TY  - THES
A1  - Finke, Hannah
T1  - Toxicological Characterization of Arsenolipids in vitro and Analysis of Global DNA (Hydroxy)methylation in the Context of Aging, Trace Element Status, and Genomic Stability
Y1  - 2020
ER  - 
TY  - THES
A1  - Steffen, Jenny
T1  - Transkription von Markergenen an immbolisierten Nukleinsäuren
T1  - Transcription of reportegenes with immobilized nucleic acids
N2  - Die Etablierung der Transkription von kompletten Genen auf planaren Oberflächen soll eine Verbindung zwischen der Mikroarraytechnologie und der Transkriptomforschung herstellen. Darüber hinaus kann mit diesem Verfahren ein Brückenschlag zwischen der Synthese der Gene und ihrer kodierenden Proteine auf einer Oberfläche erfolgen. Alle transkribierten RNAs wurden mittels RT-PCR in cDNA umgeschrieben und in einer genspezifischen PCR amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden hierfür entweder per Hand oder maschinell auf die Oberfläche transferiert. Über eine Oberflächen-PCR war es möglich, die Gensequenz des Reportergens EGFP direkt auf der Oberfläche zu synthetisieren und anschließend zu transkribieren. Somit war eine Transkription mit weniger als 1 ng an Matrize möglich. Der Vorteil einer Oberflächen-Transkription gegenüber der in Lösung liegt in der mehrfachen Verwendung der immobilisierten Matrize, wie sie in dieser Arbeit dreimal erfolgreich absolviert wurde. Die Oberflächen-Translation des EGFP-Gens konnte ebenfalls zweimal an einer immobilisierten Matrize gezeigt werden, wobei Zweifel über eine echte Festphasen-Translation nicht ausgeräumt werden konnten. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Transkription und Translation von immobilisierten Gensequenzen auf planaren Oberflächen möglich ist, wofür die linearen Matrizen direkt auf der Oberfläche synthetisiert werden können.
N2  - In vitro mRNA synthesis and in vitro translation are of great interest for biochemical and molecular biological basic research, and also for biotechnology and other applications. Solid phase coupled synthesis is very useful for the development of high throughput procedures to elucidate and manipulate gene products. An artificial gene was constructed combining the T7 promoter and terminator with the EGFP-gene from the plasmid pEGFP. The functionality of the construct was shown by in vitro translation. The gene-construct was immobilised on a planar glass surface. The transcription was performed on the immobilised gene and mRNA was determined by RT-PCR. These results demonstrate that the complete gene is transcribed from the covalently coupled PCR product. Thus, it is possible to transfer a standard transcription technique onto an On-chip reaction. The direct PCR amplification of transcriptionable sequences of EGFP bound on surfaces was successfully used for solid phase transcription. Successful transcriptions were also performed at least to 1 ng of used template. The RNA synthesis was also successful in the second and third reaction on the same slide as observed by signals after RT-PCR. It seems to be possible to transfer the translation of reportergenes in a solid phase coupled synthesis, too. For further integration of cellular procedures on a chip, the cell-free RNA synthesis on immobilised templates is an crucial technical hurdle to conquer. Major advantages of using immobilised templates for transcription are, low risk of contamination occuring in solution, and no necessity of further purification steps for downstream applications of the RNA product.
KW  - Immobilisierung
KW  - Transkription <Genetik>
KW  - Translation <Genetik>
KW  - Bakteriophage T7
KW  - Lab on chip
KW  - EGFP
KW  - Stammschleife
KW  - Lab on chip
KW  - transcription
KW  - translation
KW  - EGFP
KW  - stem loop
KW  - immobilization
KW  - T7
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-10282
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hammer, Paul
T1  - Transkriptomweite Untersuchungen von Prostata-Krebszelllinien im Kontext medizinischer Strahlentherapie
T1  - Transcriptome-wide studies of prostate cancer cell lines in the context of medical radiation
N2  - Die Strahlentherapie ist neben der Chemotherapie und einer operativen Entfernung die stärkste Waffe für die Bekämpfung bösartiger Tumore in der Krebsmedizin. Nach Herz-Kreislauf-Erkrankungen ist Krebs die zweithäufigste Todesursache in der westlichen Welt, wobei Prostatakrebs heutzutage die häufigste, männliche Krebserkrankung darstellt. Trotz technologischer Fortschritte der radiologischen Verfahren kann es noch viele Jahre nach einer Radiotherapie zu einem Rezidiv kommen, was zum Teil auf die hohe Resistenzfähigkeit einzelner, entarteter Zellen des lokal vorkommenden Tumors zurückgeführt werden kann. Obwohl die moderne Strahlenbiologie viele Aspekte der Resistenzmechanismen näher beleuchtet hat, bleiben Fragestellungen, speziell über das zeitliche Ansprechen eines Tumors auf ionisierende Strahlung, größtenteils unbeantwortet, da systemweite Untersuchungen nur begrenzt vorliegen. Als Zellmodelle wurden vier Prostata-Krebszelllinien (PC3, DuCaP, DU-145, RWPE-1) mit unterschiedlichen Strahlungsempfindlichkeiten kultiviert und auf ihre Überlebensfähigkeit nach ionisierender Bestrahlung durch einen Trypanblau- und MTT-Vitalitätstest geprüft. Die proliferative Kapazität wurde mit einem Koloniebildungstest bestimmt. Die PC3 Zelllinie, als Strahlungsresistente, und die DuCaP Zelllinie, als Strahlungssensitive, zeigten dabei die größten Differenzen bezüglich der Strahlungsempfindlichkeit. Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurden die beiden Zelllinien ausgewählt, um anhand ihrer transkriptomweiten Genexpressionen, eine Identifizierung potentieller Marker für die Prognose der Effizienz einer Strahlentherapie zu ermöglichen. Weiterhin wurde mit der PC3 Zelllinie ein Zeitreihenexperiment durchgeführt, wobei zu 8 verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 1 Gy die mRNA mittels einer Hochdurchsatz-Sequenzierung quantifiziert wurde, um das dynamisch zeitversetzte Genexpressionsverhalten auf Resistenzmechanismen untersuchen zu können. Durch das Setzen eines Fold Change Grenzwertes in Verbindung mit einem P-Wert < 0,01 konnten aus 10.966 aktiven Genen 730 signifikant differentiell exprimierte Gene bestimmt werden, von denen 305 stärker in der PC3 und 425 stärker in der DuCaP Zelllinie exprimiert werden. Innerhalb dieser 730 Gene sind viele stressassoziierte Gene wiederzufinden, wie bspw. die beiden Transmembranproteingene CA9 und CA12. Durch Berechnung eines Netzwerk-Scores konnten aus den GO- und KEGG-Datenbanken interessante Kategorien und Netzwerke abgeleitet werden, wobei insbesondere die GO-Kategorien Aldehyd-Dehydrogenase [NAD(P)+] Aktivität (GO:0004030) und der KEGG-Stoffwechselweg der O-Glykan Biosynthese (hsa00512) als relevante Netzwerke auffällig wurden. Durch eine weitere