TY - THES A1 - Schönheit, Jörg T1 - A phagocyte-specific Irf8 gene enhancer establishes early conventional dendritic cell commitment T1 - Ein Phagozyten spezifischer Enhancer des Irf8 Gens steuert die Entwicklung konventioneller dendritischer Zellen N2 - Haematopoietic development is a complex process that is strictly hierarchically organized. Here, the phagocyte lineages are a very heterogeneous cell compartment with specialized functions in innate immunity and induction of adaptive immune responses. Their generation from a common precursor must be tightly controlled. Interference within lineage formation programs for example by mutation or change in expression levels of transcription factors (TF) is causative to leukaemia. However, the molecular mechanisms driving specification into distinct phagocytes remain poorly understood. In the present study I identify the transcription factor Interferon Regulatory Factor 8 (IRF8) as the specification factor of dendritic cell (DC) commitment in early phagocyte precursors. Employing an IRF8 reporter mouse, I showed the distinct Irf8 expression in haematopoietic lineage diversification and isolated a novel bone marrow resident progenitor which selectively differentiates into CD8α+ conventional dendritic cells (cDCs) in vivo. This progenitor strictly depends on Irf8 expression to properly establish its transcriptional DC program while suppressing a lineage-inappropriate neutrophile program. Moreover, I demonstrated that Irf8 expression during this cDC commitment-step depends on a newly discovered myeloid-specific cis-enhancer which is controlled by the haematopoietic transcription factors PU.1 and RUNX1. Interference with their binding leads to abrogation of Irf8 expression, subsequently to disturbed cell fate decisions, demonstrating the importance of these factors for proper phagocyte cell development. Collectively, these data delineate a transcriptional program establishing cDC fate choice with IRF8 in its center. N2 - Die Differenzierung von hämatopoietischen Zellen ist ein komplexer Prozess, der strikt hierarchisch organisiert ist. Dabei stellen die Phagozyten eine sehr heterogene Zellpopulation dar, mit hochspezialisierten Funktionen im angeborenen Immunsystem sowie während der Initialisierung der adaptiven Immunreaktion. Ihre Entwicklung, ausgehend von einer gemeinsamen Vorläuferzelle, unterliegt einer strikten Kontrolle. Die Beeinträchtigung dieser Linienentscheidungsprogramme, z.B. durch Mutationen oder Änderungen der Expressionslevel von Transkriptionsfaktoren kann Leukämie auslösen. Die molekularen Mechanismen, welche die linienspezifische Entwicklung steuern, sind allerdings noch nicht im Detail bekannt. In dieser Arbeit zeige ich den maßgeblichen Einfluss des Transkriptionsfaktors Interferon Regulierender Faktor 8 (IRF8) auf die Entwicklung von dendritischen Zellen (DC) innerhalb der Phagozyten. Mittels einer IRF8-Reporter Maus stellte ich die sehr differenziellen Expressionsmuster von Irf8 in der hämatopoietischen Entwicklung dar. Dabei konnte ich eine neue, im Knochenmark lokalisierte, Vorläuferpopulation isolieren, die in vivo spezifisch Differenzierung in CD8α+ konventionelle dendritische Zellen (cDC) steuert. Dieser Vorläufer ist dabei absolut von der Expression von Irf8 abhängig und etabliert auf transkriptioneller Ebene die dendritische Zellentwicklung, während gleichzeitig die Entwicklung neutrophiler Zellen unterdrückt wird. Darüber hinaus zeigte ich, dass Irf8 Expression während der cDC Entwicklung von einem neu charakterisierten cis-regulatorischen Enhancer abhängt, der spezifisch in myeloiden Zellen agiert. Ich konnte zeigen, dass die hämatopoietischen Transkriptionfaktoren PU.1 und RUNX1 mittels dieses Enhancers die Irf8 Expression steuern. Können diese beiden Faktoren nicht mit dem Enhancer interagieren, führt das zu stark verminderter Irf8 Expression, damit zu Veränderungen in den Differnzierungsprogrammen der Zellen, was die Bedeutung dieses regulatorischen Mechanismus unterstreicht. Zusammengefasst beschreiben diese Daten die Etablierung der frühen cDC Entwicklung, in der IRF8 die zentrale Rolle spielt. KW - Hämatopoiese KW - dendritische Zelle KW - Immunologie KW - Transkiptionsfaktor KW - Genregulation KW - haematopoiesis KW - dendritic cell KW - immunology KW - transcription factor KW - gene regulation Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-55482 ER - TY - THES A1 - Andorf, Sandra T1 - A systems biological approach towards the molecular basis of heterosis in Arabidopsis thaliana T1 - Ein systembiologischer Ansatz für das Verständnis der molekularen Grundlagen von Heterosis in Arabidopsis thaliana N2 - Heterosis is defined as the superiority in performance of heterozygous genotypes compared to their corresponding genetically different homozygous parents. This phenomenon is already known since the beginning of the last century and it has been widely used in plant breeding, but the underlying genetic and molecular mechanisms are not well understood. In this work, a systems biological approach based on molecular network structures is proposed to contribute to the understanding of heterosis. Hybrids are likely to contain additional regulatory possibilities compared to their homozygous parents and, therefore, they may be able to correctly respond to a higher number of environmental challenges, which leads to a higher adaptability and, thus, the heterosis phenomenon. In the network hypothesis for heterosis, presented in this work, more regulatory interactions are expected in the molecular networks of the hybrids compared to the homozygous parents. Partial correlations were used to assess this difference in the global interaction structure of regulatory networks between the hybrids and the homozygous genotypes. This network hypothesis for heterosis was tested on metabolite profiles as well as gene expression data of the two parental Arabidopsis thaliana accessions C24 and Col-0 and their reciprocal crosses. These plants are known to show a heterosis effect in their biomass phenotype. The hypothesis was confirmed for mid-parent and best-parent heterosis for either hybrid of our experimental metabolite as well as gene expression data. It was shown that this result is influenced by the used cutoffs during the analyses. Too strict filtering resulted in sets of metabolites and genes for which the network hypothesis for heterosis does not hold true for either hybrid regarding mid-parent as well as best-parent heterosis. In an over-representation analysis, the genes that show the largest heterosis effects according to our network hypothesis were compared to genes of heterotic quantitative trait loci (QTL) regions. Separately for either hybrid regarding mid-parent as well as best-parent heterosis, a significantly larger overlap between the resulting gene lists of the two different approaches towards biomass heterosis was detected than expected by chance. This suggests that each heterotic QTL region contains many genes influencing biomass heterosis in the early development of Arabidopsis thaliana. Furthermore, this integrative analysis led to a confinement and an increased confidence in the group of candidate genes for biomass heterosis in Arabidopsis thaliana identified by both approaches. N2 - Als Heterosis-Effekt wird die Überlegenheit in einem oder mehreren Leistungsmerkmalen (z.B. Blattgröße von Pflanzen) von heterozygoten (mischerbigen) Nachkommen über deren unterschiedlich homozygoten (reinerbigen) Eltern bezeichnet. Dieses Phänomen ist schon seit Beginn des letzten Jahrhunderts bekannt und wird weit verbreitet in der Pflanzenzucht genutzt. Trotzdem sind die genetischen und molekularen Grundlagen von Heterosis noch weitestgehend unbekannt. Es wird angenommen, dass heterozygote Individuen mehr regulatorische Möglichkeiten aufweisen als ihre homozygoten Eltern und sie somit auf eine größere Anzahl an wechselnden Umweltbedingungen richtig reagieren können. Diese erhöhte Anpassungsfähigkeit führt zum Heterosis-Effekt. In dieser Arbeit wird ein systembiologischer Ansatz, basierend auf molekularen Netzwerkstrukturen verfolgt, um zu einem besseren Verständnis von Heterosis beizutragen. Dazu wird eine Netzwerkhypothese für Heterosis vorgestellt, die vorhersagt, dass die heterozygoten Individuen, die Heterosis zeigen, mehr regulatorische Interaktionen in ihren molekularen Netzwerken aufweisen als die homozygoten Eltern. Partielle Korrelationen wurden verwendet, um diesen Unterschied in den globalen Interaktionsstrukturen