführgängen modifiziert wird. Die durch DA und 5-HT aktivierten Signalwege sowie die an der Elektrolyt- und Flüssigkeitssekretion bzw. Speichel-modifikation beteiligten Transportmechanismen sind weitgehend unbekannt. Mikrofluorometrische Ca2+-, Na+- und pH-Messungen in Kombination mit pharmakologischen Experimenten, biochemische Messungen der Aktivitäten von Ionentransport-ATPasen sowie videomikroskopische Analysen zu transepithelialen Wasserbewegungen wurden in dieser Arbeit durchgeführt. Sie sollten Informationen über die an der Speichelbildung und -modifikation beteiligten Transportmechanismen und die Signalwege liefern, welche durch DA und/oder 5-HT aktiviert werden. Wesentliche Ergebnisse dieser Arbeit waren:
  • Messungen des intrazellulären pH (pHi) in Gangzellen zeigten, dass isolierte Ausführgänge mit Acini bei Stimulierung mit DA und 5-HT stark ansäuerten. In isolierten Ausführgängen ohne Acini verursachte nur DA eine schwache Ansäuerung. Da nur die Ausführgänge dopaminerg innerviert sind, die Acini jedoch dopaminerg und serotonerg, zeigt dieses Ergebnis, dass die DA- und/oder 5-HT-induzierte Primärspeichelbildung die Ursache für die pHi-Änderungen in den Gangzellen ist. pHi-Messungen in den Gangzellen geben also auch Hinweise auf Transportvorgänge in den Acini.
  • Der Na+-K+-2Cl--Symporter und der Cl--HCO3--Antiporter, gekoppelt mit dem Na+ H+-Antiporter (NHE) waren an der NaCl-Aufnahme in die peripheren Zellen der Acini zur Bildung des NaCl-reichen Primärspeichels beteiligt. Die Aktivität dieser Transporter hing von der CO2/HCO3--Verfügbarkeit ab und war Ca2+-abhängig.
  • Die starke Ansäuerung in den Gangzellen hing nicht von der Aktivität der apikalen vakuolären Protonen-ATPase (V-H+-ATPase), aber von der Aktivität der basolateralen Na+-K+-ATPase ab, die anscheinend in den Ausführgängen die Speichelmodifikation energetisiert.
  • In isolierten Ausführgängen mit Acini waren die V-H+-ATPase und Na+-abhängige Transporter (u. a. NHE) an der Erholung von einer DA-induzierten oder einer NH4Cl-Vorpuls-induzierten Ansäuerung in den Gangzellen beteiligt. Bei der Regulation des pHi in unstimulierten Gangzellen spielten diese Transporter keine Rolle.
  • In isolierten Ausführgängen mit Acini induzierte DA in den Gangzellen einen Anstieg der [Na+]i und, zeitlich verzögert, auch der [Ca2+]i. Der [Na+]i-Anstieg war von der Aktivität der Acini abhängig und erfolgte möglicherweise über apikale Na+-Kanäle. Der [Ca2+]i-Anstieg war graduiert und tonisch. Der DA-induzierte [Na+]i-Anstieg in den Gangzellen und deren Depolarisation führten dazu, dass der basolaterale Na+-Ca2+-Antiporter in den Ca2+-Influx-Modus umkehrte. Die daraus resultierende tonische [Ca2+]i-Erhöhung könnte an der Regulation der Na+-Rückresorption beteiligt sein.
  • Zum Nachweis transepithelialer Flüssigkeitsbewegungen in isolierten Ausführgängen wurde eine videomikroskopische Methode entwickelt. Isolierte Ausführgänge ohne Acini resorbierten im unstimulierten Zustand Flüssigkeit aus dem Ausführganglumen. Möglicherweise sezernieren die Acini auch im unstimulierten Zustand mit geringerer Rate einen Primärspeichel, der in den Ausführgängen resorbiert wird. Die Resorption war ATP-abhängig. Der ATP-verbrauchende Transportmechanismus konnte nicht identifiziert werden. Weder die Na+-K+-ATPase noch die V-H+-ATPase waren an der Resorption beteiligt.