Interaktionsanalyse konnten zwei vielversprechende Netzwerke mit den Transkriptionsfaktoren JUN und FOS als zentrale Elemente identifiziert werden. Zum besseren Verständnis des dynamisch zeitversetzten Ansprechens der strahlungsresistenten PC3 Zelllinie auf ionisierende Strahlung, konnten anhand der 10.840 exprimierten Gene und ihrer Expressionsprofile über 8 Zeitpunkte interessante Einblicke erzielt werden. Während es innerhalb von 30 min (00:00 - 00:30) nach Bestrahlung zu einer schnellen Runterregulierung der globalen Genexpression kommt, folgen in den drei darauffolgenden Zeitabschnitten (00:30 - 01:03; 01:03 - 02:12; 02:12 - 04:38) spezifische Expressionserhöhungen, die eine Aktivierung schützender Netzwerke, wie die Hochregulierung der DNA-Reparatursysteme oder die Arretierung des Zellzyklus, auslösen. In den abschließenden drei Zeitbereichen (04:38 - 09:43; 09:43 - 20:25; 20:25 - 42:35) liegt wiederum eine Ausgewogenheit zwischen Induzierung und Supprimierung vor, wobei die absoluten Genexpressionsveränderungen ansteigen. Beim Vergleich der Genexpressionen kurz vor der Bestrahlung mit dem letzten Zeitpunkt (00:00 - 42:53) liegen mit 2.670 die meisten verändert exprimierten Gene vor, was einer massiven, systemweiten Genexpressionsänderung entspricht. Signalwege wie die ATM-Regulierung des Zellzyklus und der Apoptose, des NRF2-Signalwegs nach oxidativer Stresseinwirkung und die DNA-Reparaturmechanismen der homologen Rekombination, des nicht-homologen End Joinings, der MisMatch-, der Basen-Exzision- und der Strang-Exzision-Reparatur spielen bei der zellulären Antwort eine tragende Rolle. Äußerst interessant sind weiterhin die hohen Aktivitäten RNA-gesteuerter Ereignisse, insbesondere von small nucleolar RNAs und Pseudouridin-Prozessen. Demnach scheinen diese RNA-modifizierenden Netzwerke einen bisher unbekannten funktionalen und schützenden Einfluss auf das Zellüberleben nach ionisierender Bestrahlung zu haben. All diese schützenden Netzwerke mit ihren zeitspezifischen Interaktionen sind essentiell für das Zellüberleben nach Einwirkung von oxidativem Stress und zeigen ein komplexes aber im Einklang befindliches Zusammenspiel vieler Einzelkomponenten zu einem systemweit ablaufenden Programm.
N2  - The use of radiotherapy in addition to chemotherapy and surgical removal is the most powerful instrument in the fight against malignant tumors in cancer medicine. After cardiovascular diseases, cancer is the second leading cause of death in the western world, in which prostate cancer is the most frequent male cancer. Despite continuous technological improvements in radiological instruments and prognosis, it may occur a recurrence up to many years after radiotherapy due to a high resistance capability of individual malignant cells of the locally occurring tumor. Although modern radiation biology has studied many aspects of the resistance mechanisms, questions are largely unanswered especially in regards to prognostic terms and time response of tumor cells to ionizing radiation. As cellular models four prostate cancer cell lines with different radiation sensitivities (PC3, DuCaP, DU-145, RWPE-1) were cultured and tested for their ability to survive after exposure to ionizing radiation by a trypane blue and MTT viability assay. The proliferative capacity of the four cell lines was determined using a colony formation assay. The PC3 cell line (radiation-resistant) and the DuCaP cell line (radiation-sensitive) showed the maximal differences in terms of radiation sensitivity. Based on these results the two cell lines were selected to allow identification of potential prognostic marker for predicting the effectiveness of radiation therapy via their transcriptome-wide gene expression. Furthermore, a time series experiment with the radiation-resistant PC3 cell line was performed. At 8 different time points, during the period from 00:00 - 42:53 (hh:mm) after exposure with 1 Gy, the mRNA was quantified by next generation sequencing to investigate the dynamic behavior of time-delayed gene expression and to discover resistance mechanisms. Of 10,966 expressed genes 730 were significant differentially expressed, determined by setting a fold change threshold in conjunction with a P-value < 0.01. Of those 305 were more strongly expressed in PC3 cell line and 425 were more strongly expressed in the DuCaP cell line. Within these 730 genes many known stress-associated genes could be found, such as the two trans-membrane protein genes CA9 and CA12, which are associated with increased radiation resistance. By calculating a network score interesting networks were derived by the GO and KEGG databases. In particular the GO categories aldehyde dehydrogenase [NAD(P)+] activity (GO:0004030) as well as the KEGG pathway of O-glycan biosynthesis (hsa00512) seems to be remarkably relevant. An interaction analysis revealed two promising networks with the transcription factors JUN and FOS as central elements. High expression of the JUN network would be stand as indicator for radiation resistance whereas a high expression of the FOS network is equated with radiation sensitivity. Interesting insights could be achieved by analyzing the 10,840 expressed genes of the PC3 cell line and its expression profile over the 8 time points. Shortly after irradiation (00:00 - 00:30) a transcriptome-wide down-regulation occurred, within the next three, short time periods (00:30 - 01:03; 01:03 - 02:12; 02:12 - 04:38) a predominant increase of gene expression and the activation of protective networks followed, such as the up-regulation of DNA repair systems or the arresting of cell cycle. In the ensuing three time periods (4:38 - 09:43; 09:43 - 20:25; 20:25 - 42:35) a balance between gene induction and suppression was present and the absolute gene expression change was increased. When comparing the gene expression prior to irradiation with the last time point (00:00 - 42:53) 2,670 genes were differentially expressed, suggesting a massive and system-wide change of gene expression. Signaling pathways such as the ATM-regulated cell cycle and apoptosis, the Nrf2 pathway after oxidative stress exposure, the DNA repair mechanisms of homologous recombination, the non-homologous end joining, the mismatch repair, base-excision repair and strand-excision repair play a major role. Very interesting are the high activity of RNA-driven events, especially activities of small nucleolar RNAs and pseudouridine processes. This suggests that these RNA-modifying networks could have a hitherto unknown functional and protective effect on cell survival after exposure to ionizing radiation. All these protective networks and their time-specific interactions are essential for the survival of cells after exposure to oxidative stress and show a complex but consistent interaction of many individual components to a system-wide running program.
