TY - THES A1 - Schäfer, Marjänn Helena T1 - Untersuchungen zur Evolution der 15-Lipoxygenase (ALOX15) bei Säugetieren und funktionelle Charakterisierung von Knock-in-Mäusen mit humanisierter Reaktionsspezifität der 15-Lipoxygenase-2 (Alox15b) T1 - Studies on the evolution of 15-lipoxygenase (ALOX15) in mammals and functional characterization of Knock-in mice with humanized reaction specificity of 15-lipoxygenase-2 (Alox15b) N2 - Arachidonsäurelipoxygenasen (ALOX-Isoformen) sind Lipid-peroxidierenden Enzyme, die bei der Zelldifferenzierung und bei der Pathogenese verschiedener Erkrankungen bedeutsam sind. Im menschlichen Genom gibt es sechs funktionelle ALOX-Gene, die als Einzelkopiegene vorliegen. Für jedes humane ALOX-Gen gibt es ein orthologes Mausgen. Obwohl sich die sechs humanen ALOX-Isoformen strukturell sehr ähnlich sind, unterscheiden sich ihre funktionellen Eigenschaften deutlich voneinander. In der vorliegenden Arbeit wurden vier unterschiedliche Fragestellungen zum Vorkommen, zur biologischen Rolle und zur Evolutionsabhängigkeit der enzymatischen Eigenschaften von Säugetier-ALOX-Isoformen untersucht: 1) Spitzhörnchen (Tupaiidae) sind evolutionär näher mit dem Menschen verwandt als Nagetiere und wurden deshalb als Alternativmodelle für die Untersuchung menschlicher Erkrankungen vorgeschlagen. In dieser Arbeit wurde erstmals der Arachidonsäurestoffwechsel von Spitzhörnchen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass im Genom von Tupaia belangeri vier unterschiedliche ALOX15-Gene vorkommen und die Enzyme sich hinsichtlich ihrer katalytischen Eigenschaften ähneln. Diese genomische Vielfalt, die weder beim Menschen noch bei Mäusen vorhanden ist, erschwert die funktionellen Untersuchungen zur biologischen Rolle des ALOX15-Weges. Damit scheint Tupaia belangeri kein geeigneteres Tiermodel für die Untersuchung des ALOX15-Weges des Menschen zu sein. 2) Entsprechend der Evolutionshypothese können Säugetier-ALOX15-Orthologe in Arachidonsäure-12-lipoxygenierende- und Arachidonsäure-15-lipoxygenierende Enzyme eingeteilt werden. Dabei exprimieren Säugetierspezies, die einen höheren Evolutionsgrad als Gibbons aufweisen, Arachidonsäure-15-lipoxygenierende ALOX15-Orthologe, während evolutionär weniger weit entwickelte Säugetiere Arachidonsäure-12 lipoxygenierende Enzyme besitzen. In dieser Arbeit wurden elf neue ALOX15-Orthologe als rekombinante Proteine exprimiert und funktionell charakterisiert. Die erhaltenen Ergebnisse fügen sich widerspruchsfrei in die Evolutionshypothese ein und verbreitern deren experimentelle Basis. Die experimentellen Daten bestätigen auch das Triadenkonzept. 3) Da humane und murine ALOX15B-Orthologe unterschiedliche funktionelle Eigenschaften aufweisen, können Ergebnisse aus murinen Krankheitsmodellen zur biologischen Rolle der ALOX15B nicht direkt auf den Menschen übertragen werden. Um die ALOX15B-Orthologen von Maus und Mensch funktionell einander anzugleichen, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Knock-in Mäuse durch die In vivo Mutagenese mittels CRISPR/Cas9-Technik hergestellt. Diese exprimieren eine humanisierte Mutante (Doppelmutation von Tyrosin603Asparaginsäure+Histidin604Valin) der murinen Alox15b. Diese Mäuse waren lebens- und fortpflanzungsfähig, zeigten aber geschlechtsspezifische Unterschiede zu ausgekreuzten Wildtyp-Kontrolltieren im Rahmen ihre Individualentwicklung. 4) In vorhergehenden Untersuchungen zur Rolle der ALOX15B in Rahmen der Entzündungsreaktion wurde eine antiinflammatorische Wirkung des Enzyms postuliert. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine Humanisierung der murinen Alox15b die Entzündungsreaktion in zwei verschiedenen murinen Entzündungsmodellen beeinflusst. Eine Humanisierung der murinen Alox15b führte zu einer verstärkten Ausbildung von Entzündungssymptomen im induzierten Dextran-Natrium-Sulfat-Kolitismodell. Im Gegensatz dazu bewirkte die Humanisierung der Alox15b eine Abschwächung der Entzündungssymptome im Freund‘schen Adjuvans Pfotenödemmodell. Diese Daten deuten darauf hin, dass sich die Rolle der ALOX15B in verschiedenen Entzündungsmodellen unterscheidet. N2 - Arachidonic acid lipoxygenases (ALOX-isoforms) are lipid peroxidizing enzymes that have been implicated in cell differentiation and in the pathogenesis of different diseases. In the human genome six different ALOX genes have been identified and all of them occur as single copy genes. For each human ALOX gene an ortholog exists in the mouse genome. Although human and mouse ALOX orthologs share a high degree of structural similarity ALOX15 and ALOX15B orthologs exhibit distinct functional characteristics. In the present study addressed four different questions on the occurrence, the biological role and enzyme evolution of mammalian ALOX15 and ALOX15B orthologs. 1) Tupaiidae are more closely related to humans than rodents and therefore these mammals have frequently been suggested as better animal models than mice for investigations into patho-physiological basis of human diseases. This work explored for the first time the arachidonic acid metabolism of a Tupaiidae representative (Tupaia belangeri) and found that this mammal carries four distinct ALOX15 genes in its genome. The enzymes encoded by these four genes share a high degree of functional similarity but the observed genomic multiplicity, which is neither present in mice nor in humans, makes studies into the biological role of ALOX15 orthologs more complex. Thus, Tupaia belangeri is not more suitable than mice for investigations into the biological role of mammalian ALOX15 orthologs since loss-of-function studies on one ALOX15 ortholog may easily be compensated by upregulation of an orthologous gene. 2) According to the Evolutionary Hypothesis mammalian ALOX15 orthologs can be subdivided into arachidonic acid 12-lipoxygenating and arachidonic acid 15-lipoxygenating enzymes. Mammalian species, which are ranked above gibbons express arachidonic acid 15 lipoxygenating ALOX15 orthologs. In contrast mammals ranked below gibbons express arachidonic acid 12-lipoxygenating enzymes. In this study the ALOX15 orthologs of eleven different mammals expressed as recombinant proteins and characterized their functional properties. The results of these experiments were consistent with the Evolutionary Hypothesis and put this theory on a broader experimental basis. Moreover, the obtained in vitro mutagenesis data indicate that the novel enzymes follow Triad Concept. 3) Since human and mouse ALOX15B orthologs exhibit different functional properties, conclusion drawn in mouse models of human diseases may be misleading. To make human and mouse ALOX15B orthologs more like each other were generated Alox15b knock-in mice, which express the humanized Tyr603Asp+His604Val double mutant of mouse Alox15b instead of the endogenous wildtype enzyme employing the CRISPR/Cas9 in vivo mutagenesis strategy. These Alox15b-KI mice are viable, reproduce normally but exhibit gender-specific differences to outbred wildtype control animals when the bodyweight kinetics during adolescence and early adulthood were followed. 4) In previous studies an anti-inflammatory role of ALOX15B in the pathogenesis of inflammation has been suggested. Here we explored whether functional humanization of mouse Alox15b impacts the severity of inflammatory symptoms in two mouse inflammation models. In the dextran-sodium sulfate colitis model humanization of mouse Alox15b induced more severe inflammatory symptoms. In contrast, humanization of this enzyme protected mice in the Freund’s complete adjuvants induced paw edema model. Taken together, these data suggest that the patho-physiological roles of Alox15b may vary depending on the type of the animal inflammation model used. KW - Lipoxygenase KW - ALOX15B KW - Knock in Mäuse KW - enzymatische Reaktionsspezifität KW - Tupaia belangeri KW - DSS-Colitis KW - Pfotenödem Mausmodell KW - mammalian ALOX15 orthologs Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-620340 ER - TY - THES A1 - Sureshkumar, Priyavathi T1 - Erweiterung der zellbasierten Calcium-Imaging-Methode im eukaryotischen zellfreien Proteinsynthese-System für die transient-receptor-potential (TRP) - Ionenkanäle N2 - Die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode wird auch heute noch als gängige Methode verwendet, vor allem wegen der geringeren Kosten für das Wirkstoffscreening in der pharmazeutischen Forschung, wobei Ionenkanäle sowie einige der G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) die Mehrzahl der Wirkstoffziele ansprechen. Die zellfreie Synthese eukaryotischer Proteine hat nicht die Nachteile, die bei der Überexpression dieser ionenpermeablen Proteine in Zellen auftreten können, wie z. B. Zelltoxizität, geringere Proteinexpression und die Beseitigung der exprimierten Proteine aufgrund veränderter Domänen sowie die zeitaufwändige Pflege von Zelllinien. Die Synthese von Ionenkanälen in zellfreien Proteinsyntheseplattformen für das künftige Wirkstoffscreening ist noch in der Grundlagenforschung. Obwohl die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode in zellbasierten Assays weit verbreitet ist, wurde diese Methode bisher noch nicht in zellfreien Proteinexpressionssystemen verwendet. Insgesamt ist die neue Anwendung der Calcium-Imaging-Methode in eukaryontischen zellfreien Systemen eine Voraussetzung für die schnelle pharmakologische Analyse von Wirkstoffen. Das erste Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit bestand darin, die grundlegenden Prinzipien der Calcium-Imaging-Methode zur Untersuchung von Ionenkanälen in zellbasierten Systemen zu untersuchen. Hierfür wurden zwei Tumorzelllinien des Auges verwendet, und zwar benigne Pterygiumzellen und maligne Aderhautmelanom 92.1 Zellen. In diesen Studien wurde die Interaktion zwischen den nativ überexprimierten transient-receptor-potential-Ionenkanälen (TRPs) wie TRP Vanilliod 1 (TRPV1) (Capsaicinrezeptor) und TRP Melastatin 8 (TRPM8) (Mentholrezeptor) in diesen Tumorzellen nach Zugabe von verschiedenen Medikamenten und Hormonen untersucht. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, den Calcium-Mechanismus von GPCRs in den Zellen zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde Mas, ein GPCR und Angiotensin (1-7) -Hormonrezeptor, aus dem renin-angiotensin-aldosteron-system (RAAS) in der Human Embryonic Kidney-293 (HEK293) Zelllinie überexprimiert. In dieser Studie wurden insbesondere die Aktivierung klassischer GPCR-Signalwege wie Phospholipase C und Proteinkinase C durch Angiotensin-(1-7) über Mas und die Beteiligung von TRP-Kanälen nachgewiesen. Die zellbasierte-Calcium-Imaging-Methode für chemische Calcium-Indikatoren ließ sich aufgrund der Anwesenheit einer großen Menge cytosolischer Carboxylesterasen gut anwenden. Carboxylesterase ist das wichtigste Enzym in der Calcium Imaging Methode, das die Verarbeitung chemischen Calcium-Farbstoffe behandelt. Dieses Enzym fehlt jedoch in Mikrosomen, die als Basismembran für die Integration synthetisierter Ionenkanäle in eukaryontischen zellfreien Systemen verwendet werden. Das dritte Ziel dieser Forschungsarbeit war die Umsetzung der zellbasierten Calcium-Imaging Methode und der Calcium-Signalwege in zellfreie Systeme. Hier wurde die zellfrei synthetisierte Carboxylesterase in Mikrosomen von Spodoptera frugiperda (Sf21) als praktikables Calcium-Imaging-Werkzeug etabliert, um sowohl native ionenpermeable Proteine als auch zellfrei-synthetisierte Ionenkanäle zu untersuchen. Die Enzymaktivität der zellfrei-synthetisierten Carboxylesterase in Mikrosomen wurde durch Esterase-Assays und den Calcium-Fluoreszenzfarbstoff Fluo-5N Acetoxymethylester (Fluo-5N AM) Belastungstests nachgewiesen. Das Calcium-Imaging der nativ vorhandenen Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen/endoplasmatischen Retikulums (SERCA) und der Ryanodin-Rezeptoren (RyR) in den Mikrosomen sowie der zell-frei exprimierten TRP-Ionenkanäle wurden mit dem Fura-5N-AM- Fluoreszenzfarbstoff in mit Carboxylesterase vorsynthetisierten Mikrosomen nachgewiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Prinzip der zellbasierten Calcium-Imaging -Methode vielversprechend an das eukaryotische zellfreie Sf21-System angepasst werden konnte, um Ionenkanäle zu analysieren. Nach entsprechender Forschung könnte die etablierte Methode in Zukunft auch auf andere Membranproteine ausgeweitet werden. Dies umfasst die Untersuchung anderer zell-frei exprimierte GPCRs oder anderer Ionenkanäle wie Kalium-, Natrium- und Chlorid-Ionenkanäle. N2 - Fluorescence calcium imaging is still used today used as the common method, mainly due to its cheaper costs for drug screening in pharmaceutical research encompassing both ion channels, and part of G- Protein Coupled Receptors (GPCRs) in the major share of drug targets. Eukaryotic cell-free protein translation overcomes several drawbacks that might occur for overexpression of these ion-permeable proteins in the cells such as cell toxicity, poor protein expression, and deletion due to modified protein domain and time-consuming cell line maintenance. Expressing ion channels in the cell-free protein synthesis platform for future drug screening processes is still ongoing basic research and so far, no calcium imaging technique for cell-free expressed ion channels is available. Taken together, the novel application of the fluorescence calcium imaging method in eukaryotic cell-free systems is a prerequisite for rapid pharmacological drug investigations, which are not feasible using conventional call-based approaches. The aim of this thesis is to investigate the common calcium signaling pathways relevant to drug research via ion channels and GPCRs in cell-based systems. Thereby, the basic mechanism of the cell-based calcium imaging for chemical calcium indicators is studied and then translate its principle to the cell-free protein synthesis platforms. In order to study the cell-based calcium imaging and calcium pathways, two types of eye tumor cell-based models, namely benign pterygial tumor cells and malign uveal melanoma 92.1 cells were used. Specifically, the interplay between the natively expressed Transient Receptor Potential Channels (TRPs) like TRP-Vanilloid 1 (TRPV1) (Capsaicin receptor) and TRP-Melastatin 8 (TRPM8) (Menthol receptor) in these tumor cells was investigated by application of various drugs and hormones. The second aim of this thesis was to investigate the cell-based calcium mechanism of GPCRs. For this, overexpressed Mas, a GPCR and Angiotensin-(1-7) hormone receptor, from the Renin Angiotensin Aldosterone System (RAAS) in the Human Embryonic Kidney (HEK293) cells was used. Particularly, the activation of classical GPCR pathways like Phospholipase C and Proteinkinase C via Ang-(1-7) through Mas and the involvement of TRPs was proven in this study. The third aim of this thesis is to translate the cell-based calcium imaging principle to cell-free systems. Cell-based calcium imaging for chemical calcium indicators could be performed with all ease due to the presence of a large amount of cytosolic carboxylesterase, the crucial enzyme which handles the chemical calcium dyes. But this enzyme is absent in microsomes. Microsomes are used as a backbone membrane to integrate the synthesized ion channels in a eukaryotic cell-free system. Cell-free synthesized carboxylesterase in Spodoptera frugiperda (Sf21) microsomes is established as a viable calcium imaging tool to study both natively present ion permeable proteins and cell-free synthesized ion channels. The enzyme activity of the carboxylesterase in microsomes was confirmed by esterase assays and fluorescent calcium dye Fluo-5N Acetoxymethylester (Fluo-5N AM) loading assays. Fluorescent calcium imaging of natively present SERCA (Sarco Endoplasmic Reticulum Calcium ATPase) and ryanodine channels in the microsomes and cell-free expressed TRPV1 channel was demonstrated using Fluo-5N AM fluorescent dye in carboxylesterase pre-synthesized microsomes. With adequate research in future, the established method could be promisingly extended to study other cell-free expressed GPCRs or other ion channels like potassium, sodium, and chloride ion channels. KW - zellfreie Proteinsynthese KW - Calcium-Imaging KW - transient-receptor-potential-Ionenkanäle KW - calcium imaging KW - transient receptor potential ion channels KW - cell-free protein synthesis Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-619872 ER - TY - THES A1 - Geisendörfer, Birte T1 - Autologer Ansatz zur Entwicklung von 2D- und 3D-Kokultivierungsmethoden für die Bestimmung des sensibilisierenden Potenzials von Xenobiotika N2 - Die allergische Kontaktdermatitis ist eine immunologisch bedingte Hauterkrankung mit insbesondere in den westlichen Industrienationen hoher und weiter ansteigender Prävalenz. Es handelt sich hierbei um eine Hypersensitivitätsreaktion vom Typ IV, die sich nach Allergenkontakt durch Juckreiz, Rötung, Bläschenbildung und Abschälung der Haut äußert. Zahlreiche Xenobiotika besitzen das Potenzial, Kontaktallergien auszulösen, darunter Konservierungsstoffe, Medikamente, Duftstoffe und Chemikalien. Die wirksamste Maßnahme zur Eindämmung der Erkrankung ist die Expositionsprophylaxe, also die Vermeidung des Kontakts mit den entsprechenden Substanzen. Dies wiederum setzt die Kenntnis des jeweiligen sensibilisierenden Potenzials einer Substanz voraus, dessen Bestimmung aus diesem Grund eine hohe toxikologische Relevanz besitzt. Zu diesem Zweck existieren von der OECD veröffentlichte Testleitlinien, welche auf entsprechend validierten Testmethoden basieren. Goldstandard bei der Prüfung auf hautsensibilisierendes Potenzial war über lange Zeit der murine Lokale Lymphknotentest. Seit der 7. Änderung der EU-Kosmetikrichtlinie, welche Tierversuche für Kosmetika und deren Inhaltsstoffe untersagt, wurden vermehrt Alternativmethoden in die OECD-Testleitlinien implementiert.. Die bestehenden in vitro Methoden sind jedoch alleinstehend nur begrenzt aussagekräftig, da sie lediglich singuläre Mechanismen bei der Entstehung einer Kontaktallergie abbilden. Die Entwicklung von Testmethoden, welche mehrere dieser Schlüsselereignisse berücksichtigen, erscheint daher richtungsweisend. Einen vielversprechenden Ansatz liefert hierbei der Loose-fit coculture-based sensitisation assay (LCSA), welcher eine Kokultur aus primären Keratinozyten und PBMC darstellt. Bei der Kokultivierung von Immunzellen mit anderen Zelltypen stellt sich allerdings die Frage, inwiefern die Nutzung von Zellen derselben Spender*innen (autologe Kokultur) bzw. verschiedener Spender*innen (allogene Kokultur) einen Einfluss nimmt. Zu diesem Zweck wurden im Rahmen dieser Arbeit Hautzellen spenderspezifisch aus gezupften Haarfollikeln isoliert und der LCSA mit den generierten HFDK in autologen und allogenen Ansätzen verglichen. Zusätzlich wurde auch ein Vergleich zwischen der Nutzung von HFDK und NHK, welche aus humaner Vorhaut isoliert wurden, im LCSA durchgeführt. Dabei ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen autologen und allogenen Kokulturen bzw. zwischen der Verwendung von HFDK und NHK. Die Verwendung allogener Zellen aus anonymem Spendermaterial sowie die Nutzung von Keratinozyten aus unterschiedlichen Quellen scheint im Rahmen des LCSA problemlos möglich. Einige der getesteten Kontaktallergene, darunter DNCB und NiCl2, erwiesen sich im LCSA jedoch als problematisch und konnten nicht zufriedenstellend als sensibilisierend detektiert werden. Daher wurde eine Optimierung der Kokultur durch Verwendung ex vivo differenzierter Langerhans Zellen (MoLC) angestrebt, welche ein besseres Modell primärer epidermaler Langerhans Zellen darstellen als die dendritischen Zellen aus dem LCSA. Zusätzlich wurden weitere, den Erfolg der Kokultur beeinflussende Faktoren, wie die Art und Zusammensetzung des Mediums und die Kokultivierungsdauer, untersucht und angepasst. Das schlussendlich etablierte Kokultivierungsprotokoll führte zu einer maßgeblich verstärkten Expression von CD207 (Langerin) auf den MoLC, was auf eine wirkungsvolle Interaktion zwischen Haut- und Immunzellen in der Kokultur hindeutete. Des Weiteren konnten DNCB und NiCl2 im Gegensatz zum LCSA durch Verwendung des kostimulatorischen Moleküls CD86 sowie des Reifungsmarkers CD83 als Ausleseparameter eindeutig als Kontaktallergene identifiziert werden. Die Untersuchungen zur Kokultur von MoLC und HFDK wurden jeweils vergleichend in autologen und allogenen Ansätzen durchgeführt. Ähnlich wie beim LCSA kam es aber auch hier zu keinen signifikanten Unterschieden, weder hinsichtlich der Expression von Charakterisierungs- und Aktivierungsmarkern auf MoLC noch hinsichtlich der Zytokinsekretion in den Zellkulturüberstand. Die Hinweise aus zahlreichen Studien im Mausmodell, dass Zellen des angeborenen Immunsystems zur Erkennung von und Aktivierung durch allogene Zellen bzw. Gewebe in der Lage sind, bestätigten sich im Rahmen dieser Arbeit dementsprechend nicht. Aus diesem Grund wurden abschließend CD4+ T-Lymphozyten, die Effektorzellen des adaptiven Immunsystems, in die Kokultur aus MoLC und autologen bzw. allogenen HFDK integriert. Überraschenderweise traten auch hier keine verstärkten Aktivierungen in allogener Kokultur im Vergleich zur autologen Kokultur auf. Die Nutzung autologer Primärzellen scheint im Rahmen der hier getesteten Methoden nicht notwendig zu sein, was die Validierung von Kokulturen und deren Implementierung in die OECD-Testleitlinien erleichtern dürfte. Zuletzt wurde eine Kokultivierung primärer Haut- und Immunzellen auch im 3D-Vollhautmodell durchgeführt, wobei autologe MoLC in die Epidermisäquivalente entsprechender Modelle integriert werden sollten. Obwohl die erstellten Hautmodelle unter Verwendung autologer Haarfollikel-generierter Keratinozyten und Fibroblasten eine zufriedenstellende Differenzierung und Stratifizierung aufwiesen, gestaltete sich die Inkorporation der MoLC als problematisch und konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht erreicht werden. KW - Kontaktallergie KW - Langerhans Zellen KW - Alternativmethoden KW - Kokultur KW - Hautmodell Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Tanner, Norman T1 - Methoden zur routinemäßigen Untersuchung von Bienenprodukten mittels Fourier-transformierter Infrarotspektroskopie Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Wetzel, Alexandra T1 - Epigenetische Regulation des Epstein-Barr Virus-induzierten Gens 3 (EBI3) und dessen Bedeutung bei Colitis ulcerosa N2 - Epigenetische Mechanismen spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von Colitis ulcerosa (CU). Ihr Einfluss auf das beobachtete Ungleichgewicht zwischen pro- und anti-inflammatorischen Cytokinen ist hingegen weitgehend unerforscht. Einige der wichtigsten immunmodulatorischen Cytokine sind die Mitglieder der heterodimeren Interleukin- (IL-) 12-Familie, die durch das Kombinieren einer der drei α-Ketten (IL-12p35, IL-27p28, IL-23p19) mit den ß-Untereinheiten IL-12p40 oder EBI3 (Epstein-Barr Virus-induziertes Gen 3) charakterisiert sind. IL-35 (IL-12p35/EBI3) spielt eine bedeutende anti-inflammatorische Rolle bei verschiedenen Erkrankungen, wohingegen seine Level bei chronischen Entzündungen erniedrigt sind. Eine mögliche Ursache könnte eine transkriptionelle Stilllegung über epigenetische Modifikationen sein. Tatsächlich konnte durch die Stimulation mit dem DNA-Methyltransferase-Inhibitor (DNMTi) Decitabin (DAC; Dacogen®) eine Induktion von EBI3 in humanen Epithelzellen aus gesundem Colon (HCEC) erreicht werden, die als Modell für ein lokales Entzündungsgeschehen dienten. Diese Regulation über DNA-Methylierung konnte in weiteren humanen Zellen unterschiedlichen Ursprungs sowie durch Stimulation von HCEC-Zellen mit zwei weiteren DNMTi, dem Cytosin-Analogon Azacytidin (AZA; Vidaza®) und dem natürlich vorkommenden, epigenetisch wirksamen Polyphenol Epigallocatechingallat (EGCG), verifiziert werden. Die kombinierte Inkubation mit Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα) resultierte jeweils in einer über-additiven Induktion von EBI3. Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass TNFα trotz Beeinflussung der epigenetischen DNMT- und Ten-eleven Translocation- (TET-) Enzyme keinen Einfluss auf die globalen Methylierungs- oder Hydroxymethylierungslevel hatte, jedoch eine genspezifische DNA-Hypomethylierung im EBI3-Promotor induzierte. Durch Nutzung verschiedener Inhibitoren konnte darüber hinaus nachgewiesen werden, dass der beobachtete synergistische Effekt der gemeinsamen DAC und TNFα-Stimulation hauptsächlich über NFκB (Nuclear factor “kappa-light-chain-enhancer” of activated B-cells) vermittelt wird. Ein Teil verläuft dabei über p38 MAPK (mitogen-activated protein kinases), während die JNK- (c-Jun N-terminale Kinasen-) und ERK- (extracellular-signal-regulated kinases) Signalwege keine Rolle spielen. