TY - THES A1 - Ringleb, Jennifer T1 - Identifikation antigener Determinanten des ZPB2 Proteins der Hauskatze und Charakterisierung ihrer kontrazeptiven und immunogenen Eigenschaften N2 - Die immunologische Kontrazeption mittels Zona pellucida (ZP) Proteinen gilt als vielversprechender Ansatz für die Reproduktionskontrolle verwilderter Haus- und Wildtierbestände. Da die Applikation von nativer ZP mit Nebenwirkungen verbunden ist, wird die Verwendung einzelner ZP Peptide als Bestandteil kontrazeptiver Vakzine als besonders aussichtsreich erachtet. Das Prinzip dieser nebenwirkungsfreien ZP Immunisierung ist die gezielte Trennung der Entzündungsreaktionen auslösenden T-Zell-Epitope der ZP von den kontrazeptiv wirkenden B-Zell-Epitopen. Niedermolekulare synthetische oder rekombinante Peptide allein sind gering immunogen und können somit keine ausreichende Immunantwort induzieren. Die Verwendung von Peptiden für die immunologische Kontrazeption erfordert daher ein „Vakzin-Design“, d. h. die gezielte Kombination der Peptide mit immunstimulierenden Substanzen (Liposomen, Carrierproteinen, Adjuvantien). Zielstellung der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des Potentials synthetischer Peptide für die Immunokontrazeption von verwilderten Hauskatzen (Felis catus). Dazu wurden zunächst relevante B-Zell-Epitope des felinen Zona pellucida Proteins, ZPB2, identifiziert und synthetisiert. Zwei der synthetischen Peptide (P3, P6) wurden zur Herstellung von Antikörpern an BSA konjugiert und zusammen mit Freundschem Adjuvans in Ratten verimpft. Die kontrazeptive Relevanz beider Peptide sowie der Ratten Anti-Peptid Antiseren wurde im in vitro Befruchtungssystem der Hauskatze geprüft. Zur Untersuchung der Immunogenität der Peptide in der Zielspezies Hauskatze erfolgte die Entwicklung von Vakzin-Prototypen für die einmalige Applikation. Neben der Eruierung der Stärke und Dauer der Immunantwort wurde durch Verpaarung der Tiere auch das kontrazeptive Potential in vivo abgeschätzt. N2 - Immunological contraception based on zona pellucida (ZP) proteins is regarded as a promising approach for the control of reproduction in feral domestic and wild animals. Because application of native ZP caused adverse reactions, utilization of single ZP peptides as elements of contraceptive vaccines were considered to bear good prospects. The principle of this ZP immunization is based upon a systematic separation of inflammation triggering T-cell epitopes from the contraceptive B-cell epitopes. The present study evaluates the immunogenicity and contraceptive potential of synthetic feline ZPB2 peptides for immunocontraception in cats (Felis catus). First of all, relevant B-cell epitopes were identified and synthesized. In order to generate antipeptide antibodies two peptides (P3, P6) were chosen and coupled to BSA. Rats were immunized with the conjugation product combined with Freund′s complete adjuvant. The contraceptive efficacy of both peptides and of the anti-peptide antibodies generated were determined using in vitro fertilization of feline oocytes (IVF). To evaluate the peptides immunogenicity in the target species (cat), vaccine-prototypes were developed for a single application protocol. The strength and duration of the immune response was analyzed. Additionally, cats were mated to assess the contraceptive potential of the vaccines in vivo. T2 - Identifikation antigener Determinanten des ZPB2 Proteins der Hauskatze und Charakterisierung ihrer kontrazeptiven und immunogenen Eigenschaften KW - Zona pellucida KW - Peptid KW - Katze KW - Kontraception KW - zona pellucida KW - peptide KW - cat KW - contraception Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001901 ER - TY - THES A1 - Gehmlich, Katja T1 - Strukturen der Kraftübertragung im quergestreiften Muskel : Protein-Protein-Wechselwirkungen und Regulationsmechanismen T1 - Structures of force transduction in cross-striated muscle tissues : protein-protein interactions and mechanisms of their regulation N2 - Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen Signaltransduktionsprozesse in den Strukturen der Kraftübertragung quergestreifter Muskelzellen, d. h. in den Costameren (Zell-Matrix-Kontakten) und den Glanzstreifen (Zell-Zell-Kontakten der Kardiomyozyten).Es ließ sich zeigen, dass sich die Morphologie der Zell-Matrix-Kontakte während der Differenzierung von Skelettmuskelzellen dramatisch ändert, was mit einer veränderten Proteinzusammensetzung einhergeht. Immunfluoreszenz-Analysen von Skelettmuskelzellen verschiedener Differenzierungsstadien implizieren, dass die Signalwege, welche die Dynamik der Fokalkontakte in Nichtmuskelzellen bestimmen, nur für frühe Stadien der Muskeldifferenzierung Relevanz haben können. Ausgehend von diesem Befund wurde begonnen, noch unbekannte Signalwege zu identifizieren, welche die Ausbildung von Costameren kontrollieren: In den Vorläuferstrukturen der Costamere gelang es, eine transiente Interaktion der Proteine Paxillin und Ponsin zu identifizieren. Biochemische Untersuchungen legen nahe, dass Ponsin über eine Skelettmuskel-spezifische Insertion im Carboxyterminus das Adapterprotein Nck2 in diesen Komplex rekrutiert. Es wird vorgeschlagen, dass die drei Proteine einen ternären Signalkomplex bilden, der die Umbauvorgänge der Zell-Matrix-Kontakte kontrolliert und dessen Aktivität von mitogen activated protein kinases (MAPK) reguliert wird.Die Anpassungsvorgänge der Strukturen der Kraftübertragung an pathologische Situtation (Kardiomyopathien) in der adulten quergestreiften Muskulatur wurden ausgehend von einem zweiten Protein, dem muscle LIM protein (MLP), untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein mutiertes MLP-Protein, das im Menschen eine hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) auslöst, strukturelle Defekte aufweist und weniger stabil ist. Weiterhin zeigte dieses mutierte Protein eine verringerte Bindungsfähigkeit an die beiden Liganden N-RAP und alpha-Actinin. Die molekulare Grundlage der HCM-verursachenden Mutationen im MLP-Gen könnte folglich eine Veränderung der Homöostase im ternären Komplex MLP – N-RAP – alpha-Actinin sein. Die Expressionsdaten eines neu generierten monoklonalen MLP-Antikörpers deuten darauf hin, dass die Funktionen des MLP nicht nur für die Integrität des Myokards, sondern auch für die der Skelettmuskulatur notwendig sind. N2 - The cell-matrix-contacts (costameres) and cell-cell-contacts (intercalated discs of cardiomyocytes) of cross-striated muscle cells transmit mechanical forces to the exterior. On top of this mechanical function, both structures have been implied to be involved in signal transduction processes.Dramatic morphological changes in the overall structure of cell-matrix-contacts of skeletal muscle cells were revealed during differentiation. Moreover, this reorganisation was accompanied by alterations in protein composition. Immunofluorescence microscopy indicated that signalling pathways which control the dynamics of focal contacts in non-muscle cells seem to be important only for early differentiation stages of skeletal muscle cells. To explore novel signalling pathways involved in regulating the formation of costameres, signalling molecules engaged were identified. Thus, paxillin and ponsin transiently interact at the precursors of costameres during muscle development. In addition, biochemical data indicate that a skeletal muscle specific module in the carboxyterminal part of ponsin can recruit the adapter protein Nck2 to this complex. Hence, the three proteins might form a ternary signalling complex involved in controlling the reorganisation of cell-matrix-contacts. Apparently, the activity of this signalling complex is regulated by mitogen activated protein kinases (MAPK).A second approach has focussed on adaptational processes of the same structures observed in pathological situations. In particular, the role of muscle LIM protein (MLP) in hypertrophic cardiomyopathy (HCM) was investigated. It was shown that a HCM-causing mutant MLP protein fails to fold properly and that the consequent loss of stability is reflected in altered binding properties: the mutant MLP protein shows decreased binding to both N-RAP and alpha-actinin. Hence, the molecular basis for HCM-causing mutations in the MLP gene might be an altered homeostasis of the ternary complex MLP – N-RAP – alpha-actinin. Increasing evidence indicates that the functions of MLP are required not only for the integrity of the myocardium. In addition, MLP seems to have regulatory functions in skeletal muscle tissues. KW - Herzmuskelkrankheit KW - Quergestreifte Muskulatur KW - Protein-Protein-Wechselwirkung KW - Phosphorylierung KW - Costamer KW - Fokalkontakt KW - Zell-Matrix-Kontakt KW - Ponsin KW - Muscle LIM Protein (MLP) KW - protein-protein interactions KW - costamere KW - focal adhesion KW - ponsin KW - cross-striated muscle cells Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-2576 ER - TY - THES A1 - Himmel, Mirko T1 - Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen und der in vivo Phosphorylierung des Sarkomerproteins Myomesin T1 - Analysis of Protein-Protein Interactions and in vivo Phosphorylation of the Sarcomeric Protein Myomesin N2 - Für ein tiefergehendes Verständnis von Entwicklung und Funktion der quergestreiften Muskulatur ist eine Betrachtung der am Aufbau der Myofibrillen, den kontraktilen Organellen, beteiligten Proteine essentiell. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Myomesin, einem Protein der sarkomeren M-Bande. Zunächst wurde die cDNA des humanen Myomesins vollständig kloniert, sequenziert und nachfolgend die komplette Größe der aminoterminalen Kopfdomäne bestimmt. Es konnte gezeigt werden, daß Myomesin in vitro mit den Domänen 1 und 12 an Myosin bindet. Die muskelspezifische Isoform der Kreatinkinase bindet an die Domänen 7 und 8. Stimulations- und Inhibitionsexperimente belegen, daß Myomesin an Serin 618 in vivo durch die Proteinkinase A phosphoryliert wird und daß diese Phosphorylierung durch Aktivierung beta2-adrenerger Rezeptoren stimulierbar ist. In Muskelgewebeproben von Patienten, die an der Hypertrophen Kardiomyopathie, einer genetisch bedingten Herzmuskelkrankheit, erkrankt sind, konnte mit einem neu hergestellten phosphorylierungsabhängigen Antikörper eine Verminderung der Menge phosphorylierten Myomesins nachgewiesen werden. Mögliche Ursachen werden diskutiert. Myomesin bildet Dimere, wie durch hefegenetische und biochemische Experimente gezeigt werden konnte. Die Dimerisierung von Myomesin könnte eine zentrale Rolle für den Einbau der Myosinfilamente in die naszierende Myofibrille haben. Anhand der gewonnenen Daten wurde ein verbessertes Modell der zentralen M-Bande erstellt. N2 - A deep understanding of the development and function of the sarcomeric muscle depends on the careful study of proteins involved in the assembly of myofibrills, the contractile organelles in cross-striated muscle. This thesis deals with the sarcomeric M-band protein myomesin. First, the complete cDNA of human myomesin was cloned, sequenced, and subsequently the size of the aminoterminal head domain of myomesin was determined. Myomesin binds to myosin in vitro via domains 1 and 12. Musclespecific creatine kinase is binding to the domains 7 and 8 of myomesin. Stimulation and inhibition experiments revealed, that serin 618 in human myomesin is phosphorylated in vivo by protein kinase A and that this phosphorylation can be stimulated by activation of beta2-adrenergic receptors. In muscle tissue of patients showing symptoms of the hypertrophic cardiomyopathy, a cardiac disease caused by genetic defects, the amount of phosphorylated myomesin was lowered as detected by a phosphospecific antibody which was established new. Myomesin dimerizes as shown by yeast two hybrid and biochemical experiments. Myomesin dimerization could be a central point in myofibrillogenesis, when myosin filaments were incorporated in nascent myofibrills. Taking all the data together, an improved model of the central M-band was developed. KW - Proteine KW - Myofibrille KW - Sarkomer KW - Phosphorylierung KW - M-Bandenmodell KW - PKA KW - M-band model KW - PKA Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5153 ER - TY - THES A1 - Schwonbeck, Susanne T1 - Analyse von Single Nucleotide Polymorphisms an Glas-Oberflächen N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer SNP-Genotypisierungsmethode mit auf Mikroarrays immobilisierten PCR-Produkten. Für die Analyse wurde ein faseroptischer Affinitätssensor bzw. ein Durchfluss-Biochip-Scanner mit integrierter Fluoreszenzdetektion verwendet. An den immobilisierten Analyten (PCR-Produkten) wurde eine Fluoreszenzoligonukleotidsonde hybridisiert und anschließend die Dissoziation der Sonde im Fluss verfolgt. Die Diskriminierung von Wildtyp- und Mutanten-DNA erfolgte durch die kinetische Auswertung der Dissoziationskurven sowie durch die Analyse der Fluoreszenzintensität. Die Versuche am faseroptischen Affinitätssensor zeigten, dass DNA-DNA-Hybride sowohl von Oligonukleotiden als auch von PCR-Produkten ein typisches Dissoziationsverhalten aufweisen, wobei fehlgepaarte Hybride eine signifikant schnellere Dissoziation zeigen als perfekt passende Hybride. Dieser Geschwindigkeitsunterschied lässt sich durch den Vergleich der jeweiligen kinetischen Geschwindigkeitskonstanten kD quantitativ erfassen. Da die Kopplung des Analyten an der Chipoberfläche sowie die Hybridisierungs- und Dissoziationsparameter essentiell für die Methodenentwicklung war, wurden die Parameter für ein optimales Spotting und die Immobilisierung von PCR-Produkten ermittelt. Getestet wurden die affine Kopplung von biotinylierten PCR-Produkten an Streptavidin-, Avidin- und NeutrAvidin-Oberflächen sowie die kovalente Bindung von phosphorylierten Amplifikaten mit der EDC/Methylimidazol-Methode. Die besten Ergebnisse sowohl in Spotform und -homogenität als auch im Signal/Rausch-Verhältnis wurden an NeutrAvidin-Oberflächen erreicht. Für die Etablierung der Mikroarray-Genotypisierungsmethode durch kinetische Analyse nach einem Hybridisierungsexperiment wurden Sondenlänge, Puffersystem, Spotting-Konzentration des Analyten sowie Temperatur optimiert. Das Analysensystem erlaubte es, PCR-Produkte mit einer Konzentration von 250 ng/µl in einem HEPES-EDTA-NaCl-Puffer auf mit NeutrAvidin beschichtete Glasträger zu spotten. In den anschließenden Hybridisierungs- und Dissoziationsexperimenten bei 30 °C konnte die Diskriminierung von homocygoter Wildtyp- und homocygoter Mutanten- sowie heterocygoter DNA am Beispiel von Oligonukleotid-Hybriden erreicht werden. In einer Gruppe von 24 homocygoten Patienten wurde ein Polymorphismus im SULT1A1-Gen analysiert. Sowohl durch kinetische Auswertung als auch mit der Analyse der Fluoreszenzintensität wurde der Genotyp der Proben identifiziert. Die Ergebnisse wurden mit dem Referenzverfahren, der Restriktionschnittstellenanalyse (PCR-RFLP) validiert. Lediglich ein Genotyp wurde falsch bestimmt, die Genauigkeit lag bei 96%. In einer Gruppe von 44 Patienten wurde der Genotyp eines SNP in der Adiponectin-Promotor-Region untersucht. Nach Vergleich der Analysenergebnisse mit denen eines Referenzverfahrens konnten lediglich 14 der untersuchten Genotypen bestätigt werden. Ursache für die unzureichende Genauigkeit der Methode war vor allem das schlechte Signal/Rausch-Verhältnis. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das in dieser Arbeit entwickelte Analysesystem für die Genotypisierung von Einzelpunktmutationen geeignet ist, homocygote Patientenproben zuverlässig zu analysieren. Prinzipiell ist das auch bei heterocygoter DNA möglich. Da nach aktuellem Kenntnisstand eine SNP-Analysemethode an immobilisierten PCR-Produkten noch nicht veröffentlicht wurde, stellt das hier entwickelte Verfahren eine Alternative zu bisher bekannten Mikroarray-Verfahren dar. Als besonders vorteilhaft erweist sich der reverse Ansatz der Methode. Der hier vorgestellte Ansatz ist eine kostengünstigere und weniger hoch dimensionierte Lösung für Fragestellungen beispielsweise in der Ernährungswissenschaft, bei denen meist eine mittlere Anzahl Patienten auf nur einige wenige SNPs zu untersuchen ist. Wenn es gelingt, durch die Weiterentwicklung der Hardware bzw. weiterer Optimierung, eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses und damit die Diskriminierung von heterocygoter DNA zu erreichen, kann diese Methode zukünftig bei der Analyse von mittelgroßen Patientengruppen alternativ zu anderen Genotypisierungsmethoden verwendet werden. N2 - The aim of this thesis was the development of a SNP genotyping method involving PCR products immobilised on microarrays. For the analysis a fibre optic affinity biosensor and a flow-through biochip scanner were used. Fluorescent probes were hybridized with the immobilised PCR products. In order to start the dissociation process the surface was rinsed with buffer and the fluorescence intensity was measured. Two different cases were studied: First, the full-matched DNA hybrid (wildtyp single strand with complementary wildtype single strand), second the mis-matched hybrid (wildtype single strand and mutant single strand). After determinating the reaction rates (kD) as kinetic parameter the kD values of both cases were compared. The experiments showed a significant difference in the kD value of the full- and the mis-match hybrids. Therefore, mutant and wildtype DNA were discriminated by kinetic analysis of the dissociation process and analysis of the fluorescence intensity. To set up the complete analysis process the reaction parameters like coupling of the PCR products had to be optimised. Both affininty coupled (streptavidin, neutravidin, avidin - biotin) and covalent methods (EDC/methylimidazol) were carried out. Best results in spot homogeinity and spot appearance were obtained with coupling of biotinylated PCR products on neutravidin coated chip surfaces. Additionally, the length of the probe, the spotting concentration, the spotting buffer and the reaction temperature were optimised. In the optimised analysis PCR products (250 µg/µl) were spotted onto neutravidin coated surfaces. The hybridisation and dissociation processes were carried out at 30°C. A HEPES-EDTA-NaCl buffer was used for spotting, diluting of the fluorescent probe and rinsing the microarray surface. A fluorescent probe was used with 13 nucleotides in length. The mis- or full-matching base indicating the polymorphism was located in the center position of the probe. The analysis system was tested with the genomic DNA of a group of 24 homocygote individuals with a SNP in the SULT1A1 gene region. The hybridisation and dissociation processes were carried out and the reaction rates were determinated. Subsequently after the analysis in the flow-through biochip scanner the fluorescence intensity of the spots were measured. The results showed very good comparability with results of a PCR-RFLP analysis (one false genotype). Additionally, a group of 44 heterocygote DNA samples with one SNP in the adiponectin promotor region were also genotyped. Compared to a reference method only 14 genotypes were correctly determined. This was mostly due to a low signal-noise-ratio and needs to be further investigated. Besides the problem in analysing heterocygote DNA samples the developed analysis system is very useful for genotyping SNP in homocygote DNA samples. The successful analysis of heterocygote sample is principally possible and with further investigations/optimisation, a better analysis should be possible. The most important advantage of the developed method is the reverse approach of binding PCR products at the surface instead of oligonucleotides. This allows the parallel genotyping of several individuals. Other advantages include low costs and medium sized dimensions in terms of throughput. KW - Einzelbasenaustausch KW - SNP KW - Mikrochip KW - DNA-Chip KW - SULT1A1 KW - Adiponectin KW - kinetische Analyse KW - Dissoziation KW - Durchfluß-Biochip-Scanner KW - Fließsystem KW - single nucleotide polymorphisms KW - SNP KW - microarray KW - DNA KW - kinetic analysis KW - dissociation KW - SULT1A1 KW - flow-through biochip scanner Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001853 ER - TY - THES A1 - Pellengahr, Klaus T1 - Charakterisierung von ausgewählten Protein-Phosphatasen und MATE-Proteinen aus Arabidopsis thaliana T1 - Characterisation of Protein-Phosphatases and MATE-Proteins of Arabidopsis thaliana N2 - Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression der Protein Phosphatase-gene TOPP1, TOPP2, TOPP5, STH1 und STH2 analysiert. Alle fünf ausgewählten Gene kodieren für PP des PP1/PP2A-Typs. Es wurde untersucht, ob homologen PP-Isoformen individuelle Expressionsmuster zugewiesen werden konnten. Besonderes Augenmerk richtete sich dabei auf die Expression von PP-Genen in den Schließzellen von A. thaliana. In mehreren Inhibitorstudien wurde beschrieben, dass PP1/PP2A-Proteine eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion pflanzlicher Schließzellen spielen. Bisher konnte allerdings noch keine der entsprechenden katalytischen Untereinheiten auf molekularer Ebene identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum ersten Mal nachgewiesen, dass mit TOPP1 ein Protein des PP1-Typs präferenziell in den Schließzellen von A. thaliana exprimiert wird. Ein Vergleich der Genexpression von TOPP1, TOPP2 und TOPP5 zeigte für die drei homologen Gene sehr Isoform-spezifische Expressionsmuster. Dies war ein deutlicher Hinweis, dass diese eng verwandten PP trotz großer Übereinstimmung auf Aminosäureebene vermutlich unterschiedliche Funktionen in planta haben. Die Untersuchung der Genexpression von STH1 und STH2 zeigte, dass die fast identischen Proteine zum Teil in unterschiedlichen Geweben vorkommen. Die Transkripte der beiden Gene, welche eine eigene Untergruppe von PP2A-verwandten Sequenzen bilden, konnten aus EF isoliert werden. Der in dieser Arbeit entwickelte Screeningansatz ermöglichte es, die sehr ähnlichen cDNA-Fragmente eindeutig voneinander zu unterscheiden. Die gefundenen Isoform-spezifischen Expressionsmuster waren ein deutlicher Hinweis auf unterschiedliche Funktionen in planta. Zur weiteren Untersuchung der PP-Funktionen in planta wurden Pflanzen mit veränderter Genaktivität von TOPP2 oder STH1 untersucht. In Pflanzen mit RNAi-vermittelter Reduktion des TOPP2-Transkriptgehalts ließ sich ein deutlich verändertes Blattwachstum beobachten. Die eingerollten oder asymmetrisch entwickelten Blätter waren vermutlich ein Hinweis, dass diese PP1-Isoform auch in A. thaliana eine Rolle bei der Zellteilung spielt. Für TOPP2-Expression in Hefen wurde diese Funktion schon nachgewiesen. Die Analyse von Insertions-mutanten mit T-DNA Insertionen in beiden STH1-Allelen waren neben den Expressions-studien ein weiterer Hinweis, dass sich STH1 nicht funktionell durch STH2 ersetzen lässt. Die Experimente in dieser Arbeit zeigten, dass das Fehlen der STH1-Genaktivität zu einem deutlichen Blattphänotyp mit gezahnten Blatträndern führte. Für STH2-Insertionsmutanten wurde dieses veränderte Wachstum nicht beschrieben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das Gen NIC1, welches für ein MATE-Membranprotein kodiert, identifiziert und charakterisiert. Die Sequenzierung des Genoms von A. thaliana hatte gezeigt, dass mindestens 56 MATE-Gene in dieser Pflanze vorhanden sind. Zum Zeitpunkt der Identifikation von NIC1 war keines dieser Gene charakterisiert. Außer für das MATE-Protein ERC1 aus S. cerevisiae gab es keine Studien zu eukaryotischen Mitgliedern dieser großen Familie von Membranproteinen. Anhand NIC1 wurden heterologe Expressionssysteme zur funktionellen Charakterisierung von MATE-Proteinen aus Pflanzen etabliert. Die cDNA von NIC1 wurde nach ihrer Klonierung in X. laevis Oozyten und S. cerevisiae exprimiert. In S. cerevisiae erhöhte die NIC1-Expression die Lithumtoleranz der Hefen und führte zu einer Verminderung der Natriumtoleranz. Parallele Versuche mit NIC2 und NIC4 (in den Diplomarbeiten von Blazej Dolniak und Mandy Kursawe) zeigten, dass auch diese beiden Proteine die Salztoleranz von S. cerevisiae beeinflussten. Während NIC2 die Lithium- und Natriumtoleranz erhöhte, führte NIC4-Expresion zu einer höheren Sensibilität gegenüber diesen beiden Kationen. Die unterschiedlichen Eigenschaften der drei homologen Proteine zeigten sich auch bei ihrer Expression in X. laevis Oozyten. NIC1 induzierte in den Oozyten auswärts gerichtete Chloridströme, die spannungsabhängig waren und durch mikromolare Konzentrationen der trivalenten Kationen Lanthan oder Gadolinium inhibiert werden konnten. NIC4 induzierte Barium-inhibierbare Kaliumströme, die spannungsunabhängig waren. Für NIC2 ließ sich in diesem Expressionssystem keine Aktivität detektieren. Zur Untersuchung der NIC1-Funktion in planta wurde die Genaktivität in transgenen Pflanzen lokalisiert und reduziert. Die NIC1-Genexpression war hauptsächlich in den vaskulären Geweben der Pflanze detektierbar und einer Verminderung des NIC1-Transkriptgehalts beeinflusste die Entwicklungsgeschwindigkeit der Pflanzen. Sie entwickelten sich deutlich langsamer als der parallel kultivierte Wildtyp. Der deutliche Phänotyp bei Veränderung der Genaktivität von nur einem der mindestens 56 vorhandenen MATE-Gene in A. thaliana zeigte, dass vermutlich keine weitere MATE-Isoform in der Lage ist, die Funktion von NIC1 zu übernehmen. N2 - Gene expression analysis of the protein phosphatase (PP) genes, TOPP1, TOPP2, TOPP5, STH1 and STH2, of Arabidopsis thaliana was investigated in the first part of this thesis. All five genes encode PP of subgroups PP1 or PP2A. It was determined that homologous isoforms show individual and differing expression patterns. The PP-expression in guard cells was analysed further, because previous inhibitor studies showed an important influence of PP1/PP2A on signal transduction processes in these specialised cells. The previous studies had not addressed molecular identification of the inhibited PP1-/PP2A-subunits. This work demonstrates for the first time a preferential expression of a PP1 isoform, TOPP1, in guard cells. Further analysis of TOPP1, TOPP2 and TOPP5 gene expression also revealed isoform-specific expression patterns, suggesting non-redundant functions in planta. Characterisation of the nearly identical PP2A-related genes, STH1 and STH2, also revealed individual expression patterns. An established screening approach (this work) for the identification of PP-genes from EF (epidermal fragments; a preparation enriched for guard cells) made it possible to distinguish the cDNAs of STH1 and STH2. The two genes form a subgroup of PP2A-related sequences. Differences in their expression patterns suggest that STH1 and STH2 have different functions in A. thaliana. The analysis of plants with altered gene expression of TOPP2 and STH1 gave further insights into the roles of individual PP isoforms. The RNAi-mediated reduction of TOPP2-expression led to changed morphology of leaves, which showed curling and asymmetric development. The reason for this phenotype is probably due to changes of the cell cycle in certain parts of the leaf. Previous studies have already shown that heterologously expressed TOPP2 complements yeast cell cycle mutants. The selection and characterisation of plants with insertions in both STH1-allels revealed the individual roles of STH1 and STH2 in planta. Although STH2 was not affected, plants developed an extreme phenotype with reduced growth and altered leave shape. Previous studies with STH2 loss-of-function mutants did not show this morphology. The second part of this thesis includes the identification and characterisation of a MATE (multidrug and toxic extrusion) membrane protein in plants. Described is NIC1, the first of at least 56 MATE proteins in A. thaliana. Indeed a study of the MATE protein, ERC1, of Saccharomyces cerevisiae was the only description of a eukaryotic member of this large family of membrane proteins. KW - Biologie KW - Molekularbiologie KW - molecular biology Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-2500 ER - TY - THES A1 - Freiberg, Alexander T1 - Das "Leucine-Rich Repeat" im Invasionsprotein Internalin B : Stabilität und Faltung eines Solenoidproteins T1 - The leucine-rich repeat from internalin B : stability and folding of a solenoid protein N2 - Für das Verständnis der Strukturbildung bei Proteinen ist es wichtig, allgemein geltende Prinzipien der Stabilität und Faltung zu verstehen. Bisher wurde viel Arbeit in die Erörterung von Gesetzmäßigkeiten zu den Faltungseigenschaften von globulären Proteinen investiert. Die große Proteinklasse der solenoiden Proteine, zu denen