KW  - Strahlenbiologie
KW  - Sequenzierung
KW  - Resistenzmechanismen
KW  - Genexpression
KW  - Prostatakrebs
KW  - radiation biology
KW  - next generation sequencing
KW  - prostate cancer
KW  - resistance mechanisms
KW  - gene expression
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-63190
ER  - 
TY  - THES
A1  - Zhang, Yunming
T1  - Understanding the functional specialization of poly(A) polymerases in Arabidopsis thaliana
Y1  - 2018
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schmidt, Antje
T1  - Untersuchung des Recyclings Kaede-fusionierter Corticotropin-Releasing-Factor Rezeptoren Typ 1
T1  - Use of Kaede-Fusions to Visualize Recycling of the Corticotropin-Releasing Factor Receptor Type 1
N2  - Aktivierte G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) werden schnell desensitisiert, internalisiert und anschließend entweder lysosomal degradiert oder zur Plasmamembran (PM) recycelt. Zur Resensitisierung der Zellen tragen neben recycelten auch neusynthetisierte Rezeptoren bei. Die Überlagerung beider Prozesse erschwert die Untersuchung des Rezeptorrecyclings. In dieser Arbeit sollte mit Hilfe des photokonvertierbaren Fluoreszenzproteins Kaede eine Technik entwickelt werden, mit der es möglich ist Recycling- von Neusyntheseprozessen zu trennen und das Recycling von GPCR mikroskopisch in Echtzeit zu beobachten. Als Modellproteine wurden der Vasopressin-1a-Rezeptor V1aR (recycelnder Rezeptor), der Vasopressin-2-Rezeptor V2R (degradierter Rezeptor) und der Corticotropin-Releasing Factor-Rezeptor Typ 1 (CRF1R) verwendet, wobei bei Letzterem untersucht werden sollte, ob er nach Stimulation zur PM zurücktransportiert wird. Da Kaede als fluoreszierendes Protein mit den GPCR fusioniert wird, wurde zunächst überprüft, ob es die Eigenschaften der Rezeptoren verändert und generell für Transportstudien geeignet ist. Eventuell könnte die bereits publizierte Tetramerisierung von Kaede seine Anwendung verhindern oder erschweren. Mittels Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie konnte gezeigt werden, dass Kaede nicht tetramerisiert, wenn es an ein Membranprotein fusioniert ist. Außerdem konnte in in vitro- und Zellkulturexperimenten belegt werden, dass die native und die photokonvertierte Form von Kaede gleichermaßen stabil sind. Darüber hinaus zeigten Kaede-fusionierte GPCR sowohl in Kolokalisationsstudien als auch in Agonistbindungs- und Rezeptoraktivierungsexperimenten die gleichen Eigenschaften wie CFP- bzw. die unfusionierte Rezeptoren. Lediglich die Expression der Kaede-fusionierten Rezeptoren war geringer. Parallel wurde anhand der bereits publizierten Kaede-Struktur versucht, die Tetramerisierung des Proteins durch den Austausch interagierender Aminosäuren zu unterbinden. Die eingeführten Mutationen bewirkten aber eine Fehlfaltung des Proteins und damit den Verlust der Fluoreszenz. Da zuvor gezeigt werden konnte, dass Kaede-fusionierte Membranproteine nicht tetramerisieren und nicht die Eigenschaften der fusionierten Proteine verändern, war monomerisiertes Kaede zur Untersuchung des Rezeptorrecyclings nicht notwendig. Im zweiten Teil der Arbeit wurde mit Hilfe von Kaede-Fusionsproteinen und mikroskopischer Testsysteme das noch unbekannte Recyclingverhalten des CRF1R untersucht. Hierfür wurden die Kaede-fusionierten Rezeptoren in eukaryotischen Zellen exprimiert und mit Agonisten internalisiert. Die internalisierten Rezeptoren wurden in Endosomen selektiv mit UV-Strahlung photokonvertiert. Anschließend wurde der Transport der photokonvertierten Form verfolgt. Sowohl beim CRF1R als auch beim V1aR wurden Signale in der PM detektiert, beim V2R hingegen nicht. Dies zeigt, dass es sich beim CRF1R um einen recycelnden Rezeptor handelt. Die als Kontrolle eingesetzten Rezeptoren verhielten sich in diesem Experiment wie erwartet: Der V1aR wurde zur PM zurücktransportiert, der V2R nicht. Diese Ergebnisse konnten mit Hilfe biochemischer und durchflusscytometrischer Experimente bestätigt werden. Die Internalisierung des CRF1R verläuft Clathrin-vermittelt in Anwesenheit von β-Arrestin. Je nach Stabilität der β Arrestin-Interaktion unterscheidet man zwei Klassen von Rezeptoren: Klasse A-Rezeptoren interagieren transient mit β Arrestin und können recyceln. Im Gegensatz dazu gehen Klasse B-Rezeptoren eine stabile Interaktion mit β Arrestin ein und werden nach Internalisierung degradiert. In mikroskopischen Untersuchungen konnte für die aktivierten CRF1R und V1aR eine Rekrutierung von β Arrestin zur PM und eine transiente Interaktion mit β Arrestin gezeigt werden (Klasse A-Rezeptoren). Für den V2R wurde dagegen eine stabile Interaktion mit β Arrestin beobachtet (Klasse B-Rezeptor). Diese Daten stützen die Ergebnisse des Kaede-basierten Recyclingversuchs und zeigen, dass der CRF1R ein recycelnder Rezeptor ist. Ferner wurde untersucht, ob der CRF1R zu den schnell oder langsam recycelnden Rezeptoren zählt. Schnell recycelnde Rezeptoren werden direkt aus frühen Endosomen, langsam recycelnde hingegen über das Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) bzw. über Recycling-Endosomen zur PM transportiert. Als Marker für das TGN oder die Recycling-Endosomen wurde Rab11 verwendet. In Kolokalisationsstudien konnte gezeigt werden, dass der CRF1R den langsam recycelnden Rezeptoren zugeordnet werden kann. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit belegt werden, dass Kaede als Fusionspartner für Membranproteine genutzt werden kann um deren Transport in Echtzeit zu studieren. Damit wurde erstmals eine mikroskopische Methode etabliert, die es erlaubt recycelnde von neusynthetisierten Rezeptoren zu unterscheiden. Mit Hilfe dieser Methode war es möglich zu zeigen, dass der CRF1R ein recycelnder Rezeptor ist.