zwischen den Heterozygoten und ihren homozygoten Eltern zu untersuchen. Die Netzwerkhypothese wurde anhand von Metabolit- und Genexpressionsdaten der beiden homozygoten Arabidopsis thaliana Pflanzenlinien C24 und Col-0 und deren wechselseitigen Kreuzungen getestet. Arabidopsis thaliana Pflanzen sind bekannt dafür, dass sie einen Heterosis-Effekt im Bezug auf ihre Biomasse zeigen. Die heterozygoten Pflanzen weisen bei gleichem Alter eine höhere Biomasse auf als die homozygoten Pflanzen. Die Netzwerkhypothese für Heterosis konnte sowohl im Bezug auf mid-parent Heterosis (Unterschied in der Leistung des Heterozygoten im Vergleich zum Mittelwert der Eltern) als auch auf best-parent Heterosis (Unterschied in der Leistung des Heterozygoten im Vergleich zum Besseren der Eltern) für beide Kreuzungen für die Metabolit- und Genexpressionsdaten bestätigt werden. In einer Überrepräsentations-Analyse wurden die Gene, für die die größte Veränderung in der Anzahl der regulatorischen Interaktionen, an denen sie vermutlich beteiligt sind, festgestellt wurde, mit den Genen aus einer quantitativ genetischen (QTL) Analyse von Biomasse-Heterosis in Arabidopsis thaliana verglichen. Die ermittelten Gene aus beiden Studien zeigen eine größere Überschneidung als durch Zufall erwartet. Das deutet darauf hin, dass jede identifizierte QTL-Region viele Gene, die den Biomasse-Heterosis-Effekt in Arabidopsis thaliana beeinflussen, enthält. Die Gene, die in den Ergebnislisten beider Analyseverfahren überlappen, können mit größerer Zuversicht als Kandidatengene für Biomasse-Heterosis in Arabidopsis thaliana betrachtet werden als die Ergebnisse von nur einer Studie. KW - Systembiologie KW - Heterosis KW - Molekulare Profildaten KW - Integrative Analyse KW - Systems biology KW - Heterosis KW - Molecular profile data KW - Integrative analysis Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-51173 ER - TY - GEN A1 - Eccard, Jana A1 - Fey, Karen A1 - Caspers, Barbara A. A1 - Ylönen, Hannu T1 - Breeding state and season affect interspecific interaction types BT - indirect resource competition and direct interference T2 - Postprints der Universität Potsdam Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe N2 - Indirect resource competition and interference are widely occurring mechanisms of interspecific interactions. We have studied the seasonal expression of these two interaction types within a two-species, boreal small mammal system. Seasons differ by resource availability, individual breeding state and intraspecific social system. Live-trapping methods were used to monitor space use and reproduction in 14 experimental populations of bank voles Myodes glareolus in large outdoor enclosures with and without a dominant competitor, the field vole Microtus agrestis. We further compared vole behaviour using staged dyadic encounters in neutral arenas in both seasons. Survival of the non-breeding overwintering bank voles was not affected by competition. In the spring, the numbers of male bank voles, but not of females, were reduced significantly in the competition populations. Bank vole home ranges expanded with vole density in the presence of competitors, indicating food limitation. A comparison of behaviour between seasons based on an analysis of similarity revealed an avoidance of costly aggression against opponents, independent of species. Interactions were more aggressive during the summer than during the winter, and heterospecific encounters were more aggressive than conspecific encounters. Based on these results, we suggest that interaction types and their respective mechanisms are not either–or categories and may change over the seasons. During the winter, energy constraints and thermoregulatory needs decrease direct aggression, but food constraints increase indirect resource competition. Direct interference appears in the summer, probably triggered by each individual’s reproductive and hormonal state and the defence of offspring against conspecific and heterospecific intruders. Both interaction forms overlap in the spring, possibly contributing to spring declines in the numbers of subordinate species. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 729 KW - rodents KW - aggression KW - seasonality KW - space use KW - winter biology Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-429398 SN - 1866-8372 IS - 729 SP - 623 EP - 633 ER - TY - JOUR A1 - Eccard, Jana A1 - Fey, Karen A1 - Caspers, Barbara A. A1 - Ylönen, Hannu T1 - Breeding state and season affect interspecific interaction types indirect resource competition and direct interference JF - Oecologia N2 - Indirect resource competition and interference are widely occurring mechanisms of interspecific interactions. We have studied the seasonal expression of these two interaction types within a two-species, boreal small mammal system. Seasons differ by resource availability, individual breeding state and intraspecific social system. Live-trapping methods were used to monitor space use and reproduction in 14 experimental populations of bank voles Myodes glareolus in large outdoor enclosures with and without a dominant competitor, the field vole Microtus agrestis. We further compared vole behaviour using staged dyadic encounters in neutral arenas in both seasons. Survival of the non-breeding overwintering bank voles was not affected by competition. In the spring, the numbers of male bank voles, but not of females, were reduced significantly in the competition populations. Bank vole home ranges expanded with vole density in the presence of competitors, indicating food limitation. A comparison of behaviour between seasons based on an analysis of similarity revealed an avoidance of costly aggression against opponents, independent of species. Interactions were more aggressive during the summer than during the winter, and heterospecific encounters were more aggressive than conspecific encounters. Based on these results, we suggest that interaction types and their respective mechanisms are not either-or categories and may change over the seasons. During the winter, energy constraints and thermoregulatory needs decrease direct aggression, but food constraints increase indirect resource competition. Direct interference appears in the summer, probably triggered by each individual's reproductive and hormonal state and the defence of offspring against conspecific and heterospecific intruders. Both interaction forms overlap in the spring, possibly contributing to spring declines in the numbers of subordinate species. KW - Rodents KW - Aggression KW - Seasonality KW - Space use KW - Winter biology Y1 - 2011 U6 - https://doi.org/10.1007/s00442-011-2008-y SN - 0029-8549 SN - 1432-1939 VL - 167 IS - 3 SP - 623 EP - 633 PB - Springer CY - New York ER - TY - THES A1 - Andrade Linares, Diana Rocío T1 - Characterization of tomato root-endophytic fungi and analysis of their effects on plant development, on fruit yield and quality and on interaction with the pathogen Verticillium dahliae T1 - Charakterisierung wurzelendophytischer Pilze von Tomate und Analyse ihrer Effekte auf Pflanzenentwicklung, auf Ertrag und Fruchtqualität und auf die Wechselwirkung mit dem Pathogen Verticillium dahliae N2 - Non-mycorrhizal fungal endophytes are able to colonize internally roots without causing visible disease symptoms establishing neutral or mutualistic associations with plants. These fungi known as non-clavicipitaceous endophytes have a broad host range of monocot and eudicot plants and are highly diverse. Some of them promote plant growth and confer increased abiotic-stress tolerance and disease resistance. According to such possible effects on host plants, it was aimed to isolate and to characterize native fungal root endophytes from tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) and to analyze their effects on plant development, plant resistance and fruit yield and quality together with the model endophyte Piriformospora indica. Fifty one new fungal strains were isolated from desinfected tomato roots of four different crop sites in Colombia. These isolates were roughly characterized and fourteen potential endophytes were further analyzed concerning their taxonomy, their root colonization capacity and their impact on plant growth. Sequencing of the ITS region from the ribosomal RNA gene cluster and in-depth morphological characterisation revealed that they correspond to different phylogenetic groups among the phylum Ascomycota. Nine different morphotypes were described