z. B. Leucine-Rich Repeat- (LRR-) oder Ankyrin-Proteine gehören, wurde dahingegen noch wenig untersucht. Die Proteine dieser Klasse sind durch einen stapelförmigen Aufbau von sich wiederholenden typischen Sequenzeinheiten gekennzeichnet, was in der Ausbildung einer elongierten Tertiärstruktur resultiert. In der vorliegenden Arbeit sollte versucht werden, die Stabilität und Faltung eines LRR-Proteins mittels verschiedener biophysikalischer Methoden zu charakterisieren. Als Untersuchungsobjekt diente die für die Infektion ausreichende zentrale LRR-Domäne des Invasionsproteins Internalin B (InlB241) des Bakteriums Listeria monocytogenes. Des weiteren sollten die Integrität und die Stabilitäts- und Faltungseigenschaften der sogenannten Internalin-Domäne (InlB321) untersucht werden. Hierbei handelt es sich um die bei allen Mitgliedern der Internalinfamilie vorkommende Domäne, welche aus einer direkten Fusion des C-terminalen Endes der LRR-Domäne mit einer Immunglobulin (Ig)-ähnlichen Domäne besteht. Von beiden Konstrukten konnte eine vollständige thermodynamische Charakterisierung, mit Hilfe von chemisch- bzw. thermisch-induzierten Faltungs- und Entfaltungsübergängen durchgeführt werden. Sowohl InlB241 als auch InlB321 zeigen einen reversiblen und kooperativen Verlauf der chemisch-induzierten Gleichgewichtsübergänge, was die Anwendung eines Zweizustandsmodells zur Beschreibung der Daten erlaubte. Die zusätzliche Ig-ähnliche Domäne im InlB321 resultierte im Vergleich zum InlB241 in einer Erhöhung der freien Enthalpie der Entfaltung (8.8 kcal/mol im Vergleich zu 4.7 kcal/mol). Diese Stabilitätszunahme äußerte sich sowohl in einer Verschiebung des Übergangsmittelpunktes zu höheren Guanidiniumchlorid-Konzentrationen als auch in einer Erhöhung der Kooperativität des Gleichgewichtsübergangs (9.7 kcal/mol/M im Vergleich zu 7.1 kcal/mol/M). Diese Beobachtungen zeigen dass die einzelnen Sequenzeinheiten der LRR-Domäne nicht unabhängig voneinander falten und dass die Ig-ähnliche Domäne, obwohl sie nicht direkt mit dem Wirtszellrezeptor während der Invasion interagiert, eine kritische Rolle für die in vivo Stabilität des Internalin B spielt. Des weiteren spiegelt die Kooperativität des Übergangs die Integrität der Internalin-Domäne wieder und deutet darauf hin, dass bei beiden Proteinen keine Intermediate vorliegen. Kinetische Messungen über Tryptophanfluoreszenz und Fern-UV Circulardichroismus deuteten auf die Existenz eines relativ stabilen Intermediates auf dem Faltungsweg der LRR-Domäne hin. Faltungskinetiken aus einem in pH 2 denaturierten Zustand zeigten ein reversibles Verhalten und verliefen über ein Intermediat. Eine Erhöhung der Salzkonzentration des sauer-denaturierten Proteins führte zu einer Kompaktierung der entfalteten Struktur und resultierte im Übergang zu einem alternativ gefalteten Zustand. Bei der Internalin-Domäne deuteten kinetische Messungen des Fluoreszenz- und Fern-UV Circulardichroismus-Signals während der Entfaltung möglicherweise auf die Präsenz von zwei Prozessen hin. Der erste langsame Entfaltungsprozess kurz nach dem Übergangsmittelpunkt zeigte eine starke Abhängigkeit von der Temperatur, während der zweite schnellere Prozess der Entfaltung stärker von der Guanidiniumchlorid-Konzentration abhing. Renaturierungskinetiken zeigten das Auftreten von mindestens einem Faltungsintermediat. Kinetische Daten aus Doppelsprungexperimenten lieferten für die Erklärung der langsamen Faltungsphase zunächst keinen Hinweis auf dass Vorliegen einer Prolinisomerisierungsreaktion. Die vollständige Amplitude während der Renaturierung konnte nicht detektiert werden, weswegen von einer zweiten schnellen Phase im Submillisekundenbereich ausgegangen werden kann. Die Ergebnisse der Faltungskinetiken zeigen, dass die InlB-Konstrukte als Modelle für die Untersuchung der Faltung von Solenoidproteinen verwendet werden können. N2 -

To understand the processes of protein structure formation, it is necessary to investigate protein stability and protein folding kinetics. The focus of many folding studies has been directed at small, globular proteins. The larger class of solenoid proteins, including leucine-rich repeat (LRR) and ankyrin proteins, has not been extensively investigated. These proteins contain tandem repeat motifs, and their tertiary structure consists of a regular linear array of modules that stack to form non-globular elongated or supercoiled structures. In the present work, the folding and stability of the central LRR domain of the invasion protein internalin B (InlB241) from the bacterium Listeria monocytogenes was characterized using different biophysical techniques. In addition, the integrity, stability and folding behavior of the so-called internalin-domain (InlB321) was investigated. In this single domain, which is found in all members of the internalin-family, an immunoglobulin (Ig)-like domain is directly fused to the C-terminal end of the LRR domain.

A complete thermodynamic characterization of the stability of both constructs was performed, using chemical- and temperature-induced folding and unfolding transitions. The reversible and cooperative equilibrium transition of InlB241 and InlB321 allowed the use of a two-state model for the description of the data points. The additional Ig-like domain present in InlB321 resulted in an increase of the unfolding free energy (8.8 kcal/mol compared to 4.7 kcal/mol). This resulted both, from a shift of the transition midpoint to higher denaturant concentration, and from an increase in the m-value, the denaturant dependence of the unfolding free energy (9.7 kcal/mol/M compared to 7.1 kcal/mol/M). These observations suggest that the unravelling of the individual structural repeats in the LRR region is a cooperative process and that the tight fusion with the Ig-like domain leads to a dramatically increased stability in vivo without interfering with the functionality of the protein. In addition, the cooperativity of the equilibrium transition reflects the integrity of the internalin-domain, and suggests that both InlB fragments unfold without significantly populated equilibrium intermediates.

Kinetic measurements with tryptophan fluorescence and far-UV circular dichroism are indicative for the existence of a relative stable intermediate on the folding pathway of the LRR domain. Refolding kinetics from an acid-denatured state showed a reversible behavior and passes off an intermediate. An increase in the salt concentration of the acid-denatured protein results in a transition of the unfolded structure to a compact and alternatively folded state. Unfolding kinetics of the internalin-domain measured by fluorescence and far-UV circular dichroism are indicative for the possible presence of two processes. The first slow unfolding process after the transition midpoint showed a strong dependence on temperature, whereas the second and faster unfolding process showed a stronger dependence on the denaturant concentration. Renaturation kinetics indicated the existence of at least one folding intermediate. Preliminary double-mixing experiments revealed no evidence for a rate-limiting proline isomerization reaction. It was not possible to detect the complete amplitude of the renaturation reaction, suggesting existence of a second faster phase occuring in the submillisecond range.

The results on folding kinetics prove the InlB constructs to be suitable models for the investigation of solenoid protein folding by techniques of high structural resolution. KW - Proteinfaltung KW - thermodynamische Stabilität KW - Leucine-Rich Repeat KW - Internalin B KW - Zweizustandsmodell KW - leucine-rich repeat KW - internalin B KW - thermodynamic stability KW - protein folding KW - two-state model Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-2532 ER - TY - THES A1 - Rietdorf, Katja T1 - Wirkungen biogener Amine auf die Erregungs-Sekretions-Kopplung in der Speicheldrüse von Periplaneta americana (L.) N2 - In der vorliegenden Arbeit habe ich wichtige Teilmechanismen der Erregungs-Sekretionskopplung in der Speicheldrüse der Schabe Periplaneta americana (L.) untersucht. Die Speicheldrüse ist von dopaminergen und serotonergen Fasern innerviert (Baumann et al., 2002). Beide Transmitter stimulieren eine unterschiedliche Reaktion der Drüse: Dopamin (DA) stimuliert die P-Zellen der Acini und die Ausführgangzellen, während Serotonin (5-HT) die P- und C-Zellen der Acini stimuliert, nicht jedoch die Ausführgangzellen. Der Endspeichel ist nach einer DA-Stimulierung proteinfrei. Dagegen enthält er nach einer 5-HT-Stimulierung Proteine, die von den C-Zellen sezerniert werden (Just & Walz, 1996). Im ersten Teil meiner Arbeit habe ich mittels Kapillarelektrophoretischer Analyse (CE-Analyse) die Elektrolytkonzentrationen im Endspeichel untersucht sowie die Raten der Flüssigkeitssekretion gemessen. Damit wollte ich klären, welche Transporter an der Sekretion des Primärspeichels und an dessen Modifikation beteiligt sind. Ausserdem wollte ich die Rolle der transportaktiven Epithelzellen der Ausführgänge für die Modifikation des Primärspeichels untersuchen. Dafür habe ich einen Vergleich der Elektrolytkonzentrationen im DA- und 5-HT-stimulierten Endspeichel durchgeführt. Der Elektrolytgehalt des DA- und 5-HT-stimulierten Endspeichels unterscheidet sich nicht signifikant voneinander. Er ist nach beiden Stimulierungen hypoosmotisch zum verwendeten Ringer. Die Ausführgangzellen werden durch DA stimuliert und modifizieren den Primärspeichel durch eine netto-Ionenreabsorption. Meine Versuche zeigen jedoch, dass auch die während einer 5-HT-Stimulierung der Drüse unstimulierten Ausführgangzellen den Primärspeichel modifizieren. In einer nachfolgenden Versuchsreihe habe ich den Einfluss von Ouabain, einem Hemmstoff der Na+-K+-ATPase, und Bumetanid, einem Hemmstoff des NKCC, auf die Raten der Flüssigkeitssekretion sowie den Elektrolytgehalt des Endspeichels untersucht. Ich habe gefunden, dass die Aktivität der Na+-K+-ATPase wichtig für die Modifikation des DA-stimulierten Primärspeichels ist. Im Gegensatz dazu ist sie für die Modifikation des 5-HT-stimulierten Primärspeichels nicht von Bedeutung. Bezüglich der Flüssigkeitssekretion habe ich keinen Einfluss der Na+-K+-ATPase-Aktivität auf die DA-stimulierten Sekretionsraten gefunden, dagegen ist die 5-HT-stimulierte Sekretionsrate in Anwesenheit von Ouabain gesteigert. Die Aktivität des NKCC ist für beide sekretorische Prozesse, die Ionen- und die Flüssigkeitssekretion, wichtig. Eine Hemmung des NKCC bewirkt eine signifikante Verringerung der Raten der Flüssigkeitssekretion nach DA- und 5-HT-Stimulierung sowie in beiden Fällen einen signifikanten Abfall der Ionenkonzentrationen im Endspeichel. Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich versucht, Änderungen der intrazellulären Ionenkonzentrationen in den Acinuszellen während einer DA- oder 5-HT-Stimulierung zu messen. Diese Experimente sollten mit der Methode des "ratiometric imaging" durchgeführt werden. Messungen mit dem Ca2+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 zeigten keinen globalen Anstieg in der intrazellulären Ca2+-Konzentration der P-Zellen. Aufgrund von Problemen mit einer schlechten Beladung der Zellen, einer starken und sich während der Stimulierung ändernden Autofluoreszenz der Zellen sowie Änderungen im Zellvolumen wurden keine Messungen mit Na+- und K+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt. Im dritten Teil dieser Arbeit habe ich die intrazellulären Signalwege untersucht, die zwischen einer 5-HT-Stimulierung der Drüse und der Proteinsekretion vermitteln. Dazu wurde der Proteingehalt im Endspeichel biochemisch mittels eines modifizierten Bradford Assay gemessen. Eine erstellte Dosis-Wirkungskurve zeigt, dass die Rate der Proteinsekretion von der zur Stimulierung verwendeten 5-HT-Konzentration abhängt. In einer Serie von Experimenten habe ich die intrazellulären Konzentrationen von Ca2+, cAMP und / oder cGMP erhöht und anschließend den Proteingehalt im Endspeichel gemessen. Ein Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration aktiviert nur eine geringe Rate der Proteinsekretion. Dagegen kann die Steigerung der intrazellulären cAMP-Konzentration eine stärkere Proteinsekretion aktivieren, die sich nicht signifikant von der nach 5-HT-Stimulierung unterscheidet. Die cAMP-stimulierte Proteinsekretion kann durch gleichzeitige Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration weiter gesteigert werden. Dagegen aktivierte eine Erhöhung der intrazellulären cGMP-Konzentration die Proteinsekretion nicht. Aufgrund dieser Ergebnisse postuliere ich die Existenz eines die Adenylatcyclase aktivierenden 5-HT-Rezeptors in der Basolateralmembran der C-Zellen. N2 - The aim of this PhD-work was to investigate major mechanisms of excitation-secretion coupling in the salivary gland of the cockroach Periplaneta americana (L.). This salivary gland is innervated by dopaminergic and serotonergic fibres (Baumann et al., 2002). The two transmitters stimulate different processes in the gland: Dopamine (DA) stimulates the p-cells of the acini and the salivary duct cells, whereas 5-HT (serotonin) activates the p- and the c-cells of the acini, but not the salivary duct cells. Final saliva is completely protein-free after dopamine stimulation. It contains proteins, which are secreted by the c-cells of the acini, after a 5-HT-stimulation (Just & Walz, 1996). In the first part of my work I measured the electrolytic composition of the final saliva by capillary electrophoretic analysis and measured the rates of fluid secretion, in order to answer the following questions: 1.) Which transporters affect the production of primary saliva and its modification? 