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem gezeigt, dass die DNA-Hypomethylierung während eines entzündlichen Zustandes auch in einer erhöhten EBI3-Proteinexpression resultiert. Die Höhe der immunologisch detektierten Banden wies auf eine Dimerbildung sowohl im Zelllysat als auch im Überstand hin. Humane Colonepithelzellen sind demnach in der Lage, Cytokine zu bilden und zu sezernieren, was die Bedeutung von Nicht-Immunzellen bei der lokalen Immunantwort unterstreicht. Mittels Genexpressionsanalysen wurden IL-12p35 und IL-23p19 als mögliche Bindungspartner identifiziert. Aufgrund kreuzreaktiver Antikörper ist ein direkter Nachweis der EBI3-Dimere derzeit nicht möglich. Die stattdessen genutzte Kombination verschiedener Methoden dient als geeigneter Ersatz für die problematischen Antikörper-basierten Analysen wie Immunpräzipitation oder ELISA. Durch molekularbiologische, immunologische und massenspektrometrische Methoden konnte IL-35 identifiziert werden, während IL-39 (IL-23p19/EBI3) nicht detektiert wurde. Dies ist in Einklang mit den Erkenntnissen mehrerer Forschungsgruppen, die eine Bildung des nativen humanen Dimers aus IL-23p19 und EBI3 bezweifeln. Des Weiteren wurde die biologische Aktivität des behandlungsinduzierten IL 35-Proteins durch einen Funktionsassay nachgewiesen. Neben einer DNMTi-bedingten transkriptionellen Aktivierung konnte eine Regulation von EBI3 über Histonacetylierungen gezeigt werden. Der EBI3-induzierende Effekt des Histondeacetylasen-Inhibitors (HDACi) Trichostatin A (TSA) wurde durch SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid (Vorinostat; Zolinza®)) verifiziert. Ähnlich zu der Stimulation mit den hypomethylierenden Substanzen wurde ein synergistischer Effekt bei paralleler Inkubation mit TNFα beobachtet, der in einer gesteigerten Bildung des EBI3-Proteins resultierte. Um die Befunde in einem komplexeren in vivo-Modell zu untersuchen, wurde eine chronische Colitis in Ebi3-defizienten Mäusen und dem dazugehörigen Wildtypstamm C57BL/6 durch zyklische Applikation von Natriumdextransulfat (Dextran sodium sulfate (DSS)) induziert. Der Vergleich klinischer Parameter wie Mortalitätsrate und Körper- sowie Milzgewicht wies bei Abwesenheit von Ebi3 signifikant stärkere colitische Symptome auf. Dies bestätigte die zentrale Rolle von Ebi3 in der Colitisentwicklung und deutete auf eine bevorzugte Bildung des anti-inflammatorisch wirkenden IL-35 statt des pro-inflammatorischen IL-39 in den Wildtyptieren hin. Durch zusätzliche therapeutische Behandlung der C57BL/6-Mäuse nach der DSS-Gabe konnte die in der Literatur beschriebene positive Wirkung von SAHA auf die Colitismanifestation bestätigt werden. Im Gegensatz dazu war der HDACi in den Ebi3-defizienten Tieren nicht in der Lage, die colitischen Parameter zu verbessern beziehungsweise verschlimmerte den Krankheitsphänotyp. Expressionsanalysen von Up- und Downstream-Target-Genen lieferten weitere Hinweise darauf, dass bei Anwesenheit von Ebi3 IL-35 statt IL-39 gebildet wird, was in Einklang mit den in vitro-Untersuchungen steht. Die vorliegende Arbeit konnte durch den Vergleich der C57BL/6-Mäuse mit den Ebi3-defizienten Tieren neue Erkenntnisse über die Wirkungsweise von SAHA erbringen. Histonacetylierende Bedingungen verbessern colitische Symptome über einen Mechanismus, der die epigenetische Induktion von Ebi3 mit nachfolgender IL-35-Bildung involviert. Durch Kooperation der epigenetischen Mechanismen Hypomethylierung und Histonacetylierung wurde der stärkste Effekt auf die EBI3-Induktion bewirkt. Insgesamt konnte in der vorliegenden Arbeit durch in vitro- und in vivo-Analysen die epigenetische und NFκB-vermittelte Induktion von EBI3 über DNA-Demethylierung und Histonacetylierung mit nachfolgender IL-35-Bildung und –Sezernierung nachgewiesen werden. Da IL-35 in der Lage ist, colitische Symptome zu mildern, stellt die epigenetische Reaktivierbarkeit von EBI3 durch DNMTi und HDACi eine vielversprechende Alternative für die derzeit genutzten, oft nicht oder nur kurzfristig wirksamen Therapien bei der Behandlung einer CU dar. Einer übermäßigen Immunantwort während schubweiser entzündlicher Phasen könnte entgegengewirkt und Komplikationen wie die Bildung Colitis-assoziierter Karzinome verhindert werden. N2 - Aberrant epigenetic alterations are becoming increasingly relevant in the development of multiple diseases. Epigenetic mechanisms also play a crucial role in the pathogenesis of ulcerative colitis (CU). In contrast, their influence on the observed imbalance between pro- and anti-inflammatory cytokines is largely unexplored. Several of the most important immunomodulatory cytokines are the members of the heterodimeric interleukin- (IL-) 12 family, which are characterized by combining one of the three α-chains (IL-12p35, IL-27p28, IL-23p19) with the ß-subunits IL-12p40 or EBI3 (Epstein-Barr virus induced gene 3). IL-35 (IL-12p35/EBI3) plays a significant anti-inflammatory role in various diseases, while its levels are decreased in chronic inflammation. One possible reason could be transcriptional silencing via epigenetic modifications. Indeed, stimulation with the DNA methyltransferase inhibitor (DNMTi) decitabine (DAC; Dacogen®) resulted in reactivation of EBI3 in Human Colon Epithelial Cells (HCEC) generated from healthy tissue, which served as a model for a local inflammatory process. This regulation via DNA methylation could be verified in other human cells of different origin as well as by stimulating HCEC cells with two additional DNMTi, the cytosine analog azacytidine (AZA; Vidaza®) and the naturally occurring, epigenetically active polyphenol epigallocatechin gallate (EGCG). Combined incubation with tumor necrosis factor α (TNFα) resulted in synergistic induction of EBI3. Further studies showed that TNFα had no effect on global methylation or hydroxymethylation levels despite its influence on epigenetic DNMT and ten-eleven translocation (TET) enzymes, but induced gene-specific DNA hypomethylation in the EBI3 promoter. Moreover, by using several inhibitors, it has been demonstrated that the synergistic effect of DAC and TNFα stimulation is mediated mainly via NFκB (nuclear factor "kappa-light-chain-enhancer" of activated B-cells). Part of this occurs via p38 MAPK (mitogen-activated protein kinases), while the JNK (c-Jun N-terminal kinases) and ERK (extracellular-signal-regulated kinases) signaling pathways are not involved. In the present work, it was also shown that DNA hypomethylation during an inflammatory condition also results in increased EBI3 protein expression. The level of immunologically detected bands indicated dimer formation in both cell lysate and supernatant. Human epithelial cells are therefore capable of producing and secreting cytokines, underlining the importance of non-immune cells in the local immune response. Gene expression analyses identified IL-12p35 and IL-23p19 as possible binding partners. Due to cross-reactive antibodies, direct detection of EBI3 dimers is currently not possible. The combination of different methods used instead serves as a suitable alternative to the problematic antibody-based analyses such as immunoprecipitation or ELISA. Molecular biology, immunology, and mass spectrometry methods identified IL-35, whereas IL-39 (IL-23p19/EBI3) was not detected. This is in agreement with the findings of several research groups that doubt formation of the native human dimer. Furthermore, the biological activity of treatment-induced IL-35 protein was detected by a functional assay. In addition to DNMTi-induced reactivation, regulation of EBI3 via histone acetylation was demonstrated. The EBI3-inducing effect of the histone deacetylase inhibitor (HDACi) trichostatin A (TSA) was verified by SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid (Vorinostat; Zolinza®)). Similar to stimulation with the hypomethylating agents, a synergistic effect was observed with parallel incubation with TNFα, resulting in increased EBI3 protein formation. To investigate the effects in a more complex in vivo model, chronic colitis was induced in Ebi3-deficient mice and the corresponding wild-type strain C57BL/6 by cyclic application of dextran sodium sulfate (DSS). Comparison of clinical parameters such as mortality rate and body as well as spleen weight showed significantly more severe colitic symptoms in the absence of Ebi3. This confirmed the central role of Ebi3 in colitis development and indicated preferential formation of the anti-inflammatory IL-35 rather than the pro-inflammatory IL-39 in wild-type animals. Additional therapeutic treatment of C57BL/6 mice after DSS administration confirmed the beneficial effect of SAHA on colitis manifestation reported in the literature. In contrast, HDACi in the Ebi3-deficient animals was not able to improve colitic parameters and even appeared to exacerbate the disease phenotype. Expression analyses of up- and downstream target genes provided further evidence that IL-35 rather than IL-39 is produced in the presence of Ebi3, consistent with the in vitro studies. Thus, comparison of the C57BL/6 mice with the Ebi3-deficient animals could provide insights into the mode of action of SAHA. Histone acetylating conditions ameliorate colitic symptoms via a mechanism involving epigenetic induction of Ebi3 followed by IL-35 formation. Based on the cooperation of epigenetic mechanisms and the drastic EBI3 induction shown by parallel hypomethylating and histone acetylating conditions, combined treatment with low-dose DNMTi and HDACi represents a therapeutic option for CU. In summary, the present work demonstrated epigenetic and NFκB-mediated reactivation of EBI3 via DNA demethylation and histone acetylation with subsequent IL-35 formation and secretion by in vitro and in vivo analyses. Since IL-35 is able to alleviate colitic symptoms, the epigenetic inducibility of EBI3 by DNMTi and HDACi represents a promising alternative for the currently used therapies in the treatment of CU, which are often not successful or only short-term effective. An excessive immune response during relapsing inflammatory phases could be counteracted and complications such as the formation of colitis-associated carcinomas prevented. KW - Epigenetik KW - Epstein-Barr Virus-induziertes Gen 3 KW - Colitis ulcerosa Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Steppert, Isabel T1 - Entwicklung einer nichtinvasiven Diagnostikmethode zum Nachweis von Infektionserregern T1 - Development of a non-invasive diagnostic method for the identification of infectious pathogens N2 - Die aktuelle COVID-19-Pandemie zeigt deutlich, wie sich Infektionskrankheiten weltweit verbreiten können. Neben Viruserkrankungen breiten sich auch multiresistente bakterielle Erreger weltweit aus. Dementsprechend besteht ein hoher Bedarf, durch frühzeitige Erkennung Erkrankte zu finden und Infektionswege zu unterbrechen. Herkömmliche kulturelle Verfahren benötigen minimalinvasive bzw. invasive Proben und dauern für Screeningmaßnahmen zu lange. Deshalb werden schnelle, nichtinvasive Verfahren benötigt. Im klassischen Griechenland verließen sich die Ärzte unter anderem auf ihren Geruchssinn, um Infektionen und andere Krankheiten zu differenzieren. Diese charakteristischen Gerüche sind flüchtige organische Substanzen (VOC), die im Rahmen des Metabolismus eines Organismus entstehen. Tiere, die einen besseren Geruchssinn haben, werden trainiert, bestimmte Krankheitserreger am Geruch zu unterscheiden. Allerdings ist der Einsatz von Tieren im klinischen Alltag nicht praktikabel. Es bietet sich an, auf technischem Weg diese VOCs zu analysieren. Ein technisches Verfahren, diese VOCs zu unterscheiden, ist die Ionenmobilitätsspektrometrie gekoppelt mit einer multikapillaren Gaschromatographiesäule (MCC-IMS). Hier zeigte sich, dass es sich bei dem Verfahren um eine schnelle, sensitive und verlässliche Methode handelt. Es ist bekannt, dass verschiedene Bakterien aufgrund des Metabolismus unterschiedliche VOCs und damit eigene spezifische Gerüche produzieren. Im ersten Schritt dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die verschiedenen Bakterien in-vitro nach einer kurzen Inkubationszeitzeit von 90 Minuten anhand der VOCs differenziert werden können. Hier konnte analog zur Diagnose in biochemischen Testreihen eine hierarchische Klassifikation der Bakterien erfolgen. Im Gegensatz zu Bakterien haben Viren keinen eigenen Stoffwechsel. Ob virusinfizierte Zellen andere VOCs als nicht-infizierte Zellen freisetzen, wurde an Zellkulturen überprüft. Hier konnte gezeigt werden, dass sich die Fingerprints der VOCs in Zellkulturen infizierter Zellen mit Respiratorischen Synzytial-Viren (RSV) von nicht-infizierten Zellen unterscheiden. Virusinfektionen im intakten Organismus unterscheiden sich von den Zellkulturen dadurch, dass hier neben Veränderungen im Zellstoffwechsel auch durch Abwehrmechanismen VOCs freigesetzt werden können. Zur Überprüfung, inwiefern sich Infektionen im intakten Organismus ebenfalls anhand VOCs unterscheiden lassen, wurde bei Patienten mit und ohne Nachweis einer Influenza A Infektion als auch bei Patienten mit Verdacht auf SARS-CoV-2 (Schweres-akutes-Atemwegssyndrom-Coronavirus Typ 2) Infektion die Atemluft untersucht. Sowohl Influenza-infizierte als auch SARS-CoV-2 infizierte Patienten konnten untereinander und von nicht-infizierten Patienten mittels MCC-IMS Analyse der Atemluft unterschieden werden. Zusammenfassend erbringt die MCC-IMS ermutigende Resultate in der schnellen nichtinvasiven Erkennung von Infektionen sowohl in vitro als auch in vivo. N2 - The current COVID-19 pandemic demonstrates the worldwide spread of infectious diseases. Besides virus infections there is also a worldwide dissemination of multiresistant bacterial strains. Therefore, there is an urgent need for rapid non-invasive screening methods. There is an unmet need to cut infection chains by early detection of infected subjects. Conventional cultural methods require minimally invasive or invasive samples and are not feasible for mass screening due to a long analysis time. In classical Greece, physicians also used their olfactory senses to differentiate infections from other diseases. These characteristic odors are volatile organic compounds (VOC) produced by the metabolism of an organism. Animals with a much better olfactory sense have been trained to detect different germs by their odors. However, the use of sniffing animals is not practicable in clinical settings. A technical detection of VOCs is therefore desirable. One technical approach for the differentiation of VOCs is ion mobility spectrometry coupled with a multicapillary gas chromatography (MCC-IMS). It could be shown that this method is a rapid, sensitive, and reliable method. It is known that various bacteria produce VOCs by their metabolism and therefore different specific smells. By the MCC-IMS method, different bacterial species could be distinguished based on the VOCs after an incubation time as short as 90 minutes in vitro. Comparable to biochemical series of tests a decision tree for the classification of bacteria could be implemented. In contrast to bacteria viruses have no own metabolism and thus are dependent on the host metabolism. Cell cultures were used to determine whether virus-infected cells release other VOCs than non-infected cells. It could be shown here that cell cultures infected with respiratory syncytial virus (RSV) differ from non-infected cell cultures in VOC profiles. Unlike in cell cultures, in the intact organism changes in VOC profiles are not only dependent on cell metabolism alterations but also in defense mechanisms. To investigate infection induced VOC changes in intact organisms, nasal breath of patients with and without influenza A infection as well as of patients with suspected SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2) infection were analyzed. It was proven that a breath analysis using a MCC-IMS is able to distinguish infected patients from non-infected as well as SARS-CoV-2 from influenza A infections. In summary, MCC-IMS delivers encouraging results in the rapid, non-invasive detection of infections in vitro as well as in vivo. KW - volatile organische Substanzen (VOCs) KW - Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS) KW - nichtinvasive Diagnostik KW - bakterielle Infektionen KW - virale Infektionen KW - volatile organic compounds (VOCs) KW - ion mobility spectrometry (IMS) KW - non-invasive Diagnostics KW - bacterial infections KW - viral infections Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-575441 ER - TY - THES A1 - Demin, Paul T1 - Blaulicht-aktivierbares Proteinexpressionssystem in Saccharomyces cerevisiae T1 - Blue light-inducible protein expression system in Saccharomyces cerevisiae N2 - Synthetische Transkriptionsfaktoren bestehen wie natürliche Transkriptionsfaktoren aus einer DNA-Bindedomäne, die sich spezifisch an die Bindestellensequenz vor dem Ziel-Gen anlagert, und einer Aktivierungsdomäne, die die Transkriptionsmaschinerie rekrutiert, sodass das Zielgen exprimiert wird. Der Unterschied zu den natürlichen Transkriptionsfaktoren ist, sowohl dass die DNA-Bindedomäne als auch die Aktivierungsdomäne wirtsfremd sein können und dadurch künstliche Stoffwechselwege im Wirt, größtenteils chemisch, induziert werden können. Optogenetische synthetische Transkriptionsfaktoren, die hier entwickelt wurden, gehen einen Schritt weiter. Dabei ist die DNA-Bindedomäne nicht mehr an die Aktivierungsdomäne, sondern mit dem Blaulicht-Photorezeptor CRY2 gekoppelt. Die Aktivierungsdomäne wurde mit dem Interaktionspartner CIB1 fusioniert. Unter Blaulichtbestrahlung dimerisieren CRY2 und CIB1 und damit einhergehend die beiden Domänen, sodass ein funktionsfähiger Transkriptionsfaktor entsteht. Dieses System wurde in die Saccharomyces cerevisiae genomisch integriert. Verifiziert wurde das konstruierte System mit Hilfe des Reporters yEGFP, welcher durchflusszytometrisch detektiert werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass die yEGFP Expression variabel gestaltet werden kann, indem unterschiedlich lange Blaulichtimpulse ausgesendet wurden, die DNA-Bindedomäne, die Aktivierungsdomäne oder die Anzahl der Bindestellen, an dem sich die DNA-Bindedomäne anlagert, verändert wurden. Um das System für industrielle Anwendungen attraktiv zu gestalten, wurde das System vom Deepwell-Maßstab auf Photobioreaktor-Maßstab hochskaliert. Außerdem erwies sich das Blaulichtsystem sowohl im Laborstamm YPH500 als auch im industriell oft verwendeten Hefestamm CEN.PK als funktional. Des Weiteren konnte ein industrierelevante Protein ebenso mit Hilfe des verifizierten Systems exprimiert werden. Schlussendlich konnte in dieser Arbeit das etablierte Blaulicht-System erfolgreich mit einem Rotlichtsystem kombiniert werden, was zuvor noch nicht beschrieben wurde. N2 - Like natural transcription factors, synthetic transcription factors consist of a DNA-binding domain that attaches specifically to the binding site sequence in front of the target gene, and an activation domain that recruits the transcription machinery so that the target gene is expressed. The difference to natural transcription factors is that both the DNA binding domain and the activation domain can be host foreign and artificial metabolic pathways, mostly chemically, can be induced in the host. In this work, new optogenetic synthetic transcription factors were developed so that chemical induction becomes obsolete. The DNA binding domain is no longer linked to the activation domain but to the blue light photoreceptor CRY2. The activation domain was fused to the interaction partner CIB1. Upon blue light irradiation, CRY2 and CIB1 dimerize and thus the two domains, resulting in a functional transcription factor. Six different prokaryotic DNA-binding domains and a total of two different activation domains, viral and fungal, were recombined with CRY2 and CIB1, respectively, and genomically integrated into the eukaryotic cell factory Saccharomyces cerevisiae. Since the blue light dimerization is based on the chromophore FAD, which the yeast can synthesize itself, only the blue light had to be switched on for the induction. The constructed system was verified with the help of the reporter yEGFP, which could be detected by flow cytometry. It could be shown that the yEGFP expression could be made variable by emitting blue light pulses of different lengths, changing the DNA binding domain, the activation domain or the copy number of binding sites at which the DNA binding domain attaches. To make the system attractive for industrial applications, the system was scaled up from deepwell scale to photobioreactor scale. In addition, the blue light system proved to be functional both in the laboratory strain YPH500 and in the yeast strain CEN.PK, which is often used industrially. Furthermore, the industrially relevant protein VP1 could also be expressed using the verified system. Due to its great flexibility, the blue light system established here was christened/named FLIRT (Flexible Blue Light Induced Transcription). Finally, in this work, the established flirt system could be successfully combined with a red light system, which has not been described before. KW - Synthetische Biologie KW - Hefe KW - Saccharomyces cerevisiae KW - Blaulicht KW - Transkriptionsfaktoren KW - Bioreaktor KW - bioreactor KW - blue light KW - budding yeast KW - Saccharomyces cerevisiae KW - synthetic biology KW - transcription factors Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-559696 ER - TY - THES A1 - Pitzen, Valentin T1 - Weitergeführte funktionelle Charakterisierung des centrosomalen Proteins Cep192 und Untersuchung der Topologie des Centrosoms in Dictyostelium Amöben T1 - Functional Characterization of the Centrosomal Protein Cep192 and Investigation of the Topology of the Centrosome in Dictyostelium amoeba N2 - Das Centrosom von Dictyostelium ist acentriolär aufgebaut, misst ca. 500 nm und besteht aus einer dreischichten Core-Struktur mit umgebender Corona, an der Mikrotubuli nukleieren. In dieser Arbeit wurden das centrosomale Protein Cep192 und mögliche Interaktionspartner am Centrosom eingehend untersucht. Die einleitende Lokalisationsuntersuchung von Cep192 ergab, dass es während der gesamten Mitose an den Spindelpolen lokalisiert und im Vergleich zu den anderen Strukturproteinen der Core-Struktur am stärksten exprimiert ist. Die dauerhafte Lokalisation an den Spindelpolen während der Mitose wird für Proteine angenommen, die in den beiden identisch aufgebauten äußeren Core-Schichten lokalisieren, die das mitotische Centrosom formen. Ein Knockdown von Cep192 führte zur Ausbildung von überzähligen Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOC) sowie zu einer leicht erhöhten Ploidie. Deshalb wird eine Destabilisierung des Centrosoms durch die verminderte Cep192-Expression angenommen. An Cep192 wurden zwei kleine Tags, der SpotH6- und BioH6-Tag, etabliert, die mit kleinen fluoreszierenden Nachweiskonjugaten markiert werden konnten. Mit den so getagten Proteinen konnte die hochauflösende Expansion Microscopy für das Centrosom optimiert werden und die Core-Struktur erstmals proteinspezifisch in der Fluoreszenzmikroskopie dargestellt werden. Cep192 lokalisiert dabei in den äußeren Core-Schichten. Die kombinierte Markierung von Cep192 und den centrosomalen Proteinen CP39 und CP91 in der Expansion Microscopy erlaubte die Darstellung des dreischichtigen Aufbaus der centrosomalen Core-Struktur, wobei CP39 und CP91 zwischen Cep192 in der inneren Core-Schicht lokalisieren. Auch die Corona wurde in der Expansion Microscopy untersucht: Das Corona-Protein CDK5RAP2 lokalisiert in räumlicher Nähe zu Cep192 in der inneren Corona. Ein Vergleich der Corona-Proteine CDK5RAP2, CP148 und CP224 in der Expansion Microscopy ergab unterscheidbare Sublokalisationen der Proteine innerhalb der Corona und relativ zur Core-Struktur. In Biotinylierungsassays mit den centrosomalen Core-Proteinen CP39 und CP91 sowie des Corona-Proteins CDK5RAP2 konnte Cep192 als möglicher Interaktionspartner identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die wichtige Funktion des Proteins Cep192 im Dictyostelium-Centrosom und ermöglichen durch die Kombination aus Biotinylierungsassays und Expansion Microscopy der untersuchten Proteine ein verbessertes Verständnis der Topologie des Centrosoms. N2 - The Dictyostelium centrosome contains no centrioles and has a diameter of approx. 500 nm. It consists of a three layered core structure and a surrounding corona, which nucleates microtubules. This work focusses on the centrosomal protein Cep192 and potential interactors at the centrosome. Localization studies showed, that Cep192 is a permanent resident at the spindle poles during mitosis and that, compared to other centrosomal core proteins, Cep192 is expressed at the highest level. The permanent residence at the spindle poles throughout mitosis is assumed for proteins which localize to the outer core layers, which form the mitotic centrosome. A knockdown of Cep192 resulted in supernumerary microtubule organizing centers (MTOC) and a slightly higher ploidy. Due to the phenotype, a destabilization of the centrosome caused by the reduced Cep192 expression is assumed. Cep192 was fused to the newly established short tags BioH6 and SpotH6, which are recognized by small fluorescently labelled probes. The tagged proteins were used for superresolution expansion microscopy. Superresolution expansion microscopy was optimized for the centrosome and allowed the protein specific resolving of the core structure for the first time. Cep192 localizes to the outer core layers. Combination of tagged proteins nicely mirrored all three core layers. CP39 and CP91 localize inbetween Cep192 in the inner core layer. Corona proteins were included in the expansion microscopy: the corona protein CDK5RAP2 comes into close proximity of Cep192 and localizes to the inner corona. A comparison with CP148 and CP224, two other corona proteins, revealed a distinct localization of the proteins within the corona and relatively to the core structure. Applied biotinylase assays with the core proteins CP39 and CP91, as well with the corona protein CDK5RAP2 revealed Cep192 as a possible interaction partner of all three proteins. The results of this work show the important function of Cep192 at the Dictyostelium centrosome and through the biotinylase assay and expansion microscopy data shed a light on the refined Dictyostelium centrosome topology. KW - Centrosom KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - expansion microscopy KW - Cep192 KW - CDK5RAP2 KW - fluorescence microscopy KW - Cep192 KW - CDK5RAP2 Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-548891 ER - TY - THES A1 - Zinke, Jann Felix T1 - Herstellung von Gießharzpräparaten für den Einsatz im Biologieunterricht T1 - Production of casting resin preparations to use in biology classes N2 - Das Ziel des hier beschriebenen Masterprojekts war es, eine Methode zu etablieren, mit der Insekten in Gießharz eingeschlossen werden können, damit sie dauerhaft konserviert für mikroskopische Untersuchungen im Biologieunterricht zur Verfügung stehen. Die Masterarbeit enthält eine ausführliche Anleitung zur Herstellung von Gießharzpräparaten mit darin eingebetteten Insekten. Sie soll als Handreichung vor allem für Biologie-Lehrkräfte dienen, um selbstständig hochwertige Lehrpräparate für ihren Unterricht herstellen zu können. Aufgrund der Komplexität des Themas werden Naturschutzbestimmungen und die Beschaffung der Insekten genauso beleuchtet wie deren anschließende Präparation, die Konstruktion einer eigenen Gießform, die Einbettung der Insekten in Gießharz und die Nachbehandlung des Gießlings. Wichtige Einflussfaktoren, die die Qualität der Präparate entscheidend beeinflussen und mögliche Fehlerquellen, werden ausführlich erläutert. Mittels dieser detaillierten Eingießanleitung können mit relativ einfachen und kostengünstigen Mitteln faszinierende Studienobjekte für einen anschaulichen Biologieunterricht entstehen. N2 - This master thesis aims at the establishment of a method in order to embed insects into cast resin, so that the insects are permanently preserved and available for microscopic studies in biology classes. This master thesis contains a detailed guide to produce cast resin preparations with embedded insects. It is primarily intended to serve as a guide to enable teachers in order to independently create high-quality teaching materials for their classes. Due to the complexity of the topic, environmental protection regulations and the procurement of insects are examined as well as their subsequent preparations, the construction of own casting moulds, the embedding of the insects into the casting resin and the post-treatment of the casting. Important factors which have a decisive influence on quality of the preparations and possible sources of error are particularly described. These detailed casting instructions open new possibilities for teachers to create fascinating teaching objects for vivid biology classes using relatively simple and inexpensive means. KW - Gießharz KW - Gießharzpräparate KW - Biologieunterricht KW - Herstellung KW - Präparate KW - Insekten KW - casting resin KW - preparation KW - insects KW - biology classes KW - production Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-615028 ER - TY - THES A1 - Ramm, Timo T1 - Entwicklung von Multiplex-Methoden zur Antikörper-Charakterisierung und Validierung N2 - Antikörper werden in verschiedensten Bereichen, sowohl zu therapeutischen als auch zu diagnostischen und forschungsorientierten Zwecken verwendet. Vor der Verwendung des Antikörpers bedarf es der Charakterisierung seiner Eigenschaften, in Bezug auf sein Epitop und sein Bindeverhalten gegenüber dem Paratop. Gleichzeitig muss, in Abhängigkeit des Einsatzes, der Antikörper, für den gewünschten Gebrauch, validiert werden. Zu diesem Zweck wurden in der vorliegenden Arbeit Bead-basierte, multiplexe Testsysteme entworfen, ausgetestet und etabliert mit dem Ziel, eine einfache