including six dark septate endophytes (DSE) that did not correspond to the Phialocephala group. Detailed confocal microscopy analysis showed various colonization patterns of the endophytes inside the roots ranging from epidermal penetration to hyphal growth through the cortex. Tomato pot experiments under glass house conditions showed that they differentially affect plant growth depending on colonization time and inoculum concentration. Three new isolates (two unknown fungal endophyte DSE48, DSE49 and one identified as Leptodontidium orchidicola) with neutral or positiv effects were selected and tested in several experiments for their influence on vegetative growth, fruit yield and quality and their ability to diminish the impact of the pathogen Verticillium dahliae on tomato plants. Although plant growth promotion by all three fungi was observed in young plants, vegetative growth parameters were not affected after 22 weeks of cultivation except a reproducible increase of root diameter by the endophyte DSE49. Additionally, L. orchidicola increased biomass and glucose content of tomato fruits, but only at an early date of harvest and at a certain level of root colonization. Concerning bioprotective effects, the endophytes DSE49 and L. orchidicola decreased significantly disease symptoms caused by the pathogen V. dahliae, but only at a low dosis of the pathogen. In order to analyze, if the model root endophytic fungus Piriformospora indica could be suitable for application in production systems, its impact on tomato was evaluated. Similarly to the new fungal isolates, significant differences for vegetative growth parameters were only observable in young plants and, but protection against V. dahliae could be seen in one experiment also at high dosage of the pathogen. As the DSE L. orchidicola, P. indica increased the number and biomass of marketable tomatoes only at the beginning of fruit setting, but this did not lead to a significant higher total yield. If the effects on growth are due to a better nutrition of the plant with mineral element was analyzed in barley in comparison to the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus mosseae. While the mycorrhizal fungus increased nitrogen and phosphate uptake of the plant, no such effect was observed for P. indica. In summary this work shows that many different fungal endophytes can be also isolated from roots of crops and, that these isolates can have positive effects on early plant development. This does, however, not lead to an increase in total yield or in improvement of fruit quality of tomatoes under greenhouse conditions. N2 - Endophyten, die nicht zu den Mykorrhizapilzen gehören, können das Innere von Wurzeln ohne sichtbare Krankheitssymptome besiedeln und bilden so mit der Pflanze neutrale oder mutualistische Wechselwirkungen. Diese Pilze, auch als nicht-clavicipetale Endophyten bekannt, haben ein breites Wirtsspektrum von mono- und dikotyledonen Pflanzen und weisen eine hohe Diversität auf. Einige von ihnen fördern Pflanzenwachstum und erhöhen Resistenz und Toleranz gegenüber biotischem und abiotischem Stress. Ausgehenden von diesen möglichen Effekten auf ihre Wirtspflanzen war das Ziel der vorliegenden Arbeit die Isolierung und Charakterisierung neuer pilzlicher Wurzelendophyten der Tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) und die Analyse ihres Einflusses auf Pflanzenentwicklung und Pflanzenresistenz, sowie auf Ertrag und Fruchtqualität unter Einbeziehung des Modellendophyten Piriformospora indica. Aus vier verschiedenen Anbaugebieten in Kolumbien konnten 51 neue Pilzstämme von oberflächensterilisierten Tomatenwurzeln isoliert werden. Diese Isolate wurden vorcharakterisiert und 14 potentielle Endophyten bezüglich ihrer Taxonomie, ihrer Besiedlungsmuster und ihres Einfluss auf das Pflanzenwachstum näher untersucht. Sequenzierung der ITS Region des ribosomalen RNA Genclusters und genaue morphologische Charakterisierung zeigten, dass sie zu verschiedenen phylogenetischen Gruppen innerhalb der Ascomycota gehören. Neun Morphotypen ließen sich beschreiben, wobei sechs zu den ‚Dark Septate Endophytes’ (DSEs) gehören, aber nicht mit der bekannten Phialocephala Gruppe verwandt waren. Ausführliche konfokale mikroskopische Untersuchungen ergaben sehr verschiedene Besiedelungsmuster der Wurzelendophyten vom Endringen in die Epidermis bis zum Hyphenwachstum durch den Kortex. Topfexperimente unter Gewächshausbedingungen zeigten dass die Isolate in Abhängigkeit von der Inokulumkonzentration und der Zeit der Besiedlung das Wachstum der Tomaten sehr unterschiedlich beeinflussten. Drei neue Isolate (die beiden unbekannte pilzlichen Endophyten DSE48 und DSE49 und eines identifiziert als Leptodontidium orchidicola) mit neutralen oder positiven Effekten wurden für weitere Versuche ausgewählt. In mehreren Experimenten sollte ihr Einfluss auf das vegetative Wachstum, auf Ertrag und auf Fruchtqualität untersucht werden, sowie ihre Fähigkeit die Auswirkungen des Pathogens Verticillium dahliae auf Tomatenpflanzen zu vermindern. Obwohl wachstumsfördernde Effekte durch alle drei Pilze in jungen Pflanzen beobachtet wurden, waren vegetative Wachstumsparameter nach 22 Wochen der Besiedlung nicht mehr beeinflusst bis auf ein signifikante Erhöhung des Wurzeldurchmessers durch den Endophyten DSE49. L. orchidicola dagegen erhöhte die Biomasse und den Glukosegehalt der Früchte, aber nur zu frühen Ernteterminen und bei einer bestimmten Intensität der Wurzelbesiedelung. Hinsichtlich eines schützenden Effekts, konnten die Endophyten DSE49 und L. orchidicola die Krankheitssymptome, die durch V. dahliae verursacht wurden, vermindern, aber nur bei einem geringen Pathogendruck. Um zu überprüfen, ob der Modellendophyt P. indica in Produktionssytemen eingesetzt werden kann, wurde seine Auswirkungen auf Tomaten untersucht. Ähnlich wie die neuen pilzlichen Isolate, zeigte aber auch er seinen fördernden Einfluss nur auf das frühe vegetative Wachstum. Schützende Effekte gegen V. dahliae konnten ebenfalls nur bei niedrigem Pathogendruck konstant beobachtet werden. Wie L. orchidicola erhöhte P. indica die Biomasse an marktfähigen Tomaten am Anfang des Fruchtansatzes, was nicht zu einem insgesamt höheren Ertrag führte. Ob die beobachteten Effekte auf ein verbesserte Nährstoffversorgung der Pflanze zurückzuführen seien, wurde in Gerste im Vergleich mit dem arbuskulären Mykorrhizapilz Glomus mosseae untersucht. Während der Mykorrhizapilz sowohl Phosphat wie Stickstoffaufnehme der Pflanze erhöhte, konnte dies für P. indica nicht festgestellt werden. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass auch aus Wurzeln von Kulturpflanzen viele verschiedene pilzliche Endophyten isoliert werden können, und dass einige von diesen durchaus einen positiven Effekt auf die frühe Pflanzenentwicklung aufweisen. Zumindest für Tomate unter Gewächshausbedingungen führen diese Effekte aber nicht zu einer Erhöhung des Gesamtertrags oder einer nachhaltigen Verbesserung der Fruchtqualität. KW - Pilz-Endophyten KW - Ascomycota KW - Wurzelbesiedlung KW - Tomaten (Solanum lycopersicum) KW - Pflanze-Pilz-Interaktionen KW - Fungal endophyte KW - Ascomycota KW - root colonization KW - tomato (Solanum lycopersicum) KW - plant-fungal interactions Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-51375 ER - TY - THES A1 - Krehl, Susanne T1 - Das Selenoprotein Glutathionperoxidase-2 : physiologische Funktion und Einfluss auf die entzündungsassoziierte Colonkarzinogenese T1 - The selenoprotein glutathione peroxidase-2 : physiological function and influence on inflammation triggered coloncarcinogenesis N2 - Bei der Entdeckung der Glutathionperoxidase-2 (GPx2) wurde zunächst davon ausgegangen, dass die Funktion dieses Enzyms im Kryptengrund des Colons einzig in der Reduktion von H2O2 besteht. Im Laufe der weiteren Erforschung zeigte sich, dass GPx2 auch in verschiedenen Tumorgeweben vermehrt exprimiert wird. Dabei wird diskutiert, ob die Wirkung von GPx2 im Tumor eher als pro- oder als antikarzinogen einzustufen ist. Mehrere Experimente in vitro und in vivo zeigten antiinflammatorische Eigenschaften der GPx2. Aufgrund dieser Befunde wird derzeit über weitere Funktionen der GPx2 spekuliert. In dieser Arbeit wurde die physiologische Funktion von GPx2 näher erforscht, dazu wurden Wildtyp- und GPx2-Knockout-Mäuse in Hinblick auf Veränderungen der Enzymexpression und der Colonmorphologie untersucht. Es wurden drei verschiedene Selendiäten verfüttert: selenarmes, selenadäquates und