2.) What is the function of the transport-active salivary duct cells for the modification of the primary saliva? Electrolytic composition of the DA- and 5-HT-stimulated final saliva is not significantly different from each other, and is hypoosmotic to the Ringer used. Salivary duct cells are stimulated by DA and modify the primary saliva by a netto ion-reabsorption. My experiments also show that the duct cells, which are unstimulated during a 5-HT-stimulation of the gland, modify the primary saliva. In the next series of experiments I investigated the effects of ouabain, an inhibitor of the Na+-K+-ATPase, and bumetanide, an inhibitor of the NKCC on the rates of fluid secretion and the electrolytic composition of the final saliva. I found, that the activity of the Na+-K+-ATPase is important for the modification of DA-stimulated primary saliva during its flow through the stimulated duct system. In contrast, it is not important for modification of the 5-HT-stimulated primary saliva. Inhibition of the Na+-K+-ATPase does not affect rates of DA-stimulated fluid secretion, but it increases the rates of 5-HT-stimulated fluid secretion. Activity of the NKCC is important for both secretory processes: the ion and the fluid secretion. Inhibition of the NKCC results in a significant drop in the rates of fluid secretion after DA- and 5-HT-stimulation, as well as a drop in electrolytic concentrations in the saliva. In the second part of my work, I tried to measure changes in the intracellular ionic concentrations (Ca2+, Na+, and K+) within the acinar cells during a DA- or 5-HT-stimulation. The experiments should be performed by ratiometric imaging. Measurements with the Ca2+-sensitive dye Fura-2 did not show any global increase in the intracellular Ca2+-concentration in the p-cells of the acini. Problems concerning a bad loading of the cells, a strong autofluorescence which changed during the time course of the stimulation, as well as changes in the cell volume were the reason, that no measurements using Na+- or K+-sensitive dyes were performed. In the third part of my work I investigated the intracellular signalling pathways, which activate protein secretion after 5-HT-stimulation of the gland. A modified Bradford Assay was used for measuring the protein content in the final saliva. In a dose-response curve I showed that rates of protein secretion are dependent on the 5-HT-concentrations used to stimulate the glands. In another set of experiments I increased the intracellular concentrations of Ca2+, cAMP and / or cGMP, and measured the protein content in the final saliva. An increase in the intracellular Ca2+-concentration activates only a low rate of protein secretion. After an increase in the intracellular cAMP-concentration a much higher rate of protein secretion can be activated, which is not significantly different from the 5-HT stimulated rate of protein secretion. The cAMP-stimulated protein secretion can be further increased by a simultaneous rise in the intracellular Ca2+-concentration. In contrast, cGMP does not activate protein secretion. Therefore I propose the expression of an adenylyl cyclase activating 5-HT-receptor in the basolateral membrane of the protein secreting c-cells. KW - Periplaneta KW - Speicheldrüse KW - Speichel KW - ionale Zusammensetzung KW - Ionentransport KW - Proteinsekretion KW - second messenger KW - Periplaneta KW - salivary gland KW - saliva KW - ionic composition KW - ion transport KW - protein secretion KW - second messenger Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000878 ER - TY - THES A1 - Pabel, Ulrike T1 - Stabile Expression von Sulfotransferasen - allein oder in Kombination mit Cytochrom P450 - in Zelllinien für Mutagenitätsuntersuchungen N2 - Aromatische Amine und Amide (aAA) sind aufgrund ihrer starken Verbreitung in der menschlichen Umwelt und ihres kanzerogenen Potenzials von großer toxikologischer Bedeutung. Die Kanzerogenität der aAA wird durch die Mutagenität hochreaktiver Stoffwechselprodukte vermittelt, die in zwei sequenziellen katalytischen Reaktionen entstehen. Die erste ist meistens eine N-Hydroxylierung, die oft durch Cytochrom P450 1A2 (CYP1A2) katalysiert wird. Daran schließt sich eine O-Konjugation durch Sulfotransferasen (SULT) oder N-Acetyltransferasen (NAT) an. Die Bioaktivierung ist ein kritischer Parameter für die Übertragbarkeit von Ergebnissen aus Tiermodellen auf den Menschen. Rekombinante in vitro Systeme, die fremdstoffmetabolisierende Enzyme verschiedener Spezies exprimieren, ermöglichen die vergleichende Untersuchung der Bioaktivierung im Menschen und in Versuchstieren. Ziel des Projektes war die Aufklärung der Bioaktivierung der aAA durch humane Enzyme. Im Vordergrund stand die Untersuchung der Rolle humaner SULT in diesem Prozess. Es wurden rekombinante in vitro Systeme, konstruiert, die CYP1A2 und SULT des Menschen koexprimieren. SULT-cDNAs wurden in den Säugerzell Expressionsvektor pMPSV kloniert und in Standardindikatorzellen für Mutagenitätsuntersuchungen (V79 Zellen aus dem Chinesischen Hamster) transfiziert. Das Expressionsniveau von CYP1A2 und SULT wurde mittels Immunblotanalyse und radiometrischen Aktivitätsmessungen charakterisiert. In den rekombinanten Zellen wurden vier aAA als Modellsubstanzen (2-Acetylaminofluoren, 2-Aminoanthracen, 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol, 2,4-Diaminotoluol) auf ihre Mutagenität am hprt-Locus hin untersucht.Die aAA waren in Zellen, die keine rekombinanten Enzyme oder lediglich CYP1A2 exprimierten, nicht mutagen. In Zellen, die CYP1A2 und SULT der Subfamilie 1A koexprimierten, erzeugten sie bereits in geringen Konzentrationen klare mutagene Effekte (0,3 µM für 2-Acetylaminofluoren und 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol; 0,1 µM für 2-Aminoanthracen; 10 µM für 2,4-Diaminotoluol). Die stärkste Aktivierung von 2-Acetylaminofluoren und 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol erfolgte in der Zelllinie, die CYP1A2 und SULT1A2 koexprimierte; die stärkste Aktivierung von 2,4-Diaminotoluol und 2-Aminoanthracen erfolgte in der Zelllinie, die CYP1A2 und SULT1A1 koexprimierte. Sowohl SULT1A1 als auch SULT1A2 sind im Menschen genetisch polymorph. Ein unterschiedlich starkes Aktivierungspotenzial der Alloenzyme könnte eine individuell unterschiedliche Suszeptibilität für die durch aAA ausgelöste Kanzerogenese bedingen. In HPRT-Mutationsuntersuchungen mit rekombinanten Zellen zeigten die allelischen Varianten der SULT1A2 starke Unterschiede in ihrem Aktivierungpotenzial. Nur in der Zelllinie, die das Alloenzym SULT1A2*1 mit CYP1A2 koexprimierte, wurde 2-Acetylaminofluoren zum Mutagen aktiviert. Zur Aktivierung von 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol waren jedoch sowohl das Alloenzym SULT1A2*1 als auch das Alloenzym SULT1A2*2 in der Lage. Die Alloenzyme der SULT1A1 zeigten ein ähnlich gutes Aktivierungspotenzial für aAA. In früheren Studien wurde gezeigt, dass die SULT1C1 der Ratte eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der aAA in dieser Spezies spielt. Dahingegen war die humane SULT1C1 nicht in der Lage die untersuchten aAA zu aktivieren. Die Kenntnis solcher Spezieunterschiede könnte wichtig sein um unterschiedliche Organotropismen aAA in Menschen und Tiermodellen zu erklären, da SULT mit starker Gewebespezifität exprimiert werden und das Expressionsmuster für die einzelnen SULT-Formen in Menschen und Ratten sich stark unterscheidet. N2 - Aromatic amines and amides (aAA) represent a group of chemicals with great toxicological importance due to their wide distribution in the environment and their carcinogenic potency. The carcinogenicity of aAA is mediated by the mutagenic action of highly reactive metabolites. They are frequently formed by N-hydroxylation of the exocyclic amino group, usually catalysed by cytochrome P450 1A2 (CYP1A2) and subsequent O-conjugation by phase-II enzymes e.g. sulfotransferases (SULT) or N-acetyltransferases. The bioactivation constitutes a critical parameter for the transfer of results from animal models on man. Recombinant in vitro systems expressing xenobiotic metabolizing enzymes of different species allow the comparative study of the bioactivation in humans and animal models.
The aim of this project was to elucidate the bioactivation of aAA by human xenobiotic enzymes. The investigation focused on the role of SULT in this process. SULT-cDNAs were cloned into the mammalian expression vector pMPSV and transfected in V79 Chinese Hamster cells, which represent standard indicator cells for mutagenicity tests. Selected SULT-cDNAs were also co-expressed with human CYP1A2. These cells were able to catalyse internally both enzymatic reactions that are necessary for the bioactivation of aAA. The expression level of CYP1A2 and SULT in the co-expressing cell clones was characterised by immunoblot analysis and radiometric SULT-activity measurement. The mutagenicity of four aAA model compounds, 2-aminoanthracene, 2-acetylaminofluorene, 3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzene and 2,4-diaminotoluene, at the hprt locus of the recombinant cell lines was investigated. These aAA were not or only marginally mutagenic in wild type cells or in recombinant cells expressing CYP1A2 alone. If CYP1A2 was co-expressed with SULT forms of the 1A subfamily clear mutagenic effects occured in low concentrations of the aAA (0,3 µM for 2-acetylaminofluorene and 3′-methyl-4-dimethylaminoazobenzene; 0,1 µM for 2-aminoanthracene; 10 µM for 2,4-diaminotoluene). The strongest activation of 2-acetylaminofluorene and 3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzene was mediated by SULTA2 and of 2-aminoanthracene and 2,4-diaminotoluene by SULT1A1. SULT1A1 and SULT1A2 are expressed polymorphically in humans. Differences in the activation potency of distinct alloenzymes for aAA may cause divergent individual susceptibilities for cancer induced by aAA. Briefly, the allelic variants of SULT1A2 showed substantial differences regarding their activation potencies for the investigated aAA. Only alloenzyme SULT1A2*1 was able to activate 2-acetylaminofluorene to a mutagen whereas 3′-methyl-4-di-methylaminoazobenzene was activated by alloenzymes SULT1A2*1 and SULT1A2*2. The investigated alloenzymes of SULT1A1 showed equal activation potencies for aAA. In previous studies it had been shown that the SULT1C1 plays an important role in the activation of aAA in rats. However, the human SULT1C1 was not able to activate the investigated aAA in the study presented here. Such species differences might be important for the elucidation of divergent organotropisms of aAA in humans and animal models, since SULT are expressed with strong tissue specificities and the pattern of expression in humans and rats is severely different. KW - aromatische Amine; Sulfotransferasen; Mutagenität; Bioaktivierung KW - aromatic amines; sulfotransferases; mutagenicity; bioactivation Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000900 ER - TY - THES A1 - Nolte, Björn T1 - Variabilität des Reviergesangs des Buchfinken (Fringilla coelebs) zur Raum-Zeit-Beschreibung von Metapopulationen N2 - Der Buchfinkengesang wurde in Potsdam in zwei Hauptpopulationen über drei Jahre aufgenommen. Jedes Individuum wurde eindeutig am individuellen Strophentypenrepertoire identifiziert. Ein weiterer Punkt der die individuelle Wiedererkennung bestätigt ist die hohe Standorttreue der adulten Männchen. Die beschriebene Methode eignet sich für die Untersuchung von gesamten Populationen, um den Wandel des Gesangs von Populationen in Raum und Zeit zu beschreiben. Die Haupterkenntnisse der Arbeit sind: - Die Gesamtanzahl der Grundstrophentypen innerhalb einer Population bleibt über Jahre konstant. - Die relative Häufigkeit jedes einzelnen Strophentyps variiert von Jahr zu Jahr und von Population zu Population. - Gesangslernen erfolgt exakt mit einem Korrektheitsgrad von mindestens 96%. - Das Song-Sharing ist innerhalb der Population hoch. Die diskutierten Mechanismen für das Song-Sharing sind: Die Lebenserwartung, das Zugverhalten, das Lernverhalten, die Etabliertheit von Strophentypen, Weibchenpräferenzen und die Reaktionen der territorialen Männchen. - Weiterhin wurde ein Modell zur kulturellen Evolution des Buchfinkengesangs programmiert, um die Rolle der Einflussfaktoren, wie Fehlerquote, Abwanderungsrate und Laufzeit zu ermitteln. Der Wandel des Dialektes erfolgt graduell in Raum und Zeit. Daher sind keine scharfen Dialektgrenzen anzutreffen. Trotz dieser Tatsache markieren die etablierten Strophentypen die Population. 50 % der Juvenilen siedeln am Geburtsort, auf diese Weise bleibt der Dialekt erhalten und Inzest wird vermieden. -Analysiert man das Repertoire benachbarten Männchen bei isolierten Alleen, so entspricht die Gesangsangleichung in etwa dem Zufall. -Intraindividuelle Vergleiche der quantitativen Parameter des jeweiligen Strophentyps wurden saisonal und annuell durchgeführt. Saisonal konnten für einen Strophentyp ein Trend ermittelt werden. Bei jährlichen Vergleichen konnten intraindividuell ausschließlich nicht signifikante Ergebnisse ermittelt werden, wohingegen die interindividuelle Variation in zwei Fällen signifikant war. In einem Fall bestand ein Trend und in einem weiteren Fall war die Variationsunterschiede nicht signifikant. - Der Verlauf der Brutsaison lässt sich an der jährlichen Gesangsaktivität nachvollziehen. N2 - Chaffinch song was recorded in Potsdam in two major populations of chaffinches over a period of three years. Each male was identified unambiguously because of their individual song type repertoires. These are usually easy to distinguish from sonagrams as the variation is discontinuous. A further point for individual recognition is the fixed territorial behaviour of adult males. The described method is employed to examine whole populations and to observe changes with space and time in the song of a population. The major findings of the study are: - The total amount of basic song types in each population is constant over years. - The quantity of each basic song type is different and varies from year to year and from population to population. - Song copying is extremely accurate on at least 96% of occasions. - Song-type sharing is high within populations. Discussed mechanisms for song neighbourhoods are: expectation of life, semi-migratory behaviour, learning skills, establishment of song types, female choice and male vs male interaction. Furthermore a model of cultural evolution of chaffinch song was programmed to determine the role of factors like error rate, rate of emigration and running time. The changes are gradual in space and time. Hence the dialect borders are smooth. Despite this fact established song types mark the population. As every second juvenile bird settles in the population of his birth inbreeding is avoided and the dialect structure is retained. - Analysing the repertoires of neighbouring males (“next door neighbours”) in isolated avenues to examine mutual