TY - THES A1 - Senger, Toralf T1 - Untersuchungen zur Metallhomöostase in Arabidopsis thaliana T1 - Investigations to study metal homeostasis in Arabidopsis thaliana N2 - Alle Organismen sind für ihr Überleben auf Metalle angewiesen. Hierbei gibt es für jedes Metall einen Konzentrationsbereich, der das Optimum zwischen Metallmangel, -bedarf und -toxizität darstellt. Es gilt mittlerweile als erwiesen, dass alle Organismen zur Aufrechterhaltung des Metallgleichgewichts ein komplexes Netzwerk von Proteinen und niedermolekularen Verbindungen entwickelt haben. Die molekularen Komponenten dieses Netzwerks sind nur zu einem Teil bekannt und charakterisiert: In den letzten Jahren wurden einige Proteinfamilien identifiziert, deren Mitglieder Metalle durch Lipidmembranen transportieren. Eine dieser Metalltransporterfamilien ist die Cation Diffusion Facilitator (CDF)-Familie: Alle charakterisierten Mitglieder exportieren Metalle aus dem Zytoplasma – entweder in zelluläre Kompartimente oder aus der Zelle heraus. Von den zwölf Mitgliedern dieser Familie in Arabidopsis thaliana (A. thaliana) – Metall Toleranz Protein (MTP)-1 bis -12 – wurden bisher AtMTP1 und AtMTP3 charakterisiert. In dieser Arbeit wird die Charakterisierung von AtMTP2 beschrieben. Wie die homologen Proteine AtMTP1 und AtMTP3 führt AtMTP2 zu Zn-Toleranz, wenn es heterolog in Zn-sensitiven Hefemutanten exprimiert wird. Mit AtMTP2 transformierte Hefemutanten zeigten darüber hinaus erhöhte Co-Toleranz. Expression von chimären AtMTP2/GFP Fusionsproteinen in Hefe, A.thaliana protoplasten und in stabil transformierten A.thalinana Planzenlinien deutet auf Lokalisation of AtMTP2 in Membranen des Endoplasmatischen Retikulums (ER) hin, wenn GFP an den C-Terminus von MTP2 fusioniert wird. Fusion of GFP an den N-Terminus von AtMTP2 führte zu Lokalisation in der vakuolären Membran, was wahrscheinlichsten auf Fehllokalisierung durch Maskierung eines ER-Retentionsmotivs (XXRR) am N-Terminus von AtMTP2 zurückgeht. Dies legt nahe, dass AtMTP2 die erwähnten Metalle in das Endomembransystem der Zelle transportieren kann. Eine gewebespezifische Lokalisierung wurde mit Pflanzen durchgeführt, die das β-Glucuronidase (GUS)-Reporterprotein bzw. chimäre Fusionsproteine aus EGFP und AtMTP2 unter Kontrolle des nativen pMTP2-Promotors exprimierten. Diese Experimente bestätigten zum einen, dass der pMTP2-Promotor nur unter Zn-Defizienz aktiv ist. GUS-Aktivität wurde unter diesen Bedingungen in zwei Zonen der Wurzelspitze beobachtet: in den isodiametrischen Zellen der meristematischen Zone und in der beginnenden Wurzelhaarzone. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die EGFP-Fusionsproteine unter Kontrolle des nativen pMTP2-Promotors nur in epidermalen Zellen exprimiert werden. Für eine homozygote Knockout- Linie, mtp2-S3, konnte bisher kein eindeutiger Phänotyp identifiziert werden. Auf Grundlage der bisher durchgeführten Charakterisierung von AtMTP2 erscheinen zwei Modelle der Funktion von AtMTP2 in der Pflanze möglich: AtMTP2 könnte essentiell für die Versorgung des ER mit Zn unter Zn-Mangelbedingungen sein. Hierfür spricht, dass AtMTP2 in jungen, teilungsaktiven und damit Zn-benötigenden Wurzelzonen exprimiert wird. Die auf die Epidermis beschränkte Lokalisation könnte bei diesem Modell auf die Möglichkeit der zwischenzellulären Zn-Verteilung innerhalb des ER über Desmotubules hindeuten. Alternativ könnte AtMTP2 eine Funktion bei der Detoxifizierung von Zn unter Zn-Schock Bedingungen haben: Es ist bekannt, dass unter Zn- Mangelbedingungen die Expression der zellulären Zn-Aufnahmesysteme hochreguliert wird. Wenn nun die Zn-Verfügbarkeit im Boden z. B durch eine pH-Änderung innerhalb kurzer Zeit stark ansteigt, besteht die Notwendigkeit der Entgiftung von Zn innerhalb der Zelle, bis der starke Einstrom von Zn ins Zytoplasma durch die Deaktivierung der Zn-Aufnahmesysteme und einer geringeren Expression in der Pflanze gedrosselt ist. Ein ähnlicher Mechanismus wurde in der Bäckerhefe S. cerevisae beschrieben, in der darüber hinaus ein Zn-Transporter verstärkt exprimiert wird, der Zn durch Transport in die Vakuole entgiften kann. Es ist durchaus möglich, dass in Arabidopsis AtMTP2 die Zn-Detoxifizierung unter diesen speziellen Bedingungen durch Zn-Transport in das ER oder die Vakuole vermittelt. Zur Identifikation weiterer Komponenten des Metallhomöostasenetzwerks sind verschiedene Ansätze denkbar. In dieser Arbeit wurde in Hefe ein heterologer Screen durchgeführt, um Interaktoren für vier Mitglieder der Arabidopsis-CDF-Familie zu identifizieren. Unter den 11 im Hefesystem bestätigten Kandidaten befindet sich mit AtSPL1 ein AtMTP1-Interaktionskandidat, der möglicherweise eine Rolle bei der Cu-,Zn-Homöostase spielt. Als wahrscheinliche AtMTP3-Interaktionskandidaten wurde die c”-Untereinheit der vakuolären H+-ATPase AtVHA identifiziert sowie mit AtNPSN13 ein Protein, das vermutlich eine Rolle bei Fusionen von Vesikeln mit Zielmembranen spielt. Ein anderer Ansatz zur Identifikation neuer Metallhomöostasegene ist die vergleichende Elementanalyse von natürlichen oder mutagenisierten Pflanzenpopulationen. Voraussetzung für diesen Ansatz ist die schnelle und genaue Analyse des Elementgehalts von Pflanzen. Eine etablierte Methode zur simultanen Bestimmung von bis zu 65 Elementen in einer Probe ist die Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry (ICP OES). Der limitierende Faktor für einen hohen Probendurchsatz ist die Notwendigkeit, Proben für die Analyse zu verflüssigen. Eine alternative Methode der Probenzuführung zum Analysegerät ist die elektrothermale Verdampfung (ETV) der Probe. Zur weitgehend automatisierten Analyse von Pflanzenmaterial mit minimiertem Arbeitsaufwand wurde eine Methode entwickelt, die auf der Kopplung der ETV mit der ICP OES basiert. N2 - All organisms require for their survival essential metals. For each required metal exists an optimal concentration between metal deficiency and -toxicity. It has become evident that all organisms developed a complex network of proteins and low molecular compounds to maintain the equilibrium between all metals. Only few molecular components of this metal-homeostasis network are characterized in detail: A number of protein families whose members transport metals over the barrier of lipid-membranes have been identified during the last couple of years. One of those metal-transport families is the Cation Diffusion Facilitator (CDF) family. All characterized members export metals from the cytoplasm – either into cellular compartments or outside the cell. From the 12 Arabidopsis thaliana (A.thaliana) members – Metal Tolerance Protein (MTP)-1 to 1-2 – only MTP1 and MTP3 have been characterized yet. In this work, characterization of MTP2 is described. As was found for the homologous proteins AtMTP1 and AtMTP3, heterologous expression of AtMTP2 in Zn-sensitive yeast mutants leads to enhanced Zn-tolerance. Less pronounced, enhanced tolerance was also found for Co when AtMTP2 was expressed in Co sensitive yeast mutants. Expression of chimeric AtMTP2/GFP fusion proteins in yeast, A.thaliana protoplasts and in stably transformed A.thalinana plant lines indicated localization of MTP2 in membranes of the endoplasmic reticulum, when GFP was fused to the C-terminal end of MTP2. Fusion of GFP to the N-terminal end of MTP2 lead to vacuolar localization that is most likely explained as mistargeting due to masking of an ER retrieval motive (XXRR) found at the N-terminus of MTP2. This suggests that AtMTP2 mediates the transport of Zn and Co into the endomembrane system of the cell. Tissue specific localization was performed with plant lines expressing the β-Glucuronidase (GUS) reporter protein and with plant lines expressing chimeric fusions of GFP with AtMTP2 under control of the native pMTP2 promoter. Those experiments confirmed Affymetrix Genechip® data suggesting activity of the pMTP2 promoter only under Zn-deficiency. GUS activity was only found under Zn-deficiency in two zone of root tips – the meristematic zone, characterized by isodiamtric cells, and in the beginning differentiation zone, characterized by appearing root hairs. Confocal microscopy with plant lines expressing chimeric MTP2 /GFP fusions demonstrated that expression of AtMTP2 is restricted to epidermal cells. A phenotype for the homozygous mtp2-S3 knockout mutant could not be identified yet. Based on the data obtained as yet , two mode of action of AtMTP2 in planta seam likely: AtMTP2 could be essential for delivery of Zn to the ER under Zn-deficiency. This is supported by the fact, that AtMTP2 is active in young, dividing (and therefore Zn-requiring) zones of the root. The epidermal-restricted expression of AtMTP2 points towards a distribution of Zn in these root zones of Zn within desmotubules. Alternatively, AtMTP2 could have a Zn-detoxifying function under Zn-shock. It is known that in yeast under Zn-deficiency not only the expression of an Zn-uptake transporter is up-regulated, but also the expression of a vacuolar Zn-transporter. It mediates Zn-detoxification of surplus Zn that enters cells upon Zn-resupply before shut down of the Zn uptake system. AtMTP2 could exert this function when soil Zn-availability raises suddenly, for example due to rain after a drought. Different means/methods are perceivable to identify further components of the metal homeostasis network. In this work, a heterologuos screen was performed in yeast to identify interacting proteins for four members of the Arabidopsis CDF-family. Among 11 candidates identified and confirmed in the Split Ubiquitin System (SUS, a Yeast-2-Hybrid variant) is with AtSPL1 an AtMTP1 interaction candidate, which plays putatively a role in Zn,Cu homoestasis. The c” subunit of the vacuolar H+-ATPase AtVHA was found as likely AtMTP3-interaction candidate, as well as AtNPSN13, an protein that plays putatively a role in fusion of vesicles with target-membranes. Another method to identify new metal homeostasis genes is the comparative elemental analysis of natural and mutagenized plant populations. Prerequisite for this approach is the fast and accurate analysis of the elemental composition of plants. An established method for elemental analysis is Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry (ICP OES). The limiting factor for high thoughput is the requirement for laborious wet digest of plant samples before analysis. An alternative mean of sample delivery to the ICP OES is electrothermal vaporization (ETV). For faster, less laborious analysis of plant material, a method based on the established coupling of ETV with ICP OES was developed, which is optimized for plant material and automated as far as possible. KW - CDF KW - MTP KW - MTP1 KW - MTP2 KW - MTP3 KW - Interaktoren KW - Split Ubiquitin KW - ETV KW - ICP OES KW - CDF KW - MTP KW - MTP1 KW - MTP2 KW - MTP3 KW - Interactors KW - Split Ubiquitin KW - ETV KW - ICP OES Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-13234 ER - TY - THES A1 - Andres, Janin T1 - Untersuchungen über Regulationsmechanismen der 11beta-Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ 1 T1 - Analysis of regulation of 11beta-Hydroxysteroid dehydrogenase type 1 N2 - Die 11beta-HSD1 reguliert intrazellulär die Cortisolkonzentration durch Regeneration von Cortison z.B. aus dem Blutkreislauf, zu Cortisol. Daher stellt diese ein wichtiges Element in der Glucocorticoid-vermittelten Genregulation dar. Die 11beta-HSD1 wird ubiquitär exprimiert, auf hohem Niveau besonders in Leber, Fettgewebe und glatten Muskelzellen. Insbesondere die Bedeutung der 11beta-HSD1 in Leber und Fettgewebe konnte mehrfach nachgewiesen werden. In der Leber führte eine erhöhte Aktivität aufgrund einer Überexpression in Mäusen zu einer verstärkten Gluconeogeneserate. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Expression und erhöhte Enzymaktivität der 11beta-HSD1 im subkutanen und viszeralen Fettgewebe assoziiert ist mit Fettleibigkeit, Insulinresistenz und Dyslipidämie. Über die Regulation ist jedoch noch wenig bekannt. Zur Untersuchung der Promotoraktivität wurde der Promotorbereich von -3034 bis +188, vor und nach dem Translations- und Transkriptionsstart, der 11beta-HSD1 kloniert. 8 Promotorfragmente wurden mittels Dual-Luciferase-Assay in humanen HepG2-Zellen sowie undifferenzierten und differenzierten murinen 3T3-L1-Zellen untersucht. Anschließend wurde mittels nicht-radioaktiven EMSA die Bindung des TATA-Binding Proteins (TBP) sowie von CCAAT/Enhancer-Binding-Proteinen (C/EBP) an ausgewählte Promotorregionen analysiert. Nach der Charakterisierung des Promotors wurden spezifische endogene und exogene Regulatoren untersucht. Fettsäuren modifizieren die Entstehung von Adipositas und Insulinresistenz. Ihre Wirkung wird u.a. PPARgamma-abhängig vermittelt und kann durch das Inkretin (Glucose-dependent insulinotropic Peptide) GIP modifiziert werden. So wurden die Effekte von unterschiedlichen Fettsäuren, vom PPARgamma Agonisten Rosiglitazon sowie dem Inkretin GIP auf die Expression und Enzymaktivität der 11beta-HSD1 untersucht. Dies wurde in-vitro-, tierexperimentell und in humanen in-vivo-Studien realisiert. Zuletzt wurden 2 Single Nucleotide Polymorphismen (SNP) im Promotorbereich der 11beta-HSD1 in der Zellkultur im Hinblick auf potentielle Funktionalität analysiert sowie die Assoziation mit Diabetes mellitus Typ 2 und Körpergewicht in der MeSyBePo-Kohorte bei rund 1.800 Personen untersucht. Die Luciferase-Assays zeigten basal eine zell-spezifische Regulation der 11beta-HSD1, wobei in allen 3 untersuchten Zelltypen die Bindung eines Repressors nachgewiesen werden konnte. Zudem konnte eine mögliche Bindung des TBPs sowie von C/EBP-Proteinen an verschiedene Positionen gezeigt werden. Die Transaktivierungsassays mit den C/EBP-Proteinen -alpha, -beta und -delta zeigten eben-falls eine zellspezifische Regulation des 11beta-HSD1-Promotors. Die Aktivität und Expression der 11beta-HSD1 wurde durch die hier untersuchten endogenen und exogenen Faktoren spezifisch modifiziert, was sowohl in-vitro als auch in-vivo in unterschiedlichen Modellsystemen dargestellt werden konnte. Die Charakterisierung der MeSyBePo-Kohorte ergab keine direkten Assoziationen zwischen Polymorphismus und klinischem Phänotyp, jedoch Tendenzen für eine erhöhtes Körper-gewicht und Typ 2 Diabetes mellitus in Abhängigkeit des Genotyps. Der Promotor der 11beta-HSD1 konnte aufgrund der Daten aus den Luciferaseassays sowie den Daten aus den EMSA-Analysen näher charakterisiert werden. Dieser zeigt eine variable und zell-spezifische Regulation. Ein wichtiger Regulator stellen insbesondere in den HepG2-Zellen die C/EBP-Proteine -alpha, -beta und -delta dar. Aus den in-vivo-Studien ergab sich eine Regulation der 11beta-HSD1 durch endogene, exogene und pharmakologische Substanzen, die durch die Zellkulturversuche bestätigt und näher charakterisiert werden konnten. N2 - The enzyme 11beta-HSD1 regulates intracellular the cortisol concentration by regeneration of cortisone to cortisol. Hence, 11beta-HSD1 is an important factor in glucocorticoid-mediated gene expression. It is ubiquitously expressed, but high levels have been specifically described in liver, adipose tissue and smooth muscle cells. A pivotal role for 11beta-HSD1 has been demonstrated with respect to metabolism in liver and adipose tissue. Thus, a liver-specific overexpression results in an elevated gluconeogenesis and hepatic glucose output. Furthermore, a fat-specific overexpression was associated with obesity, insulin resistance and dyslipidemia. Despite these intriguing data, the regulation of the human 11beta-HSD1 gene is still in its infancies. 8 promoter fragments from -3034 to +188 of 11beta-HSD1-gene were cloned to analyze promoter activity. Dual-Luciferase-Assay was used in humane HepG2 cells and in undifferentiated and differentiated 3T3-L1 cells. Furthermore, the region close to the transcription start was studied with a non-radioactive EMSA for binding of TATA-binding protein (TBP) and CCAAT/enhancer-binding-protein (C/EBP). The role of the endogenous and exogenous regulators fatty acids, PPARgamma and the incretin (Glucose-dependent insulinotropic Peptide) GIP was investigated in-vitro and in-vivo. Finally, the functional consequences of 2 Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) within the promoter region were studied in cell culture and the MeSyBePo-cohorts for association with diabetes mellitus type 2 and body weight. The Luciferase-assay revealed a cell-specific regulation of 11beta-HSD1 and a repressor, which was active in all 3 cell models. Accordingly, a cell-specific regulation was observed in transactivation-assays with C/EBP-proteins -alpha, -beta and -delta. The 11beta-HSD1 enzyme expression and activity was specifically modified by the here investigated endogenous and exogenous factors, which was demonstrated in-vitro but also in-vivo in various experimental settings. The characterisation of the MeSyBePo-cohorte revealed no association between genotype and clinical phenotype, although a trend for an increased body weight and diabetes mellitus type 2 was detected. This work demonstrated a cell-specific regulation of the 11beta-HSD1 promoter. Furthermore, a binding site for TATA-binding proteins was detected in HepG2 and undifferentiated 3T3-L1 cells. A pivotal role in regulation of 11beta-HSD1 promoter activity was demonstrated for the C/EBP-proteins, especially in liver cells. The in-vivo-Studies revealed a regulation of enzyme expression and activity by endogenous, exogenous and pharmacological substances, which was confirmed and analyzed in more detail in cell culture experiments. KW - Promotor KW - 11beta-HSD1 KW - Fettleibigkeit KW - Diabetes KW - Regulation KW - Promoter KW - 11beta-HSD1 KW - Obesity KW - Diabetes KW - Regulation Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-33033 ER - TY - THES A1 - Wieneke, Nadine T1 - Ursachen und Folgen vermehrter Expression des nukleären Rezeptors Constitutiver-Androstan-Rezeptor (NR1I3) durch Agonisten des nukleären Rezeptors Peroxisomenproliferator-aktivierter-Rezeptor-alpha (NR1C1) T1 - Cause and Effect of enhanced expression of the nuclear receptor constitutive androstane receptor (NR1I3) induced by agonists of the nuclear receptor peroxisome proliferator activated receptor alpha (NR1C1) N2 - Der Fettsäurestoffwechsel unterliegt vielfältigen Kontrollmechanismen. So wird der Fettsäureabbau über die Induktion und Aktivität spezifischer