selensupplementiertes Futter. Unter physiologischen Bedingungen ist am Kryptengrund des Colons, innerhalb der proliferierenden Zone, die Mitoserate am höchsten. Der Großteil der apoptotischen Zellen ist hingegen an der Kryptenspitze vorzufinden. Durch den Knockout von GPx2 kam es zu einer signifikanten Erhöhung der Apoptoserate am Kryptengrund. Dabei war der größte Effekt auf selenarmem Futter zu verzeichnen. Hierbei wurde sogar eine Veränderung der Colonmorphologie dokumentiert, da die Verschiebung der Proliferationszone in Richtung Kryptenspitze eine Verlängerung der Krypten nach sich zog. Im Wildtyp wurden keine Apoptosen im Kryptengrund detektiert. GPx1 wird unter physiologischen Bedingungen im Gegensatz zur GPx2 in der Kryptenspitze exprimiert und ist im Selenmangel nicht mehr detektierbar. Der Knockout von GPx2 erhöhte die GPx1-Expression im Kryptengrund auf allen drei Selendiäten. Diese Überexpression von GPx1 am Kryptengrund soll vermutlich den Verlust von GPx2 an dieser Stelle kompensieren. Da jedoch dort die massive Apoptoserate detektiert wurde, kann die GPx1 nicht die komplette Funktion von GPx2 kompensieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Funktion von GPx2 nicht nur in der Reduktion von H2O2 liegt. Vielmehr kann eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase von Zellen postuliert werden. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war die Klärung der Frage, welchen Einfluss GPx2 auf die entzündungsassoziierte Colonkarzinogenese ausübt. In dem hierfür verwendeten AOM/DSS-Model wird der karzinogene Prozess durch Entzündung vorangetrieben. Es erfolgte sowohl im Wildtyp als auch im GPx2-Knockout zum einen die Bewertung des Entzündungsstatus des Colons und zum anderen wurde die Anzahl von ACF und Tumoren verglichen. Das Colon im GPx2-Knockout war wesentlich stärker entzündet als im Wildtyp. Diese Ergebnisse bestätigen die für die GPx2 postulierte antiinflammatorische Funktion. Normalerweise führt eine Erhöhung der Mitoseanzahl zur Regeneration des entzündeten Gewebes. Jedoch beeinflusst der Verlust von GPx2 vermutlich den Ablauf der Entzündung, indem beispielsweise die Regeneration des Gewebes durch die enorm hohe Apoptoserate am Kryptengrund verlangsamt wird. Des Weiteren hatten sich im GPx2-Knockout tendenziell mehr Tumore entwickelt. Somit korrelierte die Entzündung des Colons mit der Entwicklung von Tumoren. Der Verlust von GPx2 begünstigte vermutlich sowohl die Tumorinitiation als auch die Tumorprogression. Allerdings stimulierte die Expression von GPx2 ebenfalls das Tumorwachstum. Es kann geschlussfolgert werden, dass eine adäquate GPx2-Expression vor Entzündung schützt und somit das Risiko für Colonkrebs senkt. Ob GPx2 aber insgesamt pro- oder antikarzinogen wirkt, hängt vermutlich vom Stadium des Colonkarzinogenese ab. N2 - Since the detection of glutathione peroxidase-2 (GPx2) it was assumed that reducing hydroperoxides is the only function of this enzyme in the crypt ground of the colon. But further studies showed that GPx2 is also highly expressed in tumor tissue. However, it is not known whether it acts a pro- or anticarcinogenic manner at this site. In vitro and in vivo experiments elucidate antiinflammatory features of GPx2, based on these findings additional functions of GPx2 are discussed. In this dissertation the physiological function of GPx2 was investigated. For this purpose in wild type and GPx2-knockout mice, changes of enzyme expression and colon morphology were analyzed. The mice were fed three diets containing different selenium concentrations: selenium deficient, selenium adequate and selenium supplemented. Under physiological conditions the mitosis rate is highest in the proliferating zone in the crypt ground of the colon. The majority of apoptotic cells are located at the tip of the crypt. The knockout of GPx2 significantly increased the rate of apoptosis in the crypt ground. The greatest effect was documented on the selenium deficient diet. Here, changes of the colonic morphology were detectable, because the shift of the proliferating zone towards the tip of the crypt lead to an extension of the crypts. In the wild type mice no apoptotic cells were detected on the crypt ground. Under physiological conditions GPx1, in contrast to GPx2, is mainly expressed on the top of the crypt, and this enzyme is no longer detectable under selenium deficiency. The knockout of GPx2 increased the expression of GPx1 in the crypt ground of the colon on all three selenium diets. It is likely that this over expression of GPx1 compensates for the loss of GPx2. However the massive apoptotic rate in the crypt ground shows that GPx1 can not compensate the complete function of GPx2. These results elucidate that GPx2 not only functions as a hydroperoxide reducer, but that it is also important for the maintenance of the stem cell character and the homeostasis of cells. The question if GPx2 influences the inflammation triggered by the coloncarcinogenic process was next assessed in this dissertation. Therefore the AOM/DSS model was used to trigger the carcinogenic process through inflammation. The amount of aberrant crypt foci (ACF) and tumors in the colon were analyzed in both wild type and GPx2-knockout mice. However initially the inflammation status was compared between the two genotypes. The inflammation of the colon was stronger in the GPx2-knockout mice than in wild type. These results support the postulated antiinflammatory features of GPx2. The loss of GPx2 may influence the inflammation process by decelerating the regeneration of the tissue caused by the increased apoptotic rate in the proliferating zone. Additionally, the GPx2-knockout mice developed more tumors in the colon. Therefore the inflammation of the colon correlated with the development of tumors. The loss of GPx2 may have enhanced both tumor initiation and progression. But the expression of GPx2 also stimulated the growth of tumors. These results indicate that an adequate GPx2-expression can protect from colonic inflammation, and therefore decrease the risk of developing colon cancer. Whether GPx2 acts in a pro- or anticarcinogenic manner appears to depend on the state of the carcinogenic process. KW - Glutathionperoxidase-2 GPx2 KW - Apoptose KW - Colonkrebs KW - Entzündung KW - Selen KW - glutathione peroxidase-2 GPx2 KW - apoptosis KW - colon cancer KW - inflammation KW - selenium Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-50220 ER - TY - THES A1 - Massie, Thomas Michael T1 - Dynamic behavior of phytoplankton populations far from steady state : chemostat experiments and mathematical modeling N2 - Nature changes continuously and is only seemingly at equilibrium. Environmental parameters like temperature, humidity or insolation may strongly fluctuate on scales ranging from seconds to millions of years. Being part of an ecosystem, species have to cope with these environmental changes. For ecologists, it is of special interest how individual responses to environmental changes affect the dynamics of an entire population – and, if this behavior is predictable. In this context, the demographic structure of a population plays a decisive role since it originates from processes of growth and mortality. These processes are fundamentally influenced by the environment. But, how exactly does the environment influence the behavior of populations? And what does the transient behavior look like? As a result from environmental influences on demography, so called cohorts form. They are age or size classes that are disproportionally represented in the demographic distribution of a population. For instance, if most old and young individuals die due to a cold spell, the population finally consists of mainly middle-aged individuals. Hence, the population got synchronized. Such a population tends to show regular fluctuations in numbers (denoted as oscillations) since the alternating phases of individual growth and population growth (due to reproduction) are now performed synchronously by the majority of the population.That is, one time the population growths, and the other time it declines due to mortality. Synchronous behavior is one of the most pervasive phenomena in nature. Gravitational synchrony in the solar system; fireflies flashing in unison; coordinate firing of pacemaker cells in the heart; electrons in a superconductor marching in lockstep. Whatever scale one looks at, in animate as well as inanimate systems, one is likely to encounter synchrony. In experiments with phytoplankton