N2  - Upon ligand binding and receptor activation, G protein-coupled receptors (GPCR) are rapidly desensitized, internalized and subsequently degraded in lysosomes or recycled back to the plasma membrane. Resensitization of the cell is enabled by both recycling receptors and newly synthesized receptors. The overlap of recycling and synthesis processes largely complicates the study of GPCR recycling mechanisms. One aim of this thesis was to develop a new microscopic technique for real-time visualization of GPCR recycling using the photoconvertible Kaede protein allowing to differentiate newly synthesized from recycling receptors. As model proteins, the V1aR (recycling receptor), the V2R (degraded receptor) and the CRF1R were used. In the case of the CRF1R, it was unknown whether this receptor recycles to the plasma membrane following agonist-promoted internalization. The study of the CRF1R recycling behaviour was another objective of this work. As the Kaede protein is fused C-terminally to the GPCRs, an influence on the pharmacological and trafficking properties of the receptors must be excluded. The previously published tetramerization of Kaede, for example, might hinder or even prevent its usability. To assess for the applicability of Kaede, fluorescence correlation spectroscopy experiments were performed and it was demonstrated that Kaede fused to membrane proteins cannot form tetramers in contrast to the soluble form. In vitro studies and experiments in cell culture revealed that both the native and the photoconverted Kaede are equally stable. Moreover Kaede-fused GPCR displayed the same pharmacological and trafficking properties as the untagged or CFP-tagged receptors. Only the expression levels of the Kaede fusion proteins were reduced, yet this did not affect the microscopic experiments. In parallel to these experiments, the interacting amino acids of the tetrameric Kaede were substituted according to the previously published crystal structure of the protein. Unfortunately, these mutations induced protein misfolding thereby causing loss of fluorescence functions. However, since it could be shown that membrane protein-fused Kaede cannot tetramerize, the monomerized Kaede was no more essential for the microscopic study of receptor recycling. In the second part of this work, Kaede-fusions were used to study the recycling behaviour of the CRF1R and the V1aR and V2R control proteins by the novel real-time recycling assay at the laser scanning microscope. To this end, HEK 293 cells expressing the Kaede-fused receptors were treated with agonist to induce receptor internalization. Internalized receptors were selectively photoconverted in endosomes using UV-irradiation and the subcellular fate of the new fluorescence signals was studied. In the case of the CRF1R, signals of the photoconverted receptors could be detected in the plasma membrane indicating that the CRF1R belongs to the family of recycling receptors. The control receptors showed the expected results: The V1aR recycled back to the plasma membrane whereas the V2R did not. These results were confirmed with biochemical and flow cytometry measurements. The CRF1R internalizes in a clathrin-dependent way via the adaptor protein AP2, dynamin and β arrestin. Depending on the stability of the resulting receptor-β-arrestin-complex, two classes of receptors can be differentiated. Class A receptors are recycling receptors undergoing a more transient β-arrestin interaction. In contrast, class B receptors stably interact with β-arrestin and are degraded after internalization. In the case of the CRF1R and V1aR, microscopic analyzes demonstrated that β arrestin transiently interacts with the stimulated CRF1R and V1aR indicating again that these receptors are recycling GPCRs (class A receptors). The V2R, in contrast, revealed a stable interaction (class B receptor). Moreover, it was studied whether the CRF1R recycles rapidly or more slowly to the plasma membrane. Rapidly recycling receptors are recruited out of early endosomes whereas slowly recycling receptors pass the trans-golgi-network or recycling endosomes before reaching the cell surface. Rab11 colocalization studies demonstrated that the CRF1R belongs to the family of slowly recycling receptors. In conclusion, a novel microscopic technique was established allowing to study GPCR recycling in real-time and to differentiate recycling and synthesis processes. Moreover, it was shown that the CRF1R belongs to the family of recycling receptors. The Kaede technique seems to be very well suited to study membrane protein trafficking in general.
KW  - Corticotropin-Releasing Factor Rezeptor Typ 1
KW  - Recycling
KW  - GPCR
KW  - Kaede
KW  - Corticotropin-Releasing Factor Receptor Type 1
KW  - Recycling
KW  - GPCR
KW  - Kaede
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-34902
ER  - 
TY  - THES
A1  - Machowetz, Anja
T1  - Untersuchung kardioprotektiver Wirkungen des Olivenöles und seiner phenolischen Komponenten in einer Gruppe gesunder deutscher Männer
T1  - Cardioprotective effects of olive oil and its phenolic compounds in healthy German men
N2  - "Untersuchung kardioprotektiver Wirkungen des Olivenöles und seiner phenolischen Komponenten in einer Gruppe gesunder deutscher Männer"  EINLEITUNG: Epidemiologische Daten belegen, dass die mediterrane Ernährung mit einer niedrigen Inzidenz an mit oxidativen Stress assoziierten kardiovaskulären Erkrankungen einhergeht. Dabei wird vor allem dem Olivenöl, als Hauptfettlieferant in der mediterranen Ernährung, eine kardioprotektive Wirkung zugesprochen. Olivenöl zeichnet sich neben dem hohen Gehalt an einfach ungesättigten Fettsäuren (MUFA) durch ein reichhaltiges Spektrum an phenolischen Verbindungen aus, deren antioxidative Wirkung bereits zahlreichen in in vitro Studien beschrieben wurde. Demnach könnte der Verzehr von phenolreichem Olivenöl auch in vivo vor oxidativen Schädigungen schützen und somit das Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen senken. ZIELSTELLUNG: Untersuchung der kardioprotektiven Wirkung von Olivenöl und seiner phenolischen Komponenten in einer Gruppe gesunder deutscher Männer. METHODE: Dazu wurde eine randomisierte cross-over doppelt-verblindete Interventionsstudie an 70 gesunden Männern zwischen 20 - 60 Jahren im Raum Berlin-Brandenburg durchgeführt. In jeweils drei dreiwöchigen Interventionsphasen konsumierten die Probanden täglich 25 ml natives (phenolreich), gemischtes (mittlerer Phenolgehalt) und raffiniertes (annähernd phenolfrei) Olivenöl, was sich ausschließlich im Gehalt an phenolischen Verbindungen unterschied. Das Olivenöl sollte dabei die gewöhnlich verzehrten Fette ersetzen. Die Interventionsphasen waren durch zweiwöchige Wash out-Phasen unterbrochen. Die Erhebung der Blutlipide, Biomarker der Lipidperoxidation und endogene Antioxidantien erfolgte zu Studienbeginn sowie zu Beginn und Ende jeder Verzehrsperiode.ERGEBNISSE: Bei den Blutlipiden sowie den Biomarkern der Lipidperoxidation und den endogenen Antioxidantien konnte keine signifikante Veränderung in Abhängigkeit vom Phenolgehalt der applizierten Olivenöle nachgewiesen werden. Einzig die Glutathion-Reduktase-Aktivität stieg mit zunehmendem Gehalt an phenolischen Verbindungen (pTrend = 0,041). Unabhängig von der Konzentration der Phenole im Olivenöl wurde bei den Probanden durch den Olivenölverzehr eine Senkung von Gesamtcholesterol (p = 0,007) und Triglyzeride (p = 0,013) im Serum erzielt. Diese Wirkung geht einher mit einem gestiegenen MUFA-Anteil in der Ernährung aufgrund des Olivenölkonsums (p < 0,001). SCHLUSSFOLGERUNG: Die Hypothese, dass die Phenole im Olivenöl aufgrund ihrer in in vitro und Tierstudien beschriebenen antioxidativen Wirkung dem Olivenöl neben dem einzigartigen Fettsäureprofil eine zusätzliche kardioprotektive Wirkung bescheren, konnte in der vorliegenden Studie nicht gezeigt werden. Dennoch konnte durch den Olivenölverzehr und der damit einhergehenden Erhöhung des MUFA-Anteils in der Ernährung eine vorteilhafte Beeinflussung der Blutlipide erzielt werden. Obgleich Olivenöl nicht das vorwiegend verzehrte Fett in Deutschland darstellt, zeigten die befragten Probanden eine hohe Akzeptanz. Folglich könnte die Integration von Olivenöl in die habituelle Ernährung einen Beitrag zur Senkung des kardiovaskulären Erkrankungsrisikos leisten.