Enzyme reguliert. Ein zentraler Regulator ist dabei der nukleäre Rezeptor Peroxisomenproliferator-aktivierter-Rezeptor-α (PPARα). PPARα wird durch freie Fettsäuren in der Zelle aktiviert und fördert über die Induktion von Zielgenen den Fettsäuretransport und -abbau sowie die Gluconeogenese und Ketogenese. Der Anstieg an freien Fettsäuren beim Fasten, aber auch im Diabetes aktiviert PPARα. Unabhängig davon wurde in beiden Stoffwechsellagen auch eine erhöhte Expression des nukleären Rezeptors Constitutiver-Androstan-Rezeptor (CAR) und einiger CAR-Zielgene, vorrangig Enzyme des Fremdstoffmetabolismus wie Cytochrom P450 2B (CYP2B), festgestellt. Bei der Adaption an eine Fastensituation scheinen PPARα- und CAR-Signalwege über einen bisher unbekannten Mechanismus miteinander verschaltet zu sein. In der vorliegenden Arbeit sollte der der Verschaltung zugrunde liegende Mechanismus anhand eines Modelsystems, der PPARα-Agonisten-vermittelten Verstärkung der Phenobarbital (PB)-abhängigen Induktion des CAR-Zielgens CYP2B, in vitro untersucht werden. Zudem sollte die physiologische Relevanz einer durch PPARα-Agonisten vermittelten Modulierung der CYP2B-Aktivität in einer Ganztierstudie in vivo belegt werden. Die verwendeten synthetischen PPARα-Agonisten steigerten in primären Hepatozyten der Ratte signifikant die Phenobarbital (PB)-abhängige mRNA- und Protein-Expression sowie die Aktivität von CYP2B. Ohne vorherige PB-Behandlung induzierten PPARα-Agonisten CYP2B nicht. In Gegenwart von PB war die Steigerung der CYP2B-Aktivität durch PPARα-Agonisten dosisabhängig. In einem Luciferase-Reportergenassay wurde gezeigt, dass die Induktion durch PB unter der Kontrolle des CYP2B1-Promotors von einem distalen PBREM (PB-responsive-enhancer-module), an welches CAR binden kann, abhängig war. PPARα-Agonisten steigerten diese PB- und PBREM-abhängige Reportergentranskription und induzierten die CAR-mRNA und CAR-Proteinexpression. Sie aktivierten die Transkription eines Reportergens unter der Kontrolle eines Promotorfragments von bis zu 4,4 kb oberhalb des mutmaßlichen CAR-Transkriptionsstarts. Mit Hilfe von Deletionskonstrukten konnte ein potentielles Peroxisomenproliferator-aktivierter-Rezeptor-responsives Element (PPRE) im CAR-Promotorbereich von -942 bp bis -930 bp identifiziert werden, welches essentiell für die Initiation der Transkription durch PPARα-Agonisten ist. In band shift Experimenten akkumulierte verstärkt Kernprotein mit diesem PPRE. Ein Überschuss an unmarkiertem Wildtyp-CAR-Reportergenvektor, nicht aber an CAR-Reportergenvektor mit PPRE-Deletion, konnte mit dem markierten PPRE um die Bindung von Kernprotein konkurrieren. Nach Chromatin-Immunpräzipitation mit einem PPARα-Antikörper wiederum wurde das betreffende PPRE amplifiziert. Bei in vivo Experimenten an männlichen Ratten resultierte die Behandlung mit PPARα-Agonisten in einer signifikanten Induktion der CAR-mRNA-Expression und signifikant erhöhter PB-abhängiger CYP2B-Aktivität. Die physiologisch Relevanz wurde durch weiterführenden Experimente unterstrichen, in denen gezeigt wurde, dass die Fasten-abhängige Induktion von CAR in PPARα-defizienten Mäusen unterdrückt war. Diese Experimente legen nahe, dass durch PPARα-Agonisten aktiviertes PPARα an das PPRE im CAR-Promotorbereich von -942 bp bis -930 bp bindet und dadurch die CAR-Transkription induziert. Somit kann CAR als PPARα-Zielgen betrachtet werden, was die Schlussfolgerung zulässt, dass die PPARα- und CAR-Signalwege über die direkte Bindung von PPARα an den CAR-Promotor unmittelbar miteinander verknüpft sind. Allerdings ist davon unabhängig eine Aktivierung von CAR, etwa durch PB, für die vermehrte Induktion von CAR-Zielgenen notwendig . Die physiologische Relevanz der PPARα-abhängige CAR-Expression zeigt sich in den Ganztierexperimenten, bei denen die Wirksamkeit der PPARα-Agonisten bestätigt werden konnte. CAR-abhängig induzierte Enzyme sind nicht nur in großem Umfang am Fremdstoffmetabolismus beteiligt, sondern auch am Abbau von Schilddrüsenhormonen und Glucocorticoiden. Sie können damit direkt Einfluss auf den Kohlenhydrat- und Energiestoffwechsel sowie die Regulation der Nahrungsaufnahme nehmen. Über eine PPARα-abhängige Induktion von CAR im Rahmen der Fastenadaption könnten die CAR-Zielgene UDP-Glucuronyltransferase 1A1 und Sulfotransferase N beispielsweise verstärkt Schilddrüsenhormone abbauen und in der Folge den Grundumsatz senken. Der in dieser Arbeit erstmals beschriebene Mechanismus ist dafür von zentraler Bedeutung. N2 - Fatty acid metabolism is tightly regulated. Thus the activity and expression level of specific enzymes involved in fatty acid turnover are controlling fatty acid catabolism. The nuclear receptor peroxisome proliferator activated receptor α (PPARα) acts as the key regulator of these pathways. PPARα is activated by intracellular free fatty acids and promotes the fatty acid transport and break down, as well as gluconeogenesis and ketogenesis, via induction of target genes. An increase in free fatty acids as seen in fasting and diabetes activates PPARα. Under these conditions, an elevated expression of another nuclear receptor, the constitutive androstane receptor (CAR) and its target genes, mainly enzymes catalysing biotransformation such as cytochrome P450 2B (CYP2B1), was also observed. It is therefore likely that as yet unidentified modes of interaction between PPARα and CAR signalling exist. The object of the present work was to discover these underlying mechanisms utilising an in vitro model, the PPARα-agonist induced increase of the phenobarbital (PB)-dependent induction of the CAR target gene CYP2B1. Furthermore, an in vivo study would serve to demonstrate the physiological relevance of a PPARα-agonist induced modulation of the CYP2B activity. The synthetic PPARα agonists under investigation significantly enhanced the PB-dependent mRNA and protein expression as well as activity of CYP2B in primary rat hepatocytes. Without prior treatment with PB, PPARα agonists did not induce CYP2B activity. In the presence of PB, PPARα agonists increased the CYP2B activity dose-dependently. Luciferase reporter gene assays showed that the PB-dependent induction of the CY2B1 promoter relied on a distal PBREM (PB-responsive enhancer module), a well-known CAR binding site. PPARα agonists enhanced this PB- and PBREM-dependent reporter gene transcription and induced the upregulation of CAR mRNA and CAR protein expression. The PPARα agonists also activated the transcription of a reporter gene controlled by up to 4.4 kb upstream of the putative CAR-transcription start site. A potential peroxisome proliferator activated receptor responsive element (PPRE), essential for the initiation of transcription by PPARα agonists, could be identified between -942 bp to -930 bp upstream of the transcription start site using CAR promoter deletion constructs. In subsequent band shift experiments, enhanced nuclear protein accumulation with this specific promoter region was observed. In contrast to unlabelled wild-type CAR reporter gene vector, an excess of unlabelled CAR reporter gene vector with PPRE deletion did not compete with the binding of nuclear protein. Furthermore, this PPRE could be amplified with specific primers after chromatin immunoprecipitation with a PPARα antibody. Treatment of rats with a PPARα agonist resulted in a significant induction of CAR mRNA expression and significantly increased PB-dependent CYP2B activity. A physiological relevance of this newly-discovered mechanism is confirmed by the observation that PPARα-deficient mice, unlike wild-type mice, do not respond to fasting with an increase of CAR mRNA expression. The results of these experiments suggest that activated PPARα binds to the PPRE of the CAR promoter to initiate transcription of the CAR gene. CAR therefore could be regarded as a PPARα target gene, which implicates that PPARα- and CAR-signalling are directly linked through binding of PPARα to the CAR promoter. For subsequent enhanced induction of CAR target genes, activation of CAR, for instance using PB, is required. In vivo studies with PPARα agonists in rats support the relevance of the PPARα-dependent CAR expression. CAR target genes code for enzymes that metabolise not only a wide range of xenobiotics, but also thyroid hormones and glucocorticoids. CAR target genes could therefore directly interfere with carbohydrate and energy metabolism, as well as with food intake. PPARα-dependent induction of CAR upon fasting could lead to an increased expression of the CAR target genes UDP-glucuronyl transferase 1A1 and sulfotransferase N, resulting in an enhanced degradation of thyroid hormones, and decreased resting energy expenditure. The findings of this present study are of primary importance since it is the first time that this mechanism has been described. KW - Fremdstoffmetabolismus KW - nukleärer Rezeptor KW - CAR KW - PPARalpha KW - Energiestoffwechsel KW - biotransformation KW - nuclear receptor KW - CAR KW - PPARalpha KW - energy metabolism Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-19167 ER - TY - THES A1 - Lehmann, Andreas T1 - Variability in human life history traits BT - an analysis of spatial and temporal variation and their integration into recent conceptual frameworks Y1 - 2018 ER - TY - THES A1 - Nolte, Björn T1 - Variabilität des Reviergesangs des Buchfinken (Fringilla coelebs) zur Raum-Zeit-Beschreibung von Metapopulationen N2 - Der Buchfinkengesang wurde in Potsdam in zwei Hauptpopulationen über drei Jahre aufgenommen. Jedes Individuum wurde eindeutig am individuellen Strophentypenrepertoire identifiziert. Ein weiterer Punkt der die individuelle Wiedererkennung bestätigt ist die hohe Standorttreue der adulten Männchen. Die beschriebene Methode eignet sich für die Untersuchung von gesamten Populationen, um den Wandel des Gesangs von Populationen in Raum und Zeit zu beschreiben. Die Haupterkenntnisse der Arbeit sind: - Die Gesamtanzahl der Grundstrophentypen innerhalb einer Population bleibt über Jahre konstant. - Die relative Häufigkeit jedes einzelnen Strophentyps variiert von Jahr zu Jahr und von Population zu Population. - Gesangslernen erfolgt exakt mit einem Korrektheitsgrad von mindestens 96%. - Das Song-Sharing ist innerhalb der Population hoch. Die diskutierten Mechanismen für das Song-Sharing sind: Die Lebenserwartung, das Zugverhalten, das Lernverhalten, die Etabliertheit von Strophentypen, Weibchenpräferenzen und die Reaktionen der territorialen Männchen. - Weiterhin wurde ein Modell zur kulturellen Evolution des Buchfinkengesangs programmiert, um die Rolle der Einflussfaktoren, wie Fehlerquote, Abwanderungsrate und Laufzeit zu ermitteln. Der Wandel des Dialektes erfolgt graduell in Raum und Zeit. Daher sind keine scharfen Dialektgrenzen anzutreffen. Trotz dieser Tatsache markieren die etablierten Strophentypen die Population. 50 % der Juvenilen siedeln am Geburtsort, auf diese Weise bleibt der Dialekt erhalten und Inzest wird vermieden. -Analysiert man das Repertoire benachbarten Männchen bei isolierten Alleen, so entspricht die Gesangsangleichung in etwa dem Zufall. -Intraindividuelle Vergleiche der quantitativen Parameter des jeweiligen Strophentyps wurden saisonal und annuell durchgeführt. Saisonal konnten für einen Strophentyp ein Trend ermittelt werden. Bei jährlichen Vergleichen konnten intraindividuell ausschließlich nicht signifikante Ergebnisse ermittelt werden, wohingegen die interindividuelle Variation in zwei Fällen signifikant war. In einem Fall bestand ein Trend und in einem weiteren Fall war die Variationsunterschiede nicht signifikant. - Der Verlauf der Brutsaison lässt sich an der jährlichen Gesangsaktivität nachvollziehen. N2 - Chaffinch song was recorded in Potsdam in two major populations of chaffinches over a period of three years. Each male was identified unambiguously because of their individual song type repertoires. These are usually easy to distinguish from sonagrams as the variation is discontinuous. A further point for individual recognition is the fixed territorial behaviour of adult males. The described method is employed to examine whole populations and to observe changes with space and time in the song of a population. The major findings of the study are: - The total amount of basic song types in each population is constant over years. - The quantity of each basic song type is different and varies from year to year and from population to population. - Song copying is extremely accurate on at least 96% of occasions. - Song-type sharing is high within populations. Discussed mechanisms for song neighbourhoods are: expectation of life, semi-migratory behaviour, learning skills, establishment of song types, female choice and male vs male interaction. Furthermore a model of cultural evolution of chaffinch song was programmed to determine the role of factors like error rate, rate of emigration and running time. The changes are gradual in space and time. Hence the dialect borders are smooth. Despite this fact established song types mark the population. As every second juvenile bird settles in the population of his birth inbreeding is avoided and the dialect structure is retained. - Analysing the repertoires of neighbouring males (“next door neighbours”) in isolated avenues to examine mutual influences suggests that these have the same amount of song types in common than would be expected by chance. - Within intraindividual comparisons the quantitative parameters of the same song types remain seasonal and annual constant, whereas interindividual variations within the same song tip are statistically significant. - The breeding biology of the chaffinch can be observed by seasonal singing activity during the breeding cycle. KW - Buchfink KW - Gesangsdialekte KW - Strophentypen KW - Gesangslernen KW - Gesangsangleich KW - Gesangsaktivität KW - Chaffinch KW - Songdialects KW - song-types KW - songlearning KW - song-sharing KW - song-matching KW - singing activity Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000882 ER - TY - THES A1 - Johnen, Heiko T1 - Vergleich von rekombinanten Vaccinia- und DNA-Vektoren zur Tumorimmuntherapie im C57BL/6-Mausmodell N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden Tumorimpfstoffe auf der Basis des Plasmid-Vektors pCI, modified vaccinia virus Ankara (MVA) und MVA-infizierten dendritischen Zellen entwickelt und durch Sequenzierung, Western blotting und durchflußzytometrische Analyse überprüft. Die in vivo Wirksamkeit der Vakzinen wurde in verschiedenen Tumormodellen in C57BL/6 Mäusen verglichen. Die auf dem eukaryotischen Expressionsvektor pCI basierende DNA-Vakzinierung induzierte einen sehr wirksamen, antigenspezifischen und langfristigen Schutz vor Muzin, CEA oder beta-Galactosidase exprimierenden Tumoren. Eine MVA-Vakzinierung bietet in den in dieser Arbeit durchgeführten Tumormodellen keinen signifikanten Schutz vor Muzin oder beta-Galactosidase exprimierenden Tumoren. Sowohl humane, als auch murine in vitro generierte dendritische Zellen lassen sich mit MVA – im Vergleich zu anderen viralen Vektoren – sehr gut infizieren. Die Expressionsrate der eingefügten Gene ist aber gering im Vergleich zur Expression in permissiven Wirtszellen des Virus (embryonale Hühnerfibroblasten). Es konnte gezeigt werden, daß eine MVA-Infektion dendritischer Zellen ähnliche Auswirkungen auf den Reifezustand humaner und muriner dendritischer Zellen hat, wie eine Infektion mit replikationskompetenten Vakzinia-Stämmen, und außerdem die Hochregulation von CD40 während der terminalen Reifung von murinen dendritischen Zellen inhibiert wird. Die während der langfristigen in vitro Kultur auf CEF-Zellen entstandenen Deletionen im MVA Genom führten zu einer starken Attenuierung und dem Verlust einiger Gene, die immunmodulatorische Proteine kodieren, jedoch nicht zu einer Verminderung des zytopathischen Effekts in dendritischen Zellen. Die geringe Expressionsrate und die beobachtete Inhibition der Expression kostimulatorischer Moleküle auf dendritischen Zellen kann für eine wenig effektive Induktion einer Immunantwort in MVA vakzinierten Tieren durch cross priming oder die direkte Infektion antigenpräsentierender Zellen verantwortlich sein. Durch die Modifikation einer Methode zur intrazellulären IFN-gamma Färbung konnten in vakzinierten Mäusen tumorantigenspezifische CTL sensitiv und quantitativ detektiert werden. Die so bestimmte CTL-Frequenz, nicht jedoch die humorale Antwort, korrelierte mit der in vivo Wirksamkeit der verschiedenen Vakzinen: DNA vakzinierte Tiere entwickeln starke tumorantigenspezifische CTL-Antworten, wohingegen in MVA-vakzinierten Tieren überwiegend gegen virale Epitope gerichtete CD4 und CD8-T-Zellen detektiert wurden. Die Wirksamkeit der pCI-DNA-Vakzine spricht für die Weiterentwicklung in weiteren präklinischen Mausmodellen, beispielsweise unter Verwendung von MUC1 oder HLA-A2 transgenen Mäusen. Die Methoden zur Detektion Tumorantigen-spezifischer CTL in 96-Loch-Mikrotiterplatten können dabei zur systematischen Suche nach im Menschen immundominanten T-Zell-Epitopen im Muzin-Molekül genutzt werden. Der durchgeführte Vergleich der auf den Vektoren pCI und MVA basierenden Vakzinen und die Analyse neuerer Publikationen führen zu dem Ergebnis, daß vor allem DNA-Vakzinen in Zukunft eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von aktiven Tumorimpfstoffen spielen werden. Rekombinante MVA-Viren, eventuell in Kombination mit DNA- oder anderen Vektoren, haben sich dagegen in zahlreichen Studien als wirksame Impfstoffe zur Kontrolle von durch Pathogene hervorgerufenen Infektionserkrankungen erwiesen. N2 - In this study, tumor vaccines based on the plasmid pCI, the attenuated vaccinia virus strain modified vaccinia virus Ankara (MVA) and MVA-infected dendritic cells were constructed and characterized by sequencing, Western blot and flow cytometric analysis. The efficiency to induce tumor immunity in vivo was compared in several C57BL/6 mouse tumor models. Naked DNA Vaccination based on the eukaryotic expression vector pCI did induce very effective, antigen-specific and long-term protection against tumor cell lines expressing mucin, CEA or beta-Gal whereas MVA vaccination did not elicit protective immunity against Mucin or beta-Gal expressing tumors. MVA does infect human or murine in vitro generated dendritic cells very efficiently compared to other viral vectors, however expression levels of the inserted antigens in dendritic cells are