populations, I could show that this principle of synchrony (as used by physicists) could well-explain the oscillations observed in the experiments, too. The size of the fluctuations depended on the strength by which environmental parameters changed as well as on the demographic state of a population prior to this change. That is, two population living in different habitats can be equally influenced by an environmental change, however, the resulting population dynamics may be significantly different when both populations differed in their demographic state before. Moreover, specific mechanisms relevant for the dynamic behavior of populations, appear only when the environmental conditions change. In my experiments, the population density declined by 50% after ressource supply was doubled. This counter-intuitive behavior can be explained by increasing ressource consumption. The phytoplankton cells grew larger and enhanced their individual constitution. But at the same time, reproduction was delayed and the population density declined due to the losses by mortality. Environmental influences can also synchronize two or more populations over large distances, which is denoted as Moran effect. Assume two populations living on two distant islands. Although there is no exchange of individuals between them, both populations show a high similarity when comparing their time series. This is because the globally acting climate synchronizes the regionally acting weather on both island. Since the weather fluctuations influence the population dynamics, the Moran effect states that the synchrony between the environment equals the one between the populations. My experiments support this theory and also explain deviations arising when accounting for differences in the populations and the habitats they are living in. Moreover, model simulations and experiments astonishingly show that the synchrony between the populations can be higher than between the environment, when accounting for differences in the environmental fluctuations (“noise color”). N2 - Die Natur unterliegt ständigen Veränderungen und befindet sich nur vermeintlich in einem Gleichgewicht. Umweltparameter wie Temperatur, Luftfeuchtigkeit oder Sonneneinstrahlung schwanken auf einer Zeitskala von Sekunden bis Jahrmillionen und beinhalten teils beträchtliche Unterschiede. Mit diesen Umweltveränderungen müssen sich Arten als Teil eines Ökosystems auseinandersetzen. Für Ökologen ist interessant, wie sich individuelle Reaktionen auf die Umweltveränderungen im dynamischen Verhalten einer ganzen Population bemerkbar machen und ob deren Verhalten vorhersagbar ist. Der Demografie einer Population kommt hierbei eine entscheidende Rolle zu, da sie das Resultat von Wachstums- und Sterbeprozessen darstellt. Eben jene Prozesse werden von der Umwelt maßgeblich beeinflusst. Doch wie genau beeinflussen Umweltveränderungen das Verhalten ganzer Populationen? Wie sieht das vorübergehende, transiente Verhalten aus? Als Resultat von Umwelteinflüssen bilden sich in Populationen sogenannte Kohorten, hinsichtlich der Zahl an Individuen überproportional stark vertretene Alters- oder Größenklassen. Sterben z.B. aufgrund eines außergewöhnlich harten Winters, die alten und jungen Individuen einer Population, so besteht diese anschließend hauptsächlich aus Individuen mittleren Alters. Sie wurde sozusagen synchronisiert. Eine solche Populationen neigt zu regelmäßigen Schwankungen (Oszillationen) in ihrer Dichte, da die sich abwechselnden Phasen der individuellen Entwicklung und der Reproduktion nun von einem Großteil der Individuen synchron durchschritten werden. D.h., mal wächst die Population und mal nimmt sie entsprechend der Sterblichkeit ab. In Experimenten mit Phytoplankton-Populationen konnte ich zeigen, dass dieses oszillierende Verhalten mit dem in der Physik gebräuchlichen Konzept der Synchronisation beschrieben werden kann. Synchrones Verhalten ist eines der verbreitetsten Phänomene in der Natur und kann z.B. in synchron schwingenden Brücken, als auch bei der Erzeugung von Lasern oder in Form von rhythmischem Applaus auf einem Konzert beobachtet werden. Wie stark die Schwankungen sind, hängt dabei sowohl von der Stärke der Umweltveränderung als auch vom demografischen Zustand der Population vor der Veränderung ab. Zwei Populationen, die sich in verschiedenen Habitaten aufhalten, können zwar gleich stark von einer Umweltveränderung beeinflusst werden. Die Reaktionen im anschließenden Verhalten können jedoch äußerst unterschiedlich ausfallen, wenn sich die Populationen zuvor in stark unterschiedlichen demografischen Zuständen befanden. Darüber hinaus treten bestimmte, für das Verhalten einer Population relevante Mechanismen überhaupt erst in Erscheinung, wenn sich die Umweltbedingungen ändern. So fiel in Experimenten beispielsweise die Populationsdichte um rund 50 Prozent ab nachdem sich die Ressourcenverfügbarkeit verdoppelte. Der Grund für dieses gegenintuitive Verhalten konnte mit der erhöhten Aufnahme von Ressourcen erklärt werden. Damit verbessert eine Algenzelle zwar die eigene Konstitution, jedoch verzögert sich dadurch die auch die Reproduktion und die Populationsdichte nimmt gemäß ihrer Verluste bzw. Sterblichkeit ab. Zwei oder mehr räumlich getrennte Populationen können darüber hinaus durch Umwelteinflüsse synchronisiert werden. Dies wird als Moran-Effekt bezeichnet. Angenommen auf zwei weit voneinander entfernten Inseln lebt jeweils eine Population. Zwischen beiden findet kein Austausch statt – und doch zeigt sich beim Vergleich ihrer Zeitreihen eine große Ähnlichkeit. Das überregionale Klima synchronisiert hierbei die lokalen Umwelteinflüsse. Diese wiederum bestimmen das Verhalten der jeweiligen Population. Der Moran-Effekt besagt nun, dass die Ähnlichkeit zwischen den Populationen jener zwischen den Umwelteinflüssen entspricht, oder geringer ist. Meine Ergebnisse bestätigen dies und zeigen darüber hinaus, dass sich die Populationen sogar ähnlicher sein können als die Umwelteinflüsse, wenn man von unterschiedlich stark schwankenden Einflüssen ausgeht. T2 - Dynamisches Verhalten von Phytoplanktonblüten fern vom Gleichgewicht : Chemostatexperimente und mathematische Modellierung KW - Chemostatexperimente KW - Chlorella vulgaris KW - Nichtgleichgewichts-Dynamiken KW - Phytoplanktonpopulationen KW - Synchronisation KW - chemostat experiments KW - Chlorella vulgaris KW - non-equilibrium dynamics KW - phytoplankton populations KW - synchronization Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-58102 ER - TY - THES A1 - Riedel, Katja T1 - Elucidation of the epithelial sodium channel as a salt taste receptor candidate and search for novel salt taste receptor candidates T1 - Validierung des epithelialen Natriumkanals als Salzgeschmacksrezeptor und Suche nach unbekannten menschlichen Salzgeschmacksrezeptoren N2 - Salty taste has evolved to maintain electrolyte homeostasis, serving as a detector for salt containing food. In rodents, salty taste involves at least two transduction mechanisms. One is sensitive to the drug amiloride and specific for Na+, involving epithelial sodium channel (ENaC). A second rodent transduction pathway, which is triggered by various cations, is amiloride insensitive and not almost understood to date. Studies in primates showed amiloride-sensitive as well as amiloride-insensitive gustatory responses to NaCl, implying a role of both salt taste transduction pathways in humans. However, sensory studies in humans point to largely amiloride-insensitive sodium taste perception. An involvement of ENaC in human sodium taste perception was not shown, so far. In this study, ENaC subunit protein and mRNA could be localized to human taste bud cells (TBC). Thus, basolateral αβγ-ENaC ion channels are likely in TBC of circumvallate papillae, possibly mediating basolateral sodium entry. Similarly, basolateral βγ-ENaC might play a role in fungiform TBC. Strikingly, δ-ENaC subunit was confined to taste bud pores of both papillae, likely mediating gustatory sodium entry in TBC, either apical or paracellular via tight junctions. However, regional separation of δ-ENaC and βγ-ENaC in fungiform and circumvallate TBC indicate the presence of unknown interaction partner necessary to assemble into functional ion channels. However, screening of a macaque taste tissue cDNA library did neither reveal polypeptides assembling into a functional cation channel by interaction with δ-ENaC or βγ-ENaC nor ENaC independent salt taste receptor candidates. Thus, ENaC