influences suggests that these have the same amount of song types in common than would be expected by chance. - Within intraindividual comparisons the quantitative parameters of the same song types remain seasonal and annual constant, whereas interindividual variations within the same song tip are statistically significant. - The breeding biology of the chaffinch can be observed by seasonal singing activity during the breeding cycle. KW - Buchfink KW - Gesangsdialekte KW - Strophentypen KW - Gesangslernen KW - Gesangsangleich KW - Gesangsaktivität KW - Chaffinch KW - Songdialects KW - song-types KW - songlearning KW - song-sharing KW - song-matching KW - singing activity Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000882 ER - TY - THES A1 - Groth, Thomas T1 - Die Bedeutung der Volumen- und Oberflächeneigenschaften von Biomaterialien für die Adsorption von Proteinen und nachfolgende zelluläre Reaktionen N2 - Es ist schon seit längerer Zeit bekannt, dass nach Kontakt des Biomaterials mit der biologischen Umgebung bei Implantation oder extrakorporaler Wechselwirkung zunächst Proteine aus dem umgebenden Milieu adsorbiert werden, wobei die Oberflächeneigenschaften des Materials die Zusammensetzung der Proteinschicht und die Konformation der darin enthaltenden Proteine determinieren. Die nachfolgende Wechselwirkung von Zellen mit dem Material wird deshalb i.d.R. von der Adsorbatschicht vermittelt. Der Einfluss der Oberflächen auf die Zusammensetzung und Konformation der Proteine und die nachfolgende Wechselwirkung mit Zellen ist von besonderem Interesse, da einerseits eine Aussage über die Anwendbarkeit ermöglicht wird, andererseits Erkenntnisse über diese Zusammenhänge für die Entwicklung neuer Materialien mit verbesserter Biokompatibilität genutzt werden können. In der vorliegenden Habilitationsschrift wurde deshalb der Einfluss der Zusammensetzung von Polymeren bzw. von deren Oberflächeneigenschaften auf die Adsorption von Proteinen, den Aktivitätszustand der plasmatischen Gerinnung und die Adhäsion von Zellen untersucht. Dabei wurden auch Möglichkeiten zur Beeinflussung dieser Vorgänge über eine Veränderung der Volumenzusammensetzung oder durch Oberflächenmodifikationen von Biomaterialien vorgestellt. Erkenntnisse aus diesen Arbeiten konnten für die Entwicklung von Membranen für Biohybrid-Organe genutzt werden. N2 - The implantation of biomaterials or the contact of blood with extracorporal devices leads to the rapid adsorption of proteins from the surrounding biological fluids. The surface properties of materials determine the composition of the adsorption layer and the conformation of adsorbed proteins. Hence, the subsequent interaction of cells with biomaterials is dependent on the adsorption layer of proteins. The detailed knowledge on the role of surface properties in protein adsorption and cellular interactions is a useful means to learn about the biomedical applicability of materials and to develop novel materials with improved biocompatibility. The thesis describes the influence of polymer composition and surface properties on protein adsorption, the activation of blood clotting and adhesion of cells. The thesis presents options to modify the reactions of the biological system by the modification of bulk or surface composition of polymers. Results of these studies have been used to develop polymer membranes for biohybrid organs. KW - Biomaterialien KW - Polymere KW - Protein Adsorption KW - Zelladhäsion KW - Biohybride Organe KW - biomaterials KW - polymers KW - protein adsorption KW - cell adhesion KW - biohybrid organs Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001022 ER - TY - THES A1 - Neichel, Dajana T1 - Charakterisierung und in vitro - Wirkung agonistischer AT1-Rezeptor Autoantikörper bei Präeklampsie-Patienten N2 - Die Präeklampsie ist eine schwangerschaftsspezifische Bluthochdruck-Erkrankung, die im Allgemeinen nach der 20. Schwangerschaftswoche auftritt. Neben der Hypertonie sind die Proteinurie und die Ödembildung charakteristische Symptome der Präeklampsie. Obwohl heute die Pathophysiologie der Präeklampsie zum großen Teil verstanden ist, ist die Ätiologie dieser Erkrankung noch unklar. 1999 konnten wir in den Seren von Präeklampsie-Patientinnen agonistische Autoantikörper, die gegen den Angiotensin II AT1-Rezeptor gerichtet sind (AT1-AAK), nachweisen. Diese AT1-AAK gehören zur Antikörpersubklasse IgG3. Die AT1-AAK führen in Kulturen neonataler Rattenkardiomyozyten AT1-Rezeptor spezifisch zu einem positiv chronotropen Effekt. Mittels Immunpräzipitation wurde gezeigt, dass AT1-AAK spezifisch den AT1-Rezeptor präzipitieren. Kontrollproben, aus denen die AT1-AAK entfernt wurden, führen zu keiner Präzipitation des AT1-Rezeptors. Die Präzipitation des AT1-Rezeptors bleibt ebenfalls aus, wenn die AT1-AAK mit einem Peptid, welches der Aminosäuresequenz des zweiten extrazellulären Loops des humanen AT1-Rezeptors entspricht, behandelt wurden. Eine Langzeitbehandlung der Kulturen neonataler Rattenherzzellen mit AT1-AAK vermindert die funktionelle Ansprechbarkeit der Zellen auf einen erneuten AT1-Rezeptor-Stimulus. Eine veränderte AT1-Rezeptorexpression wurde nicht nachgewiesen. In guter Übereinstimmung mit den in vitro-Expressionsdaten wurde gezeigt, dass die plazentare AT1-Rezeptorexpression bei Präeklampsie-Patientinnen nicht verschieden von der plazentaren AT1-Rezeptorexpression gesunder Schwangerer mit nicht pathogen verändertem Blutdruck ist. Im Zellsystem der neonatalen Rattenherzzellen führen die AT1-AAK zur Aktivierung von Gi-Proteinen und zu verringerten intrazellulären cAMP-Spiegeln. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die AT1-AAK in Kulturen neonataler Rattenherzzellen die Transkriptionsfaktoren AP-1 und NFkB aktivieren. Die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkB wurde vornehmlich in den Nicht-Myozyten der Rattenherzzellkultur nachgewiesen. Generell wurde festgestellt, dass sich die AT1-AAK pharmakologisch wie der natürliche Agonist des AT1-Rezeptors, Angiotensin II, verhalten. Erste Daten dieser Arbeit deuten auf einen eventuellen Einfluss der AT1-AAK auf die Expression von Komponenten der extrazellulären Matrix bzw. assoziierter Faktoren (Kollagen III, MMP-2, TIMP-2, Colligin) hin. In allen in dieser Arbeit untersuchten Seren von klinisch diagnostizierten Präeklampsie-Patientinnen wurden agonistische AT1-AAK nachgewiesen. Wir vermuten daher, dass die AT1-AAK möglicherweise bedeutend in der Pathogenese der Präeklampsie sind. N2 - Preeclampsia is a serious, pregnancy-specific disorder that usually occurs after week 20 of gestation and is characterized by hypertension, proteinuria, and oedema. While the pathophysiology is clear, little is known about etiology of preeclampsia. In 1999, we showed that sera from preeclamptic patients contain autoantibodies directed against angiotensin II AT1 receptor (AT1-AAB). These autoantibodies are immunoglobuliens of the IgG3 subclass. AT1-AAB accelerate the beating rate of neonatal rat cardiomyocytes. The agonistic effect can be blocked with the AT1 receptor blocker losartan. Co-immunoprecipitation studies have shown that AT1-AAB specifically precipitate the AT1 receptor while control samples lacking AT1-AAB do not. The AT1 receptor could not be precipitated following neutralization of the AT1-AAB by a peptide corresponding to the AT1 receptors second extracellular loop. In further studies on neonatal rat heart cells, we showed long-term stimulation of the AT1 receptor whereby AT1-AAB down-regulated the AT1 receptor-mediated response to a second agonistic receptor-stimulation. After long-term stimulation of neonatal rat heart cells, no changes in AT1 receptor expression could be identified. Corresponding to these in vitro-expression data, no difference was seen in placental AT1 receptor expression between patients with preeclampsia and healthy pregnant women. Next, we tested if the AT1-AAB lead to activation of AT1 receptor signaling in angiotensin II fashion. In neonatal rat heart cell cultures, AT1-AAB lead to activation of Gi-protein with reduced cAMP levels. AT1-AAB are able to activate the transcription factors AP-1 and NFkB in this cell system. In all observations, the agonistic AT1-AAB behave pharmacologically in a similar fashion to angiotensin II. Initial data suggest that AT1-AAB may have an effect on extracellular matrix components (ECM). We have found AT1-AAB in all women meeting the clinical criteria of preeclampsia and, therefore, suggest that AT1-AAB may be important to the pathogenesis of the disease. KW - AT1-Rezeptor / Präeklampsie / AT1-AAK / neonatale Rattenkardiomyozyten / Autoantikörper / Angiotensin II KW - AT1 receptor / preeclampsia / AT1-AAB / neonatal rat cardiomyocytes / autoantibody / angiotensin II Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001126 ER - TY - THES A1 - Bufe, Bernd T1 - Identifizierung und Charakterisierung von Bitterrezeptoren N2 - Menschen nehmen Tausende von Stoffen als bitter wahr. Die chemische Struktur der verschiedenen Bitterstoffe ist sehr vielfältig: Sie reicht von kleinen Molekülen wie Kaliumchlorid oder Harnstoff, bis zu sehr komplexen organischen Verbindungen. Die Größe der einzigen bekannten menschlichen Familie von Bitterrezeptoren (TAS2Rs) wurde auf nur ca. 80-120 Mitglieder geschätzt. In Anbetracht der hohen Zahl und Komplexität der Bitterstoffe erscheint die Zahl von Rezeptoren als sehr gering. Dies führt natürlich zu einer Reihe von Fragen: Wie viele Mitglieder hat die menschliche TAS2R-Genfamilie? Wie viele verschiedene Substanzen können denselben Rezeptor aktivieren? Scheint die Zahl der TAS2R-Rezeptoren ausreichend, alle Bitterstoffe wahrnehmen zu können oder muss es noch andere Bitterrezeptorfamilien geben? Diese Fragen zu beantworten, ist das Ziel der vorliegenden Arbeit. Hier durchgeführte Analysen des menschlichen Genomprojektes zeigen, dass Menschen ca. 25 TAS2R-Rezeptoren besitzt, die eine sehr divergente Aminosäurestruktur aufweisen. Diese Rezeptoren wurden in eine neu entwickelte Expressionskassette kloniert, die den Transport des Rezeptors an die Zelloberfläche ermöglicht. Um Liganden für die menschliche TAS2R-Rezeptoren zu identifizieren, wurden die Rezeptoren in HEK293 Zellen exprimiert und mit verschiedenen Bitterstoffen stimuliert. Der Nachweis der Rezeptoraktivierung erfolgte durch Calcium-Imaging. Es konnte gezeigt werden, dass hTAS2R16 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Salicin und verwandten bitteren Pyranosiden ist. So wird hTAS2R16 in HEK293 Zellen durch Salicin und chemisch verwandte Substanzen aktiviert. Ein Vergleich der in diesem Messsystem erhaltenen Daten mit psychophysikalisch ermittelten Geschmackswahrnehmungen beim Menschen, ergab eine hohe Übereinstimmung. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die Desensitiverung einzelner Rezeptoren die Ursache für die Adaption des Bittergeschmacks ist. Der Nachweis der Expression des Rezeptors in menschlichen Geschmackspapillen, sowie die festgestellte Assoziation des G/A Polymorpphismus an Position 665 des hTAS2R16 Gens mit einer reduzierten Salicinwahrnehmung, sind weitere unabhängige Beweise für diese These. Ein anderer menschlicher Rezeptor, hTAS2R10, wird durch die Bitterstoffe Strychnin, Brucin und Denatonium aktiviert. Dies sowie die Tatsache, dass die zur Aktivierung benutzten Konzentrationen eine sinnvolle Korrelation zu dem menschlichen Geschmacksschwellwert von Strychnin zeigen, sind starke Hinweise, dass hTAS2R10 der menschliche Rezeptor zur Wahrnehmung von Strychnin und verwandten Substanzen ist. Die vorliegenden Daten zeigen eindeutig, dass die TAS2R-Rezeptoren auch beim Menschen Bitterrezeptoren darstellen. Sowohl hTAS2R16, als auch hTAS2R10 werden durch ein Spektrum strukturell sehr unterschiedlicher Bitterstoffe aktiviert. Falls die anderen Mitglieder der TAS2R-Familie ebenfalls dieses Verhalten zeigen, wäre es möglich, dass die nur ca. 25 Mitglieder umfassende TAS2R-Rezeptorfamilie des Menschen tatsächlich zur Wahrnehmung aller Bitterstoffe ausreicht. N2 - Bitter taste generally is aversive and protects vertebrates from ingestion of toxic substances, but bitter tastants also contribute to the enjoyment and palatability of food influencing human nutritional habits. Although bitter taste has been extensively studied, receptor mechanisms are still poorly understood. Anatomic, functional and genetic evidence from rodents suggested, however, that the T2R genes encode a family of bitter receptors while definite proof is missing in humans 6. We here report that the hT2R16 receptor is present in vallate papilla taste buds of the human tongue and activated by bitter b-glucopyranosides. These phytonutrients did not activate any other human T2R and showed similar concentration-response relations and cross-desensitization in hT2R16 expressing cells and psychobiological experiments. hT2R16 is broadly tuned. It binds bitter compounds that share only a b-glycosidic bond and a glucose residue. The broad tuning of T2Rs could explain how a limited number of receptors permits the perception and coding of numerous and different bitter substances. Together our data identify the hT2R16 as a broadly tuned, genuine human bitter receptor for b-glucopyranosides. KW - Geschmack KW - Bitter KW - Rezeptoren KW - TAS2R KW - Salicin KW - HEK293 KW - calcium imaging KW - taste KW - bitter KW - receptor KW - TAS2R KW - HEK293 KW - Salicin KW - calcium imaging Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001130 ER - TY - THES A1 - Wende, Hagen T1 - Genetische Charakterisierung des "Leukocyte Receptor Complex" und Entwicklung einer Methode zum Nachweis seiner Produkte im Einzelzellmaßstab N2 - Der "Leukocyte Receptor Complex" (LRC) ist ein DNA-Sequenzabschnitt auf dem Chromosom 19 des Menschen, der eine Länge von über 900.000 Basenpaaren umfaßt. In diesem Chromosomenabschnitt ist eine Vielzahl von Genen lokalisiert, die für die Funktion verschiedener weißer Blutzellen (Leukozyten) von entscheidender Bedeutung sind. Bei den aus diesen Genen synthetisierten Proteinen (Eiweißen) handelt es sich um Strukturen, die auf der Oberfläche dieser Zellen lokalisiert sind und zur Interaktion der Leukozyten mit ihrer Umgebung dienen. Diese auch als Rezeptoren bezeichneten Proteine können mit Oberflächenproteinen auf anderen Körperzellen wechselwirken und daraus resultierende Signale in das Innere der Blutzelle weiterleiten. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde der LRC im Detail untersucht. Hierzu wurde zunächst der gesamte Chromosomenabschnitt aus kleineren, einander überlappenden DNA-Fragmenten rekonstruiert. Aufgrund der in diesen DNA-Fragmenten enthaltenen DNA-Sequenzen war es möglich, den gesamten Chromosomenabschnitt ähnlich einem Puzzle zusammenzusetzen. Die anschließende Analyse des LRC zeigte, daß sich dieser in drei Bereiche, sogenannte Cluster, unterteilen läßt. Diese Cluster sind dadurch gekennzeichnet, daß in ihnen jeweils nur Gene eines Rezeptortyps vorkommen. Hierbei handelt es sich um ‚immunoglobulin-like transcript′ -Gene (ILT) und ‚killer cell Ig-like receptor′-Gene (KIR). Die KIR- und ILT-Cluster werden von weiteren stammesgeschichtlich verwandten Genen unterbrochen und flankiert. Je nach Individuum können im LRC bis zu 31 solcher verwandten Rezeptorgene lokalisiert sein. Auf der Grundlage der Kartierungsdaten und von Daten des humanen Genomprojekts war es zudem möglich, evolutionäre Untersuchungen zur Entwicklung des LRC durchzuführen. Dabei wurde eine Hypothese zur Entstehung des LRC entworfen und zu anderen Spezies in Beziehung gesetzt. Im zweiten Teil der Arbeit habe ich aufbauend auf der sogenannten HRCA-Methode eine Technik entwickelt, die es erlaubt kleinste Unterschiede zwischen DNA-Sequenzen, sogenannte Einzelbasenpaaraustausche, nachzuweisen. Die entwickelte Methode kann verwendet werden, um sehr ähnliche DNA-Sequenzen, wie z.B. verschiedene KIR-Sequenzen, zu unterscheiden und ihre Menge zu bestimmen. Sie ist außerdem geeignet Mutationen, die mit bestimmten Krankheiten assoziiert sind, nachzuweisen und könnte somit in der Diagnostik Anwendung finden. N2 - The Leukocyte Receptor Complex (LRC) is a DNA region on human chromosome 19 with a length of approximately 900.000 base pairs. A number of genes, which are located in this chromosomal region, are known to be important for the function of some types of white blood cells (leukocytes). The products of theses genes are proteins, which are located on the surface of these cells and enable them to interact with their environment. These proteins are also called receptors. They can bind to cell surface proteins on other cells and transmit resulting signals into the leukocyte. During my work I analyzed the chromosomal organization of the LRC in detail. To do so, I reconstructed the whole chromosomal region from smaller overlapping DNA fragments. Due to the DNA sequences contained within these fragments it was possible to put the whole chromosomal region together like a puzzle. The following analyses of the LRC showed that it is mainly composed of three regions, so called clusters. These clusters are characterised by the presence of only one receptor family. These are the immunoglobulin-like transcripts (ILTs) and the killer cell Ig-like receptors (KIR) respectively. In the LRC the KIR- and ILT-Clusters are flanked by additional receptor genes, which are evolutionary related to KIRs and ILTs. The number of receptor genes in the LRC varies between individuals, their can be up to 31 genes on each chromosome. On the basis of the data obtained in this work as well as data from the human genome project it was also possible to draw conclusions concerning the evolutionary development of the LRC. I developed a hypothesis of the origin of the LRC and discussed this in comparison to other species. In the second part of my thesis I developed a new technique based on the so-called ’hyper-branched rolling circle amplification′ (HRCA). This technique allows the detection of small differences between two or more DNA molecules, so called ’single nucleotide polymorphisms′ (SNPs). With this newly developed method it is possible to distinguish very similar variants of a gene, e.g. two KIR sequences, and to determine their relative concentration. The method can also be used to detect mutations, which are associated with certain diseases and could therefore be used for diagnostic purposes. KW - Leukocyte Receptor Complex LRC KIR ILT FCAR Immunglobulin Evolution Immunsystem SNP HRCA KW - Leukocyte Receptor Complex LRC KIR ILT FCAR immunoglobulin evolution SNP HRCA Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001298 ER - TY - THES A1 - Hoyer, Stephan W. T1 - Prädiktiver Wert sensorischer Laboruntersuchungen für den Getränkekonsum älterer Menschen unter Alltagsbedingungen N2 - Zur Ermittlung der Akzeptanz und ihres prädiktiven Wertes für den Verzehr von Lebensmitteln bzw. Getränken, sind Beliebtheitsprüfungen mit Konsumenten unter standardisierten Bedingungen im Sensoriklabor üblich. Die prädiktive Aussagekraft dieser Laboruntersuchungen wird jedoch durch folgende Aspekte eingeschränkt: (1) Der situative Kontext wird ausgeschaltet, d.h. die Verzehrssituation, in der ein Produkt üblicherweise konsumiert wird, ist im Labor bewusst eliminiert und das zu bewertende Produkt wird nicht in einer kompletten Mahlzeit dargeboten (2) Der Produktkontakt im Labor ist im Gegensatz zu der anhaltenden Konfrontation unter alltäglichen Bedingungen nur kurzfristig, was Langzeitaussagen bzw. Dauerpräferenzen nicht zuläßt; (3) Im Labortest ist die freie Auswahl auf eine geringe Anzahl angebotener Produkte beschränkt. In dieser Arbeit soll daher die Frage beantwortet werden, welchen prädiktiven Wert sensorische Beliebtheitsuntersuchungen im Labor für Lebensmittelakzeptanz und -verzehr unter Alltagssituationen haben. Dies wird für verschiedene Altersgruppen gezeigt, die frei in ihrer Entscheidungsfindung sind. Dazu gaben 56 Studenten (23,1±3,7 Jahre) und zwei Seniorengruppen, zum einen aus einer Begegnungsstätte (20 Probanden; 75,6±8,1 Jahre) und zum anderen aus dem betreuten Wohnen (14 Probanden; 76,1±12,5 Jahre), in einer ersten Laboruntersuchung Beliebtheitsbewertungen (Akzeptanz und Rangordnungsprüfung) zu 6 Erfrischungsgetränken ab. Anschließend folgte ein mindestens vierwöchiger Zeitraum, in denen die Probanden aus einem speziell für die Studie konzipierten Automaten Getränke in Einrichtungen der Gemeinschaftsverpflegung entnehmen konnten. Die Entnahme war via Chipkarte ad libitum möglich. Computergestützt wurden dabei individuelle Getränkewahl, Menge und Entnahmezeit aufgezeichnet. Unmittelbar nach der Automatenphase wurde eine erneute Laboruntersuchung durchgeführt. In allen Untersuchungsphasen wurden dieselben Erfrischungsgetränke aus Konzentrat, variiert in Apfel- oder Orangensaftgeschmack, ohne oder mit Zusatz von Zucker (20g/l) und Kohlensäure (4 g/l CO2), angeboten. Eine Quntitativ Deskriptive Analyse bestätigte unterschiedliche Profile bei den Produkten, so dass von sensorisch wahrnehmbaren Unterschieden zwischen den Produkten ausgegangen werden konnte. Die Probanden bekamen zu keiner Zeit Informationen über die exakte Zusammensetzung der Getränke. Sowohl in der Laborbewertung als auch nach Getränkekonsum via Automat, fanden sich unterschiede zwischen den Altersgruppen. In der Akzeptanzprüfung bewerteten Studenten die Apfelvarianten besser als die Orangenvarianten. Senioren, die insgesamt höhere Akzeptanzwerte vergaben, bewerteten alle Getränke in fast allen Attributen gleichermaßen gut. Nach der 4-wöchigen Automatenphase hatte sich die Akzeptanz der sechs Getränke nicht wesentlich geändert. Auch in beiden Rangordnungsprüfungen waren bei den Studenten „Apfel“ und „Apfel mit Kohlensäure“ auf den ersten Plätzen, „Orange mit Zuckerzusatz“ auf dem letzten Platz. Nach Adjustierung auf die individuelle Trinkmenge (in Wenig-, Mittel- Vieltrinker) und wurde „Apfel mit Kohlensäure“ in der Automatenphase von den Studenten am meisten getrunken. In der Vieltrinkergruppe wurde „Orange mit Zuckerzusatz“ deutlich vernachlässigt. Der Automatenkonsum der Studenten bestätigte damit im Wesentlichen die Ergebnisse der Beliebtheitsprüfung im Labor. Bei den Senioren waren in der Rangordnungsprüfung, die eine Lieblingsreihenfolge erzwang, alle süßeren Getränke (mit Zuckerzusatz) auf den ersten Plätzen. In der Automatenphase wurden jedoch viele Getränke ohne Zuckerzusatz bevorzugt. Dies zeigte sich sowohl in der individuellen Präferenz, als auch im Gesamtkonsum. Aufgrund der Ergebnisse kann der prädiktive Wert von Laboruntersuchungen mit Senioren in Bezug auf die Auswahl und den Konsum unter alltäglichen Bedingungen als gering beurteilt werden. Die Getränke mit der individuell höchsten Laborpräferenz wurden unter Alltagsumgebung in der Gemeinschaftsverpflegung in deutlich geringeren Umfang als erwartet verzehrt. In der Vergleichsgruppe der Studenten ist die Übereinstimmung größer(p<0,05). In Häufigkeitsfragebögen vor und nach der Automatenphase wurde das Trinkverhalten speziell von kohlensäurehaltigen Getränken erfragt. Der Anteil von kohlensäurehaltigen Getränken ist sehr variabel, und kann tagesabhängig von einem geringen bis zum Hauptanteil ausmachen. Senioren tranken von den Automatengetränken weniger kohlensäurehaltige Getränke als Studenten(p<0,001). Trotzdem zeigte nur eine Minderheit einen völligen Verzicht, wie sich durch Fragebogen und auch Automatenkonsum ermitteln ließ. Die Verwendung eines computergestützten Getränkeautomaten bietet eine neue Möglichkeit, die Langzeitpräferenz und den tatsächlichen Konsum unter gewohnten Alltagsbedingungen und bei freier Produktauswahl zu ermitteln. Selbst bei Altersgruppen, die mit Laboruntersuchungen überfordert sind, können Vorlieben untersucht werden. N2 - Background: For predicting consumption of food products consumer acceptance is usually measured by using hedonic scales in the sensory lab. However, the predictive value of such results is limited by different facts: (1) the real life context is missing, e.g. the tested product is not integrated into a meal, (2) only short confrontation with the product in lab in contrast to long-term exposure in the real life. Therefore, methods are needed which give a more reliable estimate of long-term preference and consumption. Objective: To develop and to validate an automatic device to estimate the long-term acceptance of beverages in young and elderly people. Methods: A new computerized vending machine was designed and established. The device is able to deliver 6 different types of beverages and can be placed in any public room. Study participants, after identifying themselves by a chip card, are free to select any quality and quantity of the offered beverages. The individual consumption data is registered. For comparing these consumption data with hedonic lab measurements a total of 56 students (mean age 23,1) and 34 seniors (mean age 76.1) were recruited for a 3-step experiment. In the first step they visited the sensory lab and rated on a 7 point hedonic scale and afterwards ranked 2 orange and 4 apple juices modified in their sugar and carbon dioxide content. In the second step the computerized vending machine was placed in a location, where the subjects usually eat, i.e. a university canteen or senior club or an assisted living home for seniors. Subjects were offered the same beverages as in lab test. The machine registered the individual choice and consumption (amount, time). In the third step the lab test was repeated. Results: In seniors the lab acceptance test with similar products has no discriminatory power. The ranking test reveals to be more reliable for elderly people. Moreover, seniors prefer sweeter products in the lab. This is not found among younger people. The lab measurements with seniors are low in their value concerning their real life choice and intake via the device. The correlation coefficient between lab ranking and beverage choice was lower for seniors than students (p< 0.05). There was no difference between young and elderly people in the ability to handle the device. In general, students prefer more carbonated beverages than seniors(p<0.001) Conclusion: The results obtained by the new device give better information on long-term beverage consumptions than preference measurements in the lab. KW - Getränkeauswahl KW - Konsum KW - Getränkeautomat KW - Alltagsbedingungen KW - vending machine KW - food choice KW - beverage KW - situation KW - real life context Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001057 ER - TY - BOOK ED - Mühle, Ralf-Udo ED - Kaden, Klaus ED - Jeltsch, Florian T1 - Die ökologische Station Gülpe der Universität Potsdam BT - Forschungen an der Unteren Havel N2 - Fließgewässer erfüllen wichtige Funktionen im Naturhaushalt und bilden mit ihren Auen komplexe Ökosysteme, die im ursprünglichen Zustand durch die Dynamik der Wasserführung geprägt werden. Seit Jahrhunderten verändert der Mensch die Gestalt der Fließgewässer, um sie für die schnelle Ableitung des Hochwassers, zum Abwassertransport, für die Schifffahrt und die Landwirtschaft zu nutzen. Im vorliegenden Themenheft werden unterschiedliche Aspekte dieser Problematik am Beispiel der Region um die ökologische Station der Universität Potsdam an der Unteren Havel dargestellt. Zunächst wird die Entstehung der Kulturlandschaft im westlichen Havelland von den Anfängen der Besiedlung dargestellt. Anschließend folgt die Charakteristik der Landschaft und der hydrologischen Verhältnisse der Unteren Havelniederung. Die Darstellung der Vegetation der Havelaue wird durch Ausführungen zu ökophysiologischen Untersuchungen an typischen Pflanzenarten von Feuchtstandorten untersetzt. Aufgrund ihrer reichen Naturausstattung und langzeitiger extensiver Nutzung ist die Landschaft an der Unteren Havel ein Schutzgebiet von internationaler Bedeutung als Rast- und Brutplatz für Wat- und Wasservögel. Einem zoologischen Überblick mit besonderer Berücksichtigung von Flussauenarten schließen sich Betrachtungen aus ornithologischer Sicht an, die neben Übersichtsarbeiten zur Avifauna der Unteren Havel ausgewählte Veröffentlichungen zur Wasservogelforschung erwähnen. Flussauen erfüllen eine wichtige Funktion im Nährstoffhaushalt der Landschaft. Untersuchungen an Augewässer-Sedimenten unter veränderter Hochwasserdynamik tragen dem Rechnung. In Brandenburg wurden in den zurückliegenden Jahren große Gebiete unter Schutz gestellt. Am Beispiel des Naturparks Westhavelland wird exemplarisch diese Richtung der Naturschutzpolitik dargestellt. Die Mehrzahl der Beiträge basiert auf Untersuchungen in der Havelniederung, die von der Ökologischen Station Gülpe ausgingen. Den Abschluss bildet ein Ausblick auf zukünftige ökologische Forschung an der Unteren Havel. Inhalt: GÖTZE, B.: Die Untere Havelniederung - eine gewachsenen Kulturlandschaft? : über die Entstehung einer Kulturlandschaft im westlichen Havelland ; KADEN, K.; ITZEROTT, S.: Eine landschaftliche Charakteristik der Unteren Havelniederung bei Gülpe ; KADEN, K.; ITZEROTT, S.: Die hydrologischen Verhältnisse der Unteren Havelniederung ; BURKART, M.; WATTENBACH, M.; WICHMANN, M.; PÖTSCH, J.: Die Vegetation der unteren Havelaue : Stand der Forschung und Perspektiven ; Gzik , A.: Vitalität und Konkurrenzkraft charakteristischer Pflanzenarten von Feuchtstandorten der Unteren Havelaue ; MÜHLE , R.