N2  - "Cardioprotective effects of olive oil and its phenolic compounds in healthy German men"  BACKGROUND: Epidemiological data show that the Mediterranean diet is related to a low incidence of oxidative stress associated cardiovascular diseases. In particular, olive oil, which is the most consumed alimentary fat in the Mediterranean diet, is discussed to be cardio protective. Besides its high monounsaturated fatty acid content olive oil contains a remarkable amount of phenolic compounds. Results from in vitro and animal studies suggest that these phenols are powerful antioxidants. Thus, consumption of olive oil phenols also could inhibit oxidative damage in vivo and therefore could reduce the risk of cardiovascular diseases.  OBJECTIVE: To investigate the cardioprotective effect of olive oil and its phenolic compounds in healthy German men.  METHODS: Therefore, a randomised, cross-over, double-blind intervention trial in 70 healthy men aged 20 - 60 years from the Berlin-Brandenburg area was conducted. Subjects were randomised for three periods of three weeks to replace their usually consumed fat by daily 25 ml of virgin (high-phenolic), common (medium-phenolic) and refined (low-phenolic) olive oil, which vary only in their content of phenolic compounds. Each intervention was separated by a two-week wash-out period. Blood lipids, lipid peroxidation biomarker and endogenous antioxidants were assessed at study baseline and the beginning and end of each intervention period.  RESULTS: In the total study population, blood lipids, biomarker of lipid peroxidation and endogenous antioxidants were not affected by the phenolic content of the olive oils administered. Solely, a concentration-dependent increase in glutathion-reductase activity could be observed (pTrend = 0.041). A significant reduction in serum total cholesterol (p = 0.007) and triglycerides (p = 0.013) after of olive oil consumption was assessed, which was independent from the content of phenolic compounds in the olive oil. This effect goes along with an increased monounsaturated fatty acids proportion in the habitual diet of the subjects as a result of the olive oil consumption (p < 0.001).  CONCLUSION: The hypothesis, that phenolic compounds in olive oil due to its antioxidative properties reported in in vitro and animal studies provide additional cardioprotective effects besides those attributed to its unique fatty acids profile could not be supported by this study. However, olive oil consumption exert beneficial effects on blood lipids, which could be ascribed to the increased monounsaturated fatty acid content in the diet. Even though olive oil is not the main source of fat in Germany, the interviewed participants showed a high acceptance. Thus, integration of olive oil into the habitual diet could contribute to a risk reduction in cardiovascular diseases among German men.
KW  - Olivenöl
KW  - Phenole
KW  - Kontrollierte klinische Studie
KW  - Kardiovaskuläre Krankheit
KW  - Oxidativer Stress
KW  - mediterrane Ernährung
KW  - Mediterranean Diet
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-10432
ER  - 
TY  - THES
A1  - Uhlig, Katja
T1  - Untersuchungen PEG-basierter thermo-responsiver Polymeroberflächen zur Steuerung der Zelladhäsion
T1  - Analysis of PEG-based thermo-responsive polymer surfaces to control cell adhesion
N2  - Moderne Methoden für die Einzelzellanalyse werden dank der fortschreitenden Weiterentwicklung immer sensitiver. Dabei steigen jedoch auch die Anforderungen an das Probenmaterial. Viele Aufbereitungsprotokolle adhärenter Zellen beinhalten eine enzymatische Spaltung der Oberflächenproteine, um die Ablösung vom Zellkultursubstrat zu ermöglichen. Verschiedene Methoden, wie die Patch-Clamp-Technik oder eine auf der Markierung extrazellulärer Domänen von Membranproteinen basierende Durchflusszytometrie können dann nur noch eingeschränkt eingesetzt werden. Daher ist die Etablierung neuer Zellablösemethoden dringend notwendig. In der vorliegenden Arbeit werden erstmals PEG-basierte thermo-responsive Oberflächen erfolgreich für die Zellkultur eingesetzt. Dabei wird das zerstörungsfreie Ablösen verschiedener Zelllinien von den Oberflächen durch Temperatursenkung realisiert. Die Funktionalität der Oberflächen wird durch Variation der Polymerstruktur, sowie der Konzentration der Beschichtungslösung, durch Beschichtung der Oberflächen mit einem zelladhäsionsfördernden Protein (Fibronektin) und durch Adsorption zelladhäsionsvermittelnder Peptide (RGD) optimiert. Um den Zellablösungsprozess detaillierter zu untersuchen, wird hier zum ersten Mal der direkte Zellkontakt mit thermo-responsiven Oberflächen mittels oberflächensensitiver Mikroskopie (TIRAF) sichtbar gemacht. Mit dieser Technik sind die exakte Quantifizierung und die Analyse der Reduktion der Zelladhäsionsfläche während des Abkühlens möglich. Hierbei werden in Abhängigkeit von der Zelllinie Unterschiede im Zellverhalten während des Ablösens festgestellt: Zellen, wie eine Brustkrebszelllinie und eine Ovarzelllinie, die bekanntermaßen stärker mit ihrer Umgebung in Kontakt treten, vergrößern im Verlauf des Beobachtungszeitraumes den Abstand zwischen Zellmembran und Oberfläche, reduzieren jedoch ihre Zell-Substratkontaktfläche kaum. Mausfibroblasten hingegen verkleinern drastisch die Zelladhäsionsfläche. Der Ablösungsprozess wird vermutlich aktiv von den Zellen gesteuert. Diese Annahme wird durch zwei Beobachtungen gestützt: Erstens verläuft die Reduktion der Zelladhäsionsfläche bei Einschränkung des Zellmetabolismus durch eine Temperatursenkung auf 4 °C verzögert. Zweitens hinterlassen die Zellen Spuren, die nach dem Ablösen der Zellen auf den Oberflächen zurückbleiben. Mittels Kombination von TIRAF- und TIRF-Mikroskopie werden die Zelladhäsionsfläche und die Aktinstruktur gleichzeitig beobachtet. Die Verknüpfung beider Methoden stellt eine neue Möglichkeit dar, intrazelluläre Prozesse mit der Zellablösung von thermo-responsiven Oberflächen zu korrelieren.
N2  - Modern methods for single-cell analysis are becoming increasingly sensitive. At the same time, requirements for the sample material are on the rise. Today, sample preparation of adherent cells usually includes steps of enzymatic treatment to digest surface proteins thus, inducing cell detachment from culture substrates. This strongly limits the application of different techniques like patch clamp or labelling of extracellular domains of membrane proteins for flow cytometry. Therefore, a new cell detachment method is urgently required. In the present work, new PEG-based thermo-responsive polymers are used for cell culture for the first time. Here, non-destructive detachment of different cell lines from polymer-coated surfaces is realised by controlled temperature reduction. The surface functionality is systematically optimised by varying the concentration of the coating solutions, by artificial surface coating of a cell adhesion-mediating protein (fibronectin) and by co-adsorption of a cell adhesion-mediating peptide (RGD). For detailed analysis of the cell detachment process, TIRF microscopy is used to directly visualise the cell contacts on the thermo-responsive surfaces. Using this technique allows both the quantification and analysis of the reduction of the cell adhesion area during sample cooling. Furthermore, for several cell lines, different behaviours in cell detachment are observed. Cells that have close contact to their substrate like MCF-7 breast cancer cell line and CHO-K1 ovary cells increase the distance between cell membrane and surface, but there is only little decrease of cell-substrate adhesion area. In contrast, L929 fibroblasts reduce the cell adhesion area drastically. Furthermore, the hypothesis that the cell detachment is an active process is shown by lowering the cell metabolism by temperature reduction to 4 °C and by the cell traces that are left behind after rinsing the surfaces. A combination of TIRAF and TIRF enables visualising the cell adhesion area and actin structures. Measuring both parameters simultaneously opens up new possibilities to correlate intracellular and cell detachment processes on thermo-responsive surfaces.