Screeningmethode zu entwickeln, um eine hohe Anzahl an Proben beziehungsweise Analyten gleichzeitig bestimmen zu können. Dafür wurden drei verschiedene Herangehensweisen etabliert. So wurden ein phospho-PKA-Substrat Antikörper, welcher phosphorylierte Bindemotive der PKA der Form RRxpS erkennt, gleichzeitig mit einer Reihe an Peptide getestet, welche Punktmutationen im Vergleich zur Konsensussequenz enthielten, um den Einfluss einzelner Aminosäuren auf die Bindung des Antikörpers zu untersuchen. Es konnte im Multiplex gezeigt werden, dass die Unterschiede im Antikörperbindungsverhalten in Abhängigkeit der Aminosäure an verschiedenen P-Positionen detektierbar waren. Mit dem Bead-basierten Multiplexansatz konnten, durch Messungen von Konzentrationsreihen des Antikörpers, Bindungskinetiken aufgenommen und diese mit bereits etablierten Methoden verglichen werden. Des Weiteren wurden verschiedene Antikörper, welche essenzielle Bestandteile von Bead-basierten Testsystemen darstellten, validiert. Es wurden dabei verschiedene Antikörper, welche spezifisch THC und CBD erkennen ausgetestet und anschließend ein kompetitiver Assay zur Detektion von THC und CBD in humanem Serum etabliert, und die Nachweisgrenzen bestimmt. Ferner sollten Pferdeseren von Tieren, welche am Sommerekzem leiden, auf ihren IgE-Gehalt hin bestimmt werden. Dafür wurden relevante Proteine rekombinant hergestellt und durch Immobilisierung an Beads im Multiplex mit Serum inkubiert. Die spezifische Bindung des IgE an die Allergen sollte damit messbar gemacht werden können. Für die Gesamtvalidierung des Testsystems wurden zuvor sämtliche Einzelschritte einzeln validiert, um im Anschluss im multiplexen Screening zu vermessen. Die Nutzung von Bead-basierten Multiplexmessungen als eine Plattformtechnologie erleichtert die Charakterisierung von Antikörpern sowie ihre Validierung für verschiedene Testsysteme. N2 - Antibodies are widely used in different fields, which include therapeutic as well as diagnostic and research applications Before the antibody can be used, its properties must be characterized with regard to its epitope and its binding behavior to the paratope. At the same time, depending on the application, the antibody must be validated for its desired use. For this purpose, bead-based multiplex assay systems were designed, tested, and established with the aim of developing a simple screening method to simultaneously measure a high number of samples or analytes. Thus, a phospho-PKA-substrate antibody, which recognizes phosphorylated binding motifs of PKA with the RRxpS motif, was tested. A series of peptides containing point mutations as compared to consensus sequences were used to investigate the influence of individual amino acids on the binding of the antibody. In a multiplex approach it was shown that the differences in the antibody binding behavior were detectable at different P-positions depending on the amino acid. Furthermore, it was possible to measure binding kinetics by the bead-based multiplex approach using dilution series of the antibody, and to compare these with already established methods. In addition to that, different antibodies, which were applied as essential components of bead-based biosensor systems, were validated. On the one hand, different antibodies specifically recognizing THC and CBD were tested and subsequently a competitive assay for the detection of THC and CBD in human serum was established. The detection limits could be determined. On the other hand, the IgG level in horse sera from animals suffering from sweet itch were determined. For this purpose, relevant proteins were recombinantly expressed, immobilized on beads and incubated with serum in a multiplex approach. The specific binding of IgE to the allergen was measurable. For the overall validation of the test system, all individual steps were partially validated beforehand to allow for a measurement in the multiplex screening system. Thus, using the advantages of bead-based multiplex measurements, a platform for the characterization of antibodies as well as their validation in different test systems was demonstrated. KW - Antikörper KW - Multiplex KW - THC KW - Proteinkinase A KW - Sommerekzem KW - CBD KW - Bead KW - Antikörpercharakterisierung KW - Antikörpervalidierung KW - antibody KW - antibody characterization KW - antibody validation KW - THC KW - CBD KW - Proteinkinase A KW - summer eczema Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-561531 ER - TY - THES A1 - Qin, Miaojing T1 - The role of heat shock proteins (HSP23s and HSP70-4) for heat stress memory in plants N2 - Heat is a significant climatic condition that threatens crop growth and survival. Extreme temperature occurrences in nature are becoming more severe, more frequent and longer-lasting, all of which have deleterious repercussions for agricultural production. As a result, it is critical to learn more about the mechanisms that lead to increased heat tolerance in plants. To endure and survive, higher plants have evolved complex mechanisms to respond to various amounts of heat stress. Plants have a thermal tolerance that permits them to survive rapid and dramatic temperature rises for a limited time. Plants can also be primed to withstand heat stress (HS) that would otherwise be lethal by exposing them to short, moderate, and non-lethal HS (referred to as a priming stimulus) before being exposed to severe HS. A prepared acquired thermotolerance in primed plants can be maintained for a long time under optimal circumstances, implying that plants can store information during this period. Several studies have shown that acquired thermotolerance (thermopriming) refers to the increased resistance of cells, tissues, and organisms to elevated temperatures after prior heat exposure. Maintenance of acquired thermotolerance (thermomemory) is associated with the synthesis of specialized stress proteins involved in cellular protection and accelerated tissue repair, such as heat shock proteins (HSPs). Recent studies showed a main role of heat shock proteins for turnover of protein quality components, e.g. HSP21 in the chloroplast in the regulation of thermomemory. As an important organelle, mitochondrial function is critical for plant cell responses to heat. However, it is still unknown what the molecular and physiological involvement of HSPs is in mitochondrial function and thermomemory. In our study, we showed that thermopriming induces transcript and protein levels of two mitochondrial small heat shock proteins, HSP23.5 (AT5G51440) and HSP23.6 (AT4G25200), which last for 2-3 days throughout the thermomemory phase. The morphological analysis of HSP23.5/6 transgenic plants demonstrated HSP23.5/6 function redundantly in heat stress. We showed that hsp23.5/6 double knockout plants had abnormalities in thermomemory at the seedling stage, and that mature hsp23.5/6 4 plants are more sensitive to both basal thermotolerance and thermomemory. Heat treatment significantly impacted the respiration rate of hsp23.5/6 seedlings compared to WT, indicating mitochondrial dysfunction dependent on HSP23.5 and HSP23.6. In addition, we tested and confirmed the chaperone activity of HSP23.6 toward the model substrate protein malate dehydrogenase (MDH) in vitro, indicating that HSP23.6 potentially contributes to the maintenance of cellular viability. Furthermore, we discovered a novel HSP23.6 client protein, CIB22, a mitochondrial complex-I subunit protein. According to experimental data (BiFC and Co-IP), HSP23.6 and CIB22 interact in plant cells. We also identified a heat response phenotype in the cib22 mutant compared to WT, as well as CIB22 protein degradation in the hsp23.5/6 mutant when exposed to heat. Our findings suggest that the two mitochondrial-localized heat shock proteins play a role in thermotolerance, presumably by influencing mitochondrial function and structure. More broadly, to identify novel genetic components associated with thermomemory in plants, we performed proteome profiling for Arabidopsis WT (Col-0) seedlings during thermomemory. Multiple time point samples of priming and triggering with controls were collected and analyzed to reveal the dynamic proteome changes during the memory phase in Arabidopsis cells. Among the top memory-associated proteins, we discovered that HSP70-4 was significantly upregulated after priming and remains high (at least 2-fold) for the next four days. By morphologically analyzing their heat stress behaviors, we were able to verify that HSP70-4 is involved in plant heat stress response. More intriguingly, we discovered that following priming, HSP70-4-GFP creates cytosolic foci that persist for a few days into the recovery period. We propose that these foci are linked to SGs due to cycloheximide (CHX) repressing the GFP-foci signal when exposed to heat. These findings indicate an HSP70-4-mediated transcription and translation control link (module) during basal thermotolerance and thermomemory, as well as its potential role(s) in heat stress response. To summarize, our research provides new insight into the role of heat shock proteins in controlling heat stress tolerance and memory. N2 - Hitze ist eine bedeutende klimatische Bedingung, die das Wachstum und das Überleben von Pflanzen bedroht. Extreme Temperaturereignisse in der Natur werden gravierender, häufiger, länger anhaltend, was sich nachteilig auf die landwirtschaftliche Produktion auswirkt. Daher ist es wichtig, mehr über die Mechanismen zu erfahren, die zu einer erhöhten Hitzetoleranz bei Pflanzen führen. Um auszuhalten und zu überleben, haben höhere Pflanzen komplexe Mechanismen entwickelt, um auf verschiedene Intensitäten von Hitzestress zu reagieren. Pflanzen haben eine thermische Toleranz, die es ihnen ermöglicht, schnelle und dramatische Temperaturanstiege für eine begrenzte Zeit zu überleben. Pflanzen können auch darauf vorbereitet werden, Hitzestress (HS) zu widerstehen, der ansonsten tödlich wäre, indem man sie kurzen, moderaten und nicht-tödlichen HS (als Priming-Stimulus bezeichnet) aussetzt, bevor sie hohem HS ausgesetzt werden. Eine erworbene Thermotoleranz kann bei Pflanzen unter optimalen Bedingungen lange aufrechterhalten werden, was bedeutet, dass Pflanzen während dieser Zeit Informationen speichern können. Mehrere Studien haben gezeigt, dass sich erworbene Thermotoleranz (Thermopriming) auf die erhöhte Widerstandsfähigkeit von Zellen, Geweben und Organismen gegenüber erhöhten Temperaturen nach vorheriger Hitzeeinwirkung bezieht. Die Aufrechterhaltung der erworbenen Thermotoleranz (Thermomemory) ist mit der Synthese von speziellen Stressproteinen verbunden, die am Zellschutz und der beschleunigten Gewebereparatur beteiligt sind, wie z. B. Hitzeschockproteine (HSPs). Neuere Studien haben eine Beteiligung von Hitzeschockproteinen, z.B. HSP21, in Chloroplasten an der Regulation des Thermogedächtnisses belegt. Als wichtiges Organell ist die mitochondriale Funktion entscheidend für die Reaktion von Pflanzenzellen auf Hitze. Es ist jedoch noch unbekannt, wie die molekulare und physiologische Beteiligung von HSPs an der mitochondrialen Funktion im Thermogedächtnis erfolgt. In unserer Studie haben wir gezeigt, dass Thermopriming Transkript- und Proteinspiegel von zwei mitochondrialen kleinen Hitzeschockproteinen, HSP23.56 (AT5G51440) und HSP23.6 (AT4G25200), induziert, die während der Thermogedächtnisphase 2-3 Tage andauern. Die morphologische Analyse von HSP23.5/6-transgenen Pflanzen zeigte eine HSP23.5/6-Funktionsredundanz bei Hitzestress. Wir zeigten, dass hsp23.5/6-Doppel-Knockout-Pflanzen Anomalien im Thermogedächtnis im Keimlingsstadium aufwiesen und dass reife hsp23.5/6-Pflanzen sowohl mit basaler Thermotoleranz als auch mit Thermogedächtnis empfindlicher sind. Die Wärmebehandlung beeinflusste die Atmungsrate von hsp23.5/6-Keimlingen im Vergleich zu WT signifikant, was auf eine mitochondriale Dysfunktion in Abhängigkeit von HSP23.5 und HSP23.6 hinweist. Darüber hinaus haben wir die Chaperon-Aktivität von HSP23.6 gegenüber dem Modellsubstratprotein Malatdehydrogenase (MDH) in vitro getestet und bestätigt, was darauf hindeutet, dass HSP23.6 möglicherweise zur Aufrechterhaltung der zellulären Lebensfähigkeit beiträgt. Darüber hinaus entdeckten wir ein neues HSP23.6-Clientprotein, CIB22, ein mitochondriales Komplex-I-Untereinheitsprotein. Nach experimentellen Daten (BiFC und Co-IP) interagieren HSP23.6 und CIB22 in Pflanzenzellen. Wir identifizierten auch einen Hitzereaktionsphänotyp in der cib22-Mutante im Vergleich zu WT sowie einen CIB22-Proteinabbau in der hsp23.5/6-Mutante, wenn sie Hitze ausgesetzt wurde. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die beiden mitochondrial lokalisierten Hitzeschockproteine eine Rolle bei der Thermotoleranz spielen, vermutlich indem sie die mitochondriale Funktion und Struktur beeinflussen. Um neue genetische Komponenten zu identifizieren, die mit dem Thermogedächtnis in Pflanzen verbunden sind, haben wir weiterhin ein Proteom-Profiling von Arabidopsis WT (Col-0) -Keimlingen während des Thermogedächtnisses durchgeführt. Mehrere Zeitpunkte von Priming und Triggerung mit Kontrollen wurden gesammelt und analysiert, um dynamische Proteomänderungen während der Gedächtnisphase in Arabidopsis-Zellen aufzudecken. Unter den Top-gedächtnis-assoziierten Proteinen entdeckten wir, dass HSP70-4 nach dem Priming signifikant hochreguliert wurde und für die nächsten vier Tage auf hohem Niveau bleibt (mindestens 2-fach erhöht). Durch Analyse ihres Hitzestressverhaltens konnten wir verifizieren, dass HSP70-4 an der 7 Reaktion von Pflanzen auf Hitzestress beteiligt ist. Interessant ist, dass HSP70-4-GFP nach dem Priming zytosolische Foci erzeugt, die für einige Tage während der Erholungsphase bestehen bleiben. Wir schlagen vor, dass der Fokus mit SGs verbunden ist, da Cycloheximid (CHX) GFP-Foci-Signale unterdrückt, wenn sie der Hitze ausgesetzt werden. Diese Ergebnisse weisen auf eine HSP70-4-vermittelte Transkriptions- und Translationssteuerungsverbindung (Modul) während der basalen Thermotoleranz und des Thermogedächtnisses sowie auf ihre potenzielle(n) Rolle(n) bei der Reaktion auf Hitzestress hin. Zusammenfassend bietet unsere Forschung neue Einblicke in die Rolle von Hitzeschockproteinen bei der Kontrolle der Hitzestresstoleranz und des Gedächtnisses. Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Nieschalke, Kai T1 - Proteinaddukte und Urinmetaboliten des Nagetierkanzerogens Methyleugenol als Biomarker der Exposition Y1 - 2021 ER - TY - THES A1 - Raffeiner, Margot T1 - Funktionelle Charakterisierung des Xanthomonas Typ-III Effektorproteins XopS T1 - Functional characterisation of the Xanthomonas type-III effector protein XopS N2 - Angepasste Pathogene besitzen eine Reihe von Virulenzmechanismen, um pflanzliche Immunantworten unterhalb eines Schwellenwerts der effektiven Resistenz zu unterdrücken. Dadurch sind sie in der Lage sich zu vermehren und Krankheiten auf einem bestimmten Wirt zu verursachen. Eine essentielle Virulenzstrategie Gram-negativer Bakterien ist die Translokation von sogenannten Typ-III Effektorproteinen (T3Es) direkt in die Wirtszelle. Dort stören diese die Immunantwort des Wirts oder fördern die Etablierung einer für das Pathogen günstigen Umgebung. Eine kritische Komponente der Pflanzenimmunität gegen eindringende Pathogene ist die schnelle transkriptionelle Umprogrammierung der angegriffenen Zelle. Viele adaptierte bakterielle Pflanzenpathogene verwenden T3Es, um die Induktion Abwehr-assoziierter Gene zu stören. Die Aufklärung von Effektor-Funktionen, sowie die Identifikation ihrer pflanzlichen Zielproteine sind für das Verständnis der bakteriellen Pathogenese essentiell. Im Rahmen dieser Arbeit sollte das Typ-III Effektorprotein XopS aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) funktionell charakterisiert werden. Zudem lag hier ein besonderer Fokus auf der Untersuchung der Wechselwirkung zwischen XopS und seinem in Vorarbeiten identifizierten pflanzlichen Interaktionspartner WRKY40, einem transkriptionellen Regulator der Abwehr-assoziierten Genexpression. Es konnte gezeigt werden, dass XopS ein essentieller Virulenzfaktor des Phytopathogens Xcv während der präinvasiven Immunantwort ist. So zeigten xopS-defiziente Xcv Bakterien bei einer Inokulation der Blattoberfläche suszeptibler Paprika Pflanzen eine deutlich reduzierte Virulenz im Vergleich zum Xcv Wildtyp. Die Translokation von XopS durch Xcv, sowie die ektopische Expression von XopS in Arabidopsis oder N. benthamiana verhinderte das Schließen von Stomata als Reaktion auf Bakterien bzw. einem Pathogen-assoziierten Stimulus, wobei zudem gezeigt werden konnte, dass dies in einer WRKY40-abhängigen Weise geschieht. Weiter konnte gezeigt werden, dass XopS in der Lage ist, die Expression Abwehr-assoziierter Gene zu manipulieren. Dies deutet darauf hin, dass XopS sowohl in die prä-als auch in die postinvasive, apoplastische Abwehr eingreift. Phytohormon-Signalnetzwerke spielen während des Aufbaus einer effizienten pflanzlichen Immunantwort eine wichtige Rolle. Hier konnte gezeigt werden, dass XopS mit genau diesen Signalnetzwerken zu interferieren scheint. Eine ektopische Expression des Effektors in Arabidopsis führte beispielsweise zu einer signifikanten Induktion des Phytohormons Jasmonsäure (JA), während eine Infektion von suszeptiblen Paprika Pflanzen mit einem xopS-defizienten Xcv Stamm zu einer ebenfalls signifikanten Akkumulation des Salicylsäure (SA)-Gehalts führte. So kann zu diesem Zeitpunkt vermutet werden, dass XopS die Virulenz von Xcv fördert, indem JA-abhängige Signalwege induziert werden und es gleichzeitig zur Unterdrückung SA-abhängiger Signalwege kommt. Die Virus-induzierte Genstilllegung des XopS Interaktionspartners WRKY40a in Paprika erhöhte die Toleranz der Pflanze gegenüber einer Xcv Infektion, was darauf hindeutet, dass es sich bei diesem Protein um einen transkriptionellen Repressor pflanzlicher Immunantworten handelt. Die Hypothese, dass WRKY40 die Abwehr-assoziierte Genexpression reprimiert, konnte hier über verschiedene experimentelle Ansätze bekräftigt werden. So wurde beispielsweise gezeigt, dass die Expression von verschiedenen Abwehrgenen einschließlich des SA-abhängigen Gens PR1 und die des Negativregulators des JA-Signalwegs JAZ8 von WRKY40 gehemmt wird. Um bei einem Pathogenangriff die Abwehr-assoziierte Genexpression zu gewährleisten, muss WRKY40 als Negativregulator abgebaut werden. Vorarbeiten zeigten, dass WRKY40 über das 26S Proteasom abgebaut wird. In der hier vorliegenden Studie konnte weiter bestätigt, dass der T3E XopS zu einer Stabilisierung des WRKY40 Proteins führt, indem er auf bislang ungeklärte Weise dessen Abbau über das 26S Proteasom verhindert. Die Ergebnisse aus der hier vorliegenden Arbeit lassen die Vermutung zu, dass die Stabilisierung des Negativregulators der Immunantwort WRKY40 seitens XopS dazu führt, dass eine darüber vermittelte Manipulation der Abwehr-assoziierten Genexpression, sowie eine Umsteuerung phytohormoneller Wechselwirkungen die Ausbreitung von Xcv auf suszeptiblen Paprikapflanzen fördert. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, weitere potentielle in planta Interaktionspartner von XopS zu identifizieren die für seine Interaktion mit WRKY40 bzw. für die Aufschlüsselung seines Wirkmechanismus relevant sein könnten. So konnte die Deubiquitinase UBP12 als weiterer pflanzlicher Interaktionspartner sowohl von XopS als auch von WRKY40 gefunden werden. Dieses Enzym ist in der Lage, die Ubiquitinierung von Substratproteinen zu modifizieren und seine Funktion könnte somit ein Bindeglied zwischen XopS und dessen Interferenz mit dem proteasomalen Abbau von WRKY40 sein. Während einer kompatiblen Xcv-Wirtsinteraktion führte die Virus-induzierte Genstilllegung von UBP12 zu einer reduzierten Resistenz der Pflanze gegenüber des Pathogens Xcv, was auf dessen positiv-regulatorische Wirkung während der Immunantwort hindeutet. Zudem zeigten Western Blot Analysen, dass das Protein WRKY40 bei einer Herunterregulierung von UBP12 akkumuliert und dass diese Akkumulation von der Anwesenheit des T3Es XopS zusätzlich verstärkt wird. Weiterführende Analysen zur biochemischen Charakterisierung der XopS/WRKY40/UBP12 Interaktion sollten in Zukunft durchgeführt werden, um den genauen Wirkmechanismus des XopS T3Es weiter aufzuschlüsseln. N2 - Adapted pathogens have acquired a number of virulence mechanisms to suppress plant immune responses below a threshold of effective resistance and are thus able to replicate and cause disease on a given host. Virulence mechanisms include the translocation of so-called type-III effector proteins (T3Es) directly into the host cell, where they disrupt immune responses or assist the pathogen to establish a beneficial environment. A critical component of plant immunity against invading pathogens is rapid transcriptional reprogramming of the targeted cell to minimize virulence. Many adapted bacterial plant pathogens use T3Es to interfere with the induction of defense-associated genes. Due to the fact that for most of the T3Es studied to date their target proteins in the host are unknown, it is often unclear by which mechanisms these defense responses are disrupted. Thus, the elucidation of effector functions, as well as the identification of their plant target proteins, are necessary for the understanding of bacterial pathogenesis. In this work, the type-III effector protein XopS from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) was functionally characterized. In addition, a particular focus of this characterization was to investigate the interaction between XopS and its plant interaction partner WRKY40, a transcriptional regulator of defense-associated gene expression, identified in preliminary work. XopS was shown to be an essential virulence factor of the phytopathogen Xcv during the preinvasive immune response. Thus, xopS-deficient Xcv bacteria showed significantly reduced virulence when inoculated on the leaf surface of susceptible pepper plants compared to Xcv wild type. Translocation of XopS by Xcv, as well as ectopic expression of XopS in Arabidopsis or N. benthamiana, prevented stomatal closure in response to bacteria or a pathogen-associated stimulus, respectively, and it was further shown that this occurs in a WRKY40-dependent manner. Additionally, XopS was shown to be able to manipulate the expression of defense-associated genes. This suggests that XopS interferes with both preinvasive and postinvasive apoplastic defense mechanisms. Phytohormone signaling networks play an important role during the establishment of an efficient plant immune response. Here, it was shown that XopS appears to interfere with these signaling networks. For example, ectopic expression of the effector in Arabidopsis led to a significant induction of the phytohormone jasmonic acid (JA), while infection of susceptible pepper plants with a xopS-deficient Xcv strain resulted in an equally significant accumulation of the salicylic acid (SA) content. Thus, at this stage it can be speculated that XopS promotes the virulence of Xcv by inducing JA-dependent signaling pathways and simultaneously suppressing SA signaling pathways via it. In this work, it was confirmed that XopS interacts not only with WRKY40 from N. benthamiana but also with its orthologous proteins from Arabidopsis (AtWRKY40) and pepper (CaWRKY40a). Virus-induced gene silencing of WRKY40a in bell pepper increased plant tolerance to Xcv infection, suggesting that this protein is a transcriptional regulator that suppresses induction of plant immune responses. The hypothesis that WRKY40 is a transcriptional repressor of defense-associated gene expression was corroborated here via several experimental approaches. For example, the expression of several defense genes including the SA-dependent gene PR1 and that of the negative regulator of the JA pathway JAZ8 was shown to be inhibited by WRKY40. To ensure defense-associated gene expression during pathogen attack, WRKY40 as a negative regulator must be removed to allow expression of defense genes. Preliminary work showed that WRKY40 is degraded via the 26S proteasome. The present study further confirmed that the T3E XopS leads to stabilization of WRKY40 protein by preventing its proteasomal degradation in a yet unexplained manner. The results from the work presented here suggest that stabilization of the negative regulator of immune responses WRKY40 by XopS leads to the manipulation of defense-associated gene expression, as well as a redirection of phytohormonal interactions, which in turn promotes the spread of Xcv on susceptible pepper plants. Another goal of this work was to identify other potential in planta interaction partners of XopS that might be relevant for its interaction with WRKY40 or for the deciphering of its mechanism of action. This identified the deubiquitinase UBP12 as another plant interaction partner of both XopS and WRKY40. UBP12 is able to modify the ubiquitination of substrate proteins and its function could thus represent a link between XopS and its interference with the proteasomal degradation of WRKY40. During a compatible Xcv-host interaction, virus-induced gene silencing of UBP12 resulted in reduced plant resistance to the pathogen Xcv, suggesting its positive regulatory effect during the immune response. Moreover, Western blot analyses showed that the protein WRKY40 accumulates upon down-regulation of UBP12 and that this accumulation is further enhanced by the presence of the T3E XopS. Further analysis on the biochemical characterization of the XopS/WRKY40/UBP12 interaction should be performed in the future to further elucidate the exact mode of action of the XopS T3E. KW - Xanthomonas campestris pv. vesicatoria KW - XopS KW - WRKY40 KW - Stomatäre Immunität KW - Proteasomaler Abbau KW - Xanthomonas campestris pv. vesicatoria KW - XopS KW - WRKY40 KW - stomatal immunity KW - proteasomal degradation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-525532 ER - TY - THES A1 - Finke, Hannah T1 - Toxicological Characterization of Arsenolipids in vitro and Analysis of Global DNA (Hydroxy)methylation in the Context of Aging, Trace Element Status, and Genomic Stability Y1 - 2020 ER - TY - THES A1 - Aleksandrova, Krasimira T1 - Understanding the link between obesity and colorectal cancer BT - the role of biomarkers of iflammation, immunity and metabolic dysfunction Y1 - 2020 ER - TY - JOUR A1 - Schwabe, Angelika A1 - Tischew, Sabine A1 - Bergmeier, Erwin A1 - Garve, Eckhard A1 - Härdtle, Werner A1 - Heinken, Thilo A1 - Hölzel, Norbert A1 - Peppler-Lisbach, Cord A1 - Remy, Dominique A1 - Dierschke, Hartmut T1 - Pflanzengesellschaft des Jahres 2020 BT - Borstgrasrasen JF - Tuexenia : Mitteilungen der Floristisch-Soziologischen Arbeitsgemeinschaft N2 - Wie erstmals 2019 wird auch für das Jahr 2020 von der „Floristisch-soziologischen Arbeitsgemeinschaft“ (FlorSoz) für Deutschland die „Pflanzengesellschaft des Jahres“ vorgestellt. Damit soll wiederum für die Öffentlichkeit die Notwendigkeit des Schutzes gefährdeter Pflanzengesellschaften aufgezeigt werden. Für das Jahr 2020 wurden die Borstgrasrasen ausgewählt. Wie alle Pflanzengemeinschaften nährstoffarmer Standorte, sind auch die Borstgrasrasen stark gefährdet und regional sogar unmittelbar vom Aussterben bedroht. Wir konzentrieren uns vor allem auf die Bestände der planaren bis montanen Stufe (Unterverband Violenion caninae: Hundsveilchen-Borstgrasrasen). Die