-U.: Tierleben - ein zoologischer Überblick zur Unteren Havelniederung ; WALLSCHLÄGER, D: Gülper See und Untere Havelniederung aus ornitologischer Sicht : Forschungen an der Ökologischen Station der Universität Potsdam ; KNÖSCHE, R.: Zur Phospatrücklösung aus Augewässersedimenten unter veränderter Hochwasserdynamik ; BORMKI, G.; KNÖSCHE, R.; SCHNEIDER, I.: Untersuchungen zur N-Mineralisation und -Remobilisierung im Sedment eines extrem flachen Auensees (Schollener See) ; BUCHTA, R.: Der Aufbau neuer Naturparke in Brandenburg am Beispiel des Naturparkes Westhavelland ; JELTSCH , F.: Ökologische Forschungen an der Unteren Havel - ein Ausblick T3 - Brandenburgische Umwelt-Berichte - 13 KW - Gülpe KW - Untere Havel KW - ökologische Forschung Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-7962 SN - 3-935024-58-4 SN - 1434-2375 SN - 1611-9339 IS - 13 PB - Universitätsverlag Potsdam CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Lehmann, Cathleen T1 - Untersuchungen zum Aufnahmemechanismus und intrazellulärem Transport von fusogenen und kationischen Liposomen-DNA-Komplexen für den Gentransfer N2 - Mit der vorliegenden Arbeit sollten mit Hilfe elektronenmikroskopischer Methoden verschiedene Liposomen-DNA-Komplexe zum Gentransfer charakterisiert sowie die Aufnahme und Verteilung in der Zellkultur untersucht werden. Dabei waren vor allem solche Präparationen von besonderem Interesse, die in unserer Arbeitsgruppe 'Drug Targeting' getestet oder entwickelt und verwendet wurden, wie Sendai-Virus Liposomen (HVJ-Liposomen), Virosomen sowie DAC-Chol und DOCSPER-Liposomen als Vertreter der kationischen Lipide. Im ersten Teil der Arbeit wurden fusogene Liposomen und Virosomen charakterisiert. Bei diesen Untersuchungen wurden folgende Ergebnisse erzielt: ·Sendai-Viren fusionieren mit Liposomen unterschiedlicher Lipidzusammensetzung. ·Die daraus resultierenden HVJ-Liposomen sind mit elektronenmikroskopischen Methoden identifizierbar. ·Die Spikes auf den HVJ-Liposomen besitzen fusogene Eigenschaften. ·HVJ-Liposomen eignen sich auf Grund der geringen Ausbeute sowie der geringen Transfektionseffizienz nicht zum in vitro Gentransfer. ·Virosomen stellen einen weiteren Typ fusogener Gentransfervesikel dar. ·Ihre Größe und fusogenen Eigenschaften sind abhängig von der externen Zugabe einer optimierten Lipidmischung. ·Im Innenraum der Virosomen kann mit Poly-L-Lysin vorkomplexierte DNA verkapselt werden. ·Die fusogenen Eigenschaften der Virosomen wurden mit Hilfe immunelektronenmikroskopischer Techniken und monoklonaler Antikörper gegen Hämagglutinin/Neuraminidase und das Fusionsprotein sowie mit polyklonalen Antiseren gezeigt. ·An Hand goldmarkierter DNA sind Virosomen nach der Transfektion in der Zelle nachweisbar. Da in unserer Arbeitsgruppe bevorzugt kationische Liposomen zum Gentransfer verwendet werden, wurde auch die Struktur der Liposomen untersucht und folgende Ergebnisse dokumentiert: ·Die Struktur und die Größe kationischer Liposomen werden hauptsächlich durch die Lipidzusammensetzung bestimmt. ·Die Bildung von Liposomen-DNA-Komplexen ist mit einer Größenzunahme der Komplexe gekoppelt. ·Die Anzahl gebundener Plasmide steigt mit der Größe der Lipoplexe. ·Gentransferaktive Lipopolyplexe (mit Protaminsulfat komplexierte DNA und DAC-Chol- Liposomen) sind kleiner als Lipoplexe. Ihre Struktur wird von der Zusammensetzung bestimmt. Eine weitere wichtige Frage betrifft den Weg der Gencarrier in der Zelle. Kenntnisse über diese Vorgänge sind vorteilhaft, um die einzelnen Schritte zu verstehen und möglichst gezielt zu verbessern. Bei der Untersuchung der Partikel im Hinblick auf zelluläre Barrieren beim Gentransfer konnten folgende Ergebnisse erzielt werden: ·Die Bindung der Partikel an die Zellmembran und Aufnahme sind abhängig von den eingesetzten Zellen und Komplexen sowie derInkubationszeit. ·Die Aufnahme erfolgt über endozytotische Mechanismen, wobei Lipopolyplexe schneller als Lipoplexe in die Zellen gelangen. Nicht alle gebundenen Komplexe werden aufgenommen. ·Die aufgenommenen Partikel befinden sich in Endosomen und werden ins Innere der Zelle transportiert. ·Freisetzung der DNA und Eintritt in den Zellkern über Kernporen konnte nicht beobachtet werden. ·DNA-haltige Vesikel in Kernnähe deuten auf einen weiteren Mechanismus hin (Vesikeltransfer zum Zellkern). N2 - The aim of this work is the characterisation of several liposome DNA complexes for in vitro gene transfer and uptake as well as their distribution in cultured cell lines using electron microscopy. The particles used were fusogenic liposomes made from Sendai virus, virosomes and cationic liposomes. At first fusogenic liposomes and virosomes were characterised. The results obtained are summarised below: ·Sendai virus can fuse with liposomes made from different lipid composition. ·HVJ-liposomes are detectable using electron microscopy techniques. ·The spikes from HVJ-liposomes have fusogenic properties. ·HVJ-liposomes are not suitable for in vitro gene transfer due to the low amount of fusogenic liposomes leading to low transfection efficiency. ·Virosomes, reconstituted virus envelopes, are another type of fusogenic vesicles. ·Size and morphology of virosomes depends on the addition of an optimised lipid mixture. ·PLL treated DNA is entrapped into virosomes. ·Monoclonal and polyclonal antibodies and protein A gold technique can be used for the detection of viral glycoproteins on virosomes. ·Gold labelled DNA was used to show the distribution in cultured cells. In order to characterise the structure of cationic liposomes following results were obtained: ·Size and structure depends on the lipid composition. ·The formation of liposomes leads to an increase of the size. ·Larger lipoplexes contain more DNA. ·Lipopolyplexes composed of DNA complexed with protamine sulphate and DAC- Chol liposomes are smaller than lipoplexes. Their structure depends on the composition. To improve transfection ability examination of the cellular barriers is useful. With regard to the fate of lipoplexes following results were obtained. ·Binding depends on the cell line, kind of particles and incubation time. ·Uptake occurs through endocytosis. Lipopolyplexes enter the cells faster than larger lipoplexes. ·Lipoplexes are enclosed in endosomes and were carried into the centre of the cell. ·Escape of DNA from endosomes and entry into nucleus were not visible. ·Vesicles with DNA were observed near the nucleus. There is an opportunity for another pathway to the nucleus. KW - Gentherapie KW - kationische Liposomen KW - Virosomen KW - Elektronenmikroskopie KW - gene therapy KW - cationic liposome KW - virosome KW - electron microscopy Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001196 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Peter Michael T1 - Aktivitätsmessung auf nukleinsäuremodifizierten Oberflächen N2 - Im Bereich der medizinischen Diagnostik spielen DNA-Chips eine immer wichtigere Rolle. Dabei werden Glas- oder Silikon-Oberflächen mit Tausenden von einzelsträngigen DNA-Fragmenten, sog. Sonden, bestückt, die mit den passenden DNA-Fragmenten in der zugefügten Patientenprobe verschmelzen. Die Auswertung solcher Messungen liefert die Diagnose für Krankheiten wie z.B. Krebs, Alzheimer oder für den Nachweis pathogener Erreger. Durch fortschreitende Miniaturisierung dieser Meßsysteme können bis zu 40.000 Genfragmente des Menschen in einer einzigen Messung analysiert werden. Neben den DNA-Fragmenten können Bio-Chips auch für andere biologische Komponenten wie Antikörper und Proteine eingesetzt werden, wobei bei letzteren neben der Bindung auch die Aktivität ein wichtiger Diagnoseparamter ist. Am Fraunhofer-Institut für medizinische Technik und am Lehrstuhl für Analytische Biochemie der Universität Potsdam wurden im Rahmen einer Doktorarbeit Methoden entwickelt, die es ermöglichen auf nukleinsäuremodifizierten Sensoroberflächen die Aktivität von Proteinen zu messen. Es wurden Nukleinsäuren auf Oberflächen optischer Sensoren verankert. Diese fungierten als Rezeptor für die Proteine sowie auch als Substrat für Restriktionsenzyme, die Nukleinsäuren schneiden und Polymerasen, die Nukleinsäuren synthetisieren und verlängern können. Seine Anwendung fand diese Messmethode in der Messung der Aktivität des Proteins Telomerase, das in 90% aller Tumore erhöhte Aktivität gegenüber gesunden Zellen aufweist. Die Vorteile dieses neuen Assays gegenüber älteren Methoden liegt im Verzicht auf radioaktiv-markierten Komponenten und einer deutlich verkürzten Analysezeit. Die Arbeit schliesst mit einem funktionsfähigen Nachweis der Telomeraseaktivität im Zellextrakt von gesunden und kranken Zellen. Der direkte Einfluß von Hemmstoffen auf die Aktivität konnte sichtbar gemacht werden, und steht daher bei der Entwicklung neuer Tumor-Diagnostika und Therapeutika zur Verfügung. N2 - In the field of medical diagnostic the importance of DNA chips is growing continuously. On silica surfaces hundreds of single stranded DNA fragments are immobilised which finally detect the complementary sequences in samples of patients by hybridisation. These methods enable the detection of serious diseases as cancer, Alzheimer's disease or infection by pathogens. Biomolecules as nucleic acids, antibodies and proteins can be used as receptors on the solid surfaces whereas in case of proteins not only the binding but also the activity are of high interest for medical diagnosis. In this thesis a biosensoric approach has been developed to determine the activity of nucleic-acid modifying enzymes. Optical sensors as, e.g., the grating coupler, were used to monitor the association and dissociation of unlabeled compounds on the sensor surface in real time, by virtue of evanescent-field. Furthermore sensors based on total internal reflection fluorescence measured the activity of restriction enzymes and polymerases. The general approach included the immobilisation of oligonucleotides which acted as the receptor for the enzymes as well as the substrate for the enzymatic reaction. Enzymes as EcoRI and Klenow were used to establish a model system to measure the activity of DNA-modifying enzymes on optical surfaces. As most nucleic acid detection systems use amplification steps such as polymerase chain reaction (PCR) to increase the amount of the probe the new optical systems facilitated the analysis of the enzymatic activity by measuring the DNA-synthesis or restriction directly. These systems were finally used to detect the activity of the telomerase, an enzymatic marker for the cancerous development of cells. In 90% of cancer cells the activity of telomerase is higher than in normal cells. Additionally the increase of the telomerase activity in cells induced by carcinogenic substances was detected. Furthermore no purification steps of the samples were required as all measurements were performed with crude cell extract. Also the effect of inhibitors of the telomerase could be shown in real time measurements underlining the potential of this assay for further developments of new cancer therapeutics. KW - Aktivitätsmessung KW - optische Biosensoren KW - Nukleinsäuren KW - Telomerase KW - Telomerase KW - TRAP-assay KW - fibre optic KW - G-quartettes KW - grating coupler KW - on-chip enzymatic assay Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000797 ER - TY - THES A1 - Pacholsky, Dirk T1 - Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte während der Muskelentwicklung N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei humane Varianten des von Wang et al., 1999, erstmals beschriebenen muskelspezifischen Proteins Xin (Huhn und Maus) über Sequenzanalyse, Immunofluoreszenzmikroskopie, Transfektionsstudien und biochemischer Analyse näher charakterisiert. Die Proteine wurden mit human Xin related proteins 1 und 2 – hXirp1 und 2 –bezeichnet. Die Xin-Proteine enthielten bisher unbekannte, sowie spezifische, repetitive Motive, die aus jeweils mindestens 16 Aminosäuren bestanden. Ihre Aminosäuresequenz, mit einer Vielzahl weiterer putativer Motivsequenzen, verwies auf eine potentielle Funktion von hXirp als Adapterprotein in Muskelzellen. Das hier näher untersuchte hXirp1 lokalisierte an den Zell-Matrix-Verbindungen der Muskel-Sehnen-Übergangszone im Skelettmuskel, sowie an den Zell-Zell-Verbindungen der Glanzstreifen im Herzmuskel. Während der Muskelentwicklung zeigte hXirp1 eine sehr frühe Expression, zusammen mit einer prägnanten Lokalisation an den Prämyofibrillen und deren Verankerungsstrukturen, die auf eine Funktion des Proteins in der Myofibrillogenese deuten. Ektopische Expressionen von hXirp1 in einer Vielzahl von Nichtmuskel-Kulturzellen zeigten wiederum eine Lokalisation des Proteins an den Zell-Matrix-Kontakten dieser Zellen. Am Beispiel von hXirp1 und 2 wurde stellvertretend für die Familie der Xin-Proteine gezeigt, daß es sich bei den repetitiven Motiven um neuartige, F-Aktin bindende Sequenzmotive handelte. Die Xin-Proteine können somit als muskelspezifische, aktinbindende, potentielle Adapterproteine bezeichnet werden, denen eine strukturelle und funktionelle Beteiligung an der Verankerung der Myofibrillen im adulten Muskel, wie auch während der Myofibrillogenese zukommt. N2 - The scope of this work was a further characterization of two human variants of the protein Xin which was reported for chicken and mouse in 1999 by Wang et al. Therefor sequence analysis, immunofluorescence microscopy, transfection studies and biochemical approaches were utilized. The proteins were named human Xin related proteins 1 und 2 – hXirp1 und 2. Xin-proteins possess specific repetitive motives consisting of a minimum of 16 amino acids each. Concerning further putative