KW  - thermo-responsive Polymere
KW  - Polyethylenglykol
KW  - TIRF
KW  - Zelladhäsion
KW  - thermo-responsive polymers
KW  - polyethylene glycol
KW  - TIRF
KW  - cell adhesion
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-47784
ER  - 
TY  - THES
A1  - Drechsel, Oliver
T1  - Untersuchungen zu Struktur und Expression des Plastidengenoms höherer Pflanzen
T1  - Investigation of structure and expression of the plastid genome of higher plants
N2  - Auf dem Weg der genetischen Information stellt die Translation der RNA in eine Aminosäuresequenz den letzten Schritt dar. In Chloroplasten, den grünen Organellen der Pflanzenzellen, findet ein Großteil der Regulation der Genexpression auf Ebene der Initiation dieses Schrittes statt. Eine Vielzahl von Eigenschaften der RNA und von Faktoren, die an die RNA binden, entfalten einen Einfluss auf diesen Schritt. Bisher unvollständig aufgeklärt ist die Rolle einer konservierten Nukleotidsequenz in der untranslatierten Region der RNA -- der Shine-Dalgarno-Sequenz. Diese stellt in Bakterien, wie z.B. E. coli als Ribosomenbindestelle sicher, dass Ribosomen den Anfang der zu translatierenden Sequenz zuverlässig erkennen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden diverse DNA-Konstrukte in Plastiden von Tabak eingebracht. Hierzu zählten Konstrukte, die sowohl eine erhöhte Anzahl von Ribosomenbindestellen enthielten als auch vermehrte Startpunkte der Translation. Zusätzlich wurden Konstrukte hergestellt, die die Situation von mehreren zu translatierenden Regionen in der RNA nachstellten. Es konnte festgestellt werden, dass plastidäre Ribosomen die strangaufwärts gelegenen Translationsstartpunkte bevorzugen -- im Gegensatz zu E. coli, wo alle Startpunkte gleichmäßig genutzt wurden. Hierdurch zeigten die prokaryotischen Ribosomen aus Chloroplasten, die sich aus bakteriellen Systemen ableiten, Eigenschaften von eukaryotischen Ribosomen. Ein zweites Teilprojekt dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Inkompatibilität von Chloroplasten mit dem Kerngenom. In Kreuzungen von Arten der Gattung Pelargonium fielen Kombinationen auf, bei denen die Tochterpflanzen bleiche Blattbereiche bis hin zu vollständig weißen Pflanzen zeigten. Dieses Phänomen wird als Bastardbleichheit bezeichnet. In der Gattung Pelargonium werden Chloroplasten von beiden Elternteilen an die Tochterpflanzen vererbt. Da das Phänomen der Bastardbleichheit nur in einem der Plastiden vorkommt, nicht jedoch im anderen in der gleichen Pflanze, muss von einem Effekt ausgegangen werden, der von Plastiden ausgeht. Die Interaktionen zwischen Zellkern und Chloroplasten sind offensichtlich stark gestört. Zur detaillierten Untersuchung dieses Effekts wurde die Nukleotidsequenz von drei Chloroplastengenomen aufgeklärt. Es konnte eine Reihe von Sequenzunterschieden der Genome ermittelt werden. Aus diesen wurde eine Reihe von Unterschieden beobachtet, die einen solchen Effekt zur Folge haben können. Aus diesen Unterschieden wurde eine Reihe von potentiellen Kandidatengenen zusammengestellt, die in weiteren Arbeiten auf ihre Rolle in der Entstehung der Bastardbleichheit untersucht werden.
N2  - Chloroplasts are the green organelles of plants with a evolutionary prokaryotic background. During evolution chloroplasts established translation initiation as the major step in regulation of gene expression. A vast number of factors, e.g. sequence elements, secondary structures or RNA binding proteins, influences the regulation of translation initiation. A conserved sequence – Shine-Dalgarno sequence – can be identified both in prokaryotes as well as chloroplasts. In prokaryotes this sequence provides a faithful means for positioning of the ribosome to the start codon. Due to lower conservation of Shine-Dalgarno sequences the role of this sequence in translation initiation is not completely understood. We designed a series of constructs that contain different arrangements of these sequences in the 5’ UTR resulting in an increased number of potential ribosome binding sites or translation initiation sites. Additionally we constructed a series of 5’ UTRs that resembled polycistronic transcripts. The results showed a dramatic effect of the different constructs on the translation efficiency of the reporter protein. It could be shown that numerous translation initiation sites increase translation efficiency, whereas increased numbers of ribosome binding sites do not. Additionally it could be shown, that plastidic ribosomes preferentially initiate on 5’ translations initiation sites in contrast to prokaryotic ribosomes that recognize initiation sites equally. This illustrates that plastidic ribosomes in contrast to prokaryotic ribosomes show a scanning like mechanism. Hence plastidic ribosomes gained some eukaryotic properties during evolution. A second project was dealing with hybrid variegation. This phenomenon is based on plastid-nuclear genome incompatibility. Due to biparental plastid inheritance in Pelargonium hybrids may show chimeric phenotypes with bleached (incompatible) and green (compatible) sectors. This points to the plastome as cause for the hybrid variegation. To this end the nucleotide sequence of three plastid genomes was determined and an array of candidate genes causing the incompatibility could be compiled.