significantly lower than in permissive host cells (chicken embryo fibroblasts). It could be shown that the effect of MVA infection on the maturation status of dendritic cells is similar to the effects described for dendritic cells infected with replication competent vaccinia strains. In addition it was shown that the upregulation of the important costimulatory molecule CD40 through LPS stimulation is strongly inhibited in MVA infected cells. During passage in tissue culture, MVA has accumulated a number of large deletions, including a number of immunomodulatory molecules and resulting in a strong attenuation. However the strong cytopathic effect on dendritic cells is maintained. The low level of expression and the effect on dendritic cell maturation may be responsible for the failure of MVA to induce tumor immunity through either cross presentation or direct infection of antigen presenting cells. To detect and quantify tumor-antigen-specific CTL a method based on intracellular IFN-gamma staining was modified and it could be shown that the cellular – but not the humoral – response does correlate with in vivo protection: DNA but not MVA vaccines do induce high levels of tumorantigen-specific CTL whereas MVA-vaccines do induce strong and long lasting CD4 and CD8-T-cell responses against vaccinia antigens. The excellent protection induced by pCI-DNA-vaccination in different tumor models does encourage us to further investigate the elicitation of tumor immunity in MUC1 or HLA-A2 transgenic mice. In mice transgenic for human MHC-I, the IFN-gamma staining protocol could be used to systematically screen for mucin T-cell epitopes that are relevant in humans. KW - Tumorimmuntherapie KW - MVA KW - Modified Vaccinia Virus Ankara KW - Muzin KW - CEA KW - MUC1 KW - beta-Galactosidase KW - DNA-Vakzinierung KW - pCI KW - MC38 KW - tumor immunotherapy KW - MVA KW - Modified Vaccinia Virus Ankara KW - Mucin KW - MUC1 KW - beta-Galactosidase KW - CEA KW - DNA vaccine KW - pCI KW - MC38 Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000593 ER - TY - THES A1 - Frömmel, Ulrike T1 - Vergleichende geno- und phänotypische Charakterisierung von Escherichia coli aus Menschen, Hausschweinen und Wildtieren T1 - Comparative genotypic and phenotypic characterization of Escherichia coli from humans, domestic pigs and wild animals N2 - Escherichia (E.) coli ist als kommensales Bakterium ein wichtiger Bestandteil des Mikrobioms von Säugern, jedoch zudem der häufigste Infektionserreger des Menschen. Entsprechend des Infektionsortes werden intestinal (InPEC) und extraintestinal pathogene E. coli (ExPEC) unterschieden. Die Pathogenese von E. coli-Infektionen ist durch Virulenzfaktoren determiniert, welche von jeweils spezifischen virulenzassoziierten Genen (inVAGs und exVAGs) kodiert werden. Häufig werden exVAGs auch in E. coli-Isolaten aus dem Darm gesunder Wirte nachgewiesen. Dies führte zu der Vermutung, dass exVAGs die intestinale Kolonisierung des Wirtes durch E. coli unterstützen. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand darin, das Wissen über den Einfluss von exVAGs auf die Besiedlung und damit die Adhäsion von E. coli an Epithelzellen des Darmtraktes zu erweitern. Die Durchführung einer solch umfassenden E. coli-Populationsstudie erforderte die Etablierung neuer Screeningmethoden. Für die genotypische Charakterisierung wurden mikropartikelbasierte Multiplex-PCR-Assays zum Nachweis von 44 VAGs und der Phylogenie etabliert. Für die phänotypische Charakterisierung wurden Adhäsions- und Zytotoxizitätsassays etabliert. Die Screeningmethoden basieren auf der VideoScan-Technologie, einem automatisierten bildbasierten Multifluoreszenzdetektionssystem. Es wurden 398 E. coli-Isolate aus 13 Wildsäugerarten und 5 Wildvogelarten sowie aus gesunden und harnwegserkrankten Menschen und Hausschweinen charakterisiert. Die Adhäsionsassays hatten zum Ziel, sowohl die Adhäsionsraten als auch die Adhäsionsmuster der 317 nicht hämolytischen Isolate auf 5 Epithelzelllinien zu bestimmen. Die Zytotoxizität der 81 hämolytischen Isolate wurde in Abhängigkeit der Inkubationszeit auf 4 Epithelzelllinien geprüft. In den E. coli-Isolaten wurde eine Reihe von VAGs nachgewiesen. Potentielle InPEC, insbesondere shigatoxinproduzierende und enteropathogene E. coli wurden aus Menschen, Hausschweinen und Wildtieren, vor allem aus Rehen und Feldhasen isoliert. exVAGs wurden mit stark variierender Prävalenz in Isolaten aus allen Arten detektiert. Die größte Anzahl und das breiteste Spektrum an exVAGs wurde in Isolaten aus Urin harnwegserkrankter Menschen, gefolgt von Isolaten aus Dachsen und Rehen nachgewiesen. In Isolaten der phylogenetischen Gruppe B2 wurden mehr exVAGs detektiert als in den Isolaten der phylogenetischen Gruppen A, B1 und D. Die Ergebnisse der Adhäsionsassays zeigten, dass die meisten Isolate zelllinien-, gewebe- oder wirtsspezifisch adhärierten. Ein Drittel der Isolate adhärierte an keiner Zelllinie und nur zwei Isolate adhärierten stark an allen Zelllinien. Grundsätzlich adhärierten mehr Isolate an humanen sowie an intestinalen Zelllinien. Besonders Isolate aus Eichhörnchen und Amseln sowie aus Urin harnwegserkrankter Menschen und Hausschweine waren in der Lage, stark zu adhärieren. Hierbei bildeten die Isolate als Adhäsionsmuster diffuse Adhäsion, Mikrokolonien, Ketten und Agglomerationen. Mittels statistischer Analysen wurden Assoziationen zwischen exVAGs und einer hohen Adhäsionsrate ersichtlich. So war beispielsweise das Vorkommen von afa/dra mit einer höheren Adhäsionsrate auf Caco-2- und 5637-Zellen und von sfa/foc auf IPEC-J2-Zellen assoziiert. Die Ergebnisse der Zytotoxizitätsassays zeigten eine sehr starke und zeitabhängige Zerstörung der Monolayer aller Epithelzelllinien durch die α-Hämolysin-positiven Isolate. Auffallend war die hohe Toxizität hämolytischer Isolate aus Wildtieren gegenüber den humanen Zelllinien. Mit den innerhalb dieser Arbeit entwickelten Screeningmethoden war es möglich, große Mengen an Bakterien zu charakterisieren. Es konnte ein Überblick über die Verbreitung von VAGs in E. coli aus unterschiedlichen Wirten gewonnen werden. Besonders Wildtiere wurden sowohl durch den Nachweis von VAGs in den entsprechenden Isolaten, verbunden mit deren Adhäsionsfähigkeit und ausgeprägter Zytotoxizität als Reservoire pathogener E. coli identifiziert. Ebenso wurde eine zelllinienspezifische Adhäsion von Isolaten mit bestimmten exVAGs deutlich. Damit konnte der mögliche Einfluss von exVAGs auf die intestinale Kolonisierung bestätigt werden. In weiterführenden Arbeiten sind jedoch Expressions- und Funktionsanalysen der entsprechenden Proteine unerlässlich. Es wird anhand der Mikrokoloniebildung durch kommensale E. coli vermutet, dass Adhäsionsmuster und demzufolge Kolonisierungsstrategien, die bisher pathogenen E. coli zugeschrieben wurden, eher als generelle Kolonisierungsstrategien zu betrachten sind. Das E. coli-α-Hämolysin wirkt im Allgemeinen zytotoxisch auf Epithelzellen. Ein in der Fachliteratur diskutierter adhäsionsunterstützender Mechanismus dieses Toxins ist demnach fragwürdig. Innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die entwickelten Screeningmethoden umfassende Analysen einer großen Anzahl an E. coli-Isolaten ermöglichen. N2 - Escherichia (E.) coli is as commensal bacterium an important component of the microbiome of humans and animals, but also the most common infectious agent of human. According to the site of infection intestinal pathogenic (InPEC) and extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC) are differentiated. The pathogenesis of E. coli infections is determined by virulence factors encoded by specific virulence-associated genes (inVAGs and exVAGs). Frequently, exVAGs also be detected in E. coli isolates from the intestine of clinically healthy hosts. This led to the assumption that exVAGs support the intestinal colonization of the host by E. coli. The main objective of this work was to extend the knowledge about the influence of exVAGs on the settlement and adhesion of E. coli to epithelial cells of the intestinal tract. The implementation of such a comprehensive E. coli population study required the establishment of new screening methods. For the genotypic characterization novel microbead-based multiplex PCR assays were established to detect 44 VAGs and phylogeny. For the phenotypic characterization novel in vitro adhesion and cytotoxicity assays were established. These screening methods based on the VideoScan technology, which is an automated image-based multi-fluorescence detection system. There have been characterized 398 E. coli isolates from 13 wild mammal species and 5 species of wild birds as well as from healthy and urinary diseased humans and domestic pigs. The adhesion assays were aimed at both the adhesion rates and the adhesion patterns of the 317 non-hemolytic isolates on intestinal human Caco-2 and porcine IPEC-J2 cells and on human urinary bladder 5637, porcine kidney PK-15 epithelial and HEp-2 cells. The cytotoxicity of 81 hemolytic isolates was compared on the human intestinal epithelium LoVo, and on 5637, IPEC-J2 and PK-15 according to the incubation period. The E. coli isolates showed a series of VAGs. Potential InPEC, especially shigatoxin-producing and enteropathogenic E. coli were isolated from humans, domestic pigs and wild animals, especially from deers (Capreolus capreolus) and hares (Lepus europaeus). exVAGs were detected with widely varying prevalence in E. coli isolates from all species studied. The largest number and the widest range of exVAGs were shown in isolates from urine of urinary diseased patients, followed by isolates from badgers (Meles meles) and deer. Within the isolates of the phylogenetic group B2 more exVAGs were detected as within the isolates of the phylogenetic groups A, B1, and D. Adhesion of the E. coli isolates was specific to cells, host, and tissue, though it was also unspecific. A third of the isolates adhered to any cell line and only two isolates adhered strongly to all cell lines. Basically, more bacteria adhered to human as well as to intestinal cell lines. Especially isolates from squirrels (Sciurus vulgaris) and blackbirds (Turdus merula) and from the urine of urinary diseased humans and domestic pigs were able to strongly adhere. Commensal and pathogenic isolates can adhere in various forms, including diffuse distribution, microcolonies, chains and clumps. Using statistical analyzes associations between the occurrence of some VAGs and a high adhesion rates were seen. Several known adhesins were associated with host cell specific adhesion. Other new potential adhesion genes were described. The results of the cytotoxicity assays showed a very strong and time-dependent degradation of the epithelial cell monolayer of all the α-hemolysin-positive E. coli isolates. The high toxicity of hemolytic isolates from wild animals against the human cell lines was striking. The screening methods enabled both, the genotypic and phenotypic characterisation of large amounts of bacterial isolates. An overview of the distribution of VAGs in E. coli from different hosts was obtained. Especially wild animals were either by the detection of VAGs in the corresponding E. coli isolates, combined with the adhesion and marked cytotoxicity identified as reservoirs of pathogenic E. coli. As well, a cell-line specific adhesion of E. coli isolates with certain exVAGs became clear. Thus, the possible influence on the intestinal colonization of exVAGs could be confirmed. In further work, however, expression and functional analysis of the corresponding proteins are essential. It is suspected on the basis of microcolony formation by commensal E. coli that adhesion patterns and consequently colonization strategies that were previously attributed to pathogenic E. coli, are to be regarded rather as a general colonization strategy. The E. coli α-hemolysin acts generally cytotoxic to epithelial cells. An in the literature discussed adhesion supporting mechanism of this toxin is therefore questionable. Within this work it was shown that the developed screening methods enable comprehensive analyzes of a large number of E. coli isolates. KW - Escherichia coli KW - Adhäsion KW - virulenzassoziierte Gene KW - Hämolyse KW - ExPEC KW - Escherichia coli KW - adhesion KW - virulence-associated genes KW - hemolysis KW - ExPEC Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-69147 ER - TY - THES A1 - Werner, Deljana T1 - Versuche zur Gewinnung von katalytischen Antikörpern zur Hydrolyse von Arylcarbamaten und Arylharnstoffen T1 - Attempts to produce catalytic antibodies for hydrolysis of arylcarbamates and arylureas N2 - Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, katalytische Antikörper zur Hydrolyse von Benzylphenylcarbamaten sowie zahlreiche monoklonale Antikörper gegen Haptene herzustellen. Es wurden verschiedene Hapten-Protein-Konjugate unter Verwendung unterschiedlicher Kopplungsmethoden hergestellt und charakterisiert. Zur Generierung der hydrolytisch aktiven Antikörper wurden Inzuchtmäuse mit KLH-Konjugaten von 4 Übergangszustandsanaloga (ÜZA) immunisiert. Mit Hilfe der Hybridomtechnik wurden verschiedene monoklonale Antikörper gegen diese ÜZA gewonnen. Dabei wurden sowohl verschiedene Immunisierungsschemata als auch verschiedene Inzuchtmausstämme und Fusionstechniken verwendet. Insgesamt wurden 32 monoklonale Antikörper gegen die verwendeten ÜZA selektiert. Diese Antikörper wurden in großen Mengen hergestellt und gereinigt. Zum Nachweis der Antikörper-vermittelten Katalyse wurden verschiedene Methoden entwickelt und eingesetzt, darunter immunologische Nachweismethoden mit Anti-Substrat- und Anti-Produkt-Antikörpern und eine photometrische Methode mit Dimethylaminozimtaldehyd. Der Nachweis der hydrolytischen Aktivität gelang mit Hilfe eines Enzymsensors, basierend auf immobilisierter Tyrosinase. Die Antikörper N1-BC1-D11, N1-FA7-C4, N1-FA7-D12 und R3-LG2-F9 hydrolysierten die Benzylphenylcarbamate POCc18, POCc19 und Substanz 27. Der Nachweis der hydrolytischen Aktivität dieser Antikörper gelang auch mit Hilfe der HPLC. Der katalytische Antikörper N1-BC1-D11 wurde kinetisch und thermodynamisch untersucht. Es wurde eine Michaelis-Menten-Kinetik mit Km von 210 µM, vmax von 3 mM/min und kcat von 222 min-1 beobachtet. Diese Werte korrelieren mit den Werten der wenigen bekannten Diphenylcarbamat-spaltenden Abzyme. Die Beschleunigungsrate des Antikörpers N1-BC1-D11 betrug 10. Das ÜZA Hei3 hemmte die hydrolytische Aktivität. Dies beweist, dass die Hydrolyse in der Antigenbindungsstelle stattfindet. Weiter wurde zwischen der Antikörperkonzentration und der Umsatzgeschwindigkeit eine lineare Abhängigkeit festgestellt. Die thermodynamische Gleichtgewichtsdissoziationskonstante KD des Abzyms von 2,6 nM zeugt von einer sehr guten Affinität zum ÜZA. Hydrolytisch aktiv waren nur Antikörper, die gegen das Übergangszustandsanalogon Hei3 hergestellt worden waren. Es wird vermutet, dass die Hydrolyse der Benzylphenylcarbamate über einen Additions-Eliminierungsmechanismus unter Ausbildung eines tetraedrischen Übergangszustandes verläuft, dessen analoge Verbindung Hei3 ist. Im Rahmen der Generierung von Nachweisantikörpern zur Detektion der Substratabnahme bei der Hydrolyse wurden Anti-Diuron-Antikörper hergestellt. Einer der Antikörper (B91-CG5) ist spezifisch für das Herbizid Diuron und hat einen IC50-Wert von 0,19 µg/l und eine untere Nachweisgrenze von 0,04 µg/l. Ein anderer Antikörper (B91-KF5) reagiert kreuz mit einer Palette ähnlicher Herbizide. Mit diesen Antikörpern wurde ein empfindlicher Labortest, der ein Monitoring von Diuron auf Grundlage des durch die Trinkwasserverordnung festgeschriebenen Wertes für Pflanzenschutzmittel von 0,1 µg/l erlaubt, aufgebaut. Der Effekt der Anti-Diuron-Antikörper auf die Diuron-inhibierte Photosynthese wurde in vitro und in vivo untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass sowohl in isolierten Thylakoiden, als auch in intakten Algen eine Vorinkubation der Anti-Diuron-Antikörper mit Diuron zur Inaktivierung seiner Photosynthese-hemmenden Wirkung führt. Wurde der Elektronentransport in den isolierten Thylakoiden oder in Algen durch Diuron unterbrochen, so führte die Zugabe der Anti-Diuron-Antikörper zur Reaktivierung der Elektronenübertragung. N2 - Attempts to produce catalytic antibodies for hydrolysis of arylcarbamates and arylureas: The aim of the investigations was to produce antibodies which are able to cleave herbicides resistant to naturally occuring enzymes. Structurally similar carbamate and urea derivatives were chosen for the experiments. Phosphonate derivatives were synthesized that mimick possible transition state analogues in structure and charge. Mice were immunized with 4 different derivatives after conjugating them to carrier proteins. 