Diese Arbeit trug zur Kenntnis der komplexen Funktionsweise von Speicheldrüsen in Insekten bei und erweiterte das lückenhafte Wissen über die zellulären Wirkungen biogener Amine in Insekten. Zudem wurden in dieser Arbeit viele Parallelen zu Funktionsweisen der Speicheldrüsen in Vertebraten deutlich. N2 - The acinar salivary glands in the cockroach Periplaneta americana are innervated by dopaminergic and serotonergic fibers and secrete a NaCl-rich primary saliva upon stimulation with the biogenic amines dopamine (DA) or serotonin (5-HT). The ducts downstream of the acini are thought to modify the primary saliva by Na+ reabsorption and K+ secretion. The electrolyte and fluid transport processes activated by DA and 5-HT as well as the second messenger pathways mediating between the biogenic amine receptors and the effector transport mechanisms are poorly understood.In this sudy, microfluorometrical Ca2+, Na+ and pH measurements were performed in combination with pharmacological experiments. Furthermore, ATPase activity assays and microscopical analyses of transepithelial fluid transport were done. The aim of this work has been the characterisation of the DA-induced transport mechanisms in the cockroach salivary glands in order to improve our understanding of the cellular actions of biogenic amines in insects. Intracellular pH measurements in duct cells of isolated small lobes of salivary glands consiting of several acini and ducts showed a strong intracellular acidification upon DA or 5-HT stimulation. On the other hand, only a small intracellular acidification could be recognised in isolated ducts without acini. The acini are innervated by dopaminergic and serotonergic fibers, whereas the ducts are innervated only by dopaminergic fibers. Thus, this result demonstrates, that the DA- or 5-HT-induced production of primary saliva in the acini causes the intracellular pH changes in the ducts. Consequently, intracellular pH measurements in ducts are also useful to characterise transport processes in the acini. The Na+-K+-2Cl- cotransport and/or the Cl--HCO3- exchange combined with the Na+ H+ exchange (NHE) were responsible for the NaCl uptake at the basolateral membrane in the peripheral cells of the acini during production of primary saliva. The activity of these transporters was regulated by the CO2/HCO3--availability and was Ca2+-dependent. The activity of the basolateral Na+-K+-ATPase, but not of the apical vacuolar-type proton pump (V-H+-ATPase) in the duct cells was necessary for the strong intracellular acidification in the ducts with acini. Thus, the Na+-K+-ATPase seems to energise the saliva modification in the ducts. In ducts with acini, the V-H+-ATPase and Na+-dependent transporters (e.g. NHE) were responsible for the pH-recovery after a DA- or NH4Cl-induced intracellular acidification in the duct cells. In the regulation of the intracellular resting pH these transporters played a minor role. In addition, DA induced an increase in the intracellular Na+ concentration, followed by an increase in the intracellular Ca2+ concentration in duct cells with acini, but never in duct cells without acini. The Na+ elevation was probably the result of the activity of apical Na+ channels. The DA-induced Na+ elevation and a depolarisation of the basolateral membrane of the duct cells reversed a Na+-Ca2+ exchange activity into the reverse mode causing a graded Ca2+ elevation in duct cells. The Ca2+ elevation is probably involved in the regulation of the Na+ reabsorption during saliva modification. Transepithelial fluid transport in isolated ducts was detected with a fluorescent microscopical method. Already unstimulated isolated ducts reabsorbed fluid from the duct lumen to the bath side. Perhaps unstimulated acini possess a basic secretion rate and this primary saliva is than reabsorbed in the ducts. The fluid reabsorption was ATP-dependent, but the ATP-consuming transport mechanism could not be identified. Neither the basolateral Na+-K+-ATPase, nor the apical V-H+-ATPase were involved in fluid reabsorption. This work extends our knowledge about the complex function of insect salivary glands and about the cellular action of biogenic amines in insects. Additionally, it indicates lots of similarities between the functions of salivary glands in vertebrates and invertebrates. KW - Speicheldrüse KW - Amerikanische Schabe KW - Insekten KW - Speichel KW - epithelialer Transport KW - ratiometric imaging KW - Signalkaskaden KW - biogene Amine KW - Dopamin KW - Serotonin KW - salivary glands KW - epithelial transport KW - biogenic amines KW - dopamine KW - serotonin KW - cockroach KW - insects Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-9422 ER - TY - THES A1 - Trescher, Karoline T1 - Cokulturtestsystem für die Untersuchung des Einflusses physikochemischer Eigenschaften von Copolymeren auf das Verhalten von Keratinozyten und Fibroblasten T1 - Coculture test system for the investigation of the influence of physicochemical properties of copolymers on the behaviour of keratinocytes and fibroblasts N2 - Chemische und physikalische Eigenschaften von Polymeren können verschiedene Zelltypen unterschiedlich, z. B. hinsichtlich Adhärenz oder Funktionalität, beeinflussen. Die Elastizität eines Polymers beeinflusst vor allem, welche Zugkräfte eine Zelle gegenüber ihrem Substrat entwickeln kann. Das Zellverhalten wird dann über intrazelluläre Rückkopplungsmechanismen reguliert. Die Oberflächenladung und/oder Hydrophilie eines Polymers beeinflusst zunächst die Adsorption von Ionen, Proteinen und anderen Molekülen. Vor allem über die Zusammensetzung, Dichte und Konformation der adsorbierten Komponenten