KW  - Shine-Dalgarno-Sequenzen
KW  - Translationsinitiation
KW  - Plastid
KW  - Bastardbleichheit
KW  - Shine-Dalgarno sequences
KW  - translation initiation
KW  - plastid
KW  - hybrid variegation
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-31056
ER  - 
TY  - THES
A1  - Lehmann, Cathleen
T1  - Untersuchungen zum Aufnahmemechanismus und intrazellulärem Transport von fusogenen und kationischen Liposomen-DNA-Komplexen für den Gentransfer
N2  - Mit der vorliegenden Arbeit sollten mit Hilfe elektronenmikroskopischer Methoden verschiedene Liposomen-DNA-Komplexe zum Gentransfer charakterisiert sowie die Aufnahme und Verteilung in der Zellkultur untersucht werden. Dabei waren vor allem solche Präparationen von besonderem Interesse, die in unserer Arbeitsgruppe 'Drug Targeting' getestet oder entwickelt und verwendet wurden, wie Sendai-Virus Liposomen (HVJ-Liposomen), Virosomen sowie DAC-Chol und DOCSPER-Liposomen als Vertreter der kationischen Lipide.  Im ersten Teil der Arbeit wurden fusogene Liposomen und Virosomen charakterisiert. Bei diesen Untersuchungen wurden folgende Ergebnisse erzielt: ·Sendai-Viren fusionieren mit Liposomen unterschiedlicher Lipidzusammensetzung.  ·Die daraus resultierenden HVJ-Liposomen sind mit elektronenmikroskopischen Methoden identifizierbar. ·Die Spikes auf den HVJ-Liposomen besitzen fusogene Eigenschaften.  ·HVJ-Liposomen eignen sich auf Grund der geringen Ausbeute sowie der geringen Transfektionseffizienz nicht zum in vitro Gentransfer. ·Virosomen stellen einen weiteren Typ fusogener Gentransfervesikel dar. ·Ihre Größe und fusogenen Eigenschaften sind abhängig von der externen Zugabe einer optimierten Lipidmischung. ·Im Innenraum der Virosomen kann mit Poly-L-Lysin vorkomplexierte DNA verkapselt werden. ·Die fusogenen Eigenschaften der Virosomen wurden mit Hilfe immunelektronenmikroskopischer Techniken und monoklonaler Antikörper gegen Hämagglutinin/Neuraminidase und das Fusionsprotein sowie mit polyklonalen Antiseren gezeigt. ·An Hand goldmarkierter DNA sind Virosomen nach der Transfektion in der Zelle nachweisbar.  Da in unserer Arbeitsgruppe bevorzugt kationische Liposomen zum Gentransfer verwendet werden, wurde auch die Struktur der Liposomen untersucht und folgende Ergebnisse dokumentiert: ·Die Struktur und die Größe kationischer Liposomen werden hauptsächlich durch die Lipidzusammensetzung bestimmt.  ·Die Bildung von Liposomen-DNA-Komplexen ist mit einer Größenzunahme der Komplexe gekoppelt. ·Die Anzahl gebundener Plasmide steigt mit der Größe der Lipoplexe.  ·Gentransferaktive Lipopolyplexe (mit Protaminsulfat komplexierte DNA und DAC-Chol- Liposomen) sind kleiner als Lipoplexe. Ihre Struktur wird von der Zusammensetzung bestimmt.   Eine weitere wichtige Frage betrifft den Weg der Gencarrier in der Zelle. Kenntnisse über diese Vorgänge sind vorteilhaft, um die einzelnen Schritte zu verstehen und möglichst gezielt zu verbessern. Bei der Untersuchung der Partikel im Hinblick auf zelluläre Barrieren beim Gentransfer konnten folgende Ergebnisse erzielt werden:  ·Die Bindung der Partikel an die Zellmembran und Aufnahme sind abhängig von den eingesetzten Zellen und Komplexen sowie derInkubationszeit. ·Die Aufnahme erfolgt über endozytotische Mechanismen, wobei Lipopolyplexe schneller als Lipoplexe in die Zellen gelangen. Nicht alle gebundenen Komplexe werden aufgenommen. ·Die aufgenommenen Partikel befinden sich in Endosomen und werden ins Innere der Zelle transportiert.  ·Freisetzung der DNA und Eintritt in den Zellkern über Kernporen konnte nicht beobachtet werden. ·DNA-haltige Vesikel in Kernnähe deuten auf einen weiteren Mechanismus hin (Vesikeltransfer zum Zellkern).
N2  - The aim of this work is the characterisation of several liposome DNA complexes for in vitro gene transfer and uptake as well as their distribution in cultured cell lines using electron microscopy. The particles used were fusogenic liposomes made from Sendai virus, virosomes and cationic liposomes.  At first fusogenic liposomes and virosomes were characterised. The results obtained are summarised below: ·Sendai virus can fuse with liposomes made from different lipid composition. ·HVJ-liposomes are detectable using electron microscopy techniques.  ·The spikes from HVJ-liposomes have fusogenic properties. ·HVJ-liposomes are not suitable for in vitro gene transfer due to the low amount of fusogenic liposomes leading to low transfection efficiency. ·Virosomes, reconstituted virus envelopes, are another type of fusogenic vesicles. ·Size and morphology of virosomes depends on the addition of an optimised lipid mixture.  ·PLL treated DNA is entrapped into virosomes. ·Monoclonal and polyclonal antibodies and protein A gold technique can be used for the detection of viral glycoproteins on virosomes. ·Gold labelled DNA was used to show the distribution in cultured cells.  In order to characterise the structure of cationic liposomes following results were obtained: ·Size and structure depends on the lipid composition. ·The formation of liposomes leads to an increase of the size. ·Larger lipoplexes contain more DNA. ·Lipopolyplexes composed of DNA complexed with protamine sulphate and DAC- Chol liposomes are smaller than lipoplexes. Their structure depends on the composition.  To improve transfection ability examination of the cellular barriers is useful. With regard to the fate of lipoplexes following results were obtained. ·Binding depends on the cell line, kind of particles and incubation time. ·Uptake occurs through endocytosis. Lipopolyplexes enter the cells faster than larger lipoplexes. ·Lipoplexes are enclosed in endosomes and were carried into the centre of the cell. ·Escape of DNA from endosomes and entry into nucleus were not visible. ·Vesicles with DNA were observed near the nucleus. There is an opportunity for another pathway to the nucleus.
KW  - Gentherapie
KW  - kationische Liposomen
KW  - Virosomen
KW  - Elektronenmikroskopie
KW  - gene therapy
KW  - cationic liposome
KW  - virosome
KW  - electron microscopy
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001196
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schäfer, Marjänn Helena
T1  - Untersuchungen zur Evolution der 15-Lipoxygenase (ALOX15) bei Säugetieren und funktionelle Charakterisierung von Knock-in-Mäusen mit humanisierter Reaktionsspezifität der 15-Lipoxygenase-2 (Alox15b)
T1  - Studies on the evolution of 15-lipoxygenase (ALOX15) in mammals and functional characterization of Knock-in mice with humanized reaction specificity of 15-lipoxygenase-2 (Alox15b)
N2  - Arachidonsäurelipoxygenasen (ALOX-Isoformen) sind Lipid-peroxidierenden Enzyme, die bei der Zelldifferenzierung und bei der Pathogenese verschiedener Erkrankungen bedeutsam sind. Im menschlichen Genom gibt es sechs funktionelle ALOX-Gene, die als Einzelkopiegene vorliegen. Für jedes humane ALOX-Gen gibt es ein orthologes Mausgen. Obwohl sich die sechs humanen ALOX-Isoformen strukturell sehr ähnlich sind, unterscheiden sich ihre funktionellen Eigenschaften deutlich voneinander. In der vorliegenden Arbeit wurden vier unterschiedliche Fragestellungen zum Vorkommen, zur biologischen Rolle und zur Evolutionsabhängigkeit der enzymatischen Eigenschaften von Säugetier-ALOX-Isoformen untersucht:
1) Spitzhörnchen (Tupaiidae) sind evolutionär näher mit dem Menschen verwandt als Nagetiere und wurden deshalb als Alternativmodelle für die Untersuchung menschlicher Erkrankungen vorgeschlagen. In dieser Arbeit wurde erstmals der Arachidonsäurestoffwechsel von Spitzhörnchen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass im Genom von Tupaia belangeri vier unterschiedliche ALOX15-Gene vorkommen und die Enzyme sich hinsichtlich ihrer katalytischen Eigenschaften ähneln. Diese genomische Vielfalt, die weder beim Menschen noch bei Mäusen vorhanden ist, erschwert die funktionellen Untersuchungen zur biologischen Rolle des ALOX15-Weges. Damit scheint Tupaia belangeri kein geeigneteres Tiermodel für die Untersuchung des ALOX15-Weges des Menschen zu sein. 