32 hybridomas were established that produce monoclonal antibodies binding to these derivatives. The possible cleavage of substrates was determined by immunoassays with monoclonal antibodies against the substrate and the products and with a photometric method based on dimethylaminocinammonaldehyde. The measuring of cleavage products was succeeded by an amperometric method. The enzyme sensor was based on immobilized tyrosinase which oxidizes p-chlorophenol and phenol. The antibodies N1-BC1-D11, N1-FA7-C4, N1-FA7-D12 und R3-LG2-F9 hydrolysed the benzylphenylcarbamates POCc18, POCc19 und Substance 27. The hydrolytic activity of these antibodies was also succeeded with HPLC. The catalytic antibody N1-BC1-D11 was investigated kinetically and thermodynamically. A Michaelis-Menten-Kinetic was observed (at pH 8.0 exhibited a Km 210 µM, a vmax 3 mM/min and a kcat 222 min-1). These values are in the range of the values obtained for the antibody-catalysed hydrolysis of diphenylcarbamates. The rate enhancement of N1-BC1 was 10. The reaction was completely inhibited by stoichiometric quantities of the transition state analogue Hei3. This is consistent with the affinity of the abzyme to Hei3 of 2.6 nM, determined by BIAcore assay. Only antibodies generated against Hei3 showed hydrolytic activity. The hydrolysis of benzylphenylcarbamates presumably occurs via an addition-elimination-Mechanism involving a tetrahedral intermediate. In summary, this work presents the first example of antibody-catalysed hydrolysis of benzylphenylcarbamates. Monoclonal anti-diuron antibodies were generated that bind to the herbicide diuron with an extremely low equilibrium dissociation constant. A sensitive immunoassay with a low detection limit of 0.2 nM for diuron was established. This is the most sensitive immunological method for detection of diuron known so far. These antibodies were also used in vitro and in vivo to prevent diuron-dependent inhibition of photosynthesis or to restore photosynthesis after inhibition. In isolated thylakoids prepared from spinach leaves (Spinacia oleracea L.) the diuron-inhibited Hill reaction was reconstituted immediately following the addition of the monoclonal antibodies. In an in vivo approach the photosynthetic oxygen evolution of the cell wall deficient mutant (cw 15) of the green alga Chlamydomonas reinhardtii Dangeard was monitored. The antibodies prevented the diuron-dependent inhibition of photosynthesis and restored photosynthesis after inhibition. Transgenic plants that synthesize and accumulate these antibodies or antibody fragments and are therefore diuron-resistant can be created. KW - katalytische Antikörper KW - Arylcarbamate KW - Arylharnstoffe KW - monoklonale Antikörper KW - Haptene KW - Diuron KW - Anti-Diuron-Antikörper KW - Herbizide KW - Photosynthese KW - catalytic antibodies KW - arylcarbamates KW - arylureas KW - monoclonal antibodies KW - haptens KW - diuron KW - anti-diuron-antibodies KW - herbicides KW - photosynthesis Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000463 ER - TY - THES A1 - Nell, Sandra T1 - Vitamin E und der vesikuläre Transport : Untersuchungen zu den genregulatorischen Funktionen von Vitamin E mittels Microarray- und real time PCR-Analysen in der Maus und funktionellen in vitro Assays in RBL-2H3 Zellen T1 - Vitamin E and the vesicular transport : examination of the generegulatory functions of vitamin E using microarrays and real time PCR analyses in the mouse and functional in vitro assays in RBL-2H3 cells N2 - Vitamin E wird immer noch als das wichtigste lipophile Antioxidanz in biologischen Membranen betrachtet. In den letzten Jahren hat sich jedoch der Schwerpunkt der Vitamin E-Forschung hin zu den nicht-antioxidativen Funktionen verlagert. Besonderes Interesse gilt dabei dem α-Tocopherol, der häufigsten Vitamin E-Form im Gewebe von Säugetieren, und seiner Rolle bei der Regulation der Genexpression. Das Ziel dieser Dissertation war die Untersuchung der genregulatorischen Funktionen von α-Tocoperol und die Identifizierung α-Tocopherol-sensitiver Gene in vivo. Zu diesem Zweck wurden Mäuse mit verschiedenen Mengen α-Tocopherol gefüttert. Die Analyse der hepatischen Genexpression mit Hilfe von DNA-Microarrays identifizierte 387 α-Tocopherol-sensitive Gene. Funktionelle Clusteranalysen der differentiell exprimierten Gene zeigten einen Einfluss von α-Tocooherol auf zelluläre Transportprozesse. Besonders solche Gene, die an vesikulären Transportvorgängen beteiligt sind, wurden größtenteils durch α-Tocopherol hochreguliert. Für Syntaxin 1C, Vesicle-associated membrane protein 1, N-ethylmaleimide-sensitive factor and Syntaxin binding protein 1 konnte eine erhöhte Expression mittels real time PCR bestätigt werden. Ein funktioneller Einfluss von α-Tocopherol auf vesikuläre Transportprozesse konnte mit Hilfe des in vitro β-Hexosaminidase Assays in der sekretorischen Mastzelllinie RBL-2H3 gezeigt werden. Die Inkubation der Zellen mit α-Tocopherol resultierte in einer konzentrationsabhängigen Erhöhung der PMA/Ionomycin-stimulierten Sekretion der β-Hexosaminidase. Eine erhöhte Expression ausgewählter Gene, die an der Degranulation beteiligt sind, konnte nicht beobachtet werden. Damit schien ein direkter genregulatorischer Effekt von α-Tocopherol eher unwahrscheinlich. Da eine erhöhte Sekretion auch mit β-Tocopherol aber nicht mit Trolox, einem hydrophilen Vitamin E-Analogon, gefunden wurde, wurde vermutet, dass α-Tocopherol die Degranulation möglicherweise durch seine membranständige Lokalisation beeinflussen könnte. Die Inkubation der Zellen mit α-Tocopherol resultierte in einer veränderten Verteilung des Gangliosids GM1, einem Lipid raft Marker. Es wird angenommen, dass diese Membranmikrodomänen als Plattformen für Signaltransduktionsvorgänge fungieren. Ein möglicher Einfluss von Vitamin E auf die Rekrutierung/Translokation von Signalproteinen in Membranmikrodomänen könnte die beobachteten Effekte erklären. Eine Rolle von α-Tocopherol im vesikulären Transport könnte nicht nur seine eigene Absorption und seinen Transport beeinflussen, sondern auch eine Erklärung für die bei schwerer Vitamin E-Defizienz auftretenden neuronalen Dysfunktionen bieten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die α-Tocopheroltransferprotein (Ttpa) Knockout-Maus als genetisches Modell für Vitamin E-Defizienz verwendet, um den Effekt von Ttpa auf die Genexpression und die Gewebeverteilung von α-Tocopherol zu analysieren. Ttpa ist ein cytosolisches Protein, das für die selektive Retention von α-Tocopherol in der Leber verantwortlich ist. Die Ttpa-Defizienz resultierte in sehr geringen α-Tocopherol-Konzentrationen im Plasma und den extrahepatischen Geweben. Die Analyse der α-Tocopherol-Gehalte im Gehirn wies auf eine Rolle von Ttpa bei der α-Tocopherol-Aufnahme ins Gehirn hin. N2 - Vitamin E is still considered the most important lipid-soluble antioxidant within biological membranes. However, in the last years the non-antioxidant functions of vitamin E have become the focus of vitamin E research. From the eight members of the vitamin E family, specific emphasis is given to α-tocopherol, the most abundant vitamin E form in mammalian tissues, and its role in the regulation of gene expression. The aim of this thesis was the analysis of the gene regulatory functions of α-tocopherol and the identification of α-tocopherol sensitive genes in vivo. For this purpose mice were fed diets differing in α-tocopherol content. The analysis of hepatic gene expression using DNA microarrays identified 387 α-tocopherol-sensitive genes. Functional cluster analyses of these differentially expressed genes demonstrated an influence of α-tocopherol on cellular transport processes. Especially the expression of genes involved in vesicular trafficking was largely upregulated by α-tocopherol. Upregulation of syntaxin 1C, vesicle-associated membrane protein 1, N-ethylmaleimide-sensitive factor and syntaxin binding protein 1 was verified by real time PCR. A role of α-tocopherol in exocytosis was shown by the in vitro β-hexosaminidase release assay in the secretory mast cell line RBL-2H3. Incubation with α-tocopherol resulted in a concentration dependent increase of PMA/ionomycin-stimulated secretion of β-hexosaminidase. Induction of selected genes involved in degranulation was not observed at any time point. Thus, a direct gene-regulatory effect of α-tocopherol seemed rather unlikely. Since increased secretion was also observed with ß-tocopherol but not with trolox, a water-soluble analog of vitamin E, it was hypothesized that α-tocopherol might affect degranulation through its localization at the plasma membrane. Incubation of cells with α-tocopherol changed the distribution of the gangliosid GM1, a Lipid raft marker. These membrane microdomains are assumed to function as signaling platforms. An possible influence of vitamin E on the recruitment/translocation of signaling proteins into membrane microdomains could explain the observed effects. A role of α-tocopherol in the vesicular transport might not only affect its own absorption and transport but also explain the neural dysfunctions observed in severe α-tocopherol deficiency. In the second part of this dissertation the α-tocopherol transfer protein (Ttpa) knockout-mouse as a model of genetic vitamin E deficiency was used to analyze the effect of Ttpa gene expression and tissue distribution of α-tocopherol. Ttpa is a cytosolic protein, which is responsible for the selective retention of α-tocopherol in the liver. Its deficiency resulted in very low α-tocopherol concentrations in plasma and extrahepatic tissues. Analysis of α-tocopherol contents in brain indicated a role for Ttpa in the uptake of α-tocopherol into the brain. KW - Vitamin E KW - Microarray KW - Genregulation KW - vesikulärer Transport KW - α-Tocopheroltransferprotein (Ttpa) KW - vitamin E KW - microarray KW - gene regulation KW - vesicular transport KW - alpha-tocopherol transfer protein (Ttpa) Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-35710 ER - TY - THES A1 - Kluth, Dirk T1 - Vom Antioxidanz zum Genregulator : transkriptionelle Regulation von Phase I- und Phase II-Enzymen durch Vitamin E und antioxidative sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe T1 - From antioxidant to gene regulator : transcriptional regulation of phase I- and phase II-enzymes by vitamin E and antioxidative secondary plant compounds N2 - Nahrungsinhaltsstoffe sind im Organismus an Steuerungsprozessen und Stoffwechselvorgängen beteiligt, wobei die Mechanismen ihrer Wirkung noch nicht völlig aufgeklärt sind. Wie Vitamin E zeigen auch sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe in Zellsystemen sowie in vivo eine Reihe biologischer Wirkungen, deren Erklärung jedoch häufig auf ihre antioxidative Eigenschaft reduziert wird. Ziel der Dissertation war es, den Einfluss von Vitamin E und anderen Pflanzeninhaltsstoffen (in Form von Pflanzenextrakten oder isolierten sekundären Pflanzeninhaltsstoffen, z.B. Polyphenole), die bisher alle hauptsächlich als Antioxidanz klassifiziert wurden, auf die transkriptionelle Regulation von Phase I- und Phase II-Enzymen zu untersuchen. Dazu wurde die Aktivierung des PXR (pregnane X receptor) und des Nrf2 (NF-E2-related factor-2) als zentrale Transkriptionsfaktoren der Phase I- bzw. Phase II-Enzyme getestet. Der Einfluss von verschiedenen Vitamin E-Formen und antioxidativen Pflanzeninhaltsstoffen in Form von Reinsubstanzen (Curcumin, EGCG, Medox, Quercetin, Resveratrol und Sulforaphan) oder Pflanzenextrakten (aus Blaubeeren, Gewürznelken, Himbeeren, Nelkenpfeffer, Thymian oder Walnüssen) auf die Aktivierung von PXR und Nrf2 sowie des Promotors eines jeweiligen Zielgens (CYP3A4 bzw. GI-GPx) wurde in vitro mit Reportergenplasmiden untersucht. Es zeigte sich, dass sowohl Vitamin E-Formen als auch verschiedene sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe PXR und/oder Nrf2 sowie die Promotoren der jeweiligen Zielgene CYP3A4 bzw. GI-GPx aktivieren. In einem Tierexperiment konnte diese genregulatorische Wirkung von Vitamin E auf die in vivo-Situation übertragen werden. In Lebern von Mäusen, deren Futter unterschiedliche Mengen von Vitamin E enthielt (Mangel-, Normal- und Überflussdiät), wurde eine direkte Korrelation zwischen der alpha-Tocopherol-Konzentration und der Cyp3a11 mRNA-Expression nachgewiesen (Cyp3a11 ist das murine Homolog zum humanen CYP3A4). Entgegen der in vitro-Situation hatte gamma-Tocotrienol in vivo einen nur kaum nachweisbaren Effekt auf die Expression der Cyp3a11 mRNA, induzierte aber die Expression der alpha-TTP mRNA. Es konnte gezeigt werden, dass Vitamin E und sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe Phase I- und Phase II-Enzyme transkriptionell regulieren können. Die Wirkungen des Vitamin E können sich allerdings nur entfalten, wenn die Vitamin E-Formen ausreichend vom Körper aufgenommen werden. Gegenstand der Dissertation waren daher auch Untersuchungen zur Bioverfügbarkeit (zelluläre Akkumulation und Metabolismus) verschiedener Vitamin E-Formen. Es konnte gezeigt werden, dass Unterschiede in der chemischen Struktur der Vitamin E-Formen deren zelluläre Akkumulation und Metabolisierung beeinflussen. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse der Dissertation lassen sich protektive Wirkungen von antioxidativen Nahrungsinhaltsstoffen auch unabhängig von ihren antioxidativen Eigenschaften über die Induktion zelleigener Schutzsysteme, einschließlich der Phase I- und Phase II-Enzyme, erklären. Die Induktion der zelleigenen Abwehr lässt sich auch als adaptive Antwort (sog. "adaptive response") des Organismus gegenüber zellschädigenden Ereignissen betrachten. N2 - In the organism food compounds are involved in regulatory and metabolic processes although the mechanisms of their effects have not been completely elucidated yet. Like vitamin E, secondary plant compounds have diverse biological effects, both in cell systems as well as in vivo. However, the explanation thereof is often reduced to their antioxidative capacity. The aim of this thesis was to investigate the influence of vitamin E and other plant compounds (in form of plant extracts or isolated secondary plant compounds, e.g. polyphenols), which were up to now classified primarily as antioxidants, on the transcription of phase I- and phase II-enzymes. For this, the activation of central transcription factors of the phase I- or phase II enzymes, PXR (pregnane X receptor) and Nrf2 (NF-E2-related factor-2), was tested. The influence of different vitamin E forms and antioxidative plant compounds in form of pure substances (curcumin, EGCG, Medox, quercetin, resveratrol, and sulforaphane) or plant extracts (from blueberries, clove, raspberries, allspice, thyme, or walnuts) on the activation of PXR and Nrf2 as well as on the promoter of a respective target gene (CYP3A4 or GI-GPx) was investigated in vitro by reporter gene assays. It appeared that vitamin E forms as well as different secondary plant compounds activate PXR and/or Nrf2 as well as the promoter of the respective target genes CYP3A4 and GI-GPx. The effects of vitamin E were confirmed in vivo by an animal experiment. In livers of mice whose diet contained different amounts of vitamin E (deficient, adequate and supra-nutritional), a direct correlation between alpha-tocopherol content and Cyp3a11 mRNA expression was shown (Cyp3a11 is the murine homolog to the human CYP3A4). In contrast to the in vitro observations, gamma-tocotrienol in vivo only had a small effect on the expression of Cyp3a11 mRNA. However, it induced the expression of alpha-TTP on mRNA level. It could be shown that vitamin E and secondary plant compounds can influence the transcriptional regulation of phase I- and/or phase II-enzymes. However, these effects of vitamin E can only be seen if the vitamin E forms are taken up by the body sufficiently. Therefore, another aim of the thesis was to investigate the bioavailability of different vitamin E forms (i.e., cellular accumulation and metabolism). It could be shown that differences in the chemical structure of vitamin E forms influence their cellular accumulation and metabolism. Regarding the results of this thesis, protective effects of antioxidative food compounds can be explained independent of their antioxidative properties by the induction of cellular protective systems, including phase I- and phase II-enzymes. The induction of cellular defence mechanism can also be considered as an adaptive response of the organism towards cell-damaging events. KW - Vitamin E KW - Polyphenole KW - Genregulation KW - Biotransformation KW - Kernrezeptor KW - PXR KW - Nrf2 KW - CYP3A4 KW - Cyp3a11 KW - GI-GPx KW - PXR KW - Nrf2 KW - CYP3A4 KW - Cyp3a11 KW - GI-GPx Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-10060 ER - TY - THES A1 - Gromelski, Sandra T1 - Wechselwirkung zwischen Lipiden und DNA : auf dem Weg zum künstlichen Virus T1 - Interaction between lipids and DNA : on the way to the artificial virus N2 - Weltweit versuchen Wissenschaftler, künstliche Viren für den Gentransfer zu konstruieren, die nicht reproduktionsfähig sind. Diese sollen die Vorteile der natürlichen Viren besitzen (effizienter Transport von genetischem Material), jedoch keine Antigene auf ihrer Oberfläche tragen, die Immunreaktionen auslösen. Ziel dieses Projektes ist es, einen künstlichen Viruspartikel herzustellen, dessen Basis eine Polyelektrolytenhohlkugel bildet, die mit einer Lipiddoppelschicht bedeckt ist. Um intakte Doppelschichten zu erzeugen, muss die Wechselwirkung zwischen Lipid und Polyelektrolyt (z.B. DNA) verstanden und optimiert werden. Dazu ist es notwendig, die strukturelle Grundlage der Interaktion aufzuklären. Positiv geladene Lipide gehen zwar starke Wechselwirkungen mit der negativ geladenen DNA ein, sie wirken jedoch toxisch auf biologische Zellen. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die durch zweiwertige Kationen vermittelte Kopplung von genomischer oder Plasmid-DNA an zwitterionische oder negativ geladene Phospholipide an zwei Modellsystemen untersucht. 1. Modellsystem: Lipidmonoschicht an der Wasser/Luft-Grenzfläche Methoden: Filmwaagentechnik in Kombination mit IR-Spektroskopie (IRRAS), Röntgenreflexion (XR), Röntgendiffraktion (GIXD), Brewsterwinkel-Mikroskopie (BAM), Röntgenfluoreszenz (XRF) und Oberflächenpotentialmessungen Resultate: A) Die Anwesenheit der zweiwertigen Kationen Ba2+, Mg2+, Ca2+ oder Mn2+ in der Subphase hat keinen nachweisbaren Einfluss auf die Struktur der zwitterionischen DMPE- (1,2-Dimyristoyl-phosphatidyl-ethanolamin) Monoschicht. B) In der Subphase gelöste DNA adsorbiert nur in Gegenwart dieser Kationen an der DMPE-Monoschicht. C) Sowohl die Adsorption genomischer Kalbsthymus-DNA als auch der Plasmid-DNA pGL3 bewirkt eine Reduktion des Neigungswinkels der Alkylketten, die auf einen veränderten Platzbedarf der Kopfgruppe zurückzuführen ist. Durch die Umorientierung der Kopfgruppe wird die elektrostatische Wechselwirkung zwischen den positiv geladenen Stickstoffatomen der Lipidkopfgruppen und den negativ geladenen DNA-Phosphaten erhöht. D) Die adsorbierte DNA weist eine geordnete Struktur auf, wenn sie durch Barium-, Magnesium-, Calcium- oder Manganionen komplexiert ist. Der Abstand zwischen parallelen DNA-Strängen hängt dabei von der Größe der DNA-Fragmente sowie von der Art des Kations ab. Die größten Abstände ergeben sich mit Bariumionen, gefolgt von Magnesium- und Calciumionen. Die kleinsten DNA-Abstände werden durch Komplexierung mit Manganionen erhalten. Diese Ionenreihenfolge stellt sich sowohl für genomische DNA als auch für Plasmid-DNA ein. E) Die DNA-Abstände werden durch die Kompression des Lipidfilms nicht beeinflusst. Zwischen der Lipidmonoschicht und der adsorbierten DNA besteht demnach nur eine schwache Wechselwirkung. Offensichtlich befindet sich die durch zweiwertige Kationen komplexierte DNA als weitgehend eigenständige Schicht unter dem Lipidfilm. 