subunits are likely involved in human taste transduction, while exact composition and identity of an amiloride (in)sensitive salt taste receptors remain unclear. Localization of δ-ENaC in human taste pores strongly suggests a role in human taste transduction. In contrast, δ-ENaC is classified as pseudogene Scnn1d in mouse. However, no experimental detected sequences are annotated, while evidences for parts of Scnn1d derived mRNAs exist. In order to elucidate if Scnn1d is possibly involved in rodent salt taste perception, Scnn1d was evaluated in this study to clarify if Scnn1d is a gene or a transcribed pseudogene in mice. Comparative mapping of human SCNN1D to mouse chromosome 4 revealed complete Scnn1d sequence as well as its pseudogenization by Mus specific endogenous retroviruses. Moreover, tissue specific transcription of unitary Scnn1d pseudogene was found in mouse vallate papillae, kidney and testis and led to identification of nine Scnn1d transcripts. In vitro translation experiments showed that Scnn1d transcripts are coding competent for short polypeptides, possibly present in vivo. However, no sodium channel like function or sodium channel modulating activity was evident for Scnn1d transcripts and/or derived polypeptides. Thus, an involvement of mouse δ-ENaC in sodium taste transduction is unlikely and points to species specific differences in salt taste transduction mechanisms. N2 - Der Salzgeschmack ermöglicht elektrolytreiche Nahrungsquellen zu erkennen und ist eine essentielle Komponente für den Erhalt des Elektrolythaushalts. In Nagern sind bisher zwei Mechanismen bekannt, welche an der Vermittlung des Salzgeschmacks beteiligt sind. Ein Natrium-spezifischer, Amilorid-sensitiver Signaltransduktionsweg wird über den epithelialen Natriumkanal (ENaC) vermittelt. Ein weiterer, bisher ungeklärter Transduktionsweg, ist Amilorid-unempfindlich und wird durch verschiedene Kationen vermittelt. Studien in Primaten konnten Amilorid-sensitive als auch -insensitive gustatorische Signaltransduktionswege nachweisen, wohingegen sensorische Studien auf eine Amilorid-Unempfindlichkeit des Natrium-spezifischen humanen Salzgeschmacks hinweisen. Eine Beteiligung des ENaC bei der Vermittlung des menschlichen Salzgeschmacks wurde bislang nicht gezeigt. In dieser Arbeit konnte die mRNA als auch Proteine von ENaC Untereineiten in menschlichen Geschmacksrezeptorzellen (GRZ) lokalisiert werden. Demzufolge, sind αβγ-ENaC Ionenkanäle möglicherweise an einem basolateralen Natriumeinstrom in circumvallaten GRZ beteiligt. Die basolaterale Lokalisation von βγ-ENaC in fungiformen GRZ weißt auf eine gleichartige Funktion hin. Die außergewöhnliche Lokalisation der δ-ENaC Untereineit ausschließlich in der Porenregion von Geschmacksknospen beider Geschmackspapillen, legt eine Beteiligung dieser ENaC Untereinheit bei der Vermittlung geschmacksrelevanter apikaler bzw. transzellulärer Natriumströme nahe. Gleichwohl weist die räumliche Trennung von apikalen δ-ENaC und basolateralen βγ-ENaC auf die Existenz unbekannter Interaktionspartner hin, da beide getrennt voneinander nicht in der Lage sind effektive Natriumkanäle zu assemblieren. Die Durchmusterung einer geschmacksrelevanten cDNA Bibliothek führte weder zur Identifikation von ENaC Interaktionspartnern, noch von ENaC unabhängigen Polypeptiden, welche in der Lage sind einen Kationenkanal zu bilden. Die genaue Zusammensetzung humaner Amilorid- (in)sensitiver Salzrezeptoren bleibt daher unklar und ein spannendes Feld. Der Nachweis von ENaC in humanen GRZ und insbesondere die Poren assoziierte Lokalisation der δ-ENaC Untereinheit impliziert eine wichtige Rolle bei der gustatorischen Signaltransduktion. Erstaunlicherweise ist die orthologe δ-ENaC Untereinheit der Maus als Scnn1d Pseudogen klassifiziert. Neben dieser automatischen Annotierung sind keine experimentell ermittelten Sequenzen in Datenbanken hinterlegt obwohl Scnn1d abgeleitete mRNA nachgewiesen werden konnte. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht ob Scnn1d ein Gen oder ein transkribiertes Pseudogen ist, um eine mögliche Rolle bei der Transduktion des murinen Salzgeschmacks zu klären. Durch Sequenzabgleich mit humanen SCNN1D konnte das vollständige Scnn1d Gen auf dem Chromosom 4 der Maus identifiziert werden, wobei sich dessen Pseudogenisierung durch Mus spezifische endogene Retroviren zeigte. Darüber hinaus wurden neun gewebsspezifische Scnn1d Transkripte nachgewiesen, welche für kurze Polypeptide kodieren. Eine mögliche Funktion derselben als Ionenkanal bzw. eine modulatorische Funktion konnte nicht gezeigt werden. Eine Beteiligung des pseudogenisierten δ-ENaC an der Vermittlung des Salzgeschmacks der Maus ist daher unwahrscheinlich und deutet auf Speziesunterschiede der Salzgeschmacksvermittlung hin. KW - ENaC KW - Salzgeschmack KW - ENaC KW - salt taste perception Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-58764 ER - TY - THES A1 - Loßow, Kristina T1 - Erzeugung und Charakterisierung von Mausmodellen mit lichtsensitivem Geschmackssystem zur Aufklärung der neuronalen Geschmackskodierung T1 - Generation and characterization of transgenic lines of mice to elucidate neuralnetworks engaged in processing of gustatory information N2 - Die Wahrnehmung von Geschmacksempfindungen beruht auf dem Zusammenspiel verschiedener Sinneseindrücke wie Schmecken, Riechen und Tasten. Diese Komplexität der gustatorischen Wahrnehmung erschwert die Beantwortung der Frage wie Geschmacksinformationen vom Mund ins Gehirn weitergeleitet, prozessiert und kodiert werden. Die Analysen zur neuronalen Prozessierung von Geschmacksinformationen erfolgten zumeist mit Bitterstimuli am Mausmodell. Zwar ist bekannt, dass das Genom der Maus für 35 funktionelle Bitterrezeptoren kodiert, jedoch war nur für zwei unter ihnen ein Ligand ermittelt worden. Um eine bessere Grundlage für tierexperimentelle Arbeiten zu schaffen, wurden 16 der 35 Bitterrezeptoren der Maus heterolog in HEK293T-Zellen exprimiert und in Calcium-Imaging-Experimenten funktionell charakterisiert. Die Daten belegen, dass das Funktionsspektrum der Bitterrezeptoren der Maus im Vergleich zum Menschen enger ist und widerlegen damit die Aussage, dass humane und murine orthologe Rezeptoren durch das gleiche Ligandenspektrum angesprochen werden. Die Interpretation von tierexperimentellen Daten und die Übertragbarkeit auf den Menschen werden folglich nicht nur durch die Komplexität des Geschmacks, sondern auch durch Speziesunterschiede verkompliziert. Die Komplexität des Geschmacks beruht u. a. auf der Tatsache, dass Geschmacksstoffe selten isoliert auftreten und daher eine Vielzahl an Informationen kodiert werden muss. Um solche geschmacksstoffassoziierten Stimuli in der Analyse der gustatorischen Kommunikationsbahnen auszuschließen, sollten Opsine, die durch Licht spezifischer Wellenlänge angeregt werden können, für die selektive Ersetzung von Geschmacksrezeptoren genutzt werden. Um die Funktionalität dieser angestrebten Knockout-Knockin-Modelle zu evaluieren, die eine Kopplung von Opsinen mit dem geschmacksspezifischen G-Protein Gustducin voraussetzte, wurden Oozyten vom Krallenfrosch Xenopus laevis mit dem Zwei-Elektroden-Spannungsklemm-Verfahren hinsichtlich dieser Interaktion analysiert. Der positiven Bewertung dieser Kopplung folgte die Erzeugung von drei Mauslinien, die in der kodierenden Region eines spezifischen Geschmacksrezeptors (Tas1r1, Tas1r2, Tas2r114) Photorezeptoren exprimierten. Durch RT-PCR-, In-situ-Hybridisierungs- und immunhistochemische Experimente konnte der erfolgreiche Knockout der Rezeptorgene und der Knockin der Opsine belegt werden. Der Nachweis der Funktionalität der Opsine im gustatorischen System wird Gegenstand zukünftiger Analysen sein. Bei erfolgreichem Beleg der Lichtempfindlichkeit von Geschmacksrezeptorzellen dieser Mausmodelle wäre ein System geschaffen, dass es ermöglichen würde, gustatorische neuronale Netzwerke und Hirnareale zu identifizieren, die auf einen reinen geschmacks- und qualitätsspezifischen Stimulus zurückzuführen wären. N2 - Taste impression is based on the interaction of taste, smell and touch. To evaluate the nutritious content of food mammals possess five distinct taste qualities: sweet, bitter, umami (taste of amino acids), sour and salty. For bitter, sweet, and umami compounds taste signaling is initiated by binding of tastants to G protein-coupled receptors. The interactions of taste stimuli, usually watersoluble chemicals, with their cognate receptors lead to the activation of the G protein