Standorte von Violenion caninae-Gesellschaften werden nicht gedüngt und sind auf extensive Beweidung, z.T. auch auf einschürige Mahd angewiesen. Für Borstgrasrasen bezeichnend sind eine Fülle gefährdeter Pflanzenarten wie z.B. Arnica montana (Arnika) und Antennaria dioica (Zweihäusiges Katzenpfötchen). Bei den Borstgrasrasen spielen für die zunehmend hohe Gefährdung nicht nur Flächenrückgänge durch Nutzungsaufgabe, Aufforstung, Sport- und Freizeitaktivitäten und Überbauung eine Rolle, sondern auch Änderungen der Struktur und Artenzusammensetzung durch direkte Düngung sowie atmogene Stickstoffeinträge sind von Bedeutung. Nährstoffanreicherungen führen zum Verlust der konkurrenzschwachen, gefährdeten Arten zugunsten einiger allgemein verbreiteter, häufig dominanter Gräser sowie konkurrenzkräftiger Kräuter. Wir skizzieren die Bedeutung der Borstgrasrasen als gefährdete Lebensgemeinschaften, geben Hinweise zur floristisch-soziologischen Erforschung und zu weiteren Naturschutz-Aspekten (Rückgang, Erhaltung, Möglichkeiten der Restitution). Ein wirksamer Schutz ist nur bei einem integrativen Naturschutzansatz mit geeigneter Nutzung möglich. N2 - As for the first time in 2019 the ‘Floristisch-soziologische Arbeitsgemeinschaft (FlorSoz)’ intro-duces the ‘Plant Community of the Year 2020’ for Germany. The FlorSoz proposal aims to alert the public that the conservation of endangered plant communities and their biodiversity is essential.For the year 2020 the plant community of mat-grass swards (Nardus stricta grassland) has been selected. Similar to other plant communities on nutrient-poor sites, Nardus grassland is highly endan-gered and in some regions on the brink of extinction. We focus on Nardus grassland of the lowland to montane levels with the characteristic Violenion caninae suballiance (named after Viola canina,the Heath Dog-violet). The sites of Violenion caninae communities are not fertilized and depend on extensive grazing, but there are also mat-grass swards which are mown once a year. Nardus grasslands host many threatened species, e.g., Arnica montana (Arnica) and Antennaria dioica (Mountain Everlasting).The decline of Nardus grassland is not only due to abandonment, afforestation, outdoor activities and construction measures, but also due to changes in the structure and species composition through eutrophication by either direct manuring or by atmospheric nitrogen input. Eutrophication causes local decline or extinction of low-competitive, often endangered species which are replaced by ubiquists, mostly highly competitive species. For management, long-term conservation practices like extensive grazing or cutting once a year are essential. We give an outline of Nardus grassland as an endangered habitat type and summarize its current state of ecological and phytosociological research. In particular we take up the issue of conservation, including the loss of Nardus grasslands and their restoration. Effective conservation depends on an integrative nature-conservation approach, using suitable man-agement practices. Y1 - 2019 U6 - https://doi.org/10.14471/2019.39.017 SN - 0722-494X IS - 39 SP - 287 EP - 308 PB - Floristisch-soziologischen Arbeitsgemeinschaft e.V. CY - Göttingen ER - TY - GEN A1 - Dierschke, Hartmut A1 - Heinken, Thilo T1 - Vorwort T2 - Tuexenia : Mitteilungen der Floristisch-Soziologischen Arbeitsgemeinschaft Y1 - 2019 UR - https://www.tuexenia.de/publications/tuexenia/Tuexenia_2019_NS_039_0007-0007.pdf SN - 0722-494X IS - 39 SP - 7 EP - 7 PB - Floristisch-Soziologische Arbeitsgemeinschaft CY - Göttingen ER - TY - THES A1 - Zemella, Anne T1 - Fluoreszenzmarkierung und Modifizierung von komplexen Proteinen in eukaryotischen zellfreien Systemen durch die Etablierung von orthogonalen tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paaren T1 - Fluorescent labeling and modification of complex proteins in eukaryotic cell-free systems by establishing orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA-synthetase pairs N2 - Die funktionelle Charakterisierung von therapeutisch relevanten Proteinen kann bereits durch die Bereitstellung des Zielproteins in adäquaten Mengen limitierend sein. Dies trifft besonders auf Membranproteine zu, die aufgrund von zytotoxischen Effekten auf die Produktionszelllinie und der Tendenz Aggregate zu bilden, in niedrigen Ausbeuten an aktivem Protein resultieren können. Der lebende Organismus kann durch die Verwendung von translationsaktiven Zelllysaten umgangen werden- die Grundlage der zellfreien Proteinsynthese. Zu Beginn der Arbeit wurde die ATP-abhängige Translation eines Lysates auf der Basis von kultivierten Insektenzellen (Sf21) analysiert. Für diesen Zweck wurde ein ATP-bindendes Aptamer eingesetzt, durch welches die Translation der Nanoluziferase reguliert werden konnte. Durch die dargestellte Applizierung von Aptameren, könnten diese zukünftig in zellfreien Systemen für die Visualisierung der Transkription und Translation eingesetzt werden, wodurch zum Beispiel komplexe Prozesse validiert werden können. Neben der reinen Proteinherstellung können Faktoren wie posttranslationale Modifikationen sowie eine Integration in eine lipidische Membran essentiell für die Funktionalität des Membranproteins sein. Im zweiten Abschnitt konnte, im zellfreien Sf21-System, für den G-Protein-gekoppelten Rezeptor Endothelin B sowohl eine Integration in die endogen vorhandenen Endoplasmatisch Retikulum-basierten Membranstrukturen als auch Glykosylierungen, identifiziert werden. Auf der Grundlage der erfolgreichen Synthese des ET-B-Rezeptors wurden verschiedene Methoden zur Fluoreszenzmarkierung des Adenosin-Rezeptors A2a (Adora2a) angewandt und optimiert. Im dritten Abschnitt wurde der Adora2a mit Hilfe einer vorbeladenen tRNA, welche an eine fluoreszierende Aminosäure gekoppelt war, im zellfreien Chinesischen Zwerghamster Ovarien (CHO)-System markiert. Zusätzlich konnte durch den Einsatz eines modifizierten tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paares eine nicht-kanonische Aminosäure an Position eines integrierten Amber-Stopcodon in die Polypeptidkette eingebaut und die funktionelle Gruppe im Anschluss an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt werden. Aufgrund des offenen Charakters eignen sich zellfreie Proteinsynthesesysteme besonders für eine Integration von exogenen Komponenten in den Translationsprozess. Mit Hilfe der Fluoreszenzmarkierung wurde eine ligandvermittelte Konformationsänderung im Adora2a über einen Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer detektiert. Durch die Etablierung der Amber-Suppression wurde darüber hinaus das Hormon Erythropoetin pegyliert, wodurch Eigenschaften wie Stabilität und Halbwertszeit des Proteins verändert wurden. Zu guter Letzt wurde ein neues tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paar auf Basis der Methanosarcina mazei Pyrrolysin-Synthetase etabliert, um das Repertoire an nicht-kanonischen Aminosäuren und den damit verbundenen Kopplungsreaktionen zu erweitern. Zusammenfassend wurden die Potenziale zellfreier Systeme in Bezug auf der Herstellung von komplexen Membranproteinen und der Charakterisierung dieser durch die Einbringung einer positionsspezifischen Fluoreszenzmarkierung verdeutlicht, wodurch neue Möglichkeiten für die Analyse und Funktionalisierung von komplexen Proteinen geschaffen wurden. N2 - The functional characterization of therapeutically relevant proteins can be limited due to the provision of the target protein in adequate amounts. In particular membrane proteins belong to the so called “difficult-to-express” proteins because of possible cytotoxic side effects and a susceptibility to aggregation. The living organism can be circumvented by using cell lysates – the basic for cell-free protein synthesis. In the beginning of the thesis the ATP-dependent translation process in a cell lysate based on cultured insect (Sf21) cells was analyzed. For this purpose the translation of a nanoluciferase was regulated by the addition of an ATP-binding aptamer. The demonstrated application of aptamers in cell-free systems might enable a visualization of transcription and translation and following a potential validation process for high-throughput syntheses. In addition to the protein synthesis, factors such as posttranslational modifications and a correct integration into a lipid membrane are essential for the functionality of membrane proteins. Therefore, in the second part, integration of the G protein-coupled Endothelin receptor type B (ET-B) into the endogenous endoplasmic reticulum derived membranes and glycosylation were shown to be possible in a Sf21 cell-free system. Following to the successful synthesis of the ET-B receptor different fluorescent labeling strategies were applied to the adenosine receptor A2a (Adora2a). The first strategy applied precharged tRNAs, coupled to a fluorescently labeled amino acid, to the translation process in a Chinese Hamster Ovary cells (CHO) cell-free system. The second strategy utilized a modified tRNA/aminoacyl-tRNA-synthetase pair to incorporate a non-canonical amino acid at an integrated amber stop codon with a subsequently fluorescent labeling. The open character of cell-free systems enables a feasible integration of exogenous components into the translation process. The site-specific fluorescent labeling was the basis for the detection of a ligand-induced conformational change in the Adora2a by a bioluminescence resonance energy transfer. Additionally the amber suppression technique was transferred to the hormone Erythropoietin (EPO) to modify EPO´s stability and half-life period by coupling polyethylene glycol. Last but not least a novel tRNA/aminoacyl-tRNA-synthetase pair based on the Methanosarcina mazei pyrrolysine synthetase was developed to further increase the repertoire of non-canonical amino acids and copper-free click reactions. Summarizing in the present thesis the potentials of cell-free protein systems related to the synthesis of “difficult-to-express” proteins and the characterization of these proteins with site-specific fluorescence labeling are depicted, thereby establishing new methods for the analysis and functionalization of complex proteins. KW - Zellfreie Proteinsynthese KW - nicht-kanonische Aminosäuren KW - Klick-Chemie KW - Fluoreszenzmarkierung KW - GPCRs KW - Proteinmodifizierung KW - cell-free protein synthesis KW - non-canonical amino acids KW - click chemistry KW - fluorescent labeling KW - GPCRs KW - protein modification Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-442361 ER - TY - THES A1 - Schwuchow, Viola T1 - Charakterisierung der periplasmatischen Aldehyd-Oxidoreduktase (PaoABC) aus Escherichia coli N2 - Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen Analysen zur Charakterisierung der periplasmatischen Aldehyd Oxidoreduktase aus E. coli. Kinetische Untersuchungen mit Ferricyanid als Elektronenakzeptor unter anaeroben Bedingungen zeigten für dieses Enzym eine höhere Aktivität als unter aeroben Bedingungen. Die getroffene Hypothese, dass PaoABC fähig ist Elektronen an molekularen Sauerstoff weiter zu geben, konnte bestätigt werden. Für den Umsatz aromatischer Aldehyde mit molekularem Sauerstoff wurde ein Optimum von pH 6,0 ermittelt. Dies steht im Gegensatz zur Reaktion mit Ferricyanid, mit welchem ein pH-Optimum von 4,0 gezeigt wurde. Die Reaktion von PaoABC mit molekularem Sauerstoff generiert zwar Wasserstoffperoxid, die Produktion von Superoxid konnte dagegen nicht beobachtet werden. Dass aerobe Bedingungen einen Einfluss auf das Auslösen der Expression von PaoABC haben, wurde in dieser Arbeit ebenfalls ermittelt. Im Zusammenhang mit der Produktion von ROS durch PaoABC wurde die Funktion eines kürzlich in Elektronentransfer-Distanz zum FAD identifizierten [4Fe4S]-Clusters untersucht. Ein Austausch der für die Bindung des Clusters zuständigen Cysteine führte zur Instabilität der Proteinvarianten, weswegen für diese keine weiteren Untersuchungen erfolgten. Daher wird zumindest ein struktur-stabilisierender Einfluss des [4Fe4S]-Clusters angenommen. Zur weiteren Untersuchung der Funktion dieses Clusters, wurde ein zwischen FAD und [4Fe4S]-Cluster lokalisiertes Arginin gegen ein Alanin ausgetauscht. Diese Proteinvariante zeigte eine reduzierte Geschwindigkeit der Reaktion gegenüber dem Wildtyp. Die Bildung von Superoxid konnte auch hier nicht beobachtet werden. Die Vermutung, dass dieser Cluster einen elektronen-sammelnden Mechanismus unterstützt, welcher die Radikalbildung verhindert, kann trotz allem nicht ausgeschlossen werden. Da im Umkreis des Arginins weitere geladene und aromatische Aminosäuren lokalisiert sind, können diese den notwendigen Elektronentransfer übernehmen. Neben der Ermittlung eines physiologischen Elektronenakzeptors und dessen Einfluss auf die Expression von PaoABC zeigt diese Arbeit auch, dass die Chaperone PaoD und MocA während der Reifung des MCD-Kofaktor eine gemeinsame Bindung an PaoABC realisieren. Es konnte im aktiven Zentrum von PaoABC ein Arginin beschrieben werden, welches auf Grund der engen Nachbarschaft zum MCD-Kofaktor und zum Glutamat (PaoABC-EC692) am Prozess der Substratbindung beteiligt ist. Im Zusammenhang mit dem Austausch dieses Arginins gegen ein Histidin oder ein Lysin wurden die Enzymspezifität und der Einfluss physiologischer Bedingungen, wie pH und Ionenstärke, auf die Reaktion des Enzyms untersucht. Gegenüber dem Wildtyp zeigten die Varianten mit molekularem Sauerstoff eine geringere Affinität zum Substrat aber auch eine höhere Geschwindigkeit der Reaktion. Vor allem für die Histidin-Variante konnte im gesamten pH-Bereich ein instabiles Verhalten bestimmt werden. Der Grund dafür wurde durch das Lösen der Struktur der Histidin-Variante beschreiben. Durch den Austausch der Aminosäuren entfällt die stabilisierende Wirkung der delokalisierten Elektronen des Arginins und es kommt zu einer Konformationsänderung im aktiven Zentrum. Neben der Reaktion von PaoABC mit einer Vielzahl aromatischer Aldehyde konnte auch der Umsatz von Salicylaldehyd zu Salicylsäure durch PaoABC in einer Farbreaktion bestimmt werden. Durch Ausschluss von molekularem Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor, in einer enzym-gekoppelten Reaktion, erfolgte ein Elektronentransport auf Ferrocencarboxylsäure. Die Kombination aus beiden Methoden ermöglichte eine Verwendung von Ferrocen-Derivaten zur Generierung einer enzym-gekoppelten Reaktion mit PaoABC. Die Untersuchungen zu PaoABC zeigen, dass die Vielfalt der durch das Enzym katalysierten Rektionen weitere Möglichkeiten der enzymatischen Bestimmung biokatalytischer Prozesse bietet. KW - Eschericha coli KW - Periplasma KW - Aldehydoxidase KW - Aldehyd KW - Oxidoreduktase KW - Molybdän Y1 - 2019 ER - TY - BOOK ED - Berlin-Brandenburgisches Institut für Biodiverstätsforschung, T1 - Vielfalt in der Uckermark BT - Forschungsprojekte 2015 - 2018 Y1 - 2019 PB - oerding print GmbH CY - Braunschweig ER - TY - JOUR A1 - Maaß, Stefanie T1 - Blick in die Zukunft BT - wie werden sich Pflanzengemeinschaften in Brandenburg verändern? JF - Vielfalt in der Uckermark : Forschungsprojekte 2015 - 2018 Y1 - 2019 SP - 24 EP - 25 PB - oerding print GmbH CY - Braunschweig ER - TY - JOUR A1 - Wiebke, Ullmann T1 - Warum hat Bayern mehr Feldhasen als Brandenburg? JF - Vielfalt in der Uckermark : Forschungsprojekte 2015 - 2018 Y1 - 2019 SP - 46 EP - 47 PB - oerding print GmbH CY - Braunschweig ER - TY - JOUR A1 - Schäfer, Merlin T1 - Mut macht einsam BT - der Einfluss von Persönlichkeit auf das Zusammenleben von Tieren JF - Vielfalt in der Uckermark : Forschungsprojekte 2015 - 2018 Y1 - 2019 SP - 52 EP - 53 PB - oerding print GmbH CY - Braunschweig ER - TY - THES A1 - Gottmann, Pascal T1 - In silico Analyse zur Klärung der Beteiligung von micro-RNAs, die in QTL lokalisiert sind, an den metabolischen Erkrankungen Adipositas und Typ-2-Diabetes mit Hilfe von Mausmodellen Y1 - 2019 ER - TY - JOUR A1 - Reil, Daniela A1 - Binder, Florian A1 - Freise, Jona A1 - Imholt, Christian A1 - Beyrers, Konrad A1 - Jacob, Jens A1 - Krüger, Detlev H. A1 - Hofmann, Jörg A1 - Dreesman, Johannes A1 - Ulrich, Rainer Günter T1 - Hantaviren in Deutschland BT - Aktuelle Erkenntnisse zu Erreger, Reservoir, Verbreitung und Prognosemodellen JF - Berliner und Münchener tierärztliche Wochenschrift N2 - Hantaviruses are small mammal-associated pathogens that are found in rodents but also in shrews, moles and bats. Aim of this manuscript is to give a current overview of the epidemiology and ecology of hantaviruses in Germany and to discuss respective models for the prediction of virus outbreaks. In Germany the majority of human disease cases are caused by the Puumala virus (PUUV), transmitted by the bank vole (Myodes glareolus). PUUV is associated with the Western evolutionary lineage of the bank vole and is not present in the eastern and northern parts of Germany. A second human pathogenic hantavirus is the Dobrava-Belgrade virus (DOBV), genotype Kurkino; its reservoir host, the striped field mouse (Apodemus agrarius), is mostly occurring in the eastern part of Germany. A PUUV-related hantavirus is the rarely pathogenic Tula virus (TULV), that is associated with the common vole (Microtus arvalis). In addition, Seewis virus, Asikkala virus, and Bruges virus are shrew- and mole-associated hantaviruses with still unknown pathogenicity in humans. Human disease cases are associated with the different hantaviruses according to their regional distribution. The viruses can cause mild to severe but also subclinical courses of the respective disease. The number of human PUUV disease cases in 2007, 2010, 2012, 2015 and 2017 correlates with the occurrence of high levels of seed production of beech trees ("beech mast") in the preceding year. Models based on weather parameters for the prediction of PUUV disease clusters as developed in recent years need further validation and optimisation. in addition to the abundance of infected reservoir rodents, the exposure behaviour of humans affects the risk of human infection. The application of robust forecast models can assist the public health service to develop and communicate spatially and temporally targeted information. Thus, further recommendations to mitigate infection risk for the public may be provided. N2 - Hantaviren sind Kleinsäuger-assoziierte Krankheitserreger, die vor allem in Nagetieren, aber auch in Spitzmäusen, Maulwürfen und Fledermäusen vorkommen. Ziel dieser Arbeit ist es, einen aktuellen Überblick zur Epidemiologie und Ökologie der Hantaviren in Deutschland zu geben und Modelle zur Vorhersage von Virusausbrüchen zu diskutieren. In Deutschland werden die meisten humanen Erkrankungsfälle beim Menschen durch das von der Rötelmaus (Myodes glareolus) übertragene Puumalavirus (PUUV) verursacht. PUUV ist mit der westlichen evolutionären Linie der Rötelmaus assoziiert und fehlt im östlichen und nördlichen Teil Deutschlands. Ein zweites humanpathogenes Hantavirus ist das Dobrava-Belgrad-Virus (DOBV), Genotyp Kurkino, dessen Reservoir die vor allem im östlichen Teil Deutschlands vorkommende Brandmaus (Apodemus agrarius) ist. Ein PUUV-verwandtes Hantavirus ist das selten humanpathogene Tulavirus (TULV), das mit der Feldmaus (Microtus arvalis) assoziiert ist. Darüber hinaus wurden mit dem Seewis-, Asikkala- und Brugesvirus Spitzmaus- und Maulwurf-assoziierte Hantaviren mit noch unklarer Humanpathogenität gefunden. Die humanen Erkrankungen sind jeweils mit den verschiedenen Hantaviren in deren regionaler Verteilung assoziiert und können mild bis schwer, aber auch subklinisch verlaufen. Das Auftreten von Häufungen humaner, durch PUUV verursachter Erkrankungen in den Jahren 2007, 2010, 2012, 2015 und 2017 korreliert mit dem Auftreten einer starken Fruktifikation der Buche („Buchenmast“) im jeweiligen Vorjahr. Auf der Basis von Wetterparametern sind Modelle zur Vorhersage von PUUV-Erkrankungshäufungen entwickelt worden, die zukünftig validiert und optimiert werden müssen. Neben dem Ausmaß des Virusvorkommens im Reservoir wird das Risiko humaner Infektionen durch das Expositionsverhalten des Menschen beeinflusst. Durch die Anwendung von Prognosemodellen soll der öffentliche Gesundheitsdienst in die Lage versetzt werden, räumlich und zeitlich gezielte und sachgerechte Präventionsempfehlungen für die Bevölkerung abzugeben. T2 - Hantaviruses in Germany: current knowledge on pathogens, reservoirs, distribution and forecast models KW - early warning system KW - hantavirus KW - hantavirus disease KW - rodents KW - population dynamics KW - Frühwarn-System KW - Hantavirus KW - Hantavirus-Erkrankung KW - Nagetiere KW - Populationsdynamik Y1 - 2018 U6 - https://doi.org/10.2376/0005-9366-18003 SN - 0005-9366 SN - 1439-0299 VL - 131 IS - 11-12 SP - 453 EP - 464 PB - Schlütersche Verlagsgesellschaft mbH & Co. KG. CY - Hannover ER - TY - JOUR A1 - Tischew, Sabine A1 - Dierschke, Hartmut A1 - Schwabe, Angelika A1 - Garve, Eckhard A1 - Heinken, Thilo A1 - Holzel, Norbert A1 - Bergmeier, Erwin A1 - Remy, Dominique A1 - Haerdtle, Werner T1 - Pflanzengesellschaft des Jahres 2019: Die Glatthaferwiese T1 - Plant Community of the Year 2019: Oatgras Meadow JF - Tuexenia : Mitteilungen der Floristisch-Soziologischen Arbeitsgemeinschaft N2 - Um Themen des Schutzes von Pflanzengemeinschaften wirksamer in der breiten Öffentlichkeit zu kommunizieren wird der Vorstand der „Floristisch-Soziologischen Arbeitsgemeinschaft (FlorSoz)“ ab 2019 eine „Pflanzengesellschaft des Jahres“ ausrufen. Damit sollen politische und administrative Entscheidungs- und Umsetzungsprozesse zur Erhaltung der Vielfalt von Ökosystemen und Pflanzengesellschaften in Deutschlands gezielt unterstützt werden. Für das Jahr 2019 wurde die Glatthaferwiese ausgewählt. Sie zählt aktuell zu den durch Artenverarmung und Flächenrückgang besonders bedrohten Pflanzengesellschaften Deutschlands. Es sind deshalb dringend Maßnahmen zum Schutz und zur Wiederherstellung notwendig. Dieser Artikel gibt einen kurzen Überblick zur naturschutzfachlichen Bedeutung von Glatthaferwiesen und deren Ökosystemleistungen sowie zur floristisch-soziologischen Erforschung, zu Ursachen ihres Rückgangs und zu geeigneten Gegenmaßnahmen. N2 - Aiming at a better promotion of topics related to the conservation of ecosystems and plant communities, the board of the Floristisch-Soziologische Arbeitsgemeinschaft (FlorSoz)" has launched the initiative to announce a "Plant Community of the Year". Therewith we hope to raise awareness and stimulate civil society and politics in promoting more efficient conservation strategies. For the forthcoming year, we choose the oatgras meadow as Plant Community of the Year 2019. These lowland hay meadows belong to the most threatened plant communities in Germany. Concepts and schemes aiming at the conservation and restoration of lowland hay meadows are urgently needed. This article provides a short overview of the high nature-conservation value of lowland hay meadows and their ecosystem services as well as of the floristic-phytosociological research, reasons for their sharp decline and appropriate countermeasures. Y1 - 2018 U6 - https://doi.org/10.14471/2018.38.011 SN - 0722-494X IS - 38 SP - 287 EP - 295 PB - Floristisch-Soziologische Arbeitsgemeinschaft CY - Göttingen ER - TY - THES A1 - Danckert, Lena T1 - Immunscreening Virulenz-adaptierter Expressionsbibliotheken aus einem in vitro Infektionsmodell mit Salmonella Enteritidis T1 - Immunoscreening of virulence adapted expressionlibraries of an in vitro infection model with salmonella enteritidis N2 - Die Folgen einer lebensmittelbedingten Erkrankung sind zum Teil gravierend, insbesondere für Kinder und immunsupprimierte Menschen. Hierbei gehören Salmonella und Campylobacter zu den häufigsten Erregern, die verantwortlich für gastrointestinale Erkrankungen in Deutschland sind. Trotz umfassender Maßnahmen der EU zur Prävention und Bekämpfung von Salmonellen in Geflügelbeständen und der Lebensmittel-Industrie, wird von einem stagnierenden Trend von Infektionszahlen berichtet. Zoonose-Erreger wie Salmonellen können über Nutztiere in die Nahrungskette des Menschen gelangen, wodurch sich Infektionsherde schnell ausbreiten können. Dabei sind bestehende Präventionsstrategien für Geflügel vorhanden, die aber nicht auf den Menschen übertragbar sind. Folglich sind Diagnostik und Prävention in der Lebensmittelindustrie essentiell. Deshalb besteht ein hoher Bedarf für spezifische, sensitive und zuverlässige Nachweismethoden, die eine Point-of-care Diagnostik gewährleisten. Durch ein wachsendes Verständnis der wirtsspezifischen Faktoren von S. enterica Serovaren kann die Entwicklung sowohl neuartiger diagnostischer Methoden, als auch neuartiger Therapien und Impfstoffe maßgeblich vorangetrieben werden. Infolgedessen wurde in dieser Arbeit ein infektionsähnliches in vitro Modell für S. Enteritidis etabliert und darauf basierend eine umfassende Untersuchung zur Identifizierung neuer Zielstrukturen für den Erreger durchgeführt. Während einer Salmonellen-Infektion ist die erste zelluläre Barriere im Wirt die Epithelschicht. Dementsprechend wurde eine humane Zelllinie (CaCo 2, Darmepithel) für die Pathogen-Wirt-Studie ausgewählt. Das Salmonellen-Transkriptom und morphologische Eigenschaften der Epithelzellen wurden in verschiedenen Phasen der Salmonellen-Infektion untersucht und mit bereits gut beschriebenen Virulenzfaktoren und Beobachtungen in Bezug gesetzt. Durch dieses Infektionsmodell konnte ein spezifischer Phänotyp für die intrazellulären Salmonellen in den Epithelzellen nachgewiesen werden. Zudem wurde aufgezeigt, dass bereits die Kultivierung in Flüssigmedium einen invasionsaktiven Zustand der Salmonellen erzeugt. Allerdings wurde durch die Kokultivierung mit Epithelzellen eine zusätzliche Expression relevanter Gene induziert, um eine effiziente Adhäsion und Transmembran-Transport zu gewährleisten. Letzterer ist charakteristisch für die intrazelluläre Limitierung von Nährstoffen und prägt den infektionsrelevanten Status. Unter Berücksichtigung dieser Faktoren ergab sich ein Phänotyp, der eindeutig Mechanismen zur Wirtsadaptation und möglicherweise auch Pathogenese aufzeigt. Die intrazellulären Bakterien müssen vom Wirt separiert werden, was ein wesentlicher Schritt für Pathogen-bestimmende Analysen ist. Hierbei wurde mithilfe einer Detergenz-basierten Lyse der eukaryotischen Zellmembran und differentieller Zentrifugation, der eukaryotische Eintrag minimal gehalten. Unter Verwendung der Virulenz-adaptierten Salmonellen wurden Untersuchungen in Hinblick auf die Identifizierung neuer Zielstrukturen für S. Enteritidis durchgeführt. Mithilfe eines immunologischen Screenings wurden neue potentielle Antigene entdeckt. Zu diesem Zweck wurden bakterielle cDNA-basierte Expressionsbibliotheken hergestellt, die durch eine vereinfachte Microarray-Anwendung ein Hochdurchsatzscreening von Proteinen als potentielle Binder ermöglichen. Folglich konnten neue unbeschriebene Proteine identifiziert werden, die sich durch eine Salmonella-Spezifität oder Membranständigkeit auszeichnen. Ebenso wurde ein Vergleich der im Screening identifizierten Proteine mit der Regulation der kodierenden Gene im infektionsähnlichen Modell durchgeführt. Dabei wurde deutlich, dass die Häufigkeit von Transkripten einen Einfluss auf die Verfügbarkeit in der cDNA-Bibliothek und folglich auch auf die Expressionsbibliothek nimmt. Angesichts eines Ungleichgewichts zwischen der Gesamtzahl