2. Modellsystem: Lipiddoppelschicht an der fest/flüssig-Grenzfläche Methoden: Neutronenreflexion (NR) und Quarzmikrowaage (QCM-D) Resultate: A) Das zwitterionische Phospholipid DMPC (1,2-Dimyristoyl-phosphatidylcholin) bildet keine Lipiddoppelschicht auf planaren Polyelektrolytmultischichten aus, deren letzte Lage das positiv geladene PAH (Polyallylamin) ist. B) Hingegen bildet DMPC auf dem negativ geladenen PSS (Polystyrolsulfonat) eine Doppelschicht aus, die jedoch Defekte aufweist. C) Eine Adsorption von genomischer Kalbsthymus-DNA auf dieser Lipidschicht findet nur in Gegenwart von Calciumionen statt. Andere zweiwertige Kationen wurden nicht untersucht. D) Das negativ geladene Phospholipid DLPA (1,2-Dilauryl-phosphatidsäure) bildet auf dem positiv geladenen PAH eine Lipiddoppelschicht aus, die Defekte aufweist. E) DNA adsorbiert ebenfalls erst in Anwesenheit von Calciumionen in der Lösung an die DLPA-Schicht. F) Durch die Zugabe von EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) werden die Calciumionen dem DLPA/DNA-Komplex entzogen, wodurch dieser dissoziiert. Demnach ist die calciuminduzierte Bildung dieser Komplexe reversibel. N2 - All over the world scientists are trying to engineer artificial viruses, which do not replicate, for gene delivery. These artificial viruses should have the advantages of natural viruses such as efficient transport of genetic material, but they should not carry antigens, which cause immune reactions, on their top portion. The aim of this project is to develop an artificial virus particle that is based on a polyelectrolyte hollow capsule which is covered by a lipid bilayer. To create intact bilayers, it is crucial to understand and optimize the interaction between lipids and polyelectrolytes (e. g. DNA). Therefore the structural basis of that interaction must be elucidated. Positively charged lipids interact strongly with the negatively charged DNA but they cause toxic reactions in biological cells. Hence the present work used two model systems to study the coupling of genomic or plasmid DNA to zwitterionic or negatively charged phospholipids induced by divalent cations. 1. Model system: Lipid monolayer at the air/water-interface Methods: Langmuir filmbalance in combination with IR-spectroscopy (IRRAS), X-ray reflectometry (XR), X-ray diffraction (GIXD), Brewster angle microscopy (BAM), X-ray fluorescence (XRF), and surface potential measurements Results: A) The presence of the divalent cations Ba2+, Mg2+, Ca2+ or Mn2+ in the subphase has no traceable influence on the structure of a zwitterionic DMPE (1,2-dimyristoyl-phosphatidyl-ethanolamine) monolayer. B) DNA which is dissolved in the subphase adsorbs to the DMPE-monolayer only if divalent cations are present. C) The adsorption of genomic calf thymus DNA as well as of the plasmid DNA pGL3 causes a reduction of the tilt angle of the lipid alkyl chains. The tilt reduction can be ascribed to a change in the space required by the lipid head group. This change in head group orientation increases the electrostatic interaction between the positively charged nitrogen atoms in the lipid head and the negatively charged DNA phosphates. D) The adsorbed DNA exhibits an ordered structure if it is complexed by barium, magnesium, calcium or manganese ions. The spacing between parallel DNA strands depends on the size of the DNA fragments as well as on the kind of cation. The largest DNA-spacings are observed with barium ions, followed by magnesium and calcium ions. DNA-complexation with manganese ions causes the smallest spacings. This order of ions is observed for both genomic and plasmid DNA. E) Compression of the monolayer does not influence the DNA spacings. Thus the interaction between the lipid monolayer and adsorbed DNA is only weak. The DNA must exist as a more or less separate layer under the lipid film. 2. Model system: Lipid bilayer at the solid/fluid-interface Methods: Neutron reflectometry (NR), and Quartz crystal microbalance (QCM-D) Results: A) The zwitterionic phospholipid DMPC (1,2-dimyristoyl phosphatidylcholine) does not form lipid bilayers on top of planar polyelectrolyte multilayers covered with the positively charged PAH (polyallylamine). B) In contrast, DMPC forms a lipid bilayer with defects on top of the negatively charged PSS (polystyrolsulfonate) terminated polyelectrolyte cushion. C) Genomic calf thymus DNA adsorbs only to the DMPC layer in presence of calcium ions. Different ions were not examined. D) The negatively charged phospholipid DLPA (1,2-dilauryl-phosphatidic acid) also forms a lipid bilayer with defects on top of the PAH-terminated cushion. E) The DNA adsorbs also to the DLPA layer only in the presence of calcium ions in the solution. F) By addition of EDTA (ethylenediaminetretraacetic acid) the calcium cations are removed from the DLPA/DNA-complex and the complex dissociates. Thus the calcium induced formation of that complex is reversible. KW - Lipide / Doppelschicht KW - DNA KW - Monoschicht KW - Gentransfer KW - Phospholipide KW - DNA-Lipid-Wechselwirkung KW - künstlicher Virus KW - zwitterionische Phospholipide KW - zweiwertige Kationen KW - zwitterionic phospholipids KW - DNA-lipid-interaction KW - divalent cations KW - artificial virus KW - lipid monolayer Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-7629 ER - TY - THES A1 - Heilmann, Katja T1 - Wechselwirkungen von Immunzellen mit synthetischen und biomimetischen Oberflächen T1 - Interactions of immune cells with synthetic and biomimetic surfaces N2 - Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum von Oktober 2002 bis November 2005 an dem Institut für Biochemie und Biologie der Universität Potsdam in Kooperation mit dem Institut für Chemie des GKSS Forschungszentrums in Teltow unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. B. Micheel und Herrn Prof. Dr. Th. Groth angefertigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Wechselwirkungen von Immunzellen mit verschiedenen Kultursubstraten untersucht. Dafür wurden drei verschiedene Hybridomzelllinien eingesetzt. Eine Hybridomzelllinie (K2) ist im Laufe dieser Arbeit hergestellt und etabliert worden. Der Einsatz von synthetischen und proteinbeschichteten Kulturoberflächen führte bei Hybridomzellen zu einer deutlich gesteigerten Antikörpersynthese im Vergleich zu herkömmlichen Zellkulturmaterialien. Obwohl diese Zellen in der Regel als Suspensionszellen kultiviert werden, führten die eingesetzten Polymermembranen (PAN, NVP) zu einer verbesserten Antikörpersynthese (um 30%) gegenüber Polystyrol als Referenz. Es konnte gezeigt werden, dass es einen Zusammenhang zwischen der Produktivität und dem Adh asionsverhalten der Hybridomzellen gibt. Um den Einfluss von Proteinen der extrazellulären Matrix auf Zellwachstum und Antikörpersynthese von Hybridomzellen zu untersuchen, wurden proteinbeschichtete Polystyrol-Oberflächen eingesetzt. Für die Modifikationen wurden Fibronektin, Kollagen I, Laminin und BSA ausgewählt. Die Modifikation der Polystyrol-Oberfläche mit geringen Mengen Fibronektin (0,2-0,4 µg/ml) führte zu einer beträchtlichen Steigerung der Antikörpersynthese um 70-120%. Für Kollagen I- und BSA-Beschichtungen konnten Steigerungen von 40% beobachtet werden. Modifikationen der Polystyrol-Oberfläche mit Laminin zeigten nur marginale Effekte. Durch weitere Versuche wurde bestätigt, dass die Adhäsion der Zellen an Kollagen I- und Laminin-beschichteten Oberflächen verringert ist. Die alpha2-Kette des alpha2beta1-Integrins konnte auf der Zelloberfläche nicht nachgewiesen werden. Durch ihr Fehlen wird wahrscheinlich die Bindungsfähigkeit der Zellen an Kollagen I und Laminin beeinflusst. Durch die Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass Hybridomzellen nicht nur Suspensionszellen sind und das Kultursubstrate das Zellwachstum und die Produktivität dieser Zellen stark beeinflussen können. Der Einsatz von synthetischen und proteinbeschichteten Kultursubstraten zur Steigerung der Antikörpersynthese kann damit für die industrielle Anwendung von großer Relevanz sein. Für die Modellierung einer Lymphknotenmatrix wurden Fibronektin, Kollagen I, Heparansulfat und N-Acetylglucosamin-mannose in verschiedenen Kombinationen an Glasoberflächen adsorbiert und für Versuche zur In-vitro-Immunisierung eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die Modifikation der Oberflächen die Aktivierung und Interaktion von dendritischen Zellen, T- und B-Lymphozyten begünstigt, was durch den Nachweis spezifischer Interleukine (IL12, IL6) und durch die Synthese spezifischer Antikörper bestätigt wurde. Eine spezifische Immunreaktion gegen das Antigen Ovalbumin konnte mit den eingesetzten Zellpopulationen aus Ovalbumin-T-Zell-Rezeptor-transgenen Mäusen nachgewiesen werden. Die In-vitro-Immunantwort wurde dabei am stärksten durch eine Kombination von Kollagen I, Heparansulfat und N-Acetylglucosamin-mannose auf einer Glasoberfläche gefördert. Die Etablierung einer künstlichen Immunreaktion kann eine gesteuerte Aktivierung bzw. Inaktivierung von körpereigenen dendritischen Zellen gegen bestehende Krankheitsmerkmale in vitro ermöglichen. Durch die Versuche wurden Grundlagen für spezifische Immunantworten erarbeitet, die u.a. für die Herstellung von humanen Antikörpern eingesetzt werden können. N2 - In this scientific work the interactions of immune cells with different culture substrata were investigated. Therefore, three hybridoma cell lines were tested, one cell line (K2) was established during this work. The application of synthetic and protein-coated culture surfaces lead to a significantly increased synthesis of monoclonal antibodies in comparison to usual tissue polystyrene. Although hybridoma cells were normally cultured in suspension applied polymer membranes like PAN and NVP induced an increase by 30%. Furthermore, an influence of cell adhesion and antibody synthesis could be shown. To investigate the influence of extracellular matrix proteins on growth and antibody synthesis of hybridoma cells tissue culture polystyrene was coated with fibronectin, collagen I, laminin and bovine serum albumine in different concentrations. Modifications with fibronectin (concentrations between 0.2 and 0.4 µg/ml) improved the yield of monoclonal antibodies considerably by 70-120%. Coating cell culture plates with collagen I and bovine serum albumine induced an increase by 40%. The coating with laminin showed only marginal effects. Further experiments approved a decreased adhesion of hybridoma cells on collagen I and laminin coated surfaces. FACS analysis showed a reduced presence of the alpha2-chain of the alpha2/beta1-integrin responsible for mediating the binding to collagen I and laminin. Probably, the binding affinity to collagen I and laminin coated surfaces was influenced by this. The results showed a high impact of modified culture substrata on antibody synthesis even if hybridoma cells were cultured in suspension normally and this could be an approach for industrial application. The second part of this work comprised the creation of a lymph node paracortex related surface. Different matrix proteins like fibronectin, collagen I, heparane sulfate and a sugar named N-acetylglucosamine-mannose were coated in different combinations on glass surfaces to create a matrix. Dendritic cells were cultivated on these surfaces and get activated with ovalbumin. After that naïve T- and B-cell populations were added and it could be shown nicely that the modifications of the culture surface were essential for activation and interaction of dendritic cells, T- and B-cells which resulted in the secretion of specific interleukins (IL12, IL6) and specific antibodies (anti-ovalbumin-antibodies). In these experiments a specific immune respone to ovalbumin in vitro could be detected if the cells were isolated from ovalbumin-receptor-transgenic-mice (TgNDO11.10). This In-vitro-immunization was triggered at most if cells were cultured on a surface coated with a combination of collagen I, heparane sulfate and N-acetylglucosamine-mannose. These experiments could be basics for controlled specific immune reactions in vitro which could be used for the production of human antibodies or for the controlled activation or inactivation of immune cells. KW - Hybridomtechnik KW - Antikörper KW - Extrazelluläre Matrix KW - Antikörperproduktion KW - Adhäsion KW - Polymermembranen KW - adhesion KW - polymer membranes KW - hybridoma cells KW - antibody synthesis Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-8843 ER - TY - THES A1 - Festag, Matthias T1 - Weiterentwicklung eines in vitro Embryotoxizitätsassays : die Inhibierung der Differenzierung von murinen embryonalen Stammzellen zu Endothelzellen N2 - Substanzen der pharmazeutischen und chemischen Industrie müssen nach internationalen Richtlinien auf deren Toxizität gegenüber Mensch und Umwelt geprüft werden. Dazu gehören u. a. Prüfungen zur Vorhersage des embryotoxischen Potentials, die am lebenden Organismus durchgeführt werden. Mit dem Ziel die Anzahl der Tierversuche zu verringern, die notwendig sind um das toxikologische Profil einer Prüfsubstanz zu bestimmen, wurde der Embryonale Stammzelltest (EST) entwickelt. Als Grundlage des EST dienen embryonale Stammzellen (ES-Zellen) einer Zelllinie. ES-Zellen sind Zellen, die sich in der frühen embryonalen Entwicklung in die Zellen der Keimblätter entwickeln können. Daraus wiederum differenzieren die vielen verschiedenen, unterschiedlich spezialisierten Zelltypen des komplexen Organismus. Im EST wird die Konzentration einer Prüfsubstanz bestimmt, bei der die Differenzierung von ES-Zellen zu Herzmuskelzellen zu 50 % inhibiert wird. Zusätzlich wird die Konzentration der Prüfsubstanz bestimm°t, bei der 50 % der ES-Zellen (IC50D3) bzw. Fibroblastenzellen (IC503T3) absterben. Die allgemeine Toxizität ist damit von der spezifischen Toxizität der Prüfsubstanz auf die ES-Zellen und deren Differenzierung unterscheidbar. Die Parameter fliessen in ein biostatistisches Modell zur Prädiktion des embryotoxischen Potentials der Prüfsubstanzen ein. Es wurde ein Versuchsprotokoll entwickelt, wonach die ES-Zellen sich verstärkt zu Endothelzellen differenzieren. Die Endothelzellen, die im lebenden Organismus die Wand der späteren Blutgefässe, wie Venen und Arterien bilden, wurden mittels molekularbiologischer Methoden auf der RNA- und der Protein-Ebene nachgewiesen und quantifiziert. Verschiedene Zellkulturmethoden, Wachstumsfaktoren, als auch Wachstumsfaktorkonzentrationen wurden auf deren Vermögen die Differenzierung der ES-Zellen zu Endothelzellen zu induzieren, untersucht. Nach der Etablierung des Differenzierungsprotokolls wurden sieben Substanzen auf deren Vermögen geprüft, die Differenzierung von ES-Zellen zu Endothelzellen zu inhibieren. Die Endothelzellen wurden dabei über die Expression der RNA von zwei endothelzellspezifischen Genen quantifiziert. Im Vergleich dazu wurden die IC50D3 und die IC503T3 der Prüfsubstanz bestimmt, um eine Abschätzung des embryotoxischen Potentials der Prüfsubstanz zu ermöglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine Abschätzung des embryotoxischen Potentials der sieben Prüfsubstanzen in nicht-, schwach- oder stark embryotoxisch vorgenommen werden konnte. Es ist zu schlussfolgern, dass der weiterentwickelte in vitro Embryotoxizitätsassay sensitiv und reproduzierbar ist. Mit der Verwendung von verschiedenen Differenzierungsendpunkten kann die Prädiktionskraft des Assays deutlich verbessert, und die Anzahl von Tierversuchen verringert werden. Durch die Verwendung von molekularbiologischen Markern kann der Assay einem Hochdurchsatzscreening zugängig gemacht werden und damit die Anzahl von Prüfsubstanzen deutlich erhöht werden. N2 - Compounds of the pharmaceutical and chemical industry need to be tested for their toxicological potential with regard to humans and environment following international guidelines. Tests for the prediction of the embryotoxic potential executed on living organisms are examples of these guidelines. In order to reduce the number of animal experiments necessary for the assessment of the toxicological profile of compounds the embryonic stem cell test (EST) was developed. Embryonic stem cells (ES-cells) of a cell line are used as the basis of the EST. ES-cells are cells which develop at the early embryonic development into cells of the germ layers. Out of these the many different specialized cell types of the complex organism can differentiate. With the EST this concentration of a test compound will be determined where a 50 % inhibition of the differentiation of ES-cells into cardiomyocytes can be detected. Additionally, the concentration of a test compound which is cytotoxic to 50 % of the ES-cells (IC50D3) and to 50 % of fibroblasts (IC503T3) will be determined. Therefore, general toxicity caused by the test compound on ES-cells and its differentiation can be distinguished from specific toxicity of the test compound. Determined parameters will be included into a biostatistical model for the subsequent predicition of the embryotoxic potential of test compounds. A protocol was developed whereby the differentiation of ES-cells into endothelial cells is induced. Endothelial cells which make up the walls of blood vessels, such as arteries and veins, were detected and quantified at the RNA and the protein level applying molecular biological methods. Different cell culture methods, growth factors and growth factor concentrations were studied for their ability to induce the differentiation of ES-cells into endothelial cells. Applying the developed differentiation protocol seven compounds were tested for their potential to inhibit the differentiation of ES-cells into endothelial cells. Endothelial cells were quantified by the RNA-expression of two endothelial-specific genes. In comparison to the expression levels the IC50D3 and the IC503T3 were determined in order to assess the embryotoxic potential of the test compound. The results showed that an assessment of the embryotoxic potential of the seven test compounds into non-, weakly- and strongly embroytoxic was possible. It can be concluded that the improved in vitro embryotoxicity assay is sensitive and reproducible. With the use of different differentiation endpoints the power of predicitivity of this assay can be significantly increased and the number of animal experiments can be reduced. With the application of molecular biological markers this assay can be applied as a high througput screening and therefore the number of test compounds can be strongly increased. T2 - Weiterentwicklung eines in vitro Embryotoxizitätsassays : die Inhibierung der Differenzierung von murinen embryonalen Stammzellen zu Endothelzellen KW - EST KW - Stammzelle KW - Maus KW - Endothelzelle KW - EST KW - stem cell KW - mouse KW - endothelial cell Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001815 ER - TY - THES A1 - Pitzen, Valentin T1 - Weitergeführte funktionelle Charakterisierung des centrosomalen Proteins Cep192 und Untersuchung der Topologie des Centrosoms in Dictyostelium Amöben T1 - Functional Characterization of the Centrosomal Protein Cep192 and Investigation of the Topology of the Centrosome in Dictyostelium amoeba N2 - Das Centrosom von Dictyostelium ist acentriolär aufgebaut, misst ca. 500 nm und besteht aus einer dreischichten Core-Struktur mit umgebender Corona, an der Mikrotubuli nukleieren. In dieser Arbeit wurden das centrosomale Protein Cep192 und mögliche Interaktionspartner am Centrosom eingehend untersucht. Die einleitende Lokalisationsuntersuchung von Cep192 ergab, dass es während der gesamten Mitose an den Spindelpolen lokalisiert und im Vergleich zu den anderen Strukturproteinen der Core-Struktur am stärksten exprimiert ist. Die dauerhafte Lokalisation an den Spindelpolen während der Mitose wird für Proteine angenommen, die in den beiden identisch aufgebauten äußeren Core-Schichten lokalisieren, die das mitotische Centrosom formen. Ein Knockdown von Cep192 führte zur Ausbildung von überzähligen Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOC) sowie zu einer leicht erhöhten Ploidie. Deshalb wird eine Destabilisierung des Centrosoms durch die verminderte Cep192-Expression angenommen. An Cep192 wurden zwei kleine Tags, der SpotH6- und BioH6-Tag, etabliert, die mit kleinen fluoreszierenden Nachweiskonjugaten markiert werden konnten. Mit den so getagten Proteinen konnte die hochauflösende Expansion Microscopy für das Centrosom optimiert werden und die Core-Struktur erstmals proteinspezifisch in der Fluoreszenzmikroskopie dargestellt werden. Cep192 lokalisiert dabei in den äußeren Core-Schichten. Die kombinierte Markierung von Cep192 und den centrosomalen Proteinen CP39 und CP91 in der Expansion Microscopy erlaubte die Darstellung des dreischichtigen Aufbaus der centrosomalen Core-Struktur, wobei CP39 und CP91 zwischen Cep192 in der inneren Core-Schicht lokalisieren. Auch die Corona wurde in der Expansion Microscopy untersucht: Das Corona-Protein CDK5RAP2 lokalisiert in räumlicher Nähe zu Cep192 in der inneren Corona. Ein Vergleich der Corona-Proteine CDK5RAP2, CP148 und CP224 in der Expansion Microscopy ergab unterscheidbare Sublokalisationen der Proteine innerhalb der Corona und relativ zur Core-Struktur. In Biotinylierungsassays mit den centrosomalen Core-Proteinen CP39 und CP91 sowie des Corona-Proteins CDK5RAP2 konnte Cep192 als möglicher Interaktionspartner identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die wichtige Funktion des Proteins Cep192 im Dictyostelium-Centrosom und ermöglichen durch die Kombination aus Biotinylierungsassays und Expansion Microscopy der untersuchten Proteine ein verbessertes Verständnis der Topologie des Centrosoms. N2 - The Dictyostelium centrosome contains no centrioles and has a diameter of approx. 500 nm. It consists of a three layered core structure and a surrounding corona, which nucleates microtubules. This work focusses on the centrosomal protein Cep192 and potential interactors at the centrosome. Localization studies showed, that Cep192 is a permanent resident at the spindle poles during mitosis and that, compared to other centrosomal core proteins, Cep192 is expressed at the highest level. The permanent residence at the spindle poles throughout mitosis is assumed for proteins which localize to the outer core layers, which form the mitotic centrosome. A knockdown of Cep192 resulted in supernumerary microtubule organizing centers (MTOC) and a slightly higher ploidy. Due to the phenotype, a destabilization of the centrosome caused by the reduced Cep192 expression is assumed. Cep192 was fused to the newly established short tags BioH6 and SpotH6, which are recognized by small fluorescently labelled probes. The tagged proteins were used for superresolution expansion microscopy. Superresolution expansion microscopy was optimized for the centrosome and allowed the protein specific resolving of the core structure for the first time. Cep192 localizes to the outer core layers. Combination of tagged proteins nicely mirrored all three core layers. CP39 and CP91 localize inbetween Cep192 in the inner core layer. Corona proteins were included in the expansion microscopy: the corona protein CDK5RAP2 comes into close proximity of Cep192 and localizes to the inner corona. A comparison with CP148 and CP224, two other corona proteins, revealed a distinct localization of the proteins within the corona and relatively to the core structure. Applied biotinylase assays with the core proteins CP39 and CP91, as well with the corona protein CDK5RAP2 revealed Cep192 as a possible interaction partner of all three proteins. The results of this work show the important function of Cep192 at the Dictyostelium centrosome and through the biotinylase assay and expansion microscopy data shed a light on the refined Dictyostelium centrosome topology. KW - Centrosom KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - expansion microscopy KW - Cep192 KW - CDK5RAP2 KW - fluorescence microscopy KW - Cep192 KW - CDK5RAP2 Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-548891 ER - TY - THES A1 - Meyer, Susann T1 - Wirkung und Wirkungsweise von Ectoin auf DNA-Moleküle Y1 - 2018 ER - TY - THES A1 - Friedrich, Maika T1 - Wirkung von Teecatechin Epigallocatechingallat auf den Energiestoffwechsel der Maus T1 - Effect of tea catechin epigallocatechin gallate on energy metabolism in mice N2 - Die gesundheitsfördernden Eigenschaften von grünem Tee sind weitgehend akzeptiert. Den Teecatechinen, insbesondere dem Epigallocatechin-3-gallat (EGCG), werden zahlreiche positive Effekte zugesprochen (z. B. antioxidativ, antikanzerogen, antiinflammatorisch, Blutdruck und Cholesterinspiegel senkend). Die Mechanismen, die zu einer Reduktion der in Tierversuchen beschriebenen Körper- und Fettmasse führen, sind nicht ausreichend geklärt. Ziel dieser Arbeit bestand darin, die kurz- und mittelfristigen Wirkungen einer TEAVIGO®-Applikation (mind. 94 % EGCG) am Mausmodell im Hinblick auf den Energie- und Fettstoffwechsel sowie die Expression daran beteiligter Gene in wichtigen Organen und Geweben zu untersuchen. In verschiedenen Tierversuchen wurde männlichen C57BL/6-Mäusen eine Hochfettdiät (HFD) mit und ohne Supplementation (oral, diätetisch) des entkoffeinierten Grüntee-Extraktes TEAVIGO® in unterschiedlichen Dosierungen gefüttert. Es wurden sowohl kurz- als auch mittelfristige Wirkungen des EGCG auf die Energiebilanz (u. a. indirekte Tierkalorimetrie) und Körperzusammensetzung (NMR) sowie die exogene Substratoxidation (Stabilisotopentechnik: Atemtests, Inkorporation natürlicher 13C-angereicherter Triglyceride aus Maiskeimöl in diverse Organe/Gewebe) und Gen-expression (quantitative real-time PCR) untersucht. Die Applikationsform und ihre Dauer riefen unterschiedliche Wirkungen hervor. Mäuse mit diätetischer Supplementation zeigten bereits nach kurzer Zeit eine verminderte Körperfettmasse, die bei weiterer Verabreichung auch zu einer Reduktion der Körpermasse führte. Beide Applikationsformen resultieren, unabhängig von der Dauer der Intervention, in einer erhöhten Energieausscheidung, während die Futter- und Energieaufnahme durch EGCG nicht beeinflusst wurden. Der Energieverlust war von einer erhöhten Fett- und Stickstoffausscheidung begleitet, deren Ursache die in der Literatur beschriebene Interaktion und Hemmung digestiver Enzyme sein könnte. Besonders unter postprandialen Bedingungen wiesen EGCG-Mäuse erniedrigte Triglycerid- und Glycogengehalte in der Leber auf, was auf eine eingeschränkte intestinale Absorption der Nährstoffe hindeutet. Transkriptanalysen ergaben im Darm eine verminderte Expression von Fettsäuretransportern, während die Expression von Glucosetransportern durch EGCG erhöht wurde. Weiterhin reduzierte EGCG, nach Umstellung von Standard- auf eine maiskeimölhaltige Hochfettdiät, die Inkorporation natürlicher 13C-angereicherter Triglyceride in diverse Organe und Gewebe – insbesondere Leber, viszerales und braunes Fettgewebe sowie Skelettmuskel. Die Analyse der 13C-Anreicherung im Atem der Mäuse und die Energieumsatzmessungen ergaben nach kurzer Applikation eine erhöhte Fettoxidation, die im weiteren Verlauf der Intervention auf eine erhöhte Kohlenhydratoxidation umgeschaltet wurde. Weiterhin war die orale Applikation von EGCG bei gleichzeitiger Fütterung einer Hochfettdiät von makroskopischen und mikroskopischen degenerativen Veränderungen der Leber begleitet. Diese Effekte wurden nach diätetischer Supplementation der Hochfettdiät mit EGCG nicht beobachtet. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Körpergewichts- und Fettgewebs-abnahme durch diätetisches EGCG sich durch eine herabgesetzte Verdaulichkeit der Nahrung erklären lässt. Dies führte zu verschiedenen kurz- und mittelfristigen Veränderungen in der Fettverteilung und im Fettmetabolismus. N2 - The health-promoting properties of green tea are widely accepted. Tea catechins, particularly epigallocatechin-3-gallate (EGCG), are attributed to many positive effects (anti-oxidative, anti-cancerogen, anti-inflammatory, blood pressure and cholesterol lowering). Mechanisms leading to a reduction of body mass and fat mass in animal experiments are not fully elucidated. The aim of this study was to examine multiple effects of TEAVIGO® application (at least 94% EGCG) in a mouse model in terms of energy and fat metabolism. Expressions of genes involved in these processes were also determined in different organs and tissues. In several animal studies, male C57BL/6 mice were fed a high fat diet supplemented with decaffeinated TEAVIGO® (oral, dietetic) at different dosages. Short- and medium-term effects of EGCG were investigated on energy balance (indirect animal calorimetry), body composition (NMR), exogenous substrate oxidation (stable isotopes: breath tests, incorporation of naturally 13C-enriched triglycerides from corn oil into various organs/tissues), and gene expression (quantitative real-time PCR). Type of application and its duration elicited different effects. Supplemented mice already showed a reduced body fat mass after short- and medium-term treatment. Further administration lead to a reduction of body weight. Regardless of the duration of intervention, both types of application resulted in an increased energy excretion, while food and energy intake was not affected by EGCG. Fecal energy loss was accompanied by an increased fat and nitrogen excretion, which was probably due to an inhibition of digestive enzymes. Fed mice displayed a decreased triglyceride and glycogen content in liver suggesting a reduced absorption of nutrients in the intestine. This was supported by a decreased expression of intestinal fatty acid transporters. However, expression of glucose transporters was increased after short- and medium term application. Furthermore, EGCG attenuated incorporation of naturally 13C-enriched triglycerides into various organs and tissues – particularly liver, visceral and brown adipose tissue, and skeletal muscle. Analysis of 13C-enrichment in breath and measurement of energy expenditure revealed an initial increased fat oxidation, which was switched to an increased carbohydrate oxidation over time. Besides, a combination of oral administration of EGCG and high fat feeding was accompanied by macroscopic and microscopic deleterious changes in liver. These effects were not observed after dietary supplementation of EGCG. Altogether, reduction in body mass and fat mass by EGCG can be explained by a decreased food digestibility leading to various short- and medium-term changes in fat distribution and lipid metabolism. KW - Grüner Tee KW - Teecatechin KW - Epigallocatechingallat KW - Energiestoffwechsel KW - Fettstoffwechsel KW - green tea KW - tea catechin KW - epigallocatechin gallate KW - energy metabolism KW - fat metabolism Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-48159 ER - TY - THES A1 - Rietdorf, Katja T1 - Wirkungen biogener Amine auf die Erregungs-Sekretions-Kopplung in der Speicheldrüse von Periplaneta americana (L.) N2 - In der vorliegenden Arbeit habe ich wichtige Teilmechanismen der Erregungs-Sekretionskopplung in der Speicheldrüse der Schabe Periplaneta americana (L.) untersucht. Die Speicheldrüse ist von dopaminergen und serotonergen Fasern innerviert (Baumann et al., 2002). Beide Transmitter stimulieren eine unterschiedliche Reaktion der Drüse: Dopamin (DA) stimuliert die P-Zellen der Acini und die Ausführgangzellen, während Serotonin (5-HT) die P- und C-Zellen der Acini stimuliert, nicht jedoch die Ausführgangzellen. Der Endspeichel ist nach einer DA-Stimulierung proteinfrei. Dagegen enthält er nach einer 5-HT-Stimulierung Proteine, die von den C-Zellen sezerniert werden (Just & Walz, 1996). Im ersten Teil meiner Arbeit habe ich mittels Kapillarelektrophoretischer Analyse (CE-Analyse) die Elektrolytkonzentrationen im Endspeichel untersucht sowie die Raten der Flüssigkeitssekretion gemessen. Damit wollte ich klären, welche Transporter an der Sekretion des Primärspeichels und an dessen Modifikation beteiligt sind. Ausserdem wollte ich die Rolle der transportaktiven Epithelzellen der Ausführgänge für die Modifikation des Primärspeichels untersuchen. Dafür habe ich einen Vergleich der Elektrolytkonzentrationen im DA- und 5-HT-stimulierten Endspeichel durchgeführt. Der Elektrolytgehalt des DA- und 5-HT-stimulierten Endspeichels unterscheidet sich nicht signifikant voneinander. Er ist nach beiden Stimulierungen hypoosmotisch zum verwendeten Ringer. Die Ausführgangzellen werden durch DA stimuliert und modifizieren den Primärspeichel durch eine netto-Ionenreabsorption. Meine Versuche zeigen jedoch, dass auch die während einer 5-HT-Stimulierung der Drüse unstimulierten Ausführgangzellen den Primärspeichel modifizieren. In einer nachfolgenden Versuchsreihe habe ich den Einfluss von Ouabain, einem Hemmstoff der Na+-K+-ATPase, und Bumetanid, einem Hemmstoff des NKCC, auf die Raten der Flüssigkeitssekretion sowie den Elektrolytgehalt des Endspeichels untersucht. Ich habe gefunden, dass die Aktivität der Na+-K+-ATPase wichtig für die Modifikation des DA-stimulierten Primärspeichels ist. Im Gegensatz dazu ist sie für die Modifikation des 5-HT-stimulierten Primärspeichels nicht von Bedeutung. Bezüglich der Flüssigkeitssekretion habe ich keinen Einfluss der Na+-K+-ATPase-Aktivität auf die DA-stimulierten Sekretionsraten gefunden, dagegen ist die 5-HT-stimulierte Sekretionsrate in Anwesenheit von Ouabain gesteigert. Die Aktivität des NKCC ist für beide sekretorische Prozesse, die Ionen- und die Flüssigkeitssekretion, wichtig. Eine Hemmung des NKCC bewirkt eine signifikante Verringerung der Raten der Flüssigkeitssekretion nach DA- und 5-HT-Stimulierung sowie in beiden Fällen einen signifikanten Abfall der Ionenkonzentrationen im Endspeichel. Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich versucht, Änderungen der intrazellulären Ionenkonzentrationen in den Acinuszellen während einer DA- oder 5-HT-Stimulierung zu messen. Diese Experimente sollten mit der Methode des "ratiometric imaging" durchgeführt werden. Messungen mit dem Ca2+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 zeigten keinen globalen Anstieg in der intrazellulären Ca2+-Konzentration der P-Zellen. Aufgrund von Problemen mit einer schlechten Beladung der Zellen, einer starken und sich während der Stimulierung ändernden Autofluoreszenz der Zellen sowie Änderungen im Zellvolumen wurden keine Messungen mit Na+- und K+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt. Im dritten Teil dieser Arbeit habe ich die intrazellulären Signalwege untersucht, die zwischen einer 5-HT-Stimulierung der Drüse und der Proteinsekretion vermitteln. Dazu wurde der Proteingehalt im Endspeichel biochemisch mittels eines modifizierten Bradford Assay gemessen. Eine erstellte Dosis-Wirkungskurve zeigt, dass die Rate der Proteinsekretion von der zur Stimulierung verwendeten 5-HT-Konzentration abhängt. In einer Serie von Experimenten habe ich die intrazellulären Konzentrationen von Ca2+, cAMP und / oder cGMP erhöht und anschließend den Proteingehalt im Endspeichel gemessen. Ein Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration aktiviert nur eine geringe Rate der Proteinsekretion. Dagegen kann die Steigerung der intrazellulären cAMP-Konzentration eine stärkere Proteinsekretion aktivieren, die sich nicht signifikant von der nach 5-HT-Stimulierung unterscheidet. Die cAMP-stimulierte Proteinsekretion kann durch gleichzeitige Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration weiter gesteigert werden. Dagegen aktivierte eine Erhöhung der intrazellulären cGMP-Konzentration die Proteinsekretion nicht. Aufgrund dieser Ergebnisse postuliere ich die Existenz eines die Adenylatcyclase aktivierenden 5-HT-Rezeptors in der Basolateralmembran der C-Zellen. N2 - The aim of this PhD-work was to investigate major mechanisms of excitation-secretion coupling in the salivary gland of the cockroach Periplaneta americana (L.). This salivary gland is innervated by dopaminergic and serotonergic fibres (Baumann et al., 2002). The two transmitters stimulate different processes in the gland: Dopamine (DA) stimulates the p-cells of the acini and the salivary duct cells, whereas 5-HT (serotonin) activates the p- and the c-cells of the acini, but not the salivary duct cells. Final saliva is completely protein-free after dopamine stimulation. It contains proteins, which are secreted by the c-cells of the acini, after a 5-HT-stimulation (Just & Walz, 1996). In the first part of my work I measured the electrolytic composition of the final saliva by capillary electrophoretic analysis and measured the rates of fluid secretion, in order to answer the following questions: 1.) Which transporters affect the production of primary saliva and its modification? 