gustducin, which, in turn, initiates a signal resulting in the activation of gustatory afferents. However, details of gustatory signal transmission and processing as well as neural coding are only incompletely understood. This is partly due to the property of some tastants to elicit several sensations simultaneously, unspecific effects caused by the temperature, viscosity, osmolarity, and pH of the solvents, as well as by mechanical stimulation of the tongue during stimulus application. The analysis of gustatory processing of taste information are mainly based on mouse models after stimulation with bitter taste stimuli. Even though it is known that the mouse genome codes for 35 bitter taste receptor genes only few of them had been analysed so far. For better understanding and interpretation of animal experiments 16 mouse bitter receptors had been analysed by Calcium Imaging experiments with HEK293T cells. The data reveal that mouse bitter taste receptors are more narrow tuned than human bitter taste receptors, proving that the ligand spectra of murine and human orthologous receptors are not complient. In order to avoid the disturbing effects of solvents and stimulus application on the analysis of gustatory information transfer and processing, I employ an optogenetical approach to address this problem. For this purpose I generated three strains of gene-targeted mice in which the coding regions of the genes for the umami receptor subunit Tas1r1, the sweet receptor subunit Tas1r2 or the bitter taste receptor Tas2r114 have been replaced by the coding sequences of different opsins (photoreceptors of visual transduction) that are sensitive to light of various wavelengths. In these animals I should be able to activate sweet, bitter, or umami signalling by light avoiding any solvent effects. In initial experiments of this project I demonstrated that the various visual opsins indeed functionally couple to taste signal transduction pathway in oocyte expression system, generating basic knowledge and foundation for the generation of the gene-targeted animals. The knockout-knockin strategies have been successfully realized in the case of all three mouse models, revealed by RT-PCR, in situ hybridization and immunohistochemical analysis of taste papillae. All data confirm that the particular taste receptors have been replaced by the different opsins in taste cells. Further analysis concerning the functional consequences of opsin knockin and taste receptor knockout are part of prospective work. KW - Geschmack KW - G-Protein-gekoppelte Rezeptoren KW - Bitterrezeptoren KW - Optogenetik KW - taste KW - G protein-coupled receptors KW - bitter taste receptors KW - optogenetic Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-58059 ER - TY - THES A1 - Schütte, Moritz T1 - Evolutionary fingerprints in genome-scale networks T1 - Evolutionäre Spuren in genomskaligen Netzwerken N2 - Mathematical modeling of biological phenomena has experienced increasing interest since new high-throughput technologies give access to growing amounts of molecular data. These modeling approaches are especially able to test hypotheses which are not yet experimentally accessible or guide an experimental setup. One particular attempt investigates the evolutionary dynamics responsible for today's composition of organisms. Computer simulations either propose an evolutionary mechanism and thus reproduce a recent finding or rebuild an evolutionary process in order to learn about its mechanism. The quest for evolutionary fingerprints in metabolic and gene-coexpression networks is the central topic of this cumulative thesis based on four published articles. An understanding of the actual origin of life will probably remain an insoluble problem. However, one can argue that after a first simple metabolism has evolved, the further evolution of metabolism occurred in parallel with the evolution of the sequences of the catalyzing enzymes. Indications of such a coevolution can be found when correlating the change in sequence between two enzymes with their distance on the metabolic network which is obtained from the KEGG database. We observe that there exists a small but significant correlation primarily on nearest neighbors. This indicates that enzymes catalyzing subsequent reactions tend to be descended from the same precursor. Since this correlation is relatively small one can at least assume that, if new enzymes are no "genetic children" of the previous enzymes, they certainly be descended from any of the already existing ones. Following this hypothesis, we introduce a model of enzyme-pathway coevolution. By iteratively adding enzymes, this model explores the metabolic network in a manner similar to diffusion. With implementation of an Gillespie-like algorithm we are able to introduce a tunable parameter that controls the weight of sequence similarity when choosing a new enzyme. Furthermore, this method also defines a time difference between successive evolutionary innovations in terms of a new enzyme. Overall, these simulations generate putative time-courses of the evolutionary walk on the metabolic network. By a time-series analysis, we find that the acquisition of new enzymes appears in bursts which are pronounced when the influence of the sequence similarity is higher. This behavior strongly resembles punctuated equilibrium which denotes the observation that new species tend to appear in bursts as well rather than in a gradual manner. Thus, our model helps to establish a better understanding of punctuated equilibrium giving a potential description at molecular level. From the time-courses we also extract a tentative order of new enzymes, metabolites, and even organisms. The consistence of this order with previous findings provides evidence for the validity of our approach. While the sequence of a gene is actually subject to mutations, its expression profile might also indirectly change through the evolutionary events in the cellular interplay. Gene coexpression data is simply accessible by microarray experiments and commonly illustrated using coexpression networks where genes are nodes and get linked once they show a significant coexpression. Since the large number of genes makes an illustration of the entire coexpression network difficult, clustering helps to show the network on a metalevel. Various clustering techniques already exist. However, we introduce a novel one which maintains control of the cluster sizes and thus assures proper visual inspection. An application of the method on Arabidopsis thaliana reveals that genes causing a severe phenotype often show a functional uniqueness in their network vicinity. This leads to 20 genes of so far unknown phenotype which are however suggested to be essential for plant growth. Of these, six indeed provoke such a severe phenotype, shown by mutant analysis. By an inspection of the degree distribution of the A.thaliana coexpression network, we identified two characteristics. The distribution deviates from the frequently observed power-law by a sharp truncation which follows after an over-representation of highly connected nodes. For a better understanding, we developed an evolutionary model which mimics the growth of a coexpression network by gene duplication which underlies a strong selection criterion, and slight mutational changes in the expression profile. Despite the simplicity of our assumption, we can reproduce the observed properties in A.thaliana as well as in E.coli and S.cerevisiae. The over-representation of high-degree nodes could be identified with mutually well connected genes of similar functional families: zinc fingers (PF00096), flagella, and ribosomes respectively. In conclusion, these four manuscripts demonstrate the usefulness of mathematical models and statistical tools as a source of new biological insight. While the clustering approach of gene coexpression data leads to the phenotypic characterization of so far unknown genes and thus supports genome annotation, our model approaches offer explanations for observed properties of the coexpression network and furthermore substantiate punctuated equilibrium as an evolutionary process by a deeper understanding of an underlying molecular mechanism. N2 - Die biologische Zelle ist ein sehr kompliziertes Gebilde. Bei ihrer Betrachtung gilt es, das Zusammenspiel von Tausenden bis Millionen von Genen, Regulatoren, Proteinen oder Molekülen zu beschreiben und zu verstehen. Durch enorme Verbesserungen experimenteller Messgeräte