protein-kodierender Gene in S. Enteritidis zu möglichen Klonen, die während des Microarray-Screenings untersucht werden können, besteht der Bedarf einer Anreicherung von Proteinen in der Expressionsbibliothek. Das infektionsähnliche Modell zeigte, dass nicht nur Virulenz-assoziierte, sondern auch Stress- und Metabolismus-relevante Gene hochreguliert werden. Durch die Konstruktion dieser spezifischen cDNA-Bibliotheken ist die Erkennung von charakteristischen molekularen Markern gegeben. Weiterhin wurden anhand der Transkriptomanalyse spezifisch hochregulierte Gene identifiziert, die relevant für das intrazelluläre Überleben von S. Enteritidis in humanen Epithelzellen sind. Hiervon wurden drei Gene näher untersucht, indem ihr Einfluss im infektionsähnlichen Modell mittels entsprechender Gen-Knockout-Stämme analysiert wurde. Dabei wurde für eine dieser Mutanten ein reduziertes Wachstum in der späten intrazellulären Phase nachgewiesen. Weiterführende in vitro Analysen sind für die Charakterisierung des Knockout-Stamms notwendig, um den Einsatz als potenzielles Therapeutikum zu verifizieren. Zusammenfassend wurde ein in vitro Infektionsmodell für S. Enteritidis etabliert, wodurch neue Zielstrukturen des Erregers identifiziert wurden. Diese sind für diagnostische oder therapeutische Anwendungen interessant. Das Modell lässt sich ebenso für andere intrazelluläre Pathogene übertragen und gewährleistet eine zuverlässige Identifizierung von potentiellen Antigenen. N2 - The outcomes of food-borne diseases are in part severe, especially for children and immunocompromised people. Salmonella and Campylobacter are among the most common pathogens responsible for gastrointestinal diseases in Germany. Despite the comprehensive EU efforts to prevent and control salmonella in poultry flocks and the food industry, a trend of stagnating outbreaks is reported. Zoonotic agents like salmonella can enter the human food chain through livestock, allowing colonies to spread rapidly. There are existing prevention strategies for poultry, but they are not transferable to humans. Consequently, diagnostics and prevention are essential in the food industry. Therefore, a high demand exists for specific, sensitive and reliable detection methods that guarantee point-of-care diagnostics. Through a growing understanding of the host-specific factors of S. enterica serovars, the development of novel diagnostic methods as well as novel therapies and vaccines can be significantly advanced. As a result, an infection-like in vitro model for S. Enteritidis was established and a comprehensive study was conducted to identify new target structures for the pathogen. During a salmonella infection, the first cellular barrier in the host is the epithelial layer. Accordingly, a human cell line (CaCo-2, intestinal epithelium) was selected for the pathogen-host study. The salmonella transcriptome and morphological properties of epithelial cells were studied at different stages of salmonella infection and were compared with well-described virulence factors and findings. Through this infection model, a specific phenotype for intracellular salmonella in epithelial cells could be detected. In addition, it was shown that cultivation in liquid medium already induces an invasion-active state of salmonella. However, co-cultivation with epithelial cells induced additional expression of specific genes to ensure efficient adhesion and transport of the membrane. The latter is characteristic for the intracellular limitation of nutrients and determines the infection-relevant status. Taking these factors into account, a phenotype with clear mechanisms for host adaptation and also potentially pathogenesis was observed. The intracellular bacteria must be separated from the host, which is an essential step for pathogen-determined analyses. With the help of detergent-based lysis of the eukaryotic cell membrane and differential centrifugation, the eukaryotic input was kept to a minimum. Using virulence-adapted Salmonella RNA, experiments were conducted to identify new target structures for S. Enteritidis. With the help of immunological screening, new potential antigens were discovered. For this purpose, bacterial cDNA-based expression libraries were created that enable high-throughput protein screening through a simplified microarray application providing potential binders. Consequently, new undescribed proteins characterised by salmonella specificity or membrane origin could be identified. A comparison of the identified screening proteins with the regulation of the coding genes in the infection-like model was also carried out. It became clear that the frequency of transcripts has an influence on their availability in the cDNA library and consequently also on the expression library. Given an imbalance between the total number of protein-coding genes in S. Enteritidis and possible clones that can be tested during microarray screening, there is a need for protein enrichment in the expression library. The infection-like model showed that not only genes associated with virulence but also genes relevant to stress and metabolism are upregulated. The construction of such specific cDNA libraries enables the recognition of characteristic molecular markers. Furthermore, transcriptome analysis was used to identify specifically up-regulated genes that are relevant for the intracellular survival of S. Enteritidis in human epithelial cells. Three of these genes were investigated in more detail by examining their influence in the infection-like model using corresponding gene knockout strains. For one of these mutants, reduced growth in the late intracellular phase was proven. Further in vitro analyses are necessary for the characterization of the knockout strain in order to verify its use as a potential therapeutic agent. In summary, an in vitro infection model for S. Enteritidis was established, which revealed new target structures of the pathogen. These are interesting for diagnostic or therapeutic applications. The model can also be transferred to other intracellular pathogens and provides reliable identification of potential antigens. KW - Diagnostik KW - Immunscreening KW - Salmonellen KW - diagnostic KW - immunoscreening KW - salmonella Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-421108 ER - TY - THES A1 - Bühning, Martin T1 - Charakterisierung des Zusammenspiels von FeS-Cluster-Assemblierung, Molybdänkofaktor-Biosynthese und tRNA-Thiolierung in Escherichia coli Y1 - 2018 ER - TY - THES A1 - Kammel, Anne T1 - Identifizierung früher epigenetischer Veränderungen, die zur Ausbildung einer Fettleber beitragen Y1 - 2018 ER - TY - THES A1 - Schwanhold, Nadine T1 - Die Funktion und Spezifität der Molybdän-Cofaktor-bindenden Chaperone für die Formiat-Dehydrogenasen aus Escherichia coli und Rhodobacter capsulatus Y1 - 2018 ER - TY - THES A1 - Albers, Philip T1 - Funktionelle Charakterisierung des bakteriellen Typ-III Effektorproteins HopZ1a in Nicotiana benthamiana T1 - Functional characterization of the bacterial type-III effector protein HopZ1a in Nicotiana benthamiana N2 - Um das Immunsystem der Pflanze zu manipulieren translozieren gram-negative pathogene Bakterien Typ-III Effektorproteine (T3E) über ein Typ-III Sekretionssystem (T3SS) in die pflanzliche Wirtszelle. Dort lokalisieren T3Es in verschiedenen subzellulären Kompartimenten, wo sie Zielproteine modifizieren und so die Infektion begünstigen. HopZ1a, ein T3E des Pflanzenpathogens Pseudomonas syringae pv. syringae, ist eine Acetyltransferase und lokalisiert über ein Myristolierungsmotiv an der Plasmamembran der Wirtszelle. Obwohl gezeigt wurde, dass HopZ1a die frühe Signalweiterleitung an der Plasmamembran stört, wurde bisher kein mit der Plasmamembran assoziiertes Zielprotein für diesen T3E identifiziert. Um bisher unbekannte HopZ1a-Zieleproteine zu identifizieren wurde im Vorfeld dieser Arbeit eine Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung mit einer cDNA-Bibliothek aus Tabak durchgeführt, wobei ein nicht näher charakterisiertes Remorin als Interaktor gefunden wurde. Bei dem Remorin handelt es sich um einen Vertreter der Gruppe 4 der Remorin-Familie, weshalb es in NbREM4 umbenannt wurde. Durch den Einsatz verschiedener Interaktionsstudien konnte demonstriert werden, dass HopZ1a mit NbREM4 in Hefe, in vitro und in planta wechselwirkt. Es wurde ferner deutlich, dass HopZ1a auf spezifische Weise mit dem konservierten C-Terminus von NbREM4 interagiert, das Remorin jedoch in vitro nicht acetyliert. Analysen mittels BiFC haben zudem ergeben, dass NbREM4 in Homodimeren an der Plasmamembran lokalisiert, wo auch die Interaktion mit HopZ1a stattfindet. Eine funktionelle Charakterisierung von NbREM4 ergab, dass das Remorin eine spezifische Rolle im Immunsystem der Pflanze einnimmt. Die transiente Expression in N. benthamiana induziert die Expression von Abwehrgenen sowie einen veränderten Blattphänotyp. In A. thaliana wird HopZ1a über das Decoy ZED1 und das R-Protein ZAR1 erkannt, was zur Auslösung einer starken Hypersensitiven Antwort (HR von hypersensitive response) führt. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass ZAR1 in N. benthamiana konserviert ist, NbREM4 jedoch nicht in der ETI als Decoy fungiert. Mit Hilfe einer Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung mit NbZAR1 als Köder konnten zwei Proteine, die Catalase CAT1 und der Protonenpumpeninteraktor PPI1, als Interaktoren von NbZAR1 identifiziert werden, welche möglicherweise in der Regulation der HR eine Rolle spielen. Aus Voruntersuchungen war bekannt, dass NbREM4 mit weiteren, nicht näher charakterisierten Proteinen aus Tabak interagieren könnte. Eine phylogenetische Einordnung hat gezeigt, dass es sich um die bekannte Immun-Kinase PBS1 sowie zwei E3-Ubiquitin-Ligasen, NbSINA1 und NbSINAL3, handelt. PBS1 interagiert mit NbREM4 an der Plasmamembran und phosphoryliert das Remorin innerhalb des intrinsisch ungeordneten N-Terminus. Mittels Massenspektrometrie konnten die Serine an Position 64 und 65 innerhalb der Aminosäuresequenz von NbREM4 als PBS1-abhängige Phosphorylierungsstellen identifiziert wurden. NbSINA1 und NbSINAL3 besitzen in vitro Ubiquitinierungsaktivität, bilden Homo- und Heterodimere und interagieren ebenfalls mit dem N-terminalen Teil von NbREM4, wobei sie das Remorin in vitro nicht ubiquitinieren. Aus den in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass der bakterielle T3E HopZ1a gezielt mit dem Tabak-Remorin NbREM4 an der Plasmamembran interagiert und über einen noch unbekannten Mechanismus mit dem Immunsystem der Pflanze interferiert, wobei NbREM4 möglicherweise eine Rolle als Adapter- oder Ankerprotein zukommt, über welches HopZ1a mit weiteren Immunkomponenten interagiert. NbREM4 ist Teil eines größeren Immunnetzwerkes, zu welchem die bekannte Immun-Kinase PBS1 und zwei E3-Ubiquitin-Ligasen gehören. Mit NbREM4 konnte damit erstmalig ein membranständiges Protein mit einer Funktion im Immunsystem der Pflanze als Zielprotein von HopZ1a identifiziert werden. N2 - In order to manipulate the plant's immune system, gram-negative pathogenic bacteria inject type-III effector proteins (T3E) via a type III secretion system (T3SS) into the plant host cell. Inside the cell, T3Es localize to different subcellular compartments, where they modify target proteins and thereby promote the infection. HopZ1a, a T3E of the plant pathogen Pseudomonas syringae pv. syringae is an acetyltransferase and localizes to the plasma membrane. Although it has been shown that HopZ1a interferes with early signal transduction at the plasma membrane, no dedicated plasma membrane-associated target protein has been identified so far. To identify unknown HopZ1a target proteins, a yeast two-hybrid screening using a cDNA library from tobacco was performed in advance of this work. The screen identified a previously uncharacterized remorin-family protein as a putative interactor of HopZ1a. Using phylogenetic analyses, the remorin could be classified as a group 4 remorin family member and therefore was renamed NbREM4. By using different interaction studies, it has could be demonstrated that HopZ1a interacts with NbREM4 in yeast, in vitro, and in planta. It also became evident that HopZ1a specifically interacts with the conserved C-terminus of NbREM4 but does not acetylate it. BiFC analyses showed that NbREM4 localizes in homodimers at the plasma membrane, and NbREM4 interacts with HopZ1a in this subcellular compartment. From preliminary studies it was known that NbREM4 may interact with other uncharacterized proteins from tobacco. A phylogenetic analysis revealed the immune kinase NbPBS1 and two E3 ubiquitin ligases, NbSINA1 and NbSINAL3, as putative NbREM4 interacting proteins. Analysis showed that NbPBS1 interacts with NbREM4 at the plasma membrane and phosphorylates the Remorin within the intrinsically disordered N-terminus. By means of mass spectrometry, serines at position 64 and 65 within the amino acid sequence of NbREM4 were identified as PBS1-dependent phosphorylation sites. NbSINA1 and NbSINAL3 have in vitro ubiquitination activity and also interact with the N-terminal part of NbREM4, but do not ubiquitinate it. It has already been shown that, in Arabidopsis thaliana, HopZ1a is recognized by the R protein ZAR1. In the presence of the effector, ZAR1 induces a strong hypersensitive response (HR) of the cell. In this study it could be confirmed that ZAR1 is conserved in Nicotiana benthamiana and is also responsible for the recognition of HopZ1a. In addition, a yeast two-hybrid screen revealed the catalase CAT1 and the proton pump interactor PPI1 as putative NbZAR1-interacting proteins, possibly contributing to the downstream activation of HR. From the results obtained in this work, it can be deduced that the bacterial T3E HopZ1a specifically interacts with the Remorin NbREM4 at the plasma membrane and interferes with the immune system via a yet unknown mechanism. NbREM4 is part of a larger immune network that includes NbPBS1 and two E3 ligases. With NbREM4, the first membrane-associated target protein of HopZ1a could have been identified. KW - Pseudomonas syringae KW - Remorin KW - HopZ1a KW - PBS1 KW - pflanzliches Immunsystem KW - Pseudomonas syringae KW - Remorin KW - HopZ1a KW - PBS1 KW - plant immune system Y1 - 2018 ER - TY - THES A1 - Meyer, Susann T1 - Wirkung und Wirkungsweise von Ectoin auf DNA-Moleküle Y1 - 2018 ER - TY - THES A1 - Bertz, Martin T1 - Funktion von Selenoproteinen  während der kolorektalen Karzinogenese T1 - The role of selenoproteins in colorectal carcinogenesis N2 - Kolorektalkrebs (CRC) ist die dritthäufigste Tumorerkrankung weltweit. Neben dem Alter spielt auch die Ernährung eine wichtige Rolle bei der Entstehung der Krankheit. Eine vermutlich krebspräventive Wirkung wird dabei dem Spurenelement Selen zugeschrieben, das fast ausschließlich über Lebensmittel aufgenommen wird. So hängt beispielsweise ein niedriger Selenstatus mit dem Risiko, im Laufe des Lebens an CRC zu erkranken, zusammen. Seine Funktionen vermittelt Selen dabei überwiegend durch Selenoproteine, in denen es in Form von Selenocystein eingebaut wird. Zu den bisher am besten untersuchten Selenoproteinen mit möglicher Funktion während CRC zählen die Glutathionperoxidasen (GPXen). Die Mitglieder dieser Familie tragen aufgrund ihrer Hydroperoxid-reduzierenden Eigenschaften entscheidend zum Schutz der Zellen vor oxidativem Stress bei. Dies kann je nach Art und Stadium des Tumors entweder krebshemmend oder -fördernd wirken, da auch transformierte Zellen von dieser Schutzfunktion profitieren. In dieser Arbeit wurde die GPX2 in HT29-Darmkrebszellen mithilfe stabil-transfizierter shRNA herunterreguliert, um die Funktion des Enzyms vor allem in Hinblick auf regulierte Signalwege zu untersuchen. Ein Knockdowns (KD) der strukturell ähnlichen GPX1 kam ebenfalls zum Einsatz, um gezielt Isoform-spezifische Funktionen unterscheiden zu können. Anhand eines PCR-Arrays wurden Signalwege identifiziert, die auf einen Einfluss der beiden Proteine im Zellwachstum hindeuteten. Anschließende Untersuchungen ließen auf einen verminderten Differenzierungsstatus in den GPX1- und GPX2-KDs aufgrund einer geringeren Aktivität der Alkalischen Phosphatase schließen. Zudem war die Zellviabilität im Neutralrot-Assay (NRU) bei Fehlen der GPX1 bzw. GPX2 im Vergleich zur Kontrolle reduziert. Die Ergebnisse des PCR-Arrays, und speziell für die GPX2 frühere Untersuchungen der Arbeitsgruppe, wiesen weiterhin auf eine Rolle der beiden Proteine in der entzündungsgetriebenen Karzinogenese hin. Daher wurden auch mögliche Interaktionen mit dem NFκB-Signalweg analysiert. Eine Stimulation der Zellen mit dem proinflammatorischen Zytokin IL1β ging mit einer verstärkten Aktivierung der MAP-Kinasen ERK1/2 in den Zellen mit GPX1- bzw. GPX2-KD einher. Die gleichzeitige Behandlung mit dem Antioxidans NAC führte nicht zur Rücknahme der Effekte in den KDs, sodass möglicherweise nicht nur die antioxidativen Eigenschaften der Enzyme bei der Interaktion mit diesen Signalwegsproteinen relevant sind. Weiterhin wurden Analysen zum Substratspektrum der GPX2 in HCT116-Zellen mit einer Überexpression des Proteins durchgeführt. Dabei zeigte sich mittels NRU-Assay und DNA-Laddering, dass die GPX2 besonders vor den proapoptotischen Effekten einer Behandlung mit den Lipidhydroperoxiden HPODE und HPETE schützt. Im Gegensatz zur GPX2 lässt sich Selenoprotein H (SELENOH) stärker durch die alimentäre Selenzufuhr beeinflussen. Einer möglichen Nutzung als Biomarker oder gar als Ansatzpunkt bei der Prävention bzw. Behandlung von CRC steht allerdings unvollständiges Wissen über die Funktion des Proteins gegenüber. Zur genaueren Charakterisierung von SELENOH wurden daher stabil-transfizierte KD-Klone in HT29- und Caco2-Zellen hergestellt und zunächst auf ihre Tumorigenität untersucht. Zellen mit SELENOH-KD bildeten mehr und größere Kolonien im Soft Agar und zeigten ein erhöhtes Proliferations- und Migrationspotenzial im Vergleich zur Kontrolle. Ein Xenograft in Nacktmäusen resultierte zudem in einer stärkeren Tumorbildung nach Injektion von KD-Zellen. Untersuchungen zur Beteiligung von SELENOH an der Zellzyklusregulation deuten auf eine hemmende Rolle des Proteins in der G1/S-Phase hin. Die weiterhin beobachtete Hochregulation von SELENOH in humanen Adenokarzinomen und präkanzerösem Mausgewebe lässt sich möglicherweise mit der postulierten Schutzfunktion vor oxidativen Zell- und DNA-Schäden erklären. In gesunden Darmepithelzellen war das Protein vorrangig am Kryptengrund lokalisiert, was zu einer potenziellen Rolle während der gastrointestinalen Differenzierung passt. N2 - Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer worldwide. In addition to age, diet also plays an important role in the onset of the disease. The trace element selenium, which is absorbed almost exclusively from food, has been accredited with a cancer-preventive effect. For instance, a low selenium status is associated with the risk of developing CRC. The biological functions of selenium are predominantly mediated by selenoproteins, in which the element is incorporated in the form of selenocysteine. Glutathione peroxidases (GPXs) are among the most studied selenoproteins with potential functions during CRC. The members of this family are crucial for protecting cells from oxidative stress due to their hydroperoxide- reducing properties. These properties can either be anti- or procarcinogenic, depending on the type and stage of the tumor, since transformed cells may also benefit from this protection. In the course of this thesis, GPX2 was downregulated in HT29 colon cancer cells using stably transfected shRNA to investigate the proteins’ function, with particular respect to potentially regulated signaling pathways. A knockdown (KD) of the structurally similar GPX1 was also utilised to discriminate between isoform-specific effects. Signaling pathways related to cell growth were shown to be influenced by the KDs in a PCR array. Subsequent studies revealed a decreased differentiation status (lower activity of the enzyme alkaline phosphatase) in cells lacking GPX1 or GPX2. In addition, cell viability was reduced in the absence of either protein compared to the control when testing the neutral red uptake (NRU). Results of the PCR array as well as earlier findings of our research group suggested a role of both GPX1 and GPX2 in inflammation-driven carcinogenesis. Therefore, potential interactions with the NFκB signaling pathway were analyzed. Treatment using the proinflammatory cytokine IL1β was accompanied by an increased activation of the MAP kinases ERK1/2 in cells with a KD of GPX1 and GPX2, respectively. Concomitant administration of the antioxidant NAC did not reverse the observed effects, indicating that maybe not only the antioxidant properties of the enzymes were relevant for the interaction with these signaling proteins. Also, the substrate spectrum of GPX2 was analysed in HCT116 cells overexpressing the enzyme. By means of NRU assay and DNA laddering it was shown that GPX2 preferably protected cancer cells against the proapoptotic effects of the lipid hydroperoxides HPODE and HPETE. In contrast to GPX2, selenoprotein H (SELENOH) might be more easily influenced by the selenium content in the diet. Due to incomplete knowledge about the function of the protein, a prospective use as a biomarker or even as a target in the prevention or treatment of CRC has not been feasible. Therefore, stably transfected SELENOH-KD clones in HT29 and Caco2 cells were created to further characterise the protein. Interestingly, SELENOH-KD cells formed more and larger colonies in soft agar assay and showed increased proliferation as well as migration potential compared to control cells. Injecting tumour cells into nude mice resulted in larger tumour growth with the protein being knocked down. SELENOH was further shown to regulate the cell cycle by potentially inhibiting the transition from G1 to S phase. The observed upregulation of SELENOH in human adenocarcinomas and precancerous mouse tissue was consistent with the postulated role of the protein in protecting cells from oxidative DNA damage. In healthy intestinal epithelial cells, the protein was located predominantly at the crypt base, suggesting a function during gastrointestinal differentiation. KW - GPX KW - Selen KW - SELENOH KW - CRC KW - Darmkrebs KW - glutathione peroxidase KW - selenium KW - SELENOH KW - CRC KW - colorectal cancer Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-427808 ER - TY - THES A1 - Zhang, Yunming T1 - Understanding the functional specialization of poly(A) polymerases in Arabidopsis thaliana Y1 - 2018 ER - TY - THES A1 - Neuber, Corinna T1 - Analytik zur Biotransformation des Sphingosin 1-phosphat-abbauproduktes (2E)-Hexadecenal Y1 - 2017 ER - TY - THES A1 - Fischbach, Jens T1 - Isothermale Amplifikationsmethoden für den DNA- und Pyrophosphat-abhängigen Pathogennachweis T1 - Isothermal amplification methods for DNA- and pyrophophate based pathogen detection N2 - Hintergrund: Etablierte Protein- und Nukleinsäure-basierte Methoden für den spezifischen Pathogennachweis sind nur unter standardisierten Laborbedingungen von geschultem Personal durchführbar und daher mit einem hohen Zeit- und Kostenaufwand verbunden. In der Nukleinsäure-basierten Diagnostik kann durch die Einführung der isothermalen Amplifikation eine schnelle und kostengünstige Alternative zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden. Die Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) bietet aufgrund der hohen Amplifikationseffizienz vielfältige Detektionsmöglichkeiten, die sowohl für Schnelltest- als auch für Monitoring-Anwendungen geeignet sind. Ein wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung der Anwendbarkeit der LAMP und die Entwicklung einer neuen Methode für den einfachen, schnellen und günstigen Nachweis von Pathogenen mittels alternativer DNA- oder Pyrophosphat-abhängiger Detektionsverfahren. Hier wurden zunächst direkte und indirekte Detektionsmethoden untersucht und darauf aufbauend ein Verfahren entwickelt, mit dem neue Metallionen-abhängige Fluoreszenzfarbstoffe für die selektive Detektion von Pyrophosphat in der LAMP und anderen enzymatischen Reaktionen identifiziert werden können. Als Alternative für die DNA-basierte Detektion in der digitalen LAMP sollten die zuvor etablierten Farbstoffe für den Pyrophosphatnachweis in einer Emulsion getestet werden. Abschließend wurde ein neuer Reaktionsmechanismus für die effiziente Generierung hochmolekularer DNA unter isothermalen Bedingungen als Alternative zur LAMP entwickelt. Ergebnisse: Für den Nachweis RNA- und DNA-basierter Phythopathogene konnte die Echtzeit- und Endpunktdetektion mit verschiedenen Farbstoffen in einem geschlossenen System etabliert werden. Hier wurde Berberin als DNA-interkalierender Fluoreszenzfarbstoff mit vergleichbarer Sensitivität zu SYBR Green und EvaGreen erfolgreich in der LAMP mit Echtzeitdetektion eingesetzt. Ein Vorteil von Berberin gegenüber den anderen Farbstoffen ist die Toleranz der DNA-Polymerase auch bei hohen Farbstoffkonzentrationen. Berberin kann daher auch in der geschlossenen LAMP-Reaktion ohne zusätzliche Anpassung der Reaktionsbedingungen für die Endpunktdetektion verwendet werden. Darüber hinaus konnte Hydroxynaphtholblau (HNB), das für den kolorimetrischen Endpunktnachweis bekannt ist, erstmals auch für die fluorimetrische Detektion der LAMP in Echtzeit eingesetzt werden. Zusätzlich konnten in der Arbeit weitere Metallionen-abhängige Farbstoffe zur indirekten Detektion der LAMP über das Pyrophosphat identifiziert werden. Dafür wurde eine iterative Methode entwickelt, mit der potenzielle Farbstoffe hinsichtlich ihrer Enzymkompatibilität und ihrer spektralen Eigenschaften bei An- oder Abwesenheit von Manganionen selektiert werden können. Mithilfe eines kombinatorischen Screenings im Mikrotiterplattenformat konnte die komplexe Konzentrationsabhängigkeit zwischen den einzelnen Komponenten für einen fluorimetrischen Verdrängungsnachweis untersucht werden. Durch die Visualisierung des Signal-Rausch-Verhältnis’ als Intensitätsmatrix (heatmap) konnten zunächst Alizarinrot S und Tetrazyklin unter simulierten Reaktionsbedingungen selektiert werden. In der anschließenden enzymatischen LAMP-Reaktion konnte insbesondere Alizarinrot S als günstiger, nicht-toxischer und robuster Fluoreszenzfarbstoff identifiziert werden und zeigte eine Pyrophosphat-abhängige Zunahme der Fluoreszenzintensität. Die zuvor etablierten Farbstoffe (HNB, Calcein und Alizarinrot S) konnten anschließend erfolgreich für die indirekte, fluorimetrische Detektion von Pyrophosphat in einer LAMP-optimierten Emulsion eingesetzt werden. Die Stabilität und Homogenität der generierten Emulsion wurde durch den Zusatz des Emulgators Poloxamer 188 verbessert. Durch die fluoreszenzmikroskopische Analyse der Emulsion war eine eindeutige Diskriminierung der positiven und negativen Tröpfchen vor allem bei Einsatz von Calcein und Alizarinrot S möglich. Aufgrund des komplexen Primer-Designs und der hohen Wahrscheinlichkeit unspezifischer Amplifikation in der LAMP wurde eine neue Bst DNA-Polymerase-abhängige isothermale Amplifikationsreaktion entwickelt. Durch die Integration einer spezifischen Linkerstruktur (abasische Stelle oder Hexaethylenglykol) zwischen zwei Primersequenzen konnte ein bifunktioneller Primer die effiziente Regenerierung der Primerbindungsstellen