motive sequences hXirp is a potential adapter protein in the muscle cell. hXirp1 localized within the cell-matrix-contacts of the myotendinous junction in skeletal muscle as well as within the cell-cell-contacts of the intercalated disc in the cardiac muscle. During the development of muscle cells hXirp1 showed early expression as well as concise localization to premyofibrils and their anchorage structures indicating a potential role for this protein in myofibrillogenesis. Ectopic expression of hXirp1 in several non-muscle cells again revealed localization of this protein to cell-matrix contacts. Considering hXirp1 and 2 as an example for all Xin-proteins it was shown that the repetitive motives are new actin binding motives. The data indicated the Xin-proteins as muscle specific, actin binding and potential adapter proteins with implications in structure and function of anchorage of myofibrils in adult muscle and myofibrillogenesis. KW - Muskel KW - Muskel-Sehnen-Verbindung KW - Glanzstreifen KW - Xin KW - muscle KW - myotendinous junction KW - intercalated disc KW - Xin Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001161 ER - TY - THES A1 - Möseneder, Jutta M. T1 - Effekt einer ad libitum verzehrten fettreduzierten Kost, reich an Obst, Gemüse und Milchprodukten auf den Blutdruck bei Borderline-Hypertonikern N2 - In der randomisierten, multizentrischen DASH-Studie (Dietary Approaches to Stop Hy-pertension), die unter kontrollierten Bedingungen stattfand, führte eine fettreduzierte Mischkost, reich an Obst, Gemüse und Milchprodukten, bei Borderline-Hypertonikern zu einer signifikanten Blutdrucksenkung. Während der Studienphase wurden Körpermasse, Natrium-Aufnahme sowie Alkoholzufuhr aufgrund der bekannten Einflussnahme auf den Blutdruck konstant gehalten. In der eigenen Pilot-Studie sollte untersucht werden, ob das Ergebnis der DASH-Studie (i) mit deutschen Hypertonikern und (ii) unter habituellen Ernährungs- und Lebensbedingungen mit regelmäßig durchgeführter Ernährungsberatung und ad libitum Verzehr anstelle des streng kontrollierten Studienansatzes bestätigt werden kann. Eine Konstanz der Körpermasse, der Natrium-Urinausscheidung (unter diesem Studienansatz valider als die Aufnahme) und des Alkoholkonsums wurde vorausgesetzt. Die Studienpopulation setzte sich aus 53 übergewichtigen Probanden mit einer nicht medikamentös therapierten Borderline-Hypertonie und ohne Stoffwechselerkrankungen zusammen. Die Studienteilnehmer wurden randomisiert entweder der Idealgruppe mit einer fettarmen Kost reich an Milchprodukten, Obst und Gemüse (ähnlich der DASH-Idealgruppe) oder der Kontrollgruppe mit habitueller Ernährungsweise zugeteilt. Über einen Zeitraum von fünf Wochen wurde den Probanden etwa 50% ihres täglichen Lebensmittelbedarfes entsprechend ihrer Gruppenzugehörigkeit kostenfrei zur Verfügung gestellt. Gelegenheitsblutdruckmessungen und 24h-Blutdruckmessungen, Ernährungs- und Aktivitätsprotokolle, Blut- und Urinproben sowie anthropometrische Messungen wurden vor, während und fünf Wochen nach der Interventionsphase durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass in der Idealgruppe keine signifikante Blutdrucksenkung beobachtet werden konnte. Dies lässt sich durch die Tatsache erklären, dass die Lebens-mittel- und Nährstoffaufnahme der deutschen Kontrollgruppe eher der amerikanischen Idealgruppe entsprach. In der Pilot-Studie waren die Unterschiede in der Nährstoffzufuhr zwischen den beiden Gruppen viel geringer als in der DASH-Studie; für eine blutdrucksenkende Ernährungsumstellung bestand somit nur ein geringer Spielraum. Eine weitere Erklärung besteht in der unterschiedlichen Zusammensetzung der Studienpopulation. Bei DASH wurden vorwiegend farbige Probanden (40% höhere Hypertonieprävalenz) untersucht. Die Studienergebnisse lassen also den Schluss zu, dass Ernährungs- und Lebensstilgewohnheiten sowie der genetische Hintergrund der entsprechenden Bevölkerungsgruppe bei der Formulierung von nährstoff- oder lebensmittelbezogenen Empfehlungen zur Senkung des Bluthochdruckes Berücksichtigung finden müssen. N2 - The Dietary Approaches to Stop Hypertension trial (DASH), a randomized well-controlled feeding study conducted at 4 medical centers, demonstrated that a low-fat diet, rich in fruits, vegetables and dairy products is able to lower blood pressure of borderline-hypertensive people significantly. Body weight, sodium intake and alcohol consumption were kept constant during the whole study period, due to the known influence on hypertension. Aim of our study project was to investigate whether the results of the DASH study can be confirmed by (i) using a German hypertensive population and (ii) replacing the well-controlled feeding design by allowing ad libitum intake according to dietary ad-vice. The participants were asked to keep their body weight, sodium urine excretion (un-der this study design more valid than sodium intake) and their alcohol consumption con-stant. Our pilot study population consisted of 53 mainly overweight participants with borderline hypertension and without medication or any metabolic disorders. They were randomly assigned to either an ideal diet low in fat and rich in dairy products, fruits and vegetables (similar to the DASH I-group) or a habitual diet as control (C-group). During five weeks the subjects were provided 50 % of their daily intake for free according to their dietary pattern. Single and 24h-blood pressure measurements, dietary weighed and physical activity records, blood and urine samples and anthropometric measurements were collected before, during and five weeks after the intervention period. The study results indicated that no significantly reduction of blood pressure could be observed for both methods in the I-group of our trial. This is due to the fact that the baseline intake of foods and nutrients of the German subjects was nearly corresponding to the intake targeted for the DASH I-group. Therefore, it was impossible to increase the intake of these nutrients in our I-group by the same percentage as in the DASH study. Another explanation may be the different consistency of the study population. About 60% of the DASH study population were African Americans with a known higher prevalence of hy-pertension (about 40%) than Caucasians. The conclusion is that even convincing results of a controlled trial cannot be simply transferred into dietary advice for the general public. For addressing food-based dietary guidelines to reduce the risk of hypertension it is necessary to consider the genetic background as well as the dietary and the lifestyle situation of the target population carefully. KW - Hypertonie KW - Ernährungsfaktoren KW - Pilot-Studie KW - DASH-Studie KW - ad libitum-Verzehr KW - Hypertension KW - nutrients KW - pilot study KW - DASH study KW - ad libitum consumption Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000345 ER - TY - THES A1 - Werner, Deljana T1 - Versuche zur Gewinnung von katalytischen Antikörpern zur Hydrolyse von Arylcarbamaten und Arylharnstoffen T1 - Attempts to produce catalytic antibodies for hydrolysis of arylcarbamates and arylureas N2 - Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, katalytische Antikörper zur Hydrolyse von Benzylphenylcarbamaten sowie zahlreiche monoklonale Antikörper gegen Haptene herzustellen. Es wurden verschiedene Hapten-Protein-Konjugate unter Verwendung unterschiedlicher Kopplungsmethoden hergestellt und charakterisiert. Zur Generierung der hydrolytisch aktiven Antikörper wurden Inzuchtmäuse mit KLH-Konjugaten von 4 Übergangszustandsanaloga (ÜZA) immunisiert. Mit Hilfe der Hybridomtechnik wurden verschiedene monoklonale Antikörper gegen diese ÜZA gewonnen. Dabei wurden sowohl verschiedene Immunisierungsschemata als auch verschiedene Inzuchtmausstämme und Fusionstechniken verwendet. Insgesamt wurden 32 monoklonale Antikörper gegen die verwendeten ÜZA selektiert. Diese Antikörper wurden in großen Mengen hergestellt und gereinigt. Zum Nachweis der Antikörper-vermittelten Katalyse wurden verschiedene Methoden entwickelt und eingesetzt, darunter immunologische Nachweismethoden mit Anti-Substrat- und Anti-Produkt-Antikörpern und eine photometrische Methode mit Dimethylaminozimtaldehyd. Der Nachweis der hydrolytischen Aktivität gelang mit Hilfe eines Enzymsensors, basierend auf immobilisierter Tyrosinase. Die Antikörper N1-BC1-D11, N1-FA7-C4, N1-FA7-D12 und R3-LG2-F9 hydrolysierten die Benzylphenylcarbamate POCc18, POCc19 und Substanz 27. Der Nachweis der hydrolytischen Aktivität dieser Antikörper gelang auch mit Hilfe der HPLC. Der katalytische Antikörper N1-BC1-D11 wurde kinetisch und thermodynamisch untersucht. Es wurde eine Michaelis-Menten-Kinetik mit Km von 210 µM, vmax von 3 mM/min und kcat von 222 min-1 beobachtet. Diese Werte korrelieren mit den Werten der wenigen bekannten Diphenylcarbamat-spaltenden Abzyme. Die Beschleunigungsrate des Antikörpers N1-BC1-D11 betrug 10. Das ÜZA Hei3 hemmte die hydrolytische Aktivität. Dies beweist, dass die Hydrolyse in der Antigenbindungsstelle stattfindet. Weiter wurde zwischen der Antikörperkonzentration und der Umsatzgeschwindigkeit eine lineare Abhängigkeit festgestellt. Die thermodynamische Gleichtgewichtsdissoziationskonstante KD des Abzyms von 2,6 nM zeugt von einer sehr guten Affinität zum ÜZA. Hydrolytisch aktiv waren nur Antikörper, die gegen das Übergangszustandsanalogon Hei3 hergestellt worden waren. Es wird vermutet, dass die Hydrolyse der Benzylphenylcarbamate über einen Additions-Eliminierungsmechanismus unter Ausbildung eines tetraedrischen Übergangszustandes verläuft, dessen analoge Verbindung Hei3 ist. Im Rahmen der Generierung von Nachweisantikörpern zur Detektion der Substratabnahme bei der Hydrolyse wurden Anti-Diuron-Antikörper hergestellt. Einer der Antikörper (B91-CG5) ist spezifisch für das Herbizid Diuron und hat einen IC50-Wert von 0,19 µg/l und eine untere Nachweisgrenze von 0,04 µg/l. Ein anderer Antikörper (B91-KF5) reagiert kreuz mit einer Palette ähnlicher Herbizide. Mit diesen Antikörpern wurde ein empfindlicher Labortest, der ein Monitoring von Diuron auf Grundlage des durch die Trinkwasserverordnung festgeschriebenen Wertes für Pflanzenschutzmittel von 0,1 µg/l erlaubt, aufgebaut. Der Effekt der Anti-Diuron-Antikörper auf die Diuron-inhibierte Photosynthese wurde in vitro und in vivo untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass sowohl in isolierten Thylakoiden, als auch in intakten Algen eine Vorinkubation der Anti-Diuron-Antikörper mit Diuron zur Inaktivierung seiner Photosynthese-hemmenden Wirkung führt. Wurde der Elektronentransport in den isolierten Thylakoiden oder in Algen durch Diuron unterbrochen, so führte die Zugabe der Anti-Diuron-Antikörper zur Reaktivierung der Elektronenübertragung. N2 - Attempts to produce catalytic antibodies for hydrolysis of arylcarbamates and arylureas: The aim of the investigations was to produce antibodies which are able to cleave herbicides resistant to naturally occuring enzymes. Structurally similar carbamate and urea derivatives were chosen for the experiments. Phosphonate derivatives were synthesized that mimick possible transition state analogues in structure and charge. Mice were immunized with 4 different derivatives after conjugating them to carrier proteins. 32 hybridomas were established that produce monoclonal antibodies binding to these derivatives. The possible cleavage of substrates was determined by immunoassays with monoclonal antibodies against the substrate and the products and with a photometric method based on dimethylaminocinammonaldehyde. The measuring of cleavage products was succeeded by an amperometric method. The enzyme sensor was based on immobilized tyrosinase which oxidizes p-chlorophenol and phenol. The antibodies N1-BC1-D11, N1-FA7-C4, N1-FA7-D12 und R3-LG2-F9 hydrolysed the benzylphenylcarbamates POCc18, POCc19 und Substance 27. The hydrolytic activity of these antibodies was also succeeded with HPLC. The catalytic antibody N1-BC1-D11 was investigated kinetically and thermodynamically. A Michaelis-Menten-Kinetic was observed (at pH 8.0 exhibited a Km 210 µM, a vmax 3 mM/min and a kcat 222 min-1). These values are in the range of the values obtained for the antibody-catalysed hydrolysis of diphenylcarbamates. The rate enhancement of N1-BC1 was 10. The reaction was completely inhibited by stoichiometric quantities of the transition state analogue Hei3. This is consistent with the affinity of the abzyme to Hei3 of 2.6 nM, determined by BIAcore assay. Only antibodies generated against Hei3 showed hydrolytic activity. The hydrolysis of benzylphenylcarbamates presumably occurs via an addition-elimination-Mechanism involving a tetrahedral intermediate. In summary, this work presents the first example of antibody-catalysed hydrolysis of benzylphenylcarbamates. Monoclonal anti-diuron antibodies were generated that bind to the herbicide diuron with an extremely low equilibrium dissociation constant. A sensitive immunoassay with a low detection limit of 0.2 nM for diuron was established. This is the most sensitive immunological method for detection of diuron known so far. These antibodies were also used in vitro and in vivo to prevent diuron-dependent inhibition of photosynthesis or to restore photosynthesis after inhibition. In isolated thylakoids prepared from spinach leaves (Spinacia oleracea L.) the diuron-inhibited Hill reaction was reconstituted immediately following the addition of the monoclonal antibodies. In an in vivo approach the photosynthetic oxygen evolution of the cell wall deficient mutant (cw 15) of the green alga Chlamydomonas reinhardtii Dangeard was monitored. The antibodies prevented the diuron-dependent inhibition of photosynthesis and restored photosynthesis after inhibition. Transgenic plants that synthesize and accumulate these antibodies or antibody fragments and are therefore diuron-resistant can be created. KW - katalytische Antikörper KW - Arylcarbamate KW - Arylharnstoffe KW - monoklonale Antikörper KW - Haptene KW - Diuron KW - Anti-Diuron-Antikörper KW - Herbizide KW - Photosynthese KW - catalytic antibodies KW - arylcarbamates KW - arylureas KW - monoclonal antibodies KW - haptens KW - diuron KW - anti-diuron-antibodies KW - herbicides KW - photosynthesis Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000463 ER -