2) Entsprechend der Evolutionshypothese können Säugetier-ALOX15-Orthologe in Arachidonsäure-12-lipoxygenierende- und Arachidonsäure-15-lipoxygenierende Enzyme eingeteilt werden. Dabei exprimieren Säugetierspezies, die einen höheren Evolutionsgrad als Gibbons aufweisen, Arachidonsäure-15-lipoxygenierende ALOX15-Orthologe, während evolutionär weniger weit entwickelte Säugetiere Arachidonsäure-12 lipoxygenierende Enzyme besitzen. In dieser Arbeit wurden elf neue ALOX15-Orthologe als rekombinante Proteine exprimiert und funktionell charakterisiert. Die erhaltenen Ergebnisse fügen sich widerspruchsfrei in die Evolutionshypothese ein und verbreitern deren experimentelle Basis. Die experimentellen Daten bestätigen auch das Triadenkonzept. 
3) Da humane und murine ALOX15B-Orthologe unterschiedliche funktionelle Eigenschaften aufweisen, können Ergebnisse aus murinen Krankheitsmodellen zur biologischen Rolle der ALOX15B nicht direkt auf den Menschen übertragen werden. Um die ALOX15B-Orthologen von Maus und Mensch funktionell einander anzugleichen, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Knock-in Mäuse durch die In vivo Mutagenese mittels CRISPR/Cas9-Technik hergestellt. Diese exprimieren eine humanisierte Mutante (Doppelmutation von Tyrosin603Asparaginsäure+Histidin604Valin) der murinen Alox15b. Diese Mäuse waren lebens- und fortpflanzungsfähig, zeigten aber geschlechtsspezifische Unterschiede zu ausgekreuzten Wildtyp-Kontrolltieren im Rahmen ihre Individualentwicklung.
4) In vorhergehenden Untersuchungen zur Rolle der ALOX15B in Rahmen der Entzündungsreaktion wurde eine antiinflammatorische Wirkung des Enzyms postuliert. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine Humanisierung der murinen Alox15b die Entzündungsreaktion in zwei verschiedenen murinen Entzündungsmodellen beeinflusst. Eine Humanisierung der murinen Alox15b führte zu einer verstärkten Ausbildung von Entzündungssymptomen im induzierten Dextran-Natrium-Sulfat-Kolitismodell. Im Gegensatz dazu bewirkte die Humanisierung der Alox15b eine Abschwächung der Entzündungssymptome im Freund‘schen Adjuvans Pfotenödemmodell. Diese Daten deuten darauf hin, dass sich die Rolle der ALOX15B in verschiedenen Entzündungsmodellen unterscheidet.
N2  - Arachidonic acid lipoxygenases (ALOX-isoforms) are lipid peroxidizing enzymes that have been implicated in cell differentiation and in the pathogenesis of different diseases. In the human genome six different ALOX genes have been identified and all of them occur as single copy genes. For each human ALOX gene an ortholog exists in the mouse genome. Although human and mouse ALOX orthologs share a high degree of structural similarity ALOX15 and ALOX15B orthologs exhibit distinct functional characteristics. In the present study addressed four different questions on the occurrence, the biological role and enzyme evolution of mammalian ALOX15 and ALOX15B orthologs.
	1) Tupaiidae are more closely related to humans than rodents and therefore these mammals have frequently been suggested as better animal models than mice for investigations into patho-physiological basis of human diseases. This work explored for the first time the arachidonic acid metabolism of a Tupaiidae representative (Tupaia belangeri) and found that this mammal carries four distinct ALOX15 genes in its genome. The enzymes encoded by these four genes share a high degree of functional similarity but the observed genomic multiplicity, which is neither present in mice nor in humans, makes studies into the biological role of ALOX15 orthologs more complex. Thus, Tupaia belangeri is not more suitable than mice for investigations into the biological role of mammalian ALOX15 orthologs since loss-of-function studies on one ALOX15 ortholog may easily be compensated by upregulation of an orthologous gene.
	2) According to the Evolutionary Hypothesis mammalian ALOX15 orthologs can be subdivided into arachidonic acid 12-lipoxygenating and arachidonic acid 15-lipoxygenating enzymes. Mammalian species, which are ranked above gibbons express arachidonic acid 15 lipoxygenating ALOX15 orthologs. In contrast mammals ranked below gibbons express arachidonic acid 12-lipoxygenating enzymes. In this study the ALOX15 orthologs of eleven different mammals expressed as recombinant proteins and characterized their functional properties. The results of these experiments were consistent with the Evolutionary Hypothesis and put this theory on a broader experimental basis. Moreover, the obtained in vitro mutagenesis data indicate that the novel enzymes follow Triad Concept.
3) Since human and mouse ALOX15B orthologs exhibit different functional properties, conclusion drawn in mouse models of human diseases may be misleading. To make human and mouse ALOX15B orthologs more like each other were generated Alox15b knock-in mice, which express the humanized Tyr603Asp+His604Val double mutant of mouse Alox15b instead of the endogenous wildtype enzyme employing the CRISPR/Cas9 in vivo mutagenesis strategy. These Alox15b-KI mice are viable, reproduce normally but exhibit gender-specific differences to outbred wildtype control animals when the bodyweight kinetics during adolescence and early adulthood were followed. 
	4) In previous studies an anti-inflammatory role of ALOX15B in the pathogenesis of inflammation has been suggested. Here we explored whether functional humanization of mouse Alox15b impacts the severity of inflammatory symptoms in two mouse inflammation models. In the dextran-sodium sulfate colitis model humanization of mouse Alox15b induced more severe inflammatory symptoms. In contrast, humanization of this enzyme protected mice in the Freund’s complete adjuvants induced paw edema model. Taken together, these data suggest that the patho-physiological roles of Alox15b may vary depending on the type of the animal inflammation model used.
KW  - Lipoxygenase
KW  - ALOX15B
KW  - Knock in Mäuse
KW  - enzymatische Reaktionsspezifität
KW  - Tupaia belangeri
KW  - DSS-Colitis
KW  - Pfotenödem Mausmodell
KW  - mammalian ALOX15 orthologs
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-620340
ER  -