gewährleisten. Der neue Primer induziert nach der spezifischen Hybridisierung auf dem Templat die Rückfaltung zu einer Haarnadelstruktur und blockiert gleichzeitig die Polymeraseaktivität am Gegenstrang, wodurch eine autozyklische Amplifikation trotz konstanter Reaktionstemperatur möglich ist. Die Effizienz der „Hinge-initiated Primer dependent Amplification“ (HIP) konnte abschließend durch die Verkürzung der Distanz zwischen einem modifizierten Hinge-Primer und einem PCR-ähnlichen Primer verbessert werden. Schlussfolgerung: Die LAMP hat sich aufgrund der hohen Robustheit und Effizienz zu einer leistungsfähigen Alternative für die klassische PCR in der molekularbiologischen Diagnostik entwickelt. Unterschiedliche Detektionsverfahren verbessern die Leistungsfähigkeit der qualitativen und quantitativen LAMP für die Feldanwendungen und für die Diagnostik, da die neuen DNA- und Pyrophosphat-abhängigen Nachweismethoden in einer geschlossenen Reaktion eingesetzt werden können und so eine einfache Pathogendiagnostik ermöglichen. Die gezeigten Methoden können darüber hinaus zu einer Kostensenkung und Zeitersparnis gegenüber den herkömmlichen Methoden beitragen. Ein attraktives Ziel stellt die Weiterentwicklung der HIP für den Pathogennachweis als Alternative zur LAMP dar. Hierbei können die neuen LAMP-Detektionsverfahren ebenfalls Anwendung finden. Die Verwendung von Bst DNA-Polymerase-abhängigen Reaktionen ermöglicht darüber hinaus die Integration einer robusten isothermalen Amplifikation in mikrofluidische Systeme. Durch die Kombination der Probenvorbereitung, Amplifikation und Detektion sind zukünftige Anwendungen mit kurzer Analysezeit und geringem apparativen Aufwand insbesondere in der Pathogendiagnostik möglich. N2 - Background: Established protein- and nucleic acid-based methods for the specific pathogen detection are usually performed under standardized laboratory conditions by trained staff and are associated with long processing time and high costs. In nucleic acid-based pathogen diagnostics, the isothermal amplification can be used as a rapid and cost-effective alternative to the polymerase chain reaction (PCR). Among all isothermal techniques, the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) offers a wide range of applications for the rapid endpoint and real-time detection. A major goal of this work, was to improve the applicability of LAMP and the development of a new method to get a simple, fast and cost-effective diagnostic tool that is based on the detection of DNA and pyrophosphate. For this purpose, direct and indirect detection methods were investigated as well as additional metal ion-dependent fluorescent dyes for the selective detection of pyrophosphate in LAMP or other enzymatic reactions identified. As an alternative to the DNA-based digital LAMP, the previously established dyes were tested for the detection of pyrophosphate in emulsion. Finally, a new reaction mechanism was developed that allows the efficient generation of high molecular weight DNA under isothermal reaction conditions. Results: The detection of RNA- and DNA-based phytopathogens in closed reactions was established successfully with different dyes for real-time and endpoint detection. Berberine as DNA-intercalating fluorescent dye was used in the real-time detection of LAMP with comparable sensitivity to SYBR Green and EvaGreen for the first time. Additionally, the results revealed adequate tolerance of the Bst DNA polymerase to higher concentrations of the dye. Thus, it could be used directly in a closed LAMP reaction without any optimization. Furthermore, the magnesium indicator hydroxynaphthol blue (HNB) was used for fluorometric real-time detection in LAMP for the first time. To extend the number of indirect detection methods for the accumulating pyrophosphate in LAMP and other enzymatic reactions, new metal-ion-dependent dyes were identified. The developed platform could support the iterative process of finding new fluorescent dyes with regard to enzyme compatibility and their spectral properties in the presence or absence of manganese ions. To obtain a selective fluorometric displacement assay, the complex concentration dependence between all components was investigated successfully by the establishment of a combinatorial screening in a microtiter plate. The visualization of the calculated signal-to-noise ratio was then used to identify alizarin red S and tetracycline as promising candidates under simulated reaction conditions. By testing both dyes in the enzymatic assay, alizarin red S was confirmed as low-cost, non-toxic and robust dye for the pyrophosphate dependent increase of the fluorescence intensity. The previously established dyes (HNB, calcein and alizarin red S) were applied successfully for the indirect and fluorometric detection of pyrophosphate in a LAMP-optimized emulsion. The stability and homogeneity of the generated emulsion was increased by adding the surfactant poloxamer 188. The fluorescence microscopic analysis showed a distinct discrimination between positive and negative droplets, in particular by using calcein, HNB and alizarin red S. Additionally, a new amplification reaction that is also based on the Bst DNA polymerase was developed to prevent the complicated primer design and likelihood of unspecific amplification in LAMP. The efficient regeneration of the single stranded priming site was achieved by the integration of a specific linker (abasic site or hexaethylenglycol) between two priming sites to create a bifunctional hinge-primer. After the hybridization on the template sequence, the hinge-primer was used to induce the refolding to a hairpin structure and for blocking the polymerase activity on the reverse strand. Thus, an autocyclic amplification can be achieved at isothermal reaction conditions. Finally, the efficiency of the hinge-initiated primer dependent amplification (HIP) was improved by decreasing the distance between the modified hinge-primer and the corresponding PCR-like primer. Conclusion: Due to its robustness and efficiency, LAMP has been developed to a powerful alternative for the standardized PCR-based diagnostics in molecular biology in the past years. Different detection methods improve the performance of the qualitative and quantitative LAMP in field applications as well as in diagnostics. The new DNA and pyrophosphate based assays can be used in closed reactions and contribute to a simple pathogen detection. Furthermore, the advancements can lead to a considerable reduction of costs and time compared to conventional methods. An attractive achievement is the further optimization of the HIP as sensitive pathogen assay by using LAMP-based detection methods. The use of Bst DNA polymerasedependent reactions will allow a robust integration of the isothermal amplification in microfluidic systems. By combining sample preparation, amplification and detection in one device, powerful applications with short analysis time and low instrumental requirements are a future perspective in pathogen diagnostics. KW - isothermale Amplifikation KW - isothermal amplification KW - Pyrophosphat KW - pyrophosphate KW - DNA KW - DNA KW - Pathogen KW - pathogen KW - LAMP KW - LAMP Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-406072 ER - TY - THES A1 - Nitezki, Tina T1 - Charakterisierung von Stereotypien bei der FVB/NJ-Maus hinsichtlich metabolischer und immunologischer Aspekte auf die Stoffwechselleistung T1 - Characterization of stereotypies in FVB/NJ mice and their impact on metabolism and immune system N2 - Im Sinne des Refinements von Tierversuchen sollen alle Bedingungen während der Zucht, der Haltung und des Transports von zu Versuchszwecken gehaltenen Tieren und alle Methoden während des Versuchs so verbessert werden, dass die verwendeten Tiere ein minimales Maß an potentiellem Distress, Schmerzen oder Leiden erfahren. Zudem soll ihr Wohlbefinden durch die Möglichkeit des Auslebens speziesspezifischer Verhaltensweisen und die Anwendung tierschonender Verfahren maximal gefördert werden. Zur Etablierung von Grundsätzen des Refinements sind grundlegende Kenntnisse über die physiologischen Bedürfnisse und Verhaltensansprüche der jeweiligen Spezies unabdingbar. Die Experimentatoren sollten das Normalverhalten der Tiere kennen, um potentielle Verhaltensabweichungen, wie Stereotypien, zu verstehen und interpretieren zu können. Standardisierte Haltungsbedingungen von zu Versuchszwecken gehaltenen Mäusen weichen in diversen Aspekten von der natürlichen Umgebung ab und erfordern eine gewisse Adaptation. Ist ein Tier über einen längeren Zeitraum unfähig, sich an die gegebenen Umstände anzupassen, können abnormale Verhaltensweisen, wie Stereotypien auftreten. Stereotypien werden definiert als Abweichungen vom Normalverhalten, die repetitiv und ohne Abweichungen im Ablauf ausgeführt werden, scheinbar keiner Funktion dienen und der konkreten Umweltsituation nicht immer entsprechen. Bisher war unklar, in welchem Ausmaß stereotypes Verhalten den metabolischen Phänotyp eines Individuums beeinflusst. Ziel dieser Arbeit war es daher, das stereotype Verhalten der FVB/NJ-Maus erstmals detailliert zu charakterisieren, systematisch zusammenzutragen, welche metabolischen Konsequenzen dieses Verhalten bedingt und wie sich diese auf das Wohlbefinden der Tiere und die Verwendung stereotyper Tiere in Studien mit tierexperimentellem Schwerpunkt auswirken. Der Versuch begann mit der Charakterisierung der mütterlichen Fürsorge in der Parentalgeneration. Insgesamt wurden 35 Jungtiere der F1-Generation vom Absatz an, über einen Zeitraum von 11 Wochen einzeln gehalten, kontinuierlich beobachtet, bis zum Versuchsende wöchentlich Kotproben gesammelt und das Körpergewicht bestimmt. Zusätzlich erfolgten begleitende Untersuchungen wie Verhaltenstests und die Erfassung der physischen Aktivität und metabolischer Parameter. Anschließend wurden u.a. die zerebralen Serotonin- und Dopamingehalte, fäkale Glucocorticoidlevels, hepatisches Glykogen und muskuläre Glykogen- und Triglyceridlevels bestimmt. Nahezu unabhängig von der mütterlichen Herkunft entwickelte sich bei mehr als der Hälfte der 35 Jungtiere in der F1-Generation stereotypes Verhalten. Diese Daten deuten darauf hin, dass es keine Anzeichen für das Erlernen oder eine direkte genetische Transmission stereotypen Verhaltens bei der FVB/NJ-Maus gibt. Über den gesamten Beobachtungszeitraum zeichneten sich die stereotypen FVB/NJ-Mäuse durch ein eingeschränktes Verhaltensrepertoire aus. Zu Gunsten der erhöhten Aktivität und des Ausübens stereotypen Verhaltens lebten sie insgesamt weniger andere Verhaltensweisen (Klettern, Graben, Nagen) aus. Darüber hinaus waren Stereotypien sowohl im 24-Stunden Open Field Test als auch in der Messeinrichtung der indirekten Tierkalorimetrie mit einer erhöhten Aktivität und Motilität assoziiert, während die circadiane Rhythmik nicht divergierte. Diese erhöhte körperliche Betätigung spiegelte sich in den niedrigeren Körpergewichtsentwicklungen der stereotypen Tiere wieder. Außerdem unterschieden sich die Körperfett- und Körpermuskelanteile. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Ausüben stereotypen Verhaltens zu Differenzen im metabolischen Phänotyp nicht-stereotyper und stereotyper FVB/NJ-Mäuse führt. Im Sinne der „Guten Wissenschaftlichen Praxis“ sollte das zentrale Ziel jedes Wissenschaftlers sein, aussagekräftige und reproduzierbare Daten hervorzubringen. Jedoch können keine validen Resultate von Tieren erzeugt werden, die in Aspekten variieren, die für den vorgesehenen Zweck der Studie nicht berücksichtigt wurden. Deshalb sollten nicht-stereotype und stereotype Individuen nicht innerhalb einer Versuchsgruppe randomisiert werden. Stereotype Tiere demzufolge von geplanten Studien auszuschließen, würde allerdings dem Gebot des zweiten R’s – der Reduction – widersprechen. Um Refinement zu garantieren, sollte der Fokus auf der maximal erreichbaren Prävention stereotypen Verhaltens liegen. Diverse Studien haben bereits gezeigt, dass die Anreicherung der Haltungsumwelt (environmental enrichment) zu einer Senkung der Prävalenz von Stereotypien bei Mäusen führt, dennoch kommen sie weiterhin vor. Daher sollte environmental enrichment zukünftig weniger ein „Kann“, sondern ein „Muss“ sein – oder vielmehr: der Goldstandard. Zudem würde eine profunde phänotypische Charakterisierung dazu beitragen, Mausstämme zu erkennen, die zu Stereotypien neigen und den für den spezifischen Zweck am besten geeigneten Mausstamm zu identifizieren, bevor ein Experiment geplant wird. N2 - In the sense of refinement animal experimentation, all conditions during breeding, husbandry and transport of animals used for experimental purposes and all methods during the experiment should be improved to reduce the degree of potential distress, pain or suffering. In addition, their well-being should be guaranteed by the possibility of expressing natural and species-specific behavioural patterns and by the application of considerate procedures. In order to establish principles for refinement, basic knowledge about the physiological needs and behavioural requirements of the respective species is indispensable. The experimenters should know the normal behaviour of animals in order to understand and interpret potential behavioural deviations, such as stereotypies. Standardized housing conditions of laboratory mice deviate from the natural environment in various aspects and might require a certain adaptation. Behavioural adaptation allows animals to adjust to environmental changes and leads to species’ characteristic behaviour. If an animal is unable to adapt to environmental conditions, abnormal behaviours like stereotypies might occur. Stereotypies are defined as deviations from normal behaviour, which are executed repetitively and without deviations in the performance, seem to serve no function and do not always correspond to the concrete environmental situation. Since it remains unclear to what extend stereotypic behaviour influences the individual’s metabolic phenotype, this study investigated behaviour of FVB/NJ mice in detail, exemplarily for stereotypy-prone mouse strains, and compiled the impact of behavioural deviations on physical activity, animal metabolism, animal welfare and on results obtained from studies with an animal specific focus. To detect early indicators for the later development of stereotypic behaviour in the F1 generation, this study started with investigating maternal care in the parental generation. Overall, 35 animals of the F1 generation were kept individually from weaning age. For 11 weeks they were observed, faecal samples were obtained and body weight was determined. Additionally, behavioural tests, metabolic parameters and physical activity were investigated. Furthermore, among others, cerebral serotonin and dopamine contents, faecal glucocorticoid levels and hepatic glycogen, muscular triglyceride and glycogen levels were assessed. Almost independently of the mother's origin, more than half of the 35 pups developed stereotypic behavior in the F1 generation. Data suggest that there is obviously no evidence of learning or a direct genetic transmission of stereotypic behavior in the FVB/NJ-mouse. The predominant portion of stereotypic animals performed the stereotypy of back-flipping (backwards jumping), some animals demonstrated stereotypic circuit running (running in circles on the cage bottom) and wire gnawing (persistent gnawing on the cage grid while hanging with the forelimbs on it). Because of the increased activity and the performance of stereotypic behaviour, stereotypic mice displayed a restricted behavioural repertoire (reduced climbing, digging, gnawing). Moreover, stereotypies were associated with increased activity and motility, both in the 24-hours open field test and in the ITK system, while the circadian rhythm did not diverge. This elevated physical activity was reflected in the expected gender-dependent lower body weight development of stereotypic animals. In addition, stereotypic FVB/NJ-mice contained more relative muscle mass and less fat mass compared to non-stereotypic FVB/NJ-mice in experimental weeks 7 and 12. Besides, significant differences in relative organ weights were found. In conclusion, the performance of stereotypic behaviour leads to differences in the metabolic phenotype between non-stereotypic and stereotypic FVB/NJ mice. In the sense of "Good Scientific Practice", the central aim of any scientist should be to generate meaningful and reproducible data. However, no valid results can be generated with data derived from animals which differ in aspects that were not considered for the designated purpose of the study. Therefore, stereotypic and non-stereotypic individuals should not be randomized within one trial group. To generally exclude stereotypic animals from further studies, though, would interfere with the commandment of the second "R" - the reduction. To guarantee a maximum refinement, the focus should be the highest achievable prevention of stereotypies. Multiple studies indicate that environmental enrichment decreases the prevalence of stereotypic behaviour in mice, nevertheless they still occur. Thus, environmental enrichment of animal housing should not be a "can" but a "must", or rather the “golden standard”. Moreover, a profound phenotypic characterization would help to identify a stereotypy-prone mouse strain and to determine the mouse strain most suitable for the specific purpose before planning an experiment. KW - Stereotypien KW - Verhalten KW - FVB/NJ Maus KW - Versuchstierkunde KW - stereotypy KW - behaviour KW - FVB/NJ mouse KW - laboratory animal sciences Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-402265 ER - TY - THES A1 - Radon, Christin T1 - Analyse der Funktion der dualen Lokalisation der 3-Mercaptopyruvat Sulfurtransferase im Menschen Y1 - 2017 ER - TY - THES A1 - Dippong, Martin T1 - Direkte und indirekte Hapten-selektive Immunfluoreszenzmarkierung von Hybridomzellen zur Generierung monoklonaler Antikörper T1 - Direct and indirect hapten-specific immunofluorescence labeling of hybridoma cells for the generation of monoclonal antibodies N2 - Die Hybridomtechnik zur Produktion von monoklonalen Antikörpern ermöglichte einen großen Schritt in der Entwicklung von Immunoassays für die biochemische Forschung und klinische Diagnostik. Auch die Produktion von Antikörpern gegen niedermolekulare Analyten, Haptene, typische Targets in der Lebensmittel- und Umweltanalytik, erlangte in den letzten Jahren eine immer größere Bedeutung. Im Zuge der Durchführung der Hybridomtechnik werden tausende Antikörper-sezernierende und nicht-sezernierende Zellen generiert. Die Selektion der wenigen antigenselektiven Hybridomzellen zählt dabei zu den herausforderndsten Schritten für die Antikörpergewinnung. Bisherige Selektionsverfahren, wie die Limiting-Dilution-Klonierung in Verbindung mit Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs), garantieren keine Monoklonalität und erlauben nur das Screening von einigen wenigen Zellklonen. Hingegen ermöglichen Hochdurchsatz-Selektionsmethoden, wie die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS), einen sehr hohen Probendurchsatz. Eine Einzelzellablage garantiert hierbei Monoklonalität. Jedoch sind die dafür erforderlichen Zellmarkierungen oftmals zellschädigend oder aufwendig zu generieren. Auch ist bisher noch keine Markierungsmethode bekannt, die es ermöglicht, Hapten-selektive Hybridomzellen durchflusszytometrisch zu analysieren und eine FACS-Selektion durchzuführen. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit zwei Zellmarkierungsmethoden entwickelt, die dies ermöglichen sollten. Die membranständigen Antikörper von Hybridomzellen sollten entweder direkt oder indirekt immunfluoreszenz-markiert und dadurch für die Durchflusszytometrie und FACS-Selektion zugänglich gemacht werden. Die direkte Markierung wurde mittels eines Hapten-Fluorophor-Konjugats durchgeführt. Sie ermöglichte erstmalig den Anteil an Haptenselektiven Hybridomzellen in einer Hybridomzelllinie zu überprüfen. Dies konnte für zwei Hapten-selektive Hybridomzelllinien, die Antikörper gegen das Hormon 17β-Estradiol und das Cardenolid Digoxigenin bilden, gezeigt werden. Durchflusszytometrie und ELISAs lieferten vergleichbare Ergebnisse. Zellen, die Hapten-selektiv markiert werden konnten, sezernierten ebenfalls Hapten-selektive Antikörper. Des Weiteren konnte die direkte Markierung dazu genutzt werden, zwei Mykotoxin-selektive Hybridomzelllinien, welche Antikörper gegen Aflatoxin und Zearalenon bilden, auf Monoklonalität zu testen. Dies ist mittels ELISA nicht möglich. Die Markierungsmethode eignete sich jedoch nur für fixierte Hybridomzellen. Eine Markierung von lebenden Zellen konnte weder durchflusszytometrisch noch mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie gezeigt werden. Dies gelang erst mit einer neu entwickelten indirekten Immunfluoreszenzmarkierung. Dabei wurden die Zellen zunächst mit einem Hapten-Peroxidase-Konjugat inkubiert, gefolgt von einem Fluorophor-markierten anti-HRP-Antikörper-Konjugat. Dies wurde für zwei Analyten, das Hormon Estron und das Antiepileptikum Carbamazepin, gezeigt. Die indirekte Markierung wurde erfolgreich dazu verwendet, Carbamazepin-selektive Hybridomzellen aus einem Fusionsansatz für die monoklonale Antikörperproduktion auszusortieren. Damit wurde erstmalig eine Zellmarkierungsmethode entwickelt, die eine Hochdurchsatz-Selektion lebender Hybridomzellen aus einem Fusionsansatz ermöglicht. Sie ist nicht zellschädigend und kann zusätzlich zur Selektion Hapten-selektiver Plasmazellen verwendet werden. N2 - The ability to create monoclonal antibodies has allowed great strides to be made in immunoassay development for biochemical research and clinical diagnostics. Particularly for small molecular weight analytes, haptens, the need of selective antibodies has increased. The hybridoma technique generates thousands of fused antibody-secreting and non-secreting cells, with the majority being irrelevant. The subsequent screening and subcloning process in order to identify and isolate the very few hybrids that are secreting antibodies of the desired selectivity is a major concern. The traditional limiting dilution technique followed by enzymelinked immunosorbent assays (ELISAs) is inefficient and monoclonality is not guaranteed. Often the number of clones that can be screened is limited. High-throughput techniques such as fluorescence-activated cell sorting (FACS) provide an efficient tool to increase the number of cells to be screened. Furthermore, a single-cell deposition of cells would ensure monoclonality. However, antigen-selective cell labeling techniques are often cell damaging or laborious. The purpose of this study was to explore a cell labeling technique enabling the hapten-selective analysis and isolation of hybridoma cells via FACS. This would reduce much of the effort that has currently to be employed in hybridoma generation. For this reason, a direct and indirect hapten-selective labeling technique was developed. For the direct labeling, a haptenfluorophore conjugate was generated. The conjugate was used to tag membrane-bound immunoglobulin G of hybridoma cells and thereby enabling flow cytometric analysis. Using this kind of conjugate, it was possible to examine the selective antibody expression of hybridoma cell lines producing antibodies against the hormone estradiol and the steroid digoxigenin. Flow cytometric analysis and ELISAs showed comparable results: Cells, which were tagged with the corresponding hapten-fluorophore conjugate also secreted hapten-selective antibodies. Furthermore, it was possible to check hybridoma cell lines producing antibodies against the mycotoxins aflatoxin and zearalenone for monoclonality, which is not possible with ELISA. However, the direct labeling technique was only applicable to fixed cells. Successful labeling of living cells could neither be detected by flow cytometry nor by confocal laser scanning microscopy. On the contrary, using the newly developed indirect labeling technique, flow cytometric analysis and selection of living cells by FACS was possible. Here, the cells were first incubated with a hapten-peroxidase conjugate followed by a fluorophore-conjugated anti-peroxidase antibody. The technique was established on a hybridoma cell line selective for the hormone estrone. Furthermore, this labeling technique enabled for the first time the sorting of hybridoma cells producing selective antibodies against the medication carbamazepine out of a fusion mixture with high efficiency. The selected clones were used for monoclonal antibody production. The indirect labeling is harmless for cells and could also be applied on haptenselective plasma cells. KW - Durchflusszytometrie KW - Haptene KW - monoklonale Antikörper KW - Hybridom KW - Immunfluoreszenz KW - flow cytometry KW - hapten KW - monoclonal antibodies KW - hybridoma KW - immunofluorescence Y1 - 2017 ER - TY - THES A1 - Schraplau, Anne T1 - Regulation der Expression von Xenobiotika-metabolisierenden Enzymen und Deiodasen durch die Xenobiotika-abhängige wechselseitige Induktion von Xenosensor-Transkriptionsfaktoren und Prostaglandin E2 BT - Auswirkung auf die Aktivierung und Inaktivierung von Schilddrüsenhormonen Y1 - 2017 ER - TY - THES A1 - Stolzenburg, Antje T1 - Bittergeschmacksrezeptoren des peripheren und zentralen Nervensystems T1 - Bitter taste receptors of the peripheral and central nervous system N2 - Der Bittergeschmack warnt den Organismus vor potentiell verdorbener oder giftiger Nahrung und ist somit ein wichtiger Kontrollmechanismus. Die initiale Detektion der zahlreich vorkommenden Bitterstoffe erfolgt bei der Maus durch 35 Bitterrezeptoren (Tas2rs), die sich im Zungengewebe befinden. Die Geschmacksinformation wird anschließend von der Zunge über das periphere (PNS) ins zentrale Nervensystem (ZNS) geleitet, wo deren Verarbeitung stattfindet. Die Verarbeitung der Geschmacksinformation konnte bislang nicht gänzlich aufgeklärt werden. Neue Studien deuten auf eine Expression von Tas2rs auch im PNS und ZNS entlang der Geschmacksbahn hin. Über Vorkommen und Aufgaben dieser Rezeptoren bzw. Rezeptorzellen im Nervensystem ist bislang wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Tas2r-Expression in verschiedenen Mausmodellen untersucht, Tas2r-exprimierende Zellen identifiziert und deren Funktionen bei der Übertragung der Geschmacksinformationen analysiert. Im Zuge der Expressionsanalysen mittels qRT-PCR konnte die Expression von 25 der 35 bekannten Bittergeschmacksrezeptoren im zentralen Nervensystem der Maus nachgewiesen werden. Die Expressionsmuster im PNS sowie im ZNS lassen darüber hinaus Vermutungen zu Funktionen in verschiedenen Bereichen des Nervensystems zu. Basierend auf den Ergebnissen der Expressionsanalysen war es möglich, stark exprimierte Tas2rs mittels In-situ-Hybridisierung in verschiedenen Zelltypen zu visualisieren. Des Weiteren konnten immunhistochemische Färbungen unter Verwendung eines genetisch modifizierten Mausmodells die Ergebnisse der Expressionsanalysen bestätigen. Sie zeigten eine Expression von Tas2rs, am Beispiel des Tas2r131-Rezeptors, in cholinergen, dopaminergen, GABAergen, noradrenergen und glycinerg-angesteuerten Projektionsneuronen sowie in Interneuronen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen daher erstmals das Vorkommen von Tas2rs in verschiedenen neuronalen