werden anschließend die Wechselwirkungen mit den Zellen vermittelt. Des Weiteren können verschiedene Zelltypen unterschiedliche membranassoziierte Proteine, Zucker und Lipide aufweisen, so dass Polymereigenschaften zellspezifische Effekte bewirken können. Für biotechnologische Anwendungen und für den Einsatz in der regenerativen Medizin gewinnen Polymere, die spezifische Zellreaktionen regulieren können, immer weiter an Bedeutung. Die Isolierung und Kultur von primären Keratinozyten ist noch immer anspruchsvoll und die adäquate Heilung von Hautwunden stellt eine fortwährende medizinische Herausforderung dar. Ein Polymer, das eine bevorzugte Adhärenz von Keratinozyten bei gleichzeitig verminderter Anheftung dermaler Fibroblasten ermöglicht, würde erhebliche Vorteile für den Einsatz in der Keratinozyten-Zellkultur und als Wundauflage bieten. Um den potentiell spezifischen Einfluss bestimmter Polymereigenschaften auf primäre humane Keratinozyten und dermale Fibroblasten zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit ein Zellkultursystem für die Mono- und Cokultur beider Zelltypen entwickelt. Das Testsystem wurde als Screening konzipiert, um den Einfluss unterschiedlicher Polymereigenschaften in mehreren Abstufungen auf die Zellen zu untersuchen. Folgende Parameter wurden untersucht: 1. Vitalität und Dichte adhärenter und nicht-adhärierter Zellen, 2. Schädigung der Zellmembran, 3. selektive Adhärenz von Keratinozyten in Cokultur durch die spezifische immunzytochemische Färbung von Keratin14 und Vimentin. Für die Polymere mit variabler Elastizität wurden zusätzlich die Ablagerung extrazellulärer Matrixkomponenten und die Sekretion löslicher Faktoren durch die Zellen untersucht. Als Modellpolymere für die Variation der Elastizität wurden vernetzte Poly(n-butylacrylate) (cPnBA) verwendet, da deren Elastizität durch den Anteil des Vernetzers eingestellt werden kann. Auf dem weniger elastischen cPnBA zeigte sich in der Cokultur ein doppelt so hohes Verhältnis von Keratinozyten zu Fibroblasten wie auf dem elastischeren cPnBA, so dass ein leichter zellselektiver Effekt angenommen werden kann. Acrylnitril-basierte Copolymere wurden als Modellpolymere für die Variation der Oberflächenladung und Hydrophilie verwendet, da die Eigenschaften durch Art und molaren Anteil des Comonomers eingestellt werden können. Durch Variation des molaren Anteils der Comonomere mit positiver bzw. negativer Ladung, Methacrylsäure-2-aminoethylester-hydrochhlorid (AEMA) und N-3-Aminopropyl-methacrylamid-hydro-chlorid (APMA) bzw. Natriumsalz der 2-Methyl-2-propen-1-sulfonsäure (NaMAS), wurde der Anteil der positiven bzw. negativen Ladung im Copolymer variiert. Durch die Erhöhung des molaren Anteils des hydrophilen Comonomers N-Vinylpyrrolidon (NVP) wurde die Hydrophilie des Copolymers gesteigert. Die Erhöhung des molaren Anteils an positiv geladenem Comonomer AEMA im Copolymer führte tendenziell zu einer höheren Keratinozytendichte, wobei die Fibroblastendichte unverändert blieb. Durch die Erhöhung des molaren Anteils des positiv geladenen Comonomers APMA ergaben sich keine deutlichen Unterschiede in Dichte, Vitalität oder Selektivität der Zellen. Durch die stufenweise Erhöhung des molaren Anteils des negativ geladenen Comonomers NaMAS konnte, wie im Falle von AEMA, eine Tendenz zur verbesserten Keratinozytenadhärenz beobachtet werden. Die Steigerung der Hydrophilie der Copolymere führte sowohl für Keratinozyten als auch für Fibroblasten zu einer reduzierten Adhärenz und Vitalität. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde ein Testverfahren etabliert, das die Untersuchung von primären humanen Keratinozyten und primären humanen Fibroblasten in Monokultur und Cokultur auf verschiedenen Polymeren ermöglicht. Die bisherigen Ergebnisse zeigen, dass sich durch die gezielte Modifizierung verschiedener Polymereigenschaften die Adhärenz und Vitalität beider Zelltypen beeinflussen lässt. Die Reduktion der Elastizität sowie die Erhöhung des molaren Anteils geladener Comonomere führten zu einer Zunahme der Keratinozytenadhärenz. Da die Fibroblasten unbeeinflusst blieben, zeigte sich für einige der untersuchten Polymere eine leichte Zellselektivität. Diese könnte durch die weitere Erhöhung der Steifigkeit oder des Anteils geladener Comonomere möglicherweise weiter gesteigert werden. N2 - Chemical and physical properties of polymers can influence various cell types, e.g. concerning adherence and functionality. For instance, the elasticity of a polymer can influence, which pulling force a cell can generate towards a substrate. According to the cell type, its behavior can be controlled by intracellular feedback mechanisms. The surface charge and/or hydrophilicity of a polymer initially influence the adsorption of ions, proteins and other molecules. In particular, the composition, density, and conformation of the adsorbed components mediate the cell-material interactions. Since different cell types present varying cell membrane associated proteins, sugars and lipids, it is assumed that polymer properties can induce cell specific effects. Polymers, which can regulate specific cell reactions, become more and more important for biotechnological uses and applications in the regenerative medicine. The isolation and culture of primary keratinocytes is still challenging and an adequate wound healing remains a clinical task. A polymer, which enables a preferential adherence of keratinocytes and induces a reduced adherence of dermal fibroblasts, would provide enormous advantages for keratinocyte culture systems as well as for wound dressings. To investigate the specific influence of certain polymer properties