2.) What is the function of the transport-active salivary duct cells for the modification of the primary saliva? Electrolytic composition of the DA- and 5-HT-stimulated final saliva is not significantly different from each other, and is hypoosmotic to the Ringer used. Salivary duct cells are stimulated by DA and modify the primary saliva by a netto ion-reabsorption. My experiments also show that the duct cells, which are unstimulated during a 5-HT-stimulation of the gland, modify the primary saliva. In the next series of experiments I investigated the effects of ouabain, an inhibitor of the Na+-K+-ATPase, and bumetanide, an inhibitor of the NKCC on the rates of fluid secretion and the electrolytic composition of the final saliva. I found, that the activity of the Na+-K+-ATPase is important for the modification of DA-stimulated primary saliva during its flow through the stimulated duct system. In contrast, it is not important for modification of the 5-HT-stimulated primary saliva. Inhibition of the Na+-K+-ATPase does not affect rates of DA-stimulated fluid secretion, but it increases the rates of 5-HT-stimulated fluid secretion. Activity of the NKCC is important for both secretory processes: the ion and the fluid secretion. Inhibition of the NKCC results in a significant drop in the rates of fluid secretion after DA- and 5-HT-stimulation, as well as a drop in electrolytic concentrations in the saliva. In the second part of my work, I tried to measure changes in the intracellular ionic concentrations (Ca2+, Na+, and K+) within the acinar cells during a DA- or 5-HT-stimulation. The experiments should be performed by ratiometric imaging. Measurements with the Ca2+-sensitive dye Fura-2 did not show any global increase in the intracellular Ca2+-concentration in the p-cells of the acini. Problems concerning a bad loading of the cells, a strong autofluorescence which changed during the time course of the stimulation, as well as changes in the cell volume were the reason, that no measurements using Na+- or K+-sensitive dyes were performed. In the third part of my work I investigated the intracellular signalling pathways, which activate protein secretion after 5-HT-stimulation of the gland. A modified Bradford Assay was used for measuring the protein content in the final saliva. In a dose-response curve I showed that rates of protein secretion are dependent on the 5-HT-concentrations used to stimulate the glands. In another set of experiments I increased the intracellular concentrations of Ca2+, cAMP and / or cGMP, and measured the protein content in the final saliva. An increase in the intracellular Ca2+-concentration activates only a low rate of protein secretion. After an increase in the intracellular cAMP-concentration a much higher rate of protein secretion can be activated, which is not significantly different from the 5-HT stimulated rate of protein secretion. The cAMP-stimulated protein secretion can be further increased by a simultaneous rise in the intracellular Ca2+-concentration. In contrast, cGMP does not activate protein secretion. Therefore I propose the expression of an adenylyl cyclase activating 5-HT-receptor in the basolateral membrane of the protein secreting c-cells. KW - Periplaneta KW - Speicheldrüse KW - Speichel KW - ionale Zusammensetzung KW - Ionentransport KW - Proteinsekretion KW - second messenger KW - Periplaneta KW - salivary gland KW - saliva KW - ionic composition KW - ion transport KW - protein secretion KW - second messenger Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000878 ER - TY - THES A1 - Pacholsky, Dirk T1 - Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte während der Muskelentwicklung N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei humane Varianten des von Wang et al., 1999, erstmals beschriebenen muskelspezifischen Proteins Xin (Huhn und Maus) über Sequenzanalyse, Immunofluoreszenzmikroskopie, Transfektionsstudien und biochemischer Analyse näher charakterisiert. Die Proteine wurden mit human Xin related proteins 1 und 2 – hXirp1 und 2 –bezeichnet. Die Xin-Proteine enthielten bisher unbekannte, sowie spezifische, repetitive Motive, die aus jeweils mindestens 16 Aminosäuren bestanden. Ihre Aminosäuresequenz, mit einer Vielzahl weiterer putativer Motivsequenzen, verwies auf eine potentielle Funktion von hXirp als Adapterprotein in Muskelzellen. Das hier näher untersuchte hXirp1 lokalisierte an den Zell-Matrix-Verbindungen der Muskel-Sehnen-Übergangszone im Skelettmuskel, sowie an den Zell-Zell-Verbindungen der Glanzstreifen im Herzmuskel. Während der Muskelentwicklung zeigte hXirp1 eine sehr frühe Expression, zusammen mit einer prägnanten Lokalisation an den Prämyofibrillen und deren Verankerungsstrukturen, die auf eine Funktion des Proteins in der Myofibrillogenese deuten. Ektopische Expressionen von hXirp1 in einer Vielzahl von Nichtmuskel-Kulturzellen zeigten wiederum eine Lokalisation des Proteins an den Zell-Matrix-Kontakten dieser Zellen. Am Beispiel von hXirp1 und 2 wurde stellvertretend für die Familie der Xin-Proteine gezeigt, daß es sich bei den repetitiven Motiven um neuartige, F-Aktin bindende Sequenzmotive handelte. Die Xin-Proteine können somit als muskelspezifische, aktinbindende, potentielle Adapterproteine bezeichnet werden, denen eine strukturelle und funktionelle Beteiligung an der Verankerung der Myofibrillen im adulten Muskel, wie auch während der Myofibrillogenese zukommt. N2 - The scope of this work was a further characterization of two human variants of the protein Xin which was reported for chicken and mouse in 1999 by Wang et al. Therefor sequence analysis, immunofluorescence microscopy, transfection studies and biochemical approaches were utilized. The proteins were named human Xin related proteins 1 und 2 – hXirp1 und 2. Xin-proteins possess specific repetitive motives consisting of a minimum of 16 amino acids each. Concerning further putative motive sequences hXirp is a potential adapter protein in the muscle cell. hXirp1 localized within the cell-matrix-contacts of the myotendinous junction in skeletal muscle as well as within the cell-cell-contacts of the intercalated disc in the cardiac muscle. During the development of muscle cells hXirp1 showed early expression as well as concise localization to premyofibrils and their anchorage structures indicating a potential role for this protein in myofibrillogenesis. Ectopic expression of hXirp1 in several non-muscle cells again revealed localization of this protein to cell-matrix contacts. Considering hXirp1 and 2 as an example for all Xin-proteins it was shown that the repetitive motives are new actin binding motives. The data indicated the Xin-proteins as muscle specific, actin binding and potential adapter proteins with implications in structure and function of anchorage of myofibrils in adult muscle and myofibrillogenesis. KW - Muskel KW - Muskel-Sehnen-Verbindung KW - Glanzstreifen KW - Xin KW - muscle KW - myotendinous junction KW - intercalated disc KW - Xin Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001161 ER - TY - THES A1 - Brandt, Stephan Peter T1 - Zelltyp-spezifische Mikroanalyse von Arabidopsis thaliana-Blättern N2 - Im ersten Teil der Arbeit wurden Strategien zur Analyse von Transkripten erarbeitet. Die ersten Versuche zielten darauf ab, in mit Glaskapillaren genommenen Einzelzellproben verschiedener Gewebeschichten RT-PCR durchzuführen, um spezifische Transkripte nachweisen zu können. Dies gelang für eine Reihe von Genen aus verschiedenen Pflanzenspezies. Dabei konnten sowohl Transkripte stark wie auch schwach exprimierter Gene nachgewiesen werden. Für die Erstellung von Gewebe-spezifischen Expressionsprofilen war es notwendig, die in vereinigten Zellproben enthaltene mRNA zunächst zu amplifizieren, um eine ausreichende Menge für Arrayhybridisierungen zu erhalten. Vor der Vermehrung wurde die mRNA revers transkribiert. Es wurden daran anschließend verschiedene Amplifikationsstrategien getestet: Die neben Tailing, Adapterligation und anderen PCR-basierenden Protokollen getestete Arbitrary-PCR hat sich in dieser Arbeit als einfache und einzige Methode herausgestellt, die mit so geringen cDNA-Mengen reproduzierbar arbeitet. Durch Gewebe-spezifische Array-hybridisierungen mit der so amplifizierten RNA konnten schon bekannte Expressionsmuster verschiedener Gene, vornehmlich solcher, die an der Photosynthese beteiligt sind, beobachtet werden. Es wurden aber auch eine ganze Reihe neuer offensichtlich Gewebe-spezifisch exprimierter Gene gefunden. Exemplarisch für die differentiell exprimierten Gene konnte das durch Arrayhybridisierungen gefundene Expressionsmuster der kleinen Untereinheit von Rubisco verifiziert werden. Hierzu wurden Methoden zum Gewebe-spezifischen Northernblot sowie semiquantitativer und Echtzeit-Einzelzell-RT-PCR entwickelt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Methoden zur Analyse von Metaboliten einschließlich anorganischer Ionen verwendet. Es stellte sich heraus, daß die multiparallele Methode der Gaschromatographie-Massenspektrometrie keine geeignete Methode für die Analyse selbst vieler vereinigter Zellinhalte ist. Daher wurde auf Kapillarelektrophorese zurückgegriffen. Eine Methode, die mit sehr kleinen Probenvolumina auskommt, eine hohe Trennung erzielt und zudem extrem geringe Detektionslimits besitzt. Die Analyse von Kohlenhydraten und Anionen erfordert eine weitere Optimierung. Über UV-Detektion konnte die K+-Konzentration in verschiedenen Geweben von A. thaliana bestimmt werden. Sie lag in Epidermis und Mesophyll mit ca. 25 mM unterhalb der für andere Pflanzenspezies (Solanum tuberosum und Hordeum vulgare) publizierten Konzentration. Weiter konnte gezeigt werden, daß zwölf freie Aminosäuren mittels einer auf Kapillarelektrophorese basierenden Methode in vereinigten Zellproben von Cucurbita maxima identifiziert werden konnten. Die Übertragung der Methode auf A. thaliana-Proben muß jedoch weiter optimiert werden, da die Sensitivität selbst bei Laser induzierter Fluoreszenz-Detektion nicht ausreichte. Im dritten und letzten Teil der Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die die Analyse bekannter wie unbekannter Proteine in Gewebe-spezifischen Proben ermöglicht. Hierzu wurde zur Probennahme mittels mechanischer Mikrodissektion eine alternative Methode zur Laser Capture Microdissection verwendet, um aus eingebetteten Gewebeschnitten distinkte Bereiche herauszuschneiden und somit homogenes Gewebe anzureichern. Aus diesem konnten die Proteine extrahiert und über Polyacrylamidgelelektrophorese separariert werden. Banden konnten ausgeschnitten, tryptisch verdaut und massenspektrometrisch die Primärsequenz der Peptidfragmente bestimmt werden. So konnten als Hauptproteine im Mesophyll die große Untereinheit von Rubisco sowie ein Chlorophyll bindendes Protein gefunden werden. Die in dieser Arbeit entwickelten und auf die Modellpflanze Arabidopsis thaliana angewandten Einzelzellanalysetechniken erlauben es in Zukunft, physiologische Prozesse besser sowohl räumlich als auch zeitlich aufzulösen. Dies wird zu einem detaillierteren Verständnis mannigfaltiger Vorgänge wie Zell-Zell-Kommunikation, Signalweiterleitung oder Pflanzen-Pathogen-Interaktionen führen. N2 - The subject of this thesis was the analysis of single plant cells in respect to their contents of i) transcripts, ii) inorganic cations and anions, iii) metabolites like amino acids and carbohydrates as well as iv) proteins. One task was the transfer of existing methods to single cell analysis on leaf tissues of the model plant Arabisopsis thaliana L., the second one was the refinement and the development, respectively, of new protocols for the analysis of such picoliter samples. For cell type specific sampling two different complimentary methods were applied: Using micro glass capillaries specific single cell contents could be harvested from intact plants, whereas typical sample volumes were in the picoliter range. Even the sampling of inner cell types such as companion cells could be demonstrated. Using mechanical micro dissection of embedded tissue a larger amount of homogenous tissue could be collected. Because single cell samples contain only femtogram amounts of mRNA, direct detection of transcripts is impossible. Therefore, two amplification protocols were applied to the cell samples: The first procedure makes use of specifically primed RT-PCR for amplification. Several genes derived from different plants and tissues could be detected after successful RT-PCR, including high as well as low expressed genes. The second method was developed to monitor the activity of many genes in parallel using array hybridisation with filters containing the cDNA of as many as 16.000 ESTs. For this purpose, unspecific RT-PCR as it is applied in the differential display was used to amplify different transcripts in just one reaction. However, in these tissue specific array hybridisations the expression patterns of several hundreds genes could be monitored. These included known tissue specific expression patterns (of mainly photosynthesis related genes) as well as a couple of unknown expression patterns. To verify the tissue specificity of gene activity some results were reconsidered using tissue specific northern blot hybridisations and real time RT-PCR, respectively. Secondly, metabolites (including inorganic ions) were investigated: Because gas chromatography-mass spectrometry does not reveal the sensitivity which in necessary for the analysis of even multiple pooled single cell samples capillary electrophoresis was applied for these studies. This method has a high potential as it needs only small amounts of starting material, has uncomparable low detection limits and exhibits a high number of theoretical plates. The analysis of inorganic anions and carbohydrates needs further optimisations. Using UV absorption-detection potassium could be detected in different cell types whereas the concentrations in mesophyll and epidermis were found around 25 mM each. These concentrations are lower than in other species as Solanum tuberosum or Hordeum vulgare. For investigations of amino acids the cell samples were derivatized to make the use of laser induced fluorescence-detection capable. In samples derived from pumpkin (Cucurbita maxima) mesophyll twelve amino acids could be detected and identified. The transfer of this method to A. thaliana derived samples exhibited no results which may be due to the low concentration of free amino acids in these plants. Finally, a method was developed with which the existence of known and unknown proteins in tissue specific samples could be monitored. For this, mechanical micro dissection was used to: After embedding and sectioning the tissue of interest was cut out by an vibrating steel chisel to get homogenous samples. The proteins contained in these tissue pieces were extracted and separated by one dimensional SDS polyacrylamid gel electrophoresis. Several protein bands could be detected after staining with either silver or coomassie blue stain. These bands were cut out and sequenced by mass spectrometry. The large subunit of rubisco as well as one chlorophyll binding protein could be identified as the major proteins within the mesophyll. The single cell analysis methods which were developed and applied to the model plant A. thaliana in this thesis allow a better spatial as well as temporal resolution of analysis. This will lead to a more detailed understanding of physiological processes like cell to cell communication, signalling or plant-pathogen interactions. KW - Einzelzellanalytik KW - minimal invasive Probennahme KW - Array Hybridisierung KW - RT-PCR KW - Kapillarelektrophorese KW - Fluoreszeinisothiocyanat KW - mechanische Mikrodis KW - single cell analysis KW - minimal invasive sampling KW - single cell sammpling and analysis (SCSA) KW - array hybridisation KW - RT-PCR KW - capillary electrophoresis KW - fl Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000410 ER - TY - THES A1 - Lengefeld, Jan T1 - Zirkulardichroismus-Messungen mit Synchrotronstrahlung am BESSY : Möglichkeiten und Grenzen bei der Untersuchung biologischer Proben T1 - Synchrotron radiation circular dichroism measurements at BESSY : potentials and limitations investigating biological samples N2 - In dieser Arbeit wurden die Möglichkeiten und Grenzen für Zirkulardichroismus-Messungen mit Synchrotronstrahlung untersucht. Dazu wurde ein Messaufbau für Zirkulardichroismus-Messungen an zwei Strahlrohren am Berliner Elektronenspeicherring für Synchrotronstrahlung eingesetzt, die für Messungen im Bereich des ultravioletten Lichts geeignet sind. Eigenschaften der Strahlrohre und des Messaufbau wurden in einigen wichtigen Punkten mit kommerziellen Zirkulardichroismus-Spektrometern verglichen. Der Schwerpunkt lag auf der Ausdehnung des zugänglichen Wellenlängenbereichs unterhalb von 180 nm zur Untersuchung des Zirkulardichroismus von Proteinen in diesem Bereich. In diesem Bereich ist es nicht nur die Lichtquelle sondern vor allem die Absorption des Lichts durch Wasser, die den Messbereich bei der Messung biologischer Proben in wässriger Lösung einschränkt. Es wurden Bedingungen gefunden, unter denen der Messbereich auf etwa 160 nm, in einigen Fällen bis auf 130 nm ausgedehnt werden konnte. Dazu musste die Pfadlänge deutlich reduziert werden und verschieden Probenküvetten wurden getestet. Der Einfluss der dabei auftretenden Spannungsdoppelbrechung in den Probenküvetten auf das Messsignal konnte mit einem alternativen Messaufbau deutlich reduziert werden. Systematische Fehler im Messsignal und auftretende Strahlenschäden begrenzen jedoch die Zuverlässigkeit der gemessenen Spektren. Bei Proteinfilmen schränkt die Absorption von Wasser den Messbereich kaum ein. Es wurden jedoch meist deutliche Unterschiede zwischen den Spektren von Proteinfilmen und den Spektren von Proteinen in wässriger Lösung festgestellt. Solange diese Unterschiede nicht minimiert werden können, stellen Proteinfilme keine praktikable Alternative zu Messungen in wässriger Lösung dar. N2 - The possibilities and limitations for synchrotron radiation circular dichroism measurements were investigated in this thesis. Therefore an experimental setup to measure circular dichroism was used at two beamlines at the “Berliner Elektronenspeicherring für Synchrotronstrahlung”(BESSY), which were suitable in the ultraviolet range of light. Properties of the beamlines and the experimental setup were compared to those of commercial circular dichroism spectrometer in some important points. The focus was on the extension of the accessible wavelength range below 180 nm, with the aim to investigate the circular dichroism of proteins in that range. It is not only the light source