Zelltypen in weiten Teilen des ZNS. Dies lässt den Schluss zu, dass Tas2r-exprimierende Zellen potentiell multiple Funktionen innehaben. Anhand von Verhaltensexperimenten in genetisch modifizierten Mäusen wurde die mögliche Funktion von Tas2r131-exprimierenden Neuronen (Tas2r131-Neurone) bei der Geschmackswahrnehmung untersucht. Die Ergebnisse weisen auf eine Beteiligung von Tas2r131-Neuronen an der Signalweiterleitung bzw. -verarbeitung der Geschmacksinformation für eine Auswahl von Bittersubstanzen hin. Die Analysen zeigen darüber hinaus, dass Tas2r131-Neuronen nicht an der Geschmackswahrnehmung anderer Bitterstoffe sowie Geschmacksstimuli anderer Qualitäten (süß, umami, sauer, salzig), beteiligt sind. Eine spezifische „Tas2r131-Bittergeschmacksbahn“, die mit anderen potentiellen „Bitterbahnen“ teils unabhängige, teils überlappende Signalwege bzw. Verarbeitungsbereiche besitzt, bildet eine mögliche zelluläre Grundlage zur Unterscheidung von Bitterstoffen. Die im Rahmen dieser Arbeit entstandene Hypothese einer potentiellen Diskriminierung von Bitterstoffen soll daher in weiterführenden Studien durch die Etablierung eines Verhaltenstest mit Mäusen geprüft werden. N2 - Bitter taste warns the organism about potentially spoiled or toxic food and is thus an important control mechanism. The initial detection of numerous occurring bitter substances is done in mice by 35 bitter taste receptors (Tas2rs), located in tongue tissue. From the tongue the gustatory information is then passed via the peripheral (PNS) to the central nervous system (CNS), where it is processed. The processing of taste information couldn’t yet be clarified entirely. Recent studies point to an expression of Tas2rs also in the PNS and CNS along the taste transmission pathway. However, little is known concerning occurrence and functions of Tas2rs or Tas2r-expressing cells in the nervous system. In this work the Tas2r expression was examined in different mouse models, Tas2r-expressing cells were identified and their functions in transmission of taste information analyzed. Expression analyses using qRT-PCR showed an expression of 25 of the 35 known murine bitter taste receptors in the central nervous system. The expression patterns in the PNS and CNS suggests functions in different areas of the nervous system. Based on the results of the expression analysis it was possible to visualize highly expressed Tas2rs by in-situ-hybridization in various cell types. Furthermore, immunohistochemical staining using a genetically modified mouse model confirmed the results of the expression analysis. They showed an expression of Tas2rs, on the example of the Tas2r131 receptor, in the cholinergic, dopaminergic, GABAergic, noradrenergic and glycinerg-driven projection neurons and interneurons. The results of the present work show for the first time the presence of Tas2rs in different neuronal cell types in many parts of the CNS. This leads to the conclusion that Tas2r-expressing cells hold potentially multiple functions. Based on behavioral experiments in genetically modified mice, the possible taste function of Tas2r131-expressing neurons (Tas2r131 neurons) was studied. The results showed the involvement of Tas2r131 neurons in signal transduction and processing of gustatory information for a selection of bitter substances. Besides, the analyses show that Tas2r131 neurons aren’t involved in taste perception for another selection of bitter substances and taste stimuli of other qualities (sweet, umami, sour, salty). A specific "Tas2r131-bitter-pathway" which forms partly independent and partly overlapping signaling pathways or processing areas with other potential "bitter-pathways", provides a cellular basis for the distinction of specific bitter compounds. The resulting hypothesis of a potential discrimination of bitter substances should therefore be examined in further studies by establishing a behavioral test with mice. KW - Geschmack KW - Bittergeschmack KW - Bittergeschmacksrezeptoren KW - Tas2r KW - Verhaltensstudien KW - zentrales Nervensystem KW - peripheres Nervensystem KW - Neurone KW - Maus KW - taste KW - bitter taste KW - bitter taste receptors KW - Tas2rs KW - peripheral nervous system KW - central nervous system KW - neuron KW - behavioral experiments KW - expression analysis KW - mouse Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-92397 ER - TY - THES A1 - Nietzsche, Madlen T1 - Identifizierung und Charakterisierung neuer Komponenten der SnRK1-Signaltransduktion in Arabidopsis thaliana T1 - Identification and characterization of novel components of SnRK1-Signalling in Arabidopsis thaliana N2 - Für alle Organismen ist die Aufrechterhaltung ihres energetischen Gleichgewichts unter fluktuierenden Umweltbedingungen lebensnotwendig. In Eukaryoten steuern evolutionär konservierte Proteinkinasen, die in Pflanzen als SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1) bezeichnet werden, die Adaption an Stresssignale aus der Umwelt und an die Limitierung von Nährstoffen und zellulärer Energie. Die Aktivierung von SnRK1 bedingt eine umfangreiche transkriptionelle Umprogrammierung, die allgemein zu einer Repression energiekonsumierender Prozesse wie beispielsweise Zellteilung und Proteinbiosynthese und zu einer Induktion energieerzeugender, katabolischer Stoffwechselwege führt. Wie unterschiedliche Signale zu einer generellen sowie teilweise gewebe- und stressspezifischen SnRK1-vermittelten Antwort führen ist bisher noch nicht ausreichend geklärt, auch weil bislang nur wenige Komponenten der SnRK1-Signaltransduktion identifiziert wurden. In dieser Arbeit konnte ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk um die SnRK1αUntereinheiten aus Arabidopsis AKIN10/AKIN11 etabliert werden. Dadurch wurden zunächst Mitglieder der pflanzenspezifischen DUF581-Proteinfamilie als Interaktionspartner der SnRK1α-Untereinheiten identifiziert. Diese Proteine sind über ihre konservierte DUF581Domäne, in der ein Zinkfinger-Motiv lokalisiert ist, fähig mit AKIN10/AKIN11 zu interagieren. In planta Ko-Expressionsanalysen zeigten, dass die DUF581-Proteine eine Verschiebung der nucleo-cytoplasmatischen Lokalisierung von AKIN10 hin zu einer nahezu ausschließlichen zellkernspezifischen Lokalisierung begünstigen sowie die Ko-Lokalisierung von AKIN10 und DUF581-Proteinen im Nucleus. In Bimolekularen Fluoreszenzkomplementations-Analysen konnte die zellkernspezifische Interaktion von DUF581-Proteinen mit SnRK1α-Untereinheiten in planta bestätigt werden. Außerhalb der DUF581-Domäne weisen die Proteine einander keine große Sequenzähnlichkeit auf. Aufgrund ihrer Fähigkeit mit SnRK1 zu interagieren, dem Fehlen von SnRK1Phosphorylierungsmotiven sowie ihrer untereinander sehr variabler gewebs-, entwicklungs- und stimulusspezifischer Expression wurde für DUF581-Proteine eine Funktion als Adaptoren postuliert, die unter bestimmten physiologischen Bedingungen spezifische Substratproteine in den SnRK1-Komplex rekrutieren. Auf diese Weise könnten DUF581Proteine die Interaktion von SnRK1 mit deren Zielproteinen modifizieren und eine Feinjustierung der SnRK1-Signalweiterleitung ermöglichen. Durch weiterführende Interaktionsstudien konnten DUF581-interagierende Proteine darunter Transkriptionsfaktoren, Proteinkinasen sowie regulatorische Proteine gefunden werden, die teilweise ebenfalls Wechselwirkungen mit SnRK1α-Untereinheiten aufzeigten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eines dieser Proteine für das eine Beteiligung an der SnRK1Signalweiterleitung als Transkriptionsregulator vermutet wurde näher charakterisiert. STKR1 (STOREKEEPER RELATED 1), ein spezifischer Interaktionspartner von DUF581-18, gehört zu einer pflanzenspezifischen Leucin-Zipper-Transkriptionsfaktorfamilie und interagiert in Hefe sowie in planta mit SnRK1. Die zellkernspezifische Interaktion von STKR1 und AKIN10 in Pflanzen unterstützt die Vermutung der kooperativen Regulation von Zielgenen. Weiterhin stabilisierte die Anwesenheit von AKIN10 die Proteingehalte von STKR1, das wahrscheinlich über das 26S Proteasom abgebaut wird. Da es sich bei STKR1 um ein Phosphoprotein mit SnRK1-Phosphorylierungsmotiv handelt, stellt es sehr wahrscheinlich ein SnRK1-Substrat dar. Allerdings konnte eine SnRK1-vermittelte Phosphorylierung von STKR1 in dieser Arbeit nicht gezeigt werden. Der Verlust von einer Phosphorylierungsstelle beeinflusste die Homo- und Heterodimerisierungsfähigkeit von STKR1 in Hefeinteraktionsstudien, wodurch eine erhöhte Spezifität der Zielgenregulation ermöglicht werden könnte. Außerdem wurden Arabidopsis-Pflanzen mit einer veränderten STKR1-Expression phänotypisch, physiologisch und molekularbiologisch charakterisiert. Während der Verlust der STKR1-Expression zu Pflanzen führte, die sich kaum von Wildtyp-Pflanzen unterschieden, bedingte die konstitutive Überexpression von STKR1 ein stark vermindertes Pflanzenwachstum sowie Entwicklungsverzögerungen hinsichtlich der Blühinduktion und Seneszenz ähnlich wie sie auch bei SnRK1α-Überexpression beschrieben wurden. Pflanzen dieser Linien waren nicht in der Lage Anthocyane zu akkumulieren und enthielten geringere Gehalte an Chlorophyll und Carotinoiden. Neben einem erhöhten nächtlichen Stärkeumsatz waren die Pflanzen durch geringere Saccharosegehalte im Vergleich zum Wildtyp gekennzeichnet. Eine Transkriptomanalyse ergab, dass in den STKR1-überexprimierenden Pflanzen unter Energiemangelbedingungen, hervorgerufen durch eine verlängerte Dunkelphase, eine größere Anzahl an Genen im Vergleich zum Wildtyp differentiell reguliert war als während der Lichtphase. Dies spricht für eine Beteiligung von STKR1 an Prozessen, die während der verlängerten Dunkelphase aktiv sind. Ein solcher ist beispielsweise die SnRK1-Signaltransduktion, die unter energetischem Stress aktiviert wird. Die STKR1Überexpression führte zudem zu einer verstärkten transkriptionellen Induktion von Abwehrassoziierten Genen sowie NAC- und WRKY-Transkriptionsfaktoren nach verlängerter Dunkelphase. Die Transkriptomdaten deuteten auf eine stimulusunabhängige Induktion von Abwehrprozessen hin und konnten eine Erklärung für die phänotypischen und physiologischen Auffälligkeiten der STKR1-Überexprimierer liefern. N2 - For all living organism maintenance of energy homeostasis under changing environmental conditions is indispensable. In eukaryotes, evolutionary conserved protein kinases, such as the SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1) in plants, integrate environmental stress signals, nutrient availability and energy depletion during adaptational responses. Activation of SnRK1 triggers a broad transcriptional reprogramming, which in general represses energy consuming processes such as proliferation and protein biosynthesis and induces energy producing catabolic pathways. Although SnRK1 acts as a convergent point for many different environmental and metabolic signals to control growth and development, it is currently unknown how these many different signals could be translated into a cell-type or stimulusspecific response. This is also due to the fact that only a few proteins participating in SnRK1 signal transduction have yet been identified. In this work, a protein-protein interaction network of the Arabidopsis SnRK1α-subunits AKIN10/AKIN11 was established. Thereby, members of the plant specific DUF581 protein family were identified as SnRK1α interacting proteins. The highly conserved DUF581 domain possesses a zinc finger motif and mediates the interaction with AKIN10/AKIN11. In planta co-expression of AKIN10 with DUF581 proteins leads to a shift of subcellular localization from a nucleo-cytoplasmic distribution of both proteins to a nearly exclusive nuclear localization and show that AKIN10 and DUF581 proteins co-localize in nuclei of plant cells. Bimolecular fluorescence complementation analysis revealed that SnRK1α-subunits interact with DUF581 proteins in plants. Apart from their DUF581 domain there is no strong sequence similarity between DUF581 proteins. Because of their ability to interact with SnRK1, the absence of SnRK1-target motifs and their highly variable transcriptional regulation in a tissue-, development- or stimuli-specific manner, it is possible that DUF581 proteins act as adaptor proteins recruiting substrate proteins into the SnRK1 complex under defined physiological conditions. That said, DUF581 could modify the interaction of SnRK1 with its target proteins and facilitate fine-tuning of SnRK1 signal transduction. Additional interaction studies revealed further DUF581 interacting proteins such as transcription factors, protein kinases and regulatory proteins that in part were also able to interact with SnRK1α. One of these proteins which is supposed to be involved in SnRK1 signaling as a transcriptional regulator was characterized in more detail: Arabidopsis STKR1 (STOREKEPPER RELATED 1) a DUF581-18 interaction partner belongs to a plant specific leucine zipper transcription factor family and is able to interact with SnRK1 in yeast and in planta. Co-operative regulation of target genes by STKR1 and AKIN10 is supported by the specific interaction of these proteins inside the plant nucleus. Furthermore, AKIN10 seems to stabilize protein levels of STKR1 in that it attenuates its proteasomal turnover. Due to the fact that STKR1 is a phosphoprotein with putative SnRK1 target motives it is likely a SnRK1 substrate. However, SnRK1 mediated phosphorylation of STKR1 could not be shown in this work. Though, interaction studies in yeast revealed that a loss of putative phosphorylation sites influences the ability of homo- and hetero-dimerization of STKR1, possibly allowing a higher specificity during target gene regulation. Another part of this work was the phenotypic, physiological and molecular characterization of Arabidopsis plants with altered expression of STKR1. Whereas the absence of STKR1 expression results in plants without strong phenotypic abnormality compared to wildtype the overexpression leads to a strong decrease in plant growth as well as developmental retardations regarding to the induction of flowering and senescence reminiscent of SnRK1overexpressing plants. Plants of these lines were not able to accumulate anthocyanins and also contain reduced levels of chlorophyll and carotenoids. Besides a higher starch turnover in dark, these plants displayed lower sucrose contents. Microarray analysis revealed that under energy deficit stress, induced by extended darkness, a higher number of genes were differentially regulated in plants overexpressing STKR1 compared to wildtype than during the light period. This observation argues for a participation of STKR1 in processes, which are active under extended darkness, being the case for SnRK1 signaling which is strongly activated under energy deficient stress. Overexpression of STKR1 also leads to transcriptional induction of genes associated with defense like NAC and WRKY transcription factors after an extended dark. Results of transcriptome data analysis indicate a stimulus independent induction of defense associated processes and are suitable to explain phenotypical and physiological abnormality of the STKR1 overexpressing lines. KW - SnRK1 KW - Proteinkinase KW - Phosphorylierung KW - Arabidopsis thaliana KW - Energiemangel KW - phosphorylation KW - energy starvation KW - protein kinase Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-98678 ER - TY - THES A1 - Kersten, Birgit T1 - Proteom-weite Studien zur Phosphorylierung pflanzlicher Proteine mittels Proteinmikroarrays und Bioinformatik Y1 - 2016 ER - TY - THES A1 - Töle, Nadine T1 - Molekulare und histologische Untersuchungen zur gustatorischen Fettwahrnehmung des Menschen T1 - Molecular and histological analyses of human gustatory fat perception N2 - Die hohe Energieaufnahme durch Fette ist ein Hauptfaktor für die Entstehung von Adipositas, was zu weltweiten Bestrebungen führte, die Fettaufnahme zu verringern. Fettreduzierte Lebensmittel erreichen jedoch, trotz ihrer Weiterentwicklung, nicht die Schmackhaftigkeit ihrer Originale. Die traditionelle Sichtweise, dass die Attraktivität von Fetten allein durch Textur, Geruch, Aussehen und postingestive Effekte bestimmt wird, wird nun durch das Konzept einer gustatorischen Wahrnehmung ergänzt. Bei Nagetieren zeigte sich, dass Lipide unabhängig von den vorgenannten Eigenschaften erkannt werden, sowie, dass Fettsäuren, freigesetzt durch linguale Lipasen, als gustatorische Stimuli fungieren und Fettsäuresensoren in Geschmackszellen exprimiert sind. Die Datenlage für den Menschen erwies sich jedoch als sehr begrenzt, daher war es Ziel der vorliegenden Arbeit molekulare und histologische Voraussetzungen für eine gustatorische Fettwahrnehmung beim Menschen zu untersuchen. Zunächst wurde humanes Geschmacksgewebe mittels RT-PCR und immunhistochemischen Methoden auf die Expression von Fettsäuresensoren untersucht, sowie exprimierende Zellen in Kofärbeexperimenten charakterisiert und quantifiziert. Es wurde die Expression fettsäuresensitiver Rezeptoren nachgewiesen, deren Agonisten das gesamte Spektrum an kurz- bis langkettigen Fettsäuren abdecken (GPR43, GPR84, GPR120, CD36, KCNA5). Ein zweifelsfreier Nachweis des Proteins konnte für den auf langkettige Fettsäuren spezialisierten Rezeptor GPR120 in Typ-I- und Typ-III-Geschmackszellen der Wallpapillen erbracht werden. Etwa 85 % dieser GPR120-exprimierenden Zellen enthielten keine der ausgewählten Rezeptoren der Geschmacksqualitäten süß (TAS1R2/3), umami (TAS1R1/3) oder bitter (TAS2R38). Somit findet sich in humanen Geschmackspapillen nicht nur mindestens ein Sensor, sondern möglicherweise auch eine spezifische, fettsäuresensitive Zellpopulation. Weitere RT-PCR-Experimente und Untersuchungen mittels In-situ-Hybridisierung wurden zur Klärung der Frage durchgeführt, ob Lipasen in den Von-Ebner-Speicheldrüsen (VED) existieren, die freie Fettsäuren aus Triglyceriden als gustatorischen Stimulus freisetzen können. Es zeigte sich zwar keine Expression der bei Nagetieren gefundenen Lipase F (LIPF), jedoch der eng verwandten Lipasen K, M und N in den serösen Zellen der VED. In-silico-Untersuchungen der Sekundär- und Tertiärstrukturen zeigten die hohe Ähnlichkeit zu LIPF, erwiesen aber auch Unterschiede in den Bindungstaschen der Enzyme, welche auf ein differenziertes Substratspektrum hinweisen. Die Anwesenheit eines spezifischen Signalpeptids macht eine Sekretion der Lipasen in den die Geschmacksporen umspülenden Speichel wahrscheinlich und damit auch eine Bereitstellung von Fettsäuren als Stimuli für Fettsäuresensoren. Die Übertragung des durch diese Stimuli hervorgerufenen Signals von Geschmackszellen auf gustatorische Nervenfasern über P2X-Rezeptormultimere wurde mit Hilfe einer vorherigen Intervention mit einem P2X3 /P2X2/3-spezifischen Antagonisten an der Maus als Modellorganismus im Kurzzeit-Präferenztest untersucht. Es zeigte sich weder eine Beeinträchtigung der Wahrnehmung einer Fettsäurelösung, noch einer zuckerhaltigen Kontrolllösung, wohingegen die Wahrnehmung einer Bitterstofflösung reduziert wurde. Somit ist anhand der Ergebnisse dieser Arbeit eine Beteiligung des P2X3-Homomers bzw. des P2X2/3-Heteromers unwahrscheinlich, jedoch die des P2X2-Homomers und damit der gustatorischen Nervenfasern nicht ausgeschlossen. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen auf die Erfüllung grundlegender Voraussetzungen für die gustatorische Fett(säure)wahrnehmung hin und tragen zum Verständnis der sensorischen Fettwahrnehmung und der Regulation der Fettaufnahme bei. Das Wissen um die Regulation dieser Mechanismen stellt eine Grundlage zur Aufklärung der Ursachen und damit der Bekämpfung von Adipositas und assoziierten Krankheiten dar. N2 - High consumption of energy from fat is considered one of the main factors that evoke obesity which led to a worldwide effort to reduce dietary fat intake. However, despite their continuous improvement, fat-reduced foods do not yet reach the palatability of their originals. The traditional view that the attraction to fats is only determined by texture, odor, appearance as well as postingestive effects is now challenged by the concept of gustatory sensation of fats. After excluding or masking the aforementioned features, rodents showed continuous attraction towards lipid solutions. Also long-chain fatty acids liberated from triglycerides by lingual lipases as the main stimulus and the expression of fatty acid-sensitive receptors in taste buds was shown. In contrast, only little data exists for humans. Therefore, this thesis aimed at elucidating the molecular and cellular prerequisites for a gustatory detection of fat. First, human taste tissue was examined by RT-PCR and immunohistochemical methods for the expression of fatty acid sensors and the expressing cells were characterized and quantified by co-staining procedures. The expression of fatty acid-sensitive receptors was shown whose agonists cover the whole range of short- to long-chain fatty acids (GPR43, GPR84, GPR120, CD36, and KCNA5). Protein expression of the long-chain fatty acid receptor GPR120 in type I and type III taste cells was unambiguously demonstrated. About 85 % of the GPR120-expressing cells did not co-express receptors for sweet (TAS1R2/3), umami (TAS1R1/3) or bitter (TAS2R38) taste. Hence, not only does at least one fatty acid sensor exist in human taste papillae, but possibly also a special fatty acid-sensitive cell population. Additional RT-PCR experiments and in situ hybridization analyses were used to address the question, if lipases in the Von-Ebner-salivary glands (VEG) produce free fatty acids from triglycerides as gustatory stimuli. Unlike mice which express lipase F, lipases K, M and N, which are highly related to lipase F, were found to be expressed in the serous cells of the VEG. In silico approaches confirmed high similarities of the secondary and tertiary structures of these lipases to lipase F. Also a marked difference in the binding pocket of the enzymes was observed, which suggests differential substrate specificity. The presence of a signal peptide sequence proposes that the lipases K, M, and N are secreted into the trenches of gustatory papillae. This would result in lipolysis of dietary triglycerides and generation of stimuli for the fatty acid sensor GPR120. Next the hypothesis was tested whether GPR120-generated signals are conveyed to gustatory nerves via P2X-receptor-multimers. To this end short term preference tests were performed in mice after intervention with a P2X3-/P2X2/3-specific antagonist. However, this treatment did not affect the preference of mice for the fatty acid or for a sweet control solution, whereas recognition of a bitter solution was impaired. Thus, an involvement of the P2X3-homomer or the P2X3-/P2X2/3-heteromer seems unlikely. However, these results do not exclude a contribution of P2X2-receptor-heteromers and in turn gustatory nerves for the preference of fatty acid solutions. In summary, the results of this thesis give new insights into the molecular and cellular prerequisites for a gustatory component for fat detection in humans. They also help understanding fat sensation and the regulation of fat intake which in turn may eventually promote novel concepts for the treatment of obesity and related diseases. KW - Geschmack KW - Fettwahrnehmung KW - Fettsäuren KW - Sensorik KW - Lipasen KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - taste KW - fat perception KW - fatty acids KW - lipases KW - G-protein coupled receptors KW - sensory analysis Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-93180 ER - TY - THES A1 - Connor, Daniel Oliver T1 - Identifikation und Charakterisierung neuer immunogener Proteine und anschließende Generierung rekombinanter Antikörper mittels Phage Display T1 - Identification and characterisation of novel immunogenic proteins and subsequent generation of recombinant antibodies by phage display N2 - Seit der Einführung von Antibiotika in die medizinische Behandlung von bakteriellen Infektionskrankheiten existiert ein Wettlauf zwischen der Evolution von Bakterienresistenzen und der Entwicklung wirksamer Antibiotika. Während bis in die 80er Jahre verstärkt an neuen Antibiotika geforscht wurde, gewinnen multiresistente Keime heute zunehmend die Oberhand. Um einzelne Pathogene erfolgreich nachzuweisen und zu bekämpfen, ist ein grundlegendes Wissen über den Erreger unumgänglich. Bakterielle Proteine, die bei einer Infektion vorrangig vom Immunsystem prozessiert und präsentiert werden, könnten für die Entwicklung von Impfstoffen oder gezielten Therapeutika nützlich sein. Auch für die Diagnostik wären diese immundominanten Proteine interessant. Allerdings herrscht ein Mangel an Wissen über spezifische Antigene vieler pathogener Bakterien, die eine eindeutige Diagnostik eines einzelnen Erregers erlauben würden. Daher wurden in dieser Arbeit vier verschiedene Humanpathogene mittels Phage Display untersucht: Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Borrelia burgdorferi und Clostridium difficile. Hierfür wurden aus der genomischen DNA der vier Erreger Bibliotheken konstruiert und durch wiederholte Selektion und Amplifikation, dem sogenannten Panning, immunogene Proteine isoliert. Für alle Erreger bis auf C. difficile wurden immunogene Proteine aus den jeweiligen Bibliotheken isoliert. Die identifizierten Proteine von N. meningitidis und B. burgdorferi waren größtenteils bekannt, konnten aber in dieser Arbeit durch Phage Display verifiziert werden. Für N. gonorrhoeae wurden 21 potentiell immunogene Oligopeptide isoliert, von denen sechs Proteine als neue zuvor unbeschriebene Proteine mit immunogenem Charakter identifiziert wurden. Von den Phagen-präsentierten Oligopeptide der 21 immunogenen Proteine wurden Epitopmappings mit verschiedenen polyklonalen Antikörpern durchgeführt, um immunogene Bereiche näher zu identifizieren und zu charakterisieren. Bei zehn Proteinen wurden lineare Epitope eindeutig mit drei polyklonalen Antikörpern identifiziert, von fünf weiteren Proteinen waren Epitope mit mindestens einem Antikörper detektierbar. Für eine weitere Charakterisierung der ermittelten Epitope wurden Alaninscans durchgeführt, die eine detaillierte Auskunft über kritische Aminosäuren für die Bindung des Antikörpers an das Epitop geben. Ausgehend von dem neu identifizierten Protein mit immunogenem Charakter NGO1634 wurden 26 weitere Proteine aufgrund ihrer funktionellen Ähnlichkeit ausgewählt und mithilfe bioinformatischer Analysen auf ihre Eignung zur Entwicklung einer diagnostischen Anwendung analysiert. Durch Ausschluss der meisten Proteine aufgrund ihrer Lokalisation, Membrantopologie oder unspezifischen Proteinsequenz wurden scFv-Antikörper gegen acht Proteine mittels Phage Display generiert und anschließend als scFv-Fc-Fusionsantikörper produziert und charakterisiert. Die hier identifizierten Proteine und linearen Epitope könnten einen Ansatzpunkt für die Entwicklung einer diagnostischen oder therapeutischen Anwendung bieten. Lineare Epitopsequenzen werden häufig für die Impfstoffentwicklung eingesetzt, sodass vor allem die in dieser Arbeit bestimmten Epitope von Membranproteinen interessante Kandidaten für weitere Untersuchungen in diese Richtung sind. Durch weitere Untersuchungen könnten möglicherweise unbekannte Virulenzfaktoren entdeckt werden, deren Inhibierung einen entscheidenden Einfluss auf Infektionen haben könnten. N2 - Since the advent of antibiotics into the field of medical