on primary human keratinocytes and fibroblasts, a cell culture system for mono- and coculture of both cell types was established. The test system was designed as a screening to investigate the influence of polymers with gradations of different properties on the cells. Thereby, the viability and density of adherent and not adhered cells, as well as the impairment of the cell membranes were analyzed in mono- and cocultures, and the selective adherence of keratinocytes in the coculture was evaluated using a specific immunocytochemical staining for keratin14 and vimentin. Furthermore, the deposition of extracellular matrix components and the secretion of soluble factors were analyzed for the elastic polymers. Since the elasticity of crosslinked poly(n-butylacrylate) (cPnBA) networks can be adjusted by the amount of the crosslinker, they were used as model polymers to investigate the influence of varying elasticity to the cells. On the less elastic cPnBA, the ratio of keratinocytes to fibroblasts was increased compared to the more elastic one. From these results, a slight cell selective effect can be assumed. Acrylonitrile-based copolymers were used as model polymers for the variation of surface charge and hydrophilicity, since their properties can be modified by the type and molar ratio of comonomers. By the variation of the molar ratio of positively charged comonomers (Methacrylic acid-2-aminoethylester hydrochloride (AEMA) and N-3-aminopropyl methacrylamide hydrochloride (APMA)), or a negatively charged comonomer (2-methyl-2-propene-1-sulfonic acid sodium salt (NaMAS)), the amount of positive or negative charges was modified. The hydrophilicity was increased by the molar ratio of the hydrophilic comonomer N-vinylpyrrolidone (NVP). With an increased molar ratio of the positively charged comonomer AEMA, a tendency towards a higher density of adherent keratinocytes could be shown, whereby, the density of adherent fibroblasts remained unaffected. With increasing molar ratios of the positively charged comonomer APMA, no differences between cell densities, viability or selectivity were detectable. Comparable to AEMA, a tendency towards improved keratinocyte adhesion could be shown with an increasing molar ratio of the negatively charged comonomer NaMAS. The increase of the hydrophilicity of the copolymers led to a reduced adherence and viability of the keratinocytes, as well as of the fibroblasts. In conclusion, a test system was established, which enables the evaluation of primary human keratinocytes and fibroblasts in contact with different polymers in monoculture, as well as in coculture. Furthermore, the present thesis shows that directed modifications of polymer properties influenced the adherence and viability of both cell types. The decrease of elasticity and the increase of the molar ratio of charged comonomers led to an increased keratinocyte adherence. Since the fibroblasts remained unaffected, slight cell selectivity was shown. By further increasing the stiffness or the amount of charged comonomers, further enhancement of this effect might be possible. KW - Keratinozyten KW - Fibroblasten KW - Cokultur KW - Copolymere KW - Elastizitätsmodul KW - Oberflächenladung KW - Hydrophilie KW - keratinocytes KW - fibroblasts KW - coculture KW - copolymers KW - elastic modulus KW - surface charge KW - hydrophilicity Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-62915 ER - TY - THES A1 - Freiberg, Alexander T1 - Das "Leucine-Rich Repeat" im Invasionsprotein Internalin B : Stabilität und Faltung eines Solenoidproteins T1 - The leucine-rich repeat from internalin B : stability and folding of a solenoid protein N2 - Für das Verständnis der Strukturbildung bei Proteinen ist es wichtig, allgemein geltende Prinzipien der Stabilität und Faltung zu verstehen. Bisher wurde viel Arbeit in die Erörterung von Gesetzmäßigkeiten zu den Faltungseigenschaften von globulären Proteinen investiert. Die große Proteinklasse der solenoiden Proteine, zu denen z. B. Leucine-Rich Repeat- (LRR-) oder Ankyrin-Proteine gehören, wurde dahingegen noch wenig untersucht. Die Proteine dieser Klasse sind durch einen stapelförmigen Aufbau von sich wiederholenden typischen Sequenzeinheiten gekennzeichnet, was in der Ausbildung einer elongierten Tertiärstruktur resultiert. In der vorliegenden Arbeit sollte versucht werden, die Stabilität und Faltung eines LRR-Proteins mittels verschiedener biophysikalischer Methoden zu charakterisieren. Als Untersuchungsobjekt diente die für die Infektion ausreichende zentrale LRR-Domäne des Invasionsproteins Internalin B (InlB241) des Bakteriums Listeria monocytogenes. Des weiteren sollten die Integrität und die Stabilitäts- und Faltungseigenschaften der sogenannten Internalin-Domäne (InlB321) untersucht werden. Hierbei handelt es sich um die bei allen Mitgliedern der Internalinfamilie vorkommende Domäne, welche aus einer direkten Fusion des C-terminalen Endes der LRR-Domäne mit einer Immunglobulin (Ig)-ähnlichen Domäne besteht. Von beiden Konstrukten konnte eine vollständige thermodynamische Charakterisierung, mit Hilfe von chemisch- bzw. thermisch-induzierten Faltungs- und Entfaltungsübergängen durchgeführt werden. Sowohl InlB241 als auch InlB321 zeigen einen reversiblen und kooperativen Verlauf der chemisch-induzierten Gleichgewichtsübergänge, was die Anwendung eines Zweizustandsmodells zur Beschreibung der Daten erlaubte. Die zusätzliche Ig-ähnliche Domäne im InlB321 resultierte im Vergleich zum InlB241 in einer Erhöhung der freien Enthalpie der Entfaltung (8.8 kcal/mol im Vergleich zu 4.7 kcal/mol). Diese Stabilitätszunahme äußerte sich sowohl in einer Verschiebung des