that limits measurements with aqueous solutions in that range, but mainly the absorption of the light by water. Conditions were found under which the wavelength range was extended to about 160 nm, in some cases even to 130 nm. To achieve this, a significant reduction of the pathlength was necessary. Several sample cells were tested for their usability. The effect of birefringence within the sample cells on the circular dichroism signal could be reduced strongly with an alternative experimental setup. However systematic errors in the circular dichroism signal and appearing radiation damage of the proteins limits the reliability of the measured spectra. By using protein films, the light absorption by water is not a problem anymore. However, significant differences between the circular dichroism spectra of protein films and proteins in aqueous solution occurred in most of the cases. Unless these differences can be eliminated, measuring protein films is not an alternative to measurements in aqueous solution. KW - Synchrotronstrahlung KW - Zirkulardichroismus KW - BESSY KW - Wasserabsorption KW - Protein KW - synchrotron radiation KW - circular dichroism KW - BESSY KW - water absorbance KW - protein Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-44263 ER - TY - THES A1 - Gutschow, Stephan T1 - Zu cervicalen Distorsionsverletzungen und deren Auswirkungen auf posturale Schwankungsmuster T1 - To cervical whiplash injuries and their effects on postural fluctuation models N2 - Einleitung & Problemstellung: Beschwerden nach Beschleunigungsverletzungen der Halswirbelsäule sind oft nur unzureichend einzuordnen und diagnostizierbar. Eine eindeutige Diagnostik ist jedoch für eine entsprechende Therapie wie auch möglicherweise entstehende versicherungsrechtliche Forderungen notwendig. Die Entwicklung eines geeigneten Diagnoseverfahrens liegt damit im Interesse von Betroffenen wie auch Kostenträgern. Neben Störungen der Weichteilgewebe ist fast immer die Funktion der Halsmuskulatur in Folge eines Traumas beeinträchtigt. Dabei wird vor allem die sensorische Funktion der HWS-Muskulatur, die an der Regulation des Gleichgewichts beteiligt ist, gestört. In Folge dessen kann angenommen werden, dass es zu einer Beeinträchtigung der Gleichgewichtsregulation kommt. Die Zielstellung der Arbeit lautete deshalb, die möglicherweise gestörte Gleichgewichtsregulation nach einem Trauma im HWS-Bereich apparativ zu erfassen, um so die Verletzung eindeutig diagnostizieren zu können. Methodik: Unter Verwendung eines posturographischen Messsystems mit Kraftmomentensensorik wurden bei 478 Probanden einer Vergleichsgruppe und bei 85 Probanden eines Patientenpools Kraftmomente unter der Fußsohle als Äußerung der posturalen Balanceregulation aufgezeichnet. Die gemessenen Balancezeitreihen wurden nichtlinear analysiert, um die hohe Variabilität der Gleichgewichtsregulation optimal zu beschreiben. Über die dabei gewonnenen Parameter kann überprüft werden, ob sich spezifische Unterschiede im Schwankungsverhalten anhand der plantaren Druckverteilung zwischen HWS-Traumatisierten und den Probanden der Kontrollgruppe klassifizieren lassen. Ergebnisse: Die beste Klassifizierung konnte dabei über Parameter erzielt werden, die das Schwankungsverhalten in Phasen beschreiben, in denen die Amplitudenschwankungen relativ gering ausgeprägt waren. Die Analysen ergaben signifikante Unterschiede im Balanceverhalten zwischen der Gruppe HWS-traumatisierter Probanden und der Vergleichsgruppe. Die höchsten Trennbarkeitsraten wurden dabei durch Messungen im ruhigen beidbeinigen Stand mit geschlossenen Augen erzielt. Diskussion: Das posturale Balanceverhalten wies jedoch in allen Messpositionen eine hohe individuelle Varianz auf, so dass kein allgemeingültiges Schwankungsmuster für eine Gruppengesamtheit klassifiziert werden konnte. Eine individuelle Vorhersage der Gruppenzugehörigkeit ist damit nicht möglich. Die verwendete Messtechnik und die angewandten Auswerteverfahren tragen somit zwar zu einem Erkenntnisgewinn und zur Beschreibung des Gleichgewichtsverhaltens nach HWS-Traumatisierung bei. Sie können jedoch zum derzeitigen Stand für den Einzelfall keinen Beitrag zu einer eindeutigen Bestimmung eines Schleudertraumas leisten. N2 - Introduction & Problem definition: Disorders after acceleration injuries of the cervical spine can often be classified and diagnosed only inadequately. But an explicit diagnosis is necessary as a basis for an adequate therapy as well as for possibly arising demands pursuant to insurance law. The development of suitable diagnosis methods is in the interest of patients as well as the cost units. Apart from disorders of the soft tissues there are almost always impairments of the function of the neck musculature. Particularly the sensory function of the cervical spine musculature, which participates in the regulation of the equilibrium, is disturbed by that. As a result in can be assumed that the postural control is also disturbed. Therefore the aim of this study was to examine the possibly disturbed postural motor balance after a whiplash injury of the cervical spine with the help of apparatus-supported methods to be able to unambigiously diagnose. Methods: postural measuring system based on the force-moment sensortechnique was used to record the postural balance regulation of 478 test persons and 85 patients which had suffered a whiplash injury. Data analysis was accomplished by linear as well as by nonlinear time series methods in order to characterise the balance regulation in an optimal way. Thus it can be determined whether there can be classified specific differences in the plantar pressure distribution covering patients with a whiplash injury and the test persons of the control group. Results: The best classification could be achieved by parameters which describe the variation of the postural balance regulation in phases in which the differences of the amplitudes of the plantar pressure distribution were relatively small. The analyses showed significant differences in the postural motor balance between the group of patients with whiplash injuries and the control group. The most significant differences (highest discriminate rates) could be observed by measurements in both-legged position with closed eyes. Discussion: Although the results achieved support the hypothesis mentioned above, is must be conceded that the postural motor balance showed a high individual variation in all positions of measurement. Therefore no universal variation model could be classified for the entirety of either group. This way an individual forecast of the group membership is impossible. As a result the measurement technology being used and the nonlinear time series analyses can contribute to the gain of knowledge and to the description of the regulation of postural control after whiplash injury. But at present they cannot contribute to an explicit determination of a whiplash injury for a particular case. KW - Schleudertrauma KW - posturale Balanceregulierung KW - nichtlineare Zeitreihenanalysen KW - whiplash injury KW - regulation of postural balance KW - nonlinear time series analysis Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-15367 ER - TY - THES A1 - Schorling, Markus T1 - Ökologische und phytomedizinische Untersuchungen zum Anbau von Bt-Mais im Maiszünsler-Befallsgebiet Oderbruch T1 - Ecological and phytomedical investigations on Bt maize grown in the European corn borer (Ostrinia nubilalis) infested area in the Oderbruch region (Germany) N2 - In den letzten 20 Jahren hat sich der Maiszünsler (Ostrinia nubilalis HÜBNER), aus der Schmetterlingsfamilie der Pyralidae oder Zünsler, zum bedeutendsten tierischen Schädling des Maises (Zea mays) entwickelt. Eine Möglichkeit den Befall des Maiszünslers abzuwenden, bietet der Anbau von Bacillus thuringiensis-Mais (Bt-Mais). Mit Hilfe der Gentechnik wurden Gene des Bakteriums Bacillus thuringiensis übertragen, die einen für Fraßinsekten giftigen Wirkstoff bilden, wodurch die Pflanzen während der kompletten Vegetation vor den Larven des Maiszünslers geschützt sind. Ziel des vorliegenden Projektes war es, in einer 3-jährigen Studie die Auswirkungen des großflächigen Anbaus von Bt-Mais auf die ökologische Situation und den Handlungsrahmen des integrierten Pflanzenschutzes komplex zu untersuchen. Dazu wurden in Betrieben im Oderbruch, das als permanentes Befallsgebiet des Maiszünslers gilt, in den Jahren 2002 bis 2004 jährlich zwei Felder mit jeweils einer Bt-Sorte und einer konventionellen Sorte angelegt. Zusätzlich wurden biologische und chemische Maiszünsler-Bekämpfungsvarianten geprüft. Durch verschiedene Methoden wie Bonituren, Ganzpflanzenernten, Bodenfallenfänge und Beobachtungen des Wahlverhaltens von (Flug-)insekten konnten Aussagen zum Vorkommen von Insekten und Spinnentieren getroffen werden, wobei hierfür Daten aus Untersuchungen der Jahre 2000 und 2001 im Oderbruch ergänzend herangezogen werden konnten. Durch Ertragsmessungen, Energie- und Qualitätsermittlungen, sowie Fusarium- und Mykotoxinanalysen konnte der Anbau von Bt-Mais als neue Alternative zur Bekämpfung des Maiszünslers bewertet werden. Bezüglich des Auftretens von Insekten und Spinnentieren wurden im Mittel der fünfjährigen Datenerhebung beim Vergleich der Bt-Sorte zur konventionellen Sorte, mit Ausnahme der fast 100 %igen Bekämpfung des Maiszünslers, keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Hierfür wurde ein besonderes Augenmerk auf Thripse, Wanzen, Blattläuse und deren Fraßfeinde, sowie mittels Bodenfallenfängen auf Laufkäfer und Spinnen gerichtet. Die erwarteten ökonomischen Vorteile wie etwa Ertragsplus oder bessere Nährstoff- und Energiegehalte durch geringeren Schaden beim Anbau von Bt-Mais als Silomais blieben in den Untersuchungsjahren aus. Allerdings zeigten Fusarium- und Mykotoxinanalysen eine geringere Belastung des Bt-Maises, was möglicherweise auf den geringeren Schaden zurückzuführen ist, da beschädigte Pflanzen für Fusarium und Mykotoxine anfälliger sind. Desweiteren konnten erste methodische Ansätze für ein auf EU-Ebene gefordertes, den Anbau von Bt-Mais begleitendes Monitoring, erarbeitet werden. So konnten Vorschläge für geeignete Methoden, deren Umfang sowie des Zeitpunktes der Durchführungen gemacht werden. N2 - In the last 20 years the European corn borer (Ostrinia nubilalis, Pyralidae) has become the most important pest in maize (Zea mays). One of a couple of possibilities to reduce the infestation by the European corn borer is the cultivation of Bacillus thuringiensis maize (Bt maize). Genetic engineering transmitted genes from Bacillus thuringiensis, which produce a substance that is toxic to feeding insects and thus protect plants against the larvae of the European corn borer during the whole vegetation. The present project is a 3-year study to identify the effects of Bt maize growing on the ecological situation and the possibilities of integrated plant protection. From 2002 to 2004, two fields in the Oderbruch region, where Ostrinia nubilalis occurs, were each planted with Bt maize and a conventional maize variety every year. Furthermore, a biological and a chemical strategy against the European corn borer were verified. Different methods like counts, harvest of whole plants, pitfall traps and observation the landing behaviour of flying insects were used to determine the abundance of insects and spiders. Furthermore, we could use additional data from studies obtained in the Oderbruch region in 2000 and 2001. The determination of yield, quality and energy content of the crops as well as of the degree of Fusarium infection and contamination by mycotoxins led to the conclusion that the cultivation of Bt maize is a new alternative strategy to control the European corn borer. The average occurrence of insects and spiders did not differ significantly between Bt maize and the conventional variety in the 5 years of data recording. The only exception is the almost total control of the European corn borer. Attention was especially paid to thrips, bugs, aphids and their feeding enemies and using ground traps to ground beetles and spiders. The expected economic benefits like increased yield or nutrient and energy content of the crop as a result of a minimized damage to silage Bt maize were not achieved in the years under investigation. However, the analysis of Fusarium and mycotoxins indicated a lower exposure of Bt maize, which may result from a lower damage caused by Ostrinia nubilalis, and damaged plants are more susceptible to Fusarium and mycotoxins. Furthermore, we developed a first methodological approach for the monitoring procedure of Bt maize growing required by the EU. We have made proposals on appropriate methods, their extent as well as the optimum time of their application. KW - Maiszünsler KW - Oderbruch KW - Monitoring KW - Gentechnologie KW - Biodiversität KW - Bt-Mais KW - Bt maize KW - European corn borer KW - Ostrinia nubilalis KW - genetic engineering KW - monitoring Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-6260 ER - TY - THES A1 - Töle, Jonas Claudius T1 - Über die Arc-catFISH-Methode als neues Werkzeug zur Charakterisierung der Geschmacksverarbeitung im Hirnstamm der Maus T1 - The arc catFISH method as a new tool to characterize taste processing in the mouse hind brain N2 - Intensive Forschung hat in den vergangenen Jahrzehnten zu einer sehr detaillierten Charakterisierung des Geschmackssystems der Säugetiere geführt. Dennoch sind mit den bislang eingesetzten Methoden wichtige Fragestellungen unbeantwortet geblieben. Eine dieser Fragen gilt der Unterscheidung von Bitterstoffen. Die Zahl der Substanzen, die für den Menschen bitter schmecken und in Tieren angeborenes Aversionsverhalten auslösen, geht in die Tausende. Diese Substanzen sind sowohl von der chemischen Struktur als auch von ihrer Wirkung auf den Organismus sehr verschieden. Während viele Bitterstoffe potente Gifte darstellen, sind andere in den Mengen, die mit der Nahrung aufgenommen werden, harmlos oder haben sogar positive Effekte auf den Körper. Zwischen diesen Gruppen unterscheiden zu können, wäre für ein Tier von Vorteil. Ein solcher Mechanismus ist jedoch bei Säugetieren nicht bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Verarbeitung von Geschmacksinformation in der ersten Station der Geschmacksbahn im Mausgehirn, dem Nucleus tractus solitarii (NTS), mit besonderem Augenmerk auf der Frage nach der Diskriminierung verschiedener Bitterstoffe. Zu diesem Zweck wurde eine neue Untersuchungsmethode für das Geschmackssystem etabliert, die die Nachteile bereits verfügbarer Methoden umgeht und ihre Vorteile kombiniert. Die Arc-catFISH-Methode (cellular compartment analysis of temporal activity by fluorescent in situ hybridization), die die Charakterisierung der Antwort großer Neuronengruppen auf zwei Stimuli erlaubt, wurde zur Untersuchung geschmacksverarbeitender Zellen im NTS angewandt. Im Zuge dieses Projekts wurde erstmals eine stimulusinduzierte Arc-Expression im NTS gezeigt. Die ersten Ergebnisse offenbarten, dass die Arc-Expression im NTS spezifisch nach Stimulation mit Bitterstoffen auftritt und sich die Arc exprimierenden Neurone vornehmlich im gustatorischen Teil des NTS befinden. Dies weist darauf hin, dass Arc-Expression ein Marker für bitterverarbeitende gustatorische Neurone im NTS ist. Nach zweimaliger Stimulation mit Bittersubstanzen konnten überlappende, aber verschiedene Populationen von Neuronen beobachtet werden, die unterschiedlich auf die drei verwendeten Bittersubstanzen Cycloheximid, Chininhydrochlorid und Cucurbitacin I reagierten. Diese Neurone sind vermutlich an der Steuerung von Abwehrreflexen beteiligt und könnten so die Grundlage für divergentes Verhalten gegenüber verschiedenen Bitterstoffen bilden. N2 - Intense research in the past decades has led to a detailed understanding of the mammalian taste system. Some important issues, however, have remained unanswered with the established methods that have been applied so far. One of these questions is whether different bitter substances can be distinguished. There are thousands of compounds which taste bitter to humans and elicit innate aversive behavior in animals. Moreover, these bitter substances are very heterogeneous regarding their structure as well as their effect on the organism. While many bitter tastants are potent poisons, others are harmless or even have beneficial effects in the amounts that are typically ingested. The ability to discriminate between those groups of bitter tastants could be an evolutionary advantage. Such a mechanism, however, is not known for mammals. The aim of this thesis was to study the processing of taste information in the first station of gustatory processing in the mouse brain, the nucleus of the solitary tract (NTS). Of particular interest was the question concerning discrimination of bitter tastants. To this end a new method was established for the taste system combining the advantages of methods used before while circumventing their disadvantages. The Arc catFISH method (cellular compartment analysis of temporal activity by fluorescent in situ hybridization), which allows the characterization of responses of large neuron populations to two stimuli, was used to analyze taste-processing cells in the NTS. In the course of this project a stimulus-induced Arc expression in the NTS was shown for the first time. The results demonstrated that Arc expression in the NTS appears specifically after stimulation with bitter tastants and that the Arc expressing neurons are located primarily in the gustatory part of the NTS. This indicates that Arc expression is a marker for bitter-processing gustatory neurons in the NTS. Upon stimulating twice with bitter compounds, distinct, yet overlapping neuron populations were identified, that reacted differently to the three bitter substances cycloheximide, quinine hydrochloride, and cucurbitacin I. Presumably these neurons are involved in the regulation of aversive reflexes and could form a basis for divergent behavior towards different bitter substances. KW - Geschmack KW - bitter KW - Nucleus tractus solitarii KW - Immediate-early-Gen KW - activity-regulated cytoskeleton-associated protein KW - catFISH KW - taste KW - bitter KW - nucleus of the solitary tract KW - immediate early gene KW - activity-regulated cytoskeleton-associated protein KW - catFISH Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-70491 ER -