therapy of bacterial infections, there has been a battle of effective antibiotics and the everlasting evolution of bacterial resistances. Until the 1980s many antibiotics were developed after invention of the first applied antibiotic penicillin in 1946. Since then, antibiotic research has been largely neglected resulting in the evolution of numerous strains from different bacteria with multiple resistances to available antibiotics. Therefore, extensive knowledge of a pathogen is crucial to detect and fight a particular disease. Hence, proteins that are processed and presented preferentially by the immune system during an infection could be beneficial for the development of vaccines and targeted therapeutic agents. Furthermore, immunodominant proteins could be interesting for the development of a diagnostic tool. However, many potential antigen targets of most pathogenic bacteria are still unknown. On this account, four human pathogens were examined in this work utilising phage display: Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Borrelia burgdorferi und Clostridium difficile. Phage libraries were constructed from genomic DNA of the four pathogens. These libraries were used to isolate immunogenic proteins by panning through repetitive rounds of selection and amplification. Immunogenic proteins were successfully isolated for all pathogens except C. difficile. The identified proteins from N. meningitidis and B. burgdorferi had mostly been described before. However, they were verified by phage display in this work. Twenty-one potentially immunogenic oligopeptides were isolated from the N. gonorrhoeae library. Six of those were identified as novel proteins with an immunogenic character and validated also as full length proteins. Epitope mappings were conducted for all of the 21 phage presented oligopeptides with different polyclonal antibodies to identify and characterise the immunogenic regions. Linear epitopes were found unambiguously for ten proteins with the three applied antibodies. In addition, epitopes for five proteins were identified with at least one antibody. The determined epitopes were then further characterized by alanine scans to investigate the impact of each individual amino acid on the binding of the antibody to the antigen’s epitope. Based on the novel identified immunogenic protein NGO1634, 26 additional proteins were selected due to their functional resemblance. These proteins were analysed with bioinformatic tools and amongst others checked for their localisation, membrane topology and conservation of their protein sequence. Finally, scFv antibody fragments were isolated from a phage display library (HAL9/10) against eight proteins. The best antibodies were then produced as scFv-Fc fusion antibodies and their binding behaviour was further characterised. The identified proteins and linear epitopes could serve as a starting point for the development of diagnostic or therapeutic tools. Further studies could unveil unknown virulence factors. Inhibition of those virulence factors could possibly have a vital impact on countering infections. Furthermore, linear epitopes are commonly used for vaccine development. Novel epitopes of membrane proteins could be interesting candidates for further immunization studies. KW - Immunogene Proteine KW - Phage Display KW - Rekombinante Antikörper KW - Neisseria gonorrhoeae KW - Neisseria meningitidis KW - Clostridium difficile KW - Borrelia burgdorferi KW - Epitopmapping KW - Immunogenic Proteins KW - Recombinant Antibodies KW - Epitope mapping KW - Phage Display KW - Neisseria gonorrhoeae KW - Neisseria meningitidis KW - Clostridium difficile KW - Borrelia burgdorferi Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-104120 ER - TY - THES A1 - Maier, Natalia T1 - Aufbau eines Testsystems zum Nachweis von Ethylglucuronid (EtG) in Haaren Y1 - 2016 ER - TY - THES A1 - Matzk, Sören T1 - Predictive analysis of metabolic and preventive patient data T1 - Prädiktive Analyse metabolischer und präventiver Patienten Daten N2 - Every day huge amounts of medical records are stored by means of hospitals’ and medical offices’ software. These data are generally unconsidered in research. In this work anonymized everyday medical records ascertained in a physician’s office, cov- ering holistic internal medicine in combination with orthomolecular medicine, are analyzed. Due to the lack of cooperation by the provider of the medical practice software a selection of diagnoses and anthropometric parameters was extracted manually. Information about patients’ treatment are not available in this study. Nevertheless, data mining approaches in- cluding machine learning techniques are used to enable research, prevention and monitoring of patients’ course of treatment. The potential of these everyday medical data is demonstrated by investigating co-morbidity and pyroluria which is a metabolic dysfunction indicated by increased levels of hydroxy- hemopyrrolin-2-one (HPL). It points out that the metabolic syndrome forms a cluster of its components and cancer, as well as mental disorders are grouped with thyroid diseases including autoimmune thyroid diseases. In contrast to prevailing assumptions in which it was estimated that approximately 10 % of the population show increased levels of HPL, in this analysis 84.9 % of the tested patients have an increased concentration of HPL. Prevention is illustrated by using decision tree models to predict diseases. Evaluation of the obtained model for Hashimoto’s disease yield an accuracy of 87.5 %. The model generated for hypothyroidism (accuracy of 60.9 %) reveals shortcomings due to missing information about the treatment. Dynamics in the biomolecular status of 20 patients who have visited the medical office at least one time a year between 2010 and 2014 for laboratory tests are visualized by STATIS, a consensus analysis based on an extension to principal component analysis. Thereby, one can obtain patterns which are predestinated for specific diseases as hypertension. This study demonstrates that these often overlooked everyday data are challenging due to its sparsity and heterogeneity but its analysis is a great possibility to do research on disease profiles of real patients. N2 - Jeden Tag werden unzählige Mengen an medizinischen Patientendaten in Krankenhäusern und Arztpraxen digital gespeichert. Für Forschungszwecke werden diese Daten bisher größtenteils nicht verwendet. Ziel dieser Arbeit ist es täglich anfallende anonymisierte Patientendaten, die aus einer Praxis für ganzheitliche Innere Medizin stammen, zu analysieren. Aufgrund mangelnder Kooperation seitens des Anbieters der Praxissoftware konnten die Patientendaten nicht automatisch extrahiert werden. Daher wurde eine Auswahl an Diagnosen und anthropometrischen Parametern manuell in eine Datenbank übertragen. Informationen über die Behandlung wurden dabei nicht berücksichtigt. Data-Mining Verfahren ermöglichen die Forschung auf der Grundlage von alltäglichen Patientendaten. Durch die Anwendung maschinellen Lernens kann Präventionsmedizin und die Überwachung von Behandlungsverläufen unterstützt werden. Das Potenzial der Analyse dieser sonst weitgehend ungenutzten Daten wird anhand von Untersuchungen zur Komorbidität verdeutlicht. Dabei zeigt sich, dass einerseits das Metabolische Syndrom und dessen Komponenten zusammen mit Krebserkrankungen ein Cluster bilden und andererseits psychosomatische Störungen vermehrt mit Autoimmunerkrankungen der Schilddrüse auftreten. Außerdem wird eine noch nicht schulmedizinisch anerkannte Stoffwechselerkrankung, die Hämopyrrollaktamurie (HPU) untersucht. Diese lässt sich durch eine vermehrte Ausscheidung von Pyrrolen im Urin nachweisen. Bezüglich der Patienten bei denen ein HPU-Test vorliegt, weisen 84 % einen erhöhten Titer auf. Diese Beobachtung steht im Widerspruch zur vorherigen Annahme, dass in etwa 10 % der Bevölkerung von HPU betroffen sind. Präventives Handeln ermöglicht es Gesundheit zu erhalten. Zu diesem Zweck ist es notwen- dig Krankheiten möglichst früh zu erkennen. In dieser Studie können Entscheidungsbaum-Modelle die Hashimoto Thyreoiditis mit einer Genauigkeit von 87.5 % bei einem Patienten diagnostizieren. Defizite durch die fehlenden Informationen über die medikamentöse Behandlung werden anhand des Modells zur Vorhersage von Hypothyreoiditis (Genauigkeit von 60.9 %) aufgezeigt. Mit Hilfe von STATIS, das auf einer Erweiterung der Hauptkomponentenanalyse basiert, die es ermöglicht mehrere Tabellen simultan zu vergleichen, wurde der Behandlungsverlauf von 20 Patienten über einen Zeitraum von fünf Jahren überwacht. Anhand von Hypertonie wird gezeigt, dass sich sich die Patenten bezüglich Ihrer Laborwerte voneinander unterscheiden und sich Muster für Krankheiten erkennen lassen. Diese Arbeit demonstriert den Nutzen, der durch die vermehrte Analyse alltäglicher hochdimensionaler und heterogener Daten erbracht werden kann. KW - predictive analysis KW - database KW - personalised medicine KW - prädiktive Analyse KW - Datenbank KW - personalisierte Medizin Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-406103 ER - TY - THES A1 - Peter, Tatjana T1 - Molekulare Charakterisierung von CP75, einem neuen centrosomalen Protein in Dictyostelium discoideum T1 - Molecular characterization of CP75, a novel Dictyostelium centrosome protein N2 - Das Centrosom ist ein Zellkern-assoziiertes Organell, das nicht von einer Membran umschlossen ist. Es spielt eine wichtige Rolle in vielen Mikrotubuli- abhängigen Prozessen wie Organellenpositionierung, Zellpolarität oder die Organisation der mitotischen Spindel. Das Centrosom von Dictyostelium besteht aus einer dreischichtigen Core-Struktur umgeben von einer Corona, die Mikrotubuli-nukleierende Komplexe enthält. Die Verdoppelung des Centrosoms in Dictyostelium findet zu Beginn der Mitose statt. In der Prophase vergrößert sich die geschichtete Core-Struktur und die Corona löst sich auf. Anschließend trennen sich die beiden äußeren Lagen der Core-Struktur und bilden in der Metaphase die beiden Spindelpole, die in der Telophase zu zwei vollständigen Centrosomen heranreifen. Das durch eine Proteom-Analyse identifizierte Protein CP75 lokalisiert am Centrosom abhängig von den Mitosephasen. Es dissoziiert von der Core-Struktur in der Prometaphase und erscheint an den Spindelpolen in der Telophase wieder. Dieses Verhalten korreliert mit dem Verhalten der mittleren Lage der Core-Struktur in der Mitose, was darauf hinweist, dass CP75 eine Komponente dieser Schicht sein könnte. Die FRAP-Experimente am Interphase- Centrosom zeigen, dass GFP-CP75 dort nicht mobil ist. Das deutet darauf hin, dass das Protein wichtige Funktionen im Strukturerhalt der centrosomalen Core- Struktur übernehmen könnte. Sowohl die C- als auch die N-terminale Domäne von CP75 enthalten centrosomale Targeting-Domäne. Als GFP-Fusionsproteine (GFP-CP75-N und -C) lokalisieren die beiden Fragmente am Centrosom in der Interphase. Während GFP-CP75-C in der Mitose am Centrosom verbleibt, verschwindet GFP-CP75-N in der Metaphase und kehrt erst in der späten Telophase zurück. GFP-CP75-C und GFP-CP75O/E kolokalisieren mit F-Aktin am Zellcortex, zeigen aber keine Interaktion mit Aktin mit der BioID-Methode. Die N-terminale Domäne von CP75 enthält eine potentielle Plk1- Phosphorylierungssequenz. Die Überexpression der nichtphosphorylierbaren Punktmutante (GFP-CP75-Plk-S143A) ruft verschiedene Phänotypen wie verlängerte oder überzählige Centrosomen, vergrößerte Zellkerne und Anreicherung von detyrosinierten Mikrotubuli hervor. Die ähnlichen Phänotypen konnten auch bei GFP-CP75-N und CP75-RNAi beobachtet werden. Der Phänotyp der detyrosinierten Mikrotubuli bringt erstmals den Beweis dafür, dass I in Dictyostelium posttranslationale Modifikation an Tubulinen stattfindet. Außerdem zeigten CP75-RNAi-Zellen Defekte in der Organisation der mitotischen Spindel. Mittels BioID-Methode konnten drei potentielle Interaktionspartner von CP75 identifiziert werden. Diese drei Proteine CP39, CP91 und Cep192 sind ebenfalls Bestandteile des Centrosoms. N2 - The centrosome is a nonmembranous, nucleus-associated organelle. It plays crucial roles in a variety of mucrotubule-dependent processes, such as organelle positioning, cell polarization and mitotic spindle organization. The Dictyostelium centrosome consists of a core structure with three major layers, surrounded by a corona containing micrutubule-nucleation complexes. Dictyostelium centrosome replication starts at the onset of mitosis. In prophase, the core structure enlarges and the corona disappears. Afterwards, the core structure splits and the outer layers form two spindle poles maturating to two new, complete centrosomes in telophase. CP75 is one of nine novel proteins identified in a centrosomal proteome analysis. Endogenous CP75 localizes to the centrosome in a cell cycle- dependent manner. It dissociates from the core structure in early prometaphase and reappears at spindle poles in telophase. Since this pattern fits to the disappearance and reappearance of the central layer of the core structure, this indicates that CP75 is a constituent of this layer. During interphase FRAP experiments reveal that GFP-CP75 exhibits no mobility at the centrosome. This indicates a role in structural maintenance of the centrosomal core. Both the C- and N-terminal domains of CP75 contain a centrosomal targeting domain. Fused to GFP (GFP-CP75-N and -C) both fragments localized to the centrosome in interphase, but only GFP-CP75-N disappears from the centrosome during mitosis. GFP-CP75-C and GFP-CP75O/E also colocalized with F-actin at the cell cortex. But it shows no direct interaction with actin in BioID. The N-terminal domain of CP75 contains Plk1 phosphorylation sites. Overexpression of phosphorylation site-defficient mutant of GFP-CP75 (GFP-CP75-Plk-S143A) causes different phenotypes like enlarged and disrupted nuclei, enlarged and supernumerary centrosomes and detyrosinated microtubules. A very similar phenotype was observed upon overexpression of GFP-CP75-N and upon knockdown of CP75 expression by RNAi. The phenotype of detyrosinated microtubules for the first time shows that posttranslational modification of Tubulin takes place in Dictyostelium. Live cell imaging showed that lack of CP75 caused defect in spindle formation. CP75 interacts in BioID with CP39, CP91 and Cep192, three other components of the centrosome. KW - Dictyostelium KW - Centrosom KW - CP75 KW - dictyostelium KW - centrosome KW - CP75 Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-96472 ER - TY - THES A1 - Putzler, Sascha T1 - Molekulare Charakterisierung des Centrosom-assoziierten Proteins CP91 in Dictyostelium discoideum T1 - Molecular characterization of the centrosome-associated protein CP91 in Dictyostelium discoideum N2 - Das Dictyostelium-Centrosom ist ein Modell für acentrioläre Centrosomen. Es besteht aus einer dreischichtigen Kernstruktur und ist von einer Corona umgeben, welche Nukleationskomplexe für Mikrotubuli beinhaltet. Die Verdoppelung der Kernstruktur wird einmal pro Zellzyklus am Übergang der G2 zur M-Phase gestartet. Durch eine Proteomanalyse isolierter Centrosomen konnte CP91 identifiziert werden, ein 91 kDa großes Coiled-Coil Protein, das in der centrosomalen Kernstruktur lokalisiert. GFP-CP91 zeigte fast keine Mobilität in FRAP-Experimenten während der Interphase, was darauf hindeutet, dass es sich bei CP91 um eine Strukturkomponente des Centrosoms handelt. In der Mitose hingegen dissoziieren das GFP-CP91 als auch das endogene CP91 ab und fehlen an den Spindelpolen von der späten Prophase bis zur Anaphase. Dieses Verhalten korreliert mit dem Verschwinden der zentralen Schicht der Kernstruktur zu Beginn der Centrosomenverdopplung. Somit ist CP91 mit großer Wahrscheinlichkeit ein Bestandteil dieser Schicht. CP91-Fragmente der N-terminalen bzw. C-terminalen Domäne (GFP-CP91 N-Terminus, GFP-CP91 C-Terminus) lokalisieren als GFP-Fusionsproteine exprimiert auch am Centrosom, zeigen aber nicht die gleiche mitotische Verteilung des Volllängenproteins. Das CP91-Fragment der zentralen Coiled-Coil Domäne (GFP-CP91cc) lokalisiert als GFP-Fusionsprotein exprimiert, als ein diffuser cytosolische Cluster, in der Nähe des Centrosoms. Es zeigt eine partiell ähnliche mitotische Verteilung wie das Volllängenprotein. Dies lässt eine regulatorische Domäne innerhalb der Coiled-Coil Domäne vermuten. Die Expression der GFP-Fusionsproteine unterdrückt die Expression des endogenen CP91 und bringt überzählige Centrosomen hervor. Dies war auch eine markante Eigenschaft nach der Unterexpression von CP91 durch RNAi. Zusätzlich zeigte sich in CP91-RNAi Zellen eine stark erhöhte Ploidie verursacht durch schwere Defekte in der Chromosomensegregation verbunden mit einer erhöhten Zellgröße und Defekten im Abschnürungsprozess während der Cytokinese. Die Unterexpression von CP91 durch RNAi hatte auch einen direkten Einfluss auf die Menge an den centrosomalen Proteinen CP39, CP55 und CEP192 und dem Centromerprotein Cenp68 in der Interphase. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass CP91 eine zentrale centrosomale Kernkomponente ist und für den Zusammenhalt der beiden äußeren Schichten der Kernstruktur benötigt wird. Zudem spielt CP91 eine wichtige Rolle für eine ordnungsgemäße Centrosomenbiogenese und, unabhängig davon, bei dem Abschnürungsprozess der Tochterzellen während der Cytokinese. N2 - The Dictyostelium centrosome is a model for acentriolar centrosomes and it consists of a three-layered core structure surrounded by a corona harboring microtubule nucleation complexes. Its core structure duplicates once per cell cycle at the G2/M transition. Through proteomic analysis of isolated centrosomes we have identified CP91, a 91-kDa coiled coil protein that was localized at the centrosomal core structure. While GFP-CP91 showed almost no mobility in FRAP experiments during interphase, both GFP-CP91 and endogenous CP91 dissociated during mitosis and were absent from spindle poles from late prophase to anaphase. Since this behavior correlates with the disappearance of the central layer upon centrosome duplication, CP91 is a putative component of this layer. When expressed as GFP-fusions, CP91 fragments corresponding to the N-terminal and C-terminal domain (GFP-CP91N, and GFP-CP91C respectively) also localized to the centrosome but did not show the mitotic redistribution of the full length protein. The CP91 fragment corresponding to the central coiled coil domain (GFP-CP91cc) localized as a diffuse cluster close to the centrosome and did show a partially similar mitotic redistribution of the full length protein suggesting a regulatory role of the coiled coil domain. Expression of all GFP-fusion proteins suppressed expression of endogenous CP91 and elicited supernumerary centrosomes. This was also very prominent upon depletion of CP91 by RNAi. CP91-RNAi cells exhibited heavily increased ploidy due to severe defects in chromosome segregation along with increased cell size and defects in the abscission process during cytokinesis. Additionally, depletion of CP91 by RNAi had an immediate impact on the amount of the centrosomal core components CP39, CP55 and CEP192 and the centromere protein Cenp68 in interphase cells. Our results indicate that CP91 is a central centrosomal core component required for centrosomal integrity, proper centrosome biogenesis and, independently, for abscission during cytokinesis. KW - Centrosom KW - Dictyostelium KW - Mikrotubuli KW - Mitose KW - Zellkern KW - centrosome KW - dictyostelium KW - microtubules KW - mitosis KW - nucleus Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-394689 ER - TY - THES A1 - Frahnow, Turid T1 - Bioinformatische Analyse der NUGAT-Studie (NUtriGenomic Analysis in Twins) T1 - Bioinformatic analysis of the NUGAT study (NUtriGenomic Analysis in Twins) BT - Verfahren zur Integration lipidomischer, transkriptomischer und metabolischer Daten BT - methods for the integration of lipidomic, transcriptomic and metabolic data N2 - Durch die Zunahme metabolischer Stoffwechselstörungen und Erkrankungen in der Weltbevölkerung wird in der Medizin und den Lebenswissenschaften vermehrt nach Präventionsstrategien und Ansatzpunkten gesucht, die die Gesundheit fördern, Erkrankungen verhindern helfen und damit auch die Gesamtlast auf die Gesundheitssysteme erleichtern. Ein Ansatzpunkt wird dabei in der Ernährung gesehen, da insbesondere der Konsum von gesättigten Fetten die Gesundheit nachträglich zu beeinflussen scheint. Dabei wird übersehen, dass in vielen Studien Hochfettdiäten nicht ausreichend von den Einflüssen einer zum Bedarf hyperkalorischen Energiezufuhr getrennt werden, sodass die Datenlage zu dem Einfluss von (gesättigten) Fetten auf den Metabolismus bei gleichbleibender Energieaufnahme noch immer unzureichend ist. In der NUtriGenomic Analysis in Twins-Studie wurden 46 Zwillingspaare (34 monozygot, 12 dizygot) über einen Zeitraum von sechs Wochen mittels einer kohlenhydratreichen, fettarmen Diät nach Richtlinien der Deutschen Gesellschaft für Ernährung für ihr Ernährungsverhalten standardisiert, ehe sie zu einer kohlenhydratarmen, fettreichen Diät, die insbesondere gesättigte Fette enthielt, für weitere sechs Wochen wechselten. Beide Diäten waren dem individuellen Energiebedarf der Probanden angepasst, um so sowohl akut nach einerWoche als auch längerfristig nach sechs Wochen Änderungen des Metabolismus beobachten zu können, die sich in der vermehrten Aufnahme von (gesättigten) Fetten begründeten. Die über die detaillierte Charakterisierung der Probanden an den klinischen Untersuchungstagen generierten Datensätze wurden mit statistischen und mathematischen Methoden (z.B. lineare gemischte Modellierung) analysiert, die der Größe der Datensätze und damit ihrem Informationsvolumen angepasst waren. Es konnte gezeigt werden, dass die metabolisch gesunden und relativ jungen Probanden, die eine gute Compliance zeigten, im Hinblick auf ihren Glukosestoffwechsel adaptieren konnten, indem die Akutantwort nach einer Woche im Nüchterninsulin und dem Index für Insulinresistenz in den weiteren fünf Wochen ausgeglichen wurde. Der Lipidstoffwechsel in Form der klassischen Marker wie Gesamtcholesterin, LDL und HDL war dagegen stärker beeinflusst und auch nach insgesamt sechs Wochen deutlich erhöht. Letzteres unterstützt die Beobachtung im Transkriptom des weißen, subkutanen Fettgewebes, bei der eine Aktivierung der über die Toll-like receptors und das Inflammasom vermittelten subklinischen Inflammation beobachtet werden konnte. Die auftretenden Veränderungen in Konzentration und Komposition des Plasmalipidoms zeigte ebenfalls nur eine teilweise und auf bestimmte Spezies begrenzte Gegenregulation. Diesbezüglich kann also geschlussfolgert werden, dass auch die isokalorische Aufnahme von (gesättigten) Fetten zu Veränderungen im Metabolismus führt, wobei die Auswirkungen in weiteren (Langzeit-)Studien und Experimenten noch genauer untersucht werden müssen. Insbesondere wäre dabei ein längerer Zeitraum unter isokalorischen Bedingungen von Interesse und die Untersuchung von Probanden mit metabolischer Vorbelastung (z.B. Insulinresistenz). Darüber hinaus konnte in NUGAT aber ebenfalls gezeigt werden, dass die Nutrigenetik und Nutrigenomik zwei nicht zu vernachlässigende Faktoren darstellen. So zeigten unter anderem die Konzentrationen einiger Lipidspezies eine starke Erblichkeit und Abhängigkeit der Diät. Zudem legen die Ergebnisse nahe, dass laufende wie geplante Präventionsstrategien und medizinische Behandlungen deutlich stärker den Patienten als Individuum mit einbeziehen müssen, da die Datenanalyse interindividuelle Unterschiede identifizierte und Hinweise lieferte, dass einige Probanden die nachteiligen, metabolischen Auswirkungen einer Hochfettdiät besser ausgleichen konnten als andere. N2 - Based on the increasing incidence of metabolic disorders and diseases in the world population, medicine and life sciences aim for (new) prevention strategies and targets to promote health, prevent diseases and thereby ease the overall financial burden on health systems. One approach is seen in diet and nutrition. According to recent studies and nutritional guide lines, especially the consumption of saturated fats affects health negatively. Nevertheless, in many studies high fat diets are not separated from the influences of a hypercaloric energy intake. In conclusion the available data for the isolated effects of (saturated) fats on metabolism are still insufficient. In the NUtriGenomic Analysis in Twins study, 46 healthy twin pairs (34 monozygotic, 12 dizygotic) were standardized for their nutritional behavior over a period of six weeks on a high-carbohydrate, low-fat diet according to the DGE guidelines. This standardization was followed by an interventional low-carbohydrate, high-fat diet for another six weeks. Both diets were isocaloric to the individuals' requirements in order to evaluate rapid after 1 week) and long-term (after 6 weeks) effects on metabolism, which were based on the higher intake of (saturated) fatty acids. The data sets, which were generated by a detailed characterization of the subjects at the clinical investigation days, were analyzed with statistical and mathematical methods (e.g. linear mixed modeling), which aimed to cover the size of the data sets and thereby the whole amount of information within the data sets. We could show that the metabolically healthy and relatively young subjects, who showed good compliance, were able to adapt in terms of their glucose metabolism, since the acute increase after one week in fasting insulin and the loss of insulin sensitivity was balanced after additional five weeks. In contrast, lipid metabolism, represented by the classical marker total cholesterol as well as LDL and HDL, was more strongly influenced and still increased after six weeks on high-fat diet. The latter supports the observations in the transcriptome of white, subcutaneous adipose tissue, where Toll-like receptors and inflammasome seemed to mediate the activation of a low-grade inflammation. The changes occurring in the concentration and composition of the plasma lipidome also showed a partial counterregulation limited to certain lipid species. In this regard, we conclude that independent of the energy intake, the consumption of (saturated) fatty acids leads to changes in metabolism, although further studies and experiments are needed to investigate the isolated effects further. Especially studies of extended periods under isocaloric conditions and studies in patients with pathological conditions (e.g. insulin resistance) would be of interest. Nevertheless, the results in NUGAT emphasize the importance of nutrigenetics and nutrigenomics, since the concentrations of some lipid species seemed to be highly heritable and diet-dependent. Moreover, our results suggest that ongoing and planned prevention strategies and medical treatments have to treat patients much more as individuals. Our analysis identified interindividual differences and indicated that some participants were able to compensate the adverse and unfavorable metabolic effects of a high fat diet better than others. KW - Hochfettdiät KW - Zwillingsstudie KW - Lipidomics KW - Heritabilität KW - linear gemischte Modelle KW - twin study KW - high fat diet KW - lipidomics KW - heritability KW - linear mixed models Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-394902 ER -