Übergangsmittelpunktes zu höheren Guanidiniumchlorid-Konzentrationen als auch in einer Erhöhung der Kooperativität des Gleichgewichtsübergangs (9.7 kcal/mol/M im Vergleich zu 7.1 kcal/mol/M). Diese Beobachtungen zeigen dass die einzelnen Sequenzeinheiten der LRR-Domäne nicht unabhängig voneinander falten und dass die Ig-ähnliche Domäne, obwohl sie nicht direkt mit dem Wirtszellrezeptor während der Invasion interagiert, eine kritische Rolle für die in vivo Stabilität des Internalin B spielt. Des weiteren spiegelt die Kooperativität des Übergangs die Integrität der Internalin-Domäne wieder und deutet darauf hin, dass bei beiden Proteinen keine Intermediate vorliegen. Kinetische Messungen über Tryptophanfluoreszenz und Fern-UV Circulardichroismus deuteten auf die Existenz eines relativ stabilen Intermediates auf dem Faltungsweg der LRR-Domäne hin. Faltungskinetiken aus einem in pH 2 denaturierten Zustand zeigten ein reversibles Verhalten und verliefen über ein Intermediat. Eine Erhöhung der Salzkonzentration des sauer-denaturierten Proteins führte zu einer Kompaktierung der entfalteten Struktur und resultierte im Übergang zu einem alternativ gefalteten Zustand. Bei der Internalin-Domäne deuteten kinetische Messungen des Fluoreszenz- und Fern-UV Circulardichroismus-Signals während der Entfaltung möglicherweise auf die Präsenz von zwei Prozessen hin. Der erste langsame Entfaltungsprozess kurz nach dem Übergangsmittelpunkt zeigte eine starke Abhängigkeit von der Temperatur, während der zweite schnellere Prozess der Entfaltung stärker von der Guanidiniumchlorid-Konzentration abhing. Renaturierungskinetiken zeigten das Auftreten von mindestens einem Faltungsintermediat. Kinetische Daten aus Doppelsprungexperimenten lieferten für die Erklärung der langsamen Faltungsphase zunächst keinen Hinweis auf dass Vorliegen einer Prolinisomerisierungsreaktion. Die vollständige Amplitude während der Renaturierung konnte nicht detektiert werden, weswegen von einer zweiten schnellen Phase im Submillisekundenbereich ausgegangen werden kann. Die Ergebnisse der Faltungskinetiken zeigen, dass die InlB-Konstrukte als Modelle für die Untersuchung der Faltung von Solenoidproteinen verwendet werden können. N2 -

To understand the processes of protein structure formation, it is necessary to investigate protein stability and protein folding kinetics. The focus of many folding studies has been directed at small, globular proteins. The larger class of solenoid proteins, including leucine-rich repeat (LRR) and ankyrin proteins, has not been extensively investigated. These proteins contain tandem repeat motifs, and their tertiary structure consists of a regular linear array of modules that stack to form non-globular elongated or supercoiled structures. In the present work, the folding and stability of the central LRR domain of the invasion protein internalin B (InlB241) from the bacterium Listeria monocytogenes was characterized using different biophysical techniques. In addition, the integrity, stability and folding behavior of the so-called internalin-domain (InlB321) was investigated. In this single domain, which is found in all members of the internalin-family, an immunoglobulin (Ig)-like domain is directly fused to the C-terminal end of the LRR domain.

A complete thermodynamic characterization of the stability of both constructs was performed, using chemical- and temperature-induced folding and unfolding transitions. The reversible and cooperative equilibrium transition of InlB241 and InlB321 allowed the use of a two-state model for the description of the data points. The additional Ig-like domain present in InlB321 resulted in an increase of the unfolding free energy (8.8 kcal/mol compared to 4.7 kcal/mol). This resulted both, from a shift of the transition midpoint to higher denaturant concentration, and from an increase in the m-value, the denaturant dependence of the unfolding free energy (9.7 kcal/mol/M compared to 7.1 kcal/mol/M). These observations suggest that the unravelling of the individual structural repeats in the LRR region is a cooperative process and that the tight fusion with the Ig-like domain leads to a dramatically increased stability in vivo without interfering with the functionality of the protein. In addition, the cooperativity of the equilibrium transition reflects the integrity of the internalin-domain, and suggests that both InlB fragments unfold without significantly populated equilibrium intermediates.

Kinetic measurements with tryptophan fluorescence and far-UV circular dichroism are indicative for the existence of a relative stable intermediate on the folding pathway of the LRR domain. Refolding kinetics from an acid-denatured state showed a reversible behavior and passes off an intermediate. An increase in the salt concentration of the acid-denatured protein results in a transition of the unfolded structure to a compact and alternatively folded state. Unfolding kinetics of the internalin-domain measured by fluorescence and far-UV circular dichroism are indicative for the possible presence of two processes. The first slow unfolding process after the transition midpoint showed a strong dependence on temperature, whereas the second and faster unfolding process showed a stronger dependence on the denaturant concentration. Renaturation kinetics indicated the existence of at least one folding intermediate. Preliminary double-mixing experiments revealed no evidence for a rate-limiting proline isomerization reaction. It was not possible to detect the complete amplitude of the renaturation reaction, suggesting existence of a second faster phase occuring in the submillisecond range.

The results on folding kinetics prove the InlB constructs to be suitable models for the investigation of solenoid protein folding by techniques of high structural resolution. KW - Proteinfaltung KW - thermodynamische Stabilität KW - Leucine-Rich Repeat KW - Internalin B KW - Zweizustandsmodell KW - leucine-rich repeat KW - internalin B KW - thermodynamic stability KW - protein folding KW - two-state model Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-2532 ER - TY - THES A1 - Hahn, Robert T1 - Das Blüte-Bestäuber-Netz auf Brachflächen : biozönologische Untersuchung zur Bedeutung von Brachen in einer intensiv genutzten Agrarlandschaft N2 - In der vorliegenden Dissertation wird die Bedeutung von Brachen für Artenvielfalt und Stabilität von Blüte-Bestäuber-Nahrungsnetzen in agrarisch genutzten Landschaften anhand ausgewählter blütenbesuchender Insektengruppen (Syrphidae, Lepidoptera) untersucht. Die Freilandarbeiten fanden von 1998-2000 im Raum der Feldberger Seenlandschaft, Mecklenburg-Vorpommern, statt. Es werden die beiden Hauptnahrungsquellen Nektar und Pollen betrachtet, dabei fanden Untersuchungen zur Intensität der Blüte-Bestäuber-Interaktion auf Stilllegungsflächen, zum flächenbezogenen quantitativen Nektarangebot im Jahresverlauf, zur individuellen Pollennutzung bei Syrphiden und zur Breite und Überlappung der Nahrungsnischen bei den dominanten Arten Episyrphus balteatus, Metasyrphus corollae, Syritta pipiens und Sphaerophoria scripta statt. Im Ergebnis zeigt sich eine hohe Bedeutung der Brachflächen für die Stabilität des Blüte-Bestäuber-Netzes, während die Diversität von anderen, eher landschaftsbezogenen Faktoren abhängig ist. N2 - This dissertation examines the importance of fallow land for the diversity and stability of pollination webs in agricultural landscapes as exemplified by selected groups of anthophilous insects (syrphidae and lepidoptera). The field studies were carried out between 1998 and 2000 in the Feldberg lakeland area in the north-east German State of Mecklenburg-Western Pomerania. Observations were made of nectar and pollen as the two main sources of food. Studies were conducted into the intensity of plant-pollinator interaction in set-aside areas, the site-specific quantity of nectar available during the vegetation period and the individual pollen intake of syrphid flies. Different methods were employed to establish the breadth of the trophic niches among the predominant species (Episyrphus balteatus, Metasyrphus corollae, Syritta pipiens and Sphaerophoria scripta) and the extent to which they overlapped. The studies showed that, while fallow land is very important for the stability of plant-pollinator food webs, their diversity depends on other factors that are more closely related to the landscape. KW - Feldberger Seenlandschaft ; Agrarlandschaft ; Brache ; Samenpflanzen ; Bestäuber ; Artenreichtum KW - Brachfläche KW - Bestäubung KW - Blütenökologie KW - Blüte-Bestäuber-Interaktion KW - Nektar KW - Pollen KW - fallow land KW - pollination KW - flower ecology KW - flower-insect-interaction KW - nectar KW - pollen Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000652 ER - TY - THES A1 - Küster, Frank T1 - Das Lektin aus der Erbse Pisum sativum : Bindungsstudien, Monomer-Dimer-Gleichgewicht und Rückfaltung aus Fragmenten N2 - Das Lektin aus Pisum sativum, der Gartenerbse, ist Teil der Familie der Leguminosenlektine. Diese Proteine haben untereinander eine hohe Sequenzhomologie, und die Struktur ihrer Monomere, ein all-ß-Motiv, ist hoch konserviert. Dagegen gibt es innerhalb der Familie eine große Vielfalt an unterschiedlichen Quartärstrukturen, die Gegenstand kristallographischer und theoretischer Arbeiten waren. Das Erbsenlektin ist ein dimeres Leguminosenlektin mit einer Besonderheit in seiner Struktur: Nach der Faltung in der Zelle wird aus einem Loop eine kurze Aminosäuresequenz herausgeschnitten, so dass sich in jeder Untereinheit zwei unabhängige Polypeptidketten befinden. Beide Ketten sind aber stark miteinander verschränkt und bilden eine gemeinsame strukturelle Domäne. Wie alle Lektine bindet Erbsenlektin komplexe Oligosaccharide, doch sind seine physiologische Rolle und der natürliche Ligand unbekannt. In dieser Arbeit wurden Versuche zur Entwicklung eines Funktionstests für Erbsenlektin durchgeführt und seine Faltung, Stabilität und Monomer-Dimer-Gleichgewicht charakterisiert. Um die spezifische Rolle der Prozessierung für Stabilität und Faltung zu untersuchen, wurde ein unprozessiertes Konstrukt in E. coli exprimiert und mit der prozessierten Form verglichen. Beide Proteine zeigen die gleiche kinetische Stabilität gegenüber chemischer Denaturierung. Sie denaturieren extrem langsam, weil nur die isolierten Untereinheiten entfalten können und das Monomer-Dimer-Gleichgewicht bei mittleren Konzentrationen an Denaturierungsmittel auf der Seite der Dimere liegt. Durch die extrem langsame Entfaltung zeigen beide Proteine eine apparente Hysterese im Gleichgewichtsübergang, und es ist nicht möglich, die thermodynamische Stabilität zu bestimmen. Die Stabilität und die Geschwindigkeit der Assoziation und Dissoziation in die prozessierten bzw. nichtprozessierten Untereinheiten sind für beide Proteine gleich. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch unter nicht-denaturierenden Bedingungen die Untereinheiten zwischen den Dimeren ausgetauscht werden. Die Renaturierung der unprozessierten Variante ist unter stark nativen Bedingungen zu 100 % möglich. Das prozessierte Protein dagegen renaturiert nur zu etwa 50 %, und durch die Prozessierung ist die Faltung stark verlangsamt, der Faltungsprozess ist erst nach mehreren Tagen abgeschlossen. Im Laufe der Renaturierung wird ein Intermediat populiert, in dem die längere der beiden Polypeptidketten ein Homodimer mit nativähnlicher Untereinheitenkontaktfläche bildet. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Renaturierung ist die Assoziation der entfalteten kürzeren Kette mit diesem Dimer. N2 - The lectin from Pisum sativum (garden pea) is a member of the family of legume lectins. These proteins share a high sequence homology, and the structure of their monomers, an all-ß-motif, is highly conserved. Their quaternary structures, however, show a great diversity which has been subject to cristallographic and theoretical studies. Pea lectin is a dimeric legume lectin with a special structural feature: After folding is completed in the cell, a short amino acid sequence is cut out of a loop, resulting in two independent polypeptide chains in each subunit. Both chains are closely intertwined and form one contiguous structural domain. Like all lectins, pea lectin binds to complex oligosaccharides, but its physiological role and its natural ligand are unknown. In this study, experiments to establish a functional assay for pea lectin have been conducted, and its folding, stability and monomer-dimer-equilibrium have been characterized. To investigate the specific role of the processing for stability and folding, an unprocessed construct was expressed in E. coli and compared to the processed form. Both proteins have the same kinetic stability against chemical denaturant. They denature extremely slowly, because only the isolated subunits can unfold, and the monomer-dimer-equilibrium favors the dimer at moderate concentrations of denaturant. Due to the slow unfolding, both proteins exhibit an apparent hysteresis in the denaturation transition. Therefore it has not been possible to determine their thermodynamic stability. For both proteins, the stability and the rates of association and dissociation into processed or unprocessed subunits, respectively, are equal. Furthermore it could be shown that even under non-denaturing conditions the subunits are exchanged between dimers. Renaturation of the unprocessed variants is possible under strongly native conditions with 100 % yield. The processed protein, however, can be renatured with yields of about 50 %, and its refolding is strongly decelerated. The folding process is finished only after several days. During renaturation, an intermediate is populated, in which the longer of the two polypeptide chains forms a homodimer with a native-like subunit interface. The rate limiting step of renaturation is the association of the unfolded short chain with this dimer. KW - Leguminosenlektin KW - Faltung KW - irreversibel KW - Fragmente KW - Prozessierung KW - Assoziation KW - Saccharidbindung KW - Oligomer KW - Untereinheitenautausch KW - Isoformen KW - legume lectin KW - folding KW - irreversible KW - fragments KW - processing KW - association KW - saccharide binding KW - oligomer KW - subunit exchange KW - isoforms Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000612 ER - TY - THES A1 - Krehl, Susanne T1 - Das Selenoprotein Glutathionperoxidase-2 : physiologische Funktion und Einfluss auf die entzündungsassoziierte Colonkarzinogenese T1 - The selenoprotein glutathione peroxidase-2 : physiological function and influence on inflammation triggered coloncarcinogenesis N2 - Bei der Entdeckung der Glutathionperoxidase-2 (GPx2) wurde zunächst davon ausgegangen, dass die Funktion dieses Enzyms im Kryptengrund des Colons einzig in der Reduktion von H2O2 besteht. Im Laufe der weiteren Erforschung zeigte sich, dass GPx2 auch in verschiedenen Tumorgeweben vermehrt exprimiert wird. Dabei wird diskutiert, ob die Wirkung von GPx2 im Tumor eher als pro- oder als antikarzinogen einzustufen ist. Mehrere Experimente in vitro und in vivo zeigten antiinflammatorische Eigenschaften der GPx2. Aufgrund dieser Befunde wird derzeit über weitere Funktionen der GPx2 spekuliert. In dieser Arbeit wurde die physiologische Funktion von GPx2 näher erforscht, dazu wurden Wildtyp- und GPx2-Knockout-Mäuse in Hinblick auf Veränderungen der Enzymexpression und der Colonmorphologie untersucht. Es wurden drei verschiedene Selendiäten verfüttert: selenarmes, selenadäquates und selensupplementiertes Futter. Unter physiologischen Bedingungen ist am Kryptengrund des Colons, innerhalb der proliferierenden Zone, die Mitoserate am höchsten. Der Großteil der apoptotischen Zellen ist hingegen an der Kryptenspitze vorzufinden. Durch den Knockout von GPx2 kam es zu einer signifikanten Erhöhung der Apoptoserate am Kryptengrund. Dabei war der größte Effekt auf selenarmem Futter zu verzeichnen. Hierbei wurde sogar eine Veränderung der Colonmorphologie dokumentiert, da die Verschiebung der Proliferationszone in Richtung Kryptenspitze eine Verlängerung der Krypten nach sich zog. Im Wildtyp wurden keine Apoptosen im Kryptengrund detektiert. GPx1 wird unter physiologischen Bedingungen im Gegensatz zur GPx2 in der Kryptenspitze exprimiert und ist im Selenmangel nicht mehr detektierbar. Der Knockout von GPx2 erhöhte die GPx1-Expression im Kryptengrund auf allen drei Selendiäten. Diese Überexpression von GPx1 am Kryptengrund soll vermutlich den Verlust von GPx2 an dieser Stelle kompensieren. Da jedoch dort die massive Apoptoserate detektiert wurde, kann die GPx1 nicht die komplette Funktion von GPx2 kompensieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Funktion von GPx2 nicht nur in der Reduktion von H2O2 liegt. Vielmehr kann eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase von Zellen postuliert werden. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war die Klärung der Frage, welchen Einfluss GPx2 auf die entzündungsassoziierte Colonkarzinogenese ausübt. In dem hierfür verwendeten AOM/DSS-Model wird der karzinogene Prozess durch Entzündung vorangetrieben. Es erfolgte sowohl im Wildtyp als auch im GPx2-Knockout zum einen die Bewertung des Entzündungsstatus des Colons und zum anderen wurde die Anzahl von ACF und Tumoren verglichen. Das Colon im GPx2-Knockout war wesentlich stärker entzündet als im Wildtyp. Diese Ergebnisse bestätigen die für die GPx2 postulierte antiinflammatorische Funktion. Normalerweise führt eine Erhöhung der Mitoseanzahl zur Regeneration des entzündeten Gewebes. Jedoch beeinflusst der Verlust von GPx2 vermutlich den Ablauf der Entzündung, indem beispielsweise die Regeneration des Gewebes durch die enorm hohe Apoptoserate am Kryptengrund verlangsamt wird. Des Weiteren hatten sich im GPx2-Knockout tendenziell mehr Tumore entwickelt. Somit korrelierte die Entzündung des Colons mit der Entwicklung von Tumoren. Der Verlust von GPx2 begünstigte vermutlich sowohl die Tumorinitiation als auch die Tumorprogression. Allerdings stimulierte die Expression von GPx2 ebenfalls das Tumorwachstum. Es kann geschlussfolgert werden, dass eine adäquate GPx2-Expression vor Entzündung schützt und somit das Risiko für Colonkrebs senkt. Ob GPx2 aber insgesamt pro- oder antikarzinogen wirkt, hängt vermutlich vom Stadium des Colonkarzinogenese ab. N2 - Since the detection of glutathione peroxidase-2 (GPx2) it was assumed that reducing hydroperoxides is the only function of this enzyme in the crypt ground of the colon. But further studies showed that GPx2 is also highly expressed in tumor tissue. However, it is not known whether it acts a pro- or anticarcinogenic manner at this site. In vitro and in vivo experiments elucidate antiinflammatory features of GPx2, based on these findings additional functions of GPx2 are discussed. In this dissertation the physiological function of GPx2 was investigated. For this purpose in wild type and GPx2-knockout mice, changes of enzyme expression and colon morphology were analyzed. The mice were fed three diets containing different selenium concentrations: selenium deficient, selenium adequate and selenium supplemented. Under physiological conditions the mitosis rate is highest in the proliferating zone in the crypt ground of the colon. The majority of apoptotic cells are located at the tip of the crypt. The knockout of GPx2 significantly increased the rate of apoptosis in the crypt ground. The greatest effect was documented on the selenium deficient diet. Here, changes of the colonic morphology were detectable, because the shift of the proliferating zone towards the tip of the crypt lead to an extension of the crypts. In the wild type mice no apoptotic cells were detected on the crypt ground. Under physiological conditions GPx1, in contrast to GPx2, is mainly expressed on the top of the crypt, and this enzyme is no longer detectable under selenium deficiency. The knockout of GPx2 increased the expression of GPx1 in the crypt ground of the colon on all three selenium diets. It is likely that this over expression of GPx1 compensates for the loss of GPx2. However the massive apoptotic rate in the crypt ground shows that GPx1 can not compensate the complete function of GPx2. These results elucidate that GPx2 not only functions as a hydroperoxide reducer, but that it is also important for the maintenance of the stem cell character and the homeostasis of cells. The question if GPx2 influences the inflammation triggered by the coloncarcinogenic process was next assessed in this dissertation. Therefore the AOM/DSS model was used to trigger the carcinogenic process through inflammation. The amount of aberrant crypt foci (ACF) and tumors in the colon were analyzed in both wild type and GPx2-knockout mice. However initially the inflammation status was compared between the two genotypes. The inflammation of the colon was stronger in the GPx2-knockout mice than in wild type. These results support the postulated antiinflammatory features of GPx2. The loss of GPx2 may influence the inflammation process by decelerating the regeneration of the tissue caused by the increased apoptotic rate in the proliferating zone. Additionally, the GPx2-knockout mice developed more tumors in the colon. Therefore the inflammation of the colon correlated with the development of tumors. The loss of GPx2 may have enhanced both tumor initiation and progression. But the expression of GPx2 also stimulated the growth of tumors. These results indicate that an adequate GPx2-expression can protect from colonic inflammation, and therefore decrease the risk of developing colon cancer. Whether GPx2 acts in a pro- or anticarcinogenic manner appears to depend on the state of the carcinogenic process. KW - Glutathionperoxidase-2 GPx2 KW - Apoptose KW - Colonkrebs KW - Entzündung KW - Selen KW - glutathione peroxidase-2 GPx2 KW - apoptosis KW - colon cancer KW - inflammation KW - selenium Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-50220 ER -