gelingt es mittlerweile allerdings in geringer Zeit enorme Datenmengen zu messen, seien dies z.B. die Entschlüsselung eines Genoms oder die Konzentrationen der Moleküle in einer Zelle. Die Systembiologie nimmt sich dem Problem an, aus diesem Datenmeer ein quantitatives Verständnis für die Gesamtheit der Wechselwirkungen in der Zelle zu entwickeln. Dabei stellt die mathematische Modellierung und computergestützte Analyse ein eminent wichtiges Werkzeug dar, lassen sich doch am Computer in kurzer Zeit eine Vielzahl von Fällen testen und daraus Hypothesen generieren, die experimentell verifiziert werden können. Diese Doktorarbeit beschäftigt sich damit, wie durch mathematische Modellierung Rückschlüsse auf die Evolution und deren Mechanismen geschlossen werden können. Dabei besteht die Arbeit aus zwei Teilen. Zum Einen wurde ein Modell entwickelt, dass die Evolution des Stoffwechsels nachbaut. Der zweite Teil beschäftigt sich mit der Analyse von Genexpressionsdaten, d.h. der Stärke mit der ein bestimmtes Gen in ein Protein umgewandelt, "exprimiert", wird. Der Stoffwechsel bezeichnet die Gesamtheit der chemischen Vorgänge in einem Organismus; zum Einen werden Nahrungsstoffe für den Organismus verwertbar zerlegt, zum Anderen aber auch neue Stoffe aufgebaut. Da für nahezu jede chemische Reaktion ein katalysierendes Enzym benötigt wird, ist davon auszugehen, dass sich der Stoffwechsel parallel zu den Enzymen entwickelt hat. Auf dieser Annahme basiert das entwickelte Modell zur Enzyme-Stoffwechsel-Koevolution. Von einer Anfangsmenge von Enzymen und Molekülen ausgehend, die etwa in einer primitiven Atmosphäre vorgekommen sind, werden sukzessive Enzyme und die nun katalysierbaren Reaktionen hinzugefügt, wodurch die Stoffwechselkapazität anwächst. Die Auswahl eines neuen Enzyms geschieht dabei in Abhängigkeit von der Ähnlichkeit mit bereits vorhandenen und ist so an den evolutionären Vorgang der Mutation angelehnt: je ähnlicher ein neues Enzym zu den vorhandenen ist, desto schneller kann es hinzugefügt werden. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis der Stoffwechsel die heutige Form angenommen hat. Interessant ist vor allem der zeitliche Verlauf dieser Evolution, der mittels einer Zeitreihenanalyse untersucht wird. Dabei zeigt sich, dass neue Enzyme gebündelt in Gruppen kurzer Zeitfolge auftreten, gefolgt von Intervallen relativer Stille. Dasselbe Phänomen kennt man von der Evolution neuer Arten, die ebenfalls gebündelt auftreten, und wird Punktualismus genannt. Diese Arbeit liefert somit ein besseres Verständnis dieses Phänomens durch eine Beschreibung auf molekularer Ebene. Im zweiten Projekt werden Genexpressionsdaten von Pflanzen analysiert. Einerseits geschieht dies mit einem eigens entwickelten Cluster-Algorithmus. Hier läßt sich beobachten, dass Gene mit einer ähnlichen Funktion oft auch ein ähnliches Expressionsmuster aufweisen. Das Clustering liefert einige Genkandidaten, deren Funktion bisher unbekannt war, von denen aber nun vermutet werden konnte, dass sie enorm wichtig für das Wachstum der Pflanze sind. Durch Experimente von Pflanzen mit und ohne diese Gene zeigte sich, dass sechs neuen Genen dieses essentielle Erscheinungsbild zugeordnet werden kann. Weiterhin wurden Netzwerke der Genexpressionsdaten einer Pflanze, eines Pilzes und eines Bakteriums untersucht. In diesen Netzwerken werden zwei Gene verbunden, falls sie ein sehr ähnliches Expressionsprofil aufweisen. Nun zeigten diese Netzwerke sehr ähnliche und charakteristische Eigenschaften auf. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher ein weiteres evolutionäres Modell entwickelt, das die Expressionsprofile anhand von Duplikation, Mutation und Selektion beschreibt. Obwohl das Modell auf sehr simplen Eigenschaften beruht, spiegelt es die beobachteten Eigenschaften sehr gut wider, und es läßt sich der Schluss ziehen, dass diese als Resultat der Evolution betrachtet werden können. Die Ergebnisse dieser Arbeiten sind als Doktorarbeit in kumulativer Form bestehend aus vier veröffentlichten Artikeln vereinigt. KW - Systembiologie KW - Modellierung KW - Evolution KW - Stoffwechsel KW - Gen-Koexpression KW - Systems Biology KW - Modeling KW - Evolution KW - Metabolism KW - Gene co-expression Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-57483 ER - TY - THES A1 - Giorgi, Federico Manuel T1 - Expression-based reverse engineering of plant transcriptional networks T1 - Expressionsbasierte Rekonstruktion von pflanzlichen Transkriptionsnetzwerken N2 - Regulation of gene transcription plays a major role in mediating cellular responses and physiological behavior in all known organisms. The finding that similar genes are often regulated in a similar manner (co-regulated or "co-expressed") has directed several "guilt-by-association" approaches in order to reverse-engineer the cellular transcriptional networks using gene expression data as a compass. This kind of studies has been considerably assisted in the recent years by the development of high-throughput transcript measurement platforms, specifically gene microarrays and next-generation sequencing. In this thesis, I describe several approaches for improving the extraction and interpretation of the information contained in microarray based gene expression data, through four steps: (1) microarray platform design, (2) microarray data normalization, (3) gene network reverse engineering based on expression data and (4) experimental validation of expression-based guilt-by-association inferences. In the first part test case is shown aimed at the generation of a microarray for Thellungiella salsuginea, a salt and drought resistant close relative to the model plant Arabidopsis thaliana; the transcripts of this organism are generated on the combination of publicly available ESTs and newly generated ad-hoc next-generation sequencing data. Since the design of a microarray platform requires the availability of highly reliable and non-redundant transcript models, these issues are addressed consecutively, proposing several different technical solutions. In the second part I describe how inter-array correlation artifacts are generated by the common microarray normalization methods RMA and GCRMA, together with the technical and mathematical characteristics underlying the problem. A solution is proposed in the form of a novel normalization method, called tRMA. The third part of the thesis deals with the field of expression-based gene network reverse engineering. It is shown how different centrality measures in reverse engineered gene networks can be used to distinguish specific classes of genes, in particular essential genes in Arabidopsis thaliana, and how the use of conditional correlation can add a layer of understanding over the information flow processes underlying transcript regulation. Furthermore, several network reverse engineering approaches are compared, with a particular focus on the LASSO, a linear regression derivative rarely applied before in global gene network reconstruction, despite its theoretical advantages in robustness and interpretability over more standard methods. The performance of LASSO is assessed through several in silico analyses dealing with the reliability of the inferred gene networks. In the final part, LASSO and other reverse engineering methods are used to experimentally identify novel genes involved in two independent scenarios: the seed coat mucilage pathway in Arabidopsis thaliana and the hypoxic tuber development in Solanum tuberosum. In both cases an interesting method complementarity is shown, which strongly suggests a general use of hybrid approaches for transcript expression-based inferences. In conclusion, this work has helped to improve our understanding of gene transcription regulation through a better interpretation of high-throughput expression data. Part of the network reverse engineering methods described in this thesis have been included in a tool (CorTo) for gene network reverse engineering and annotated visualization from custom transcription datasets. N2 - Die Regulation der Gentranskription spielt eine wichtige Rolle bei der Steuerung des physiologischen Verhaltens in allen Organismen. Dass ähnliche Gene oft in gleicher Weise reguliert werden (koreguliert oder koexpimiert), hat zu diversen „guilt-by-association“-Ansätzen zur Rekonstruktion von zellulären Transkriptionsnetzwerken geführt, die Genexpressionsdaten zur Orientierung nutzen. Studien dieser Art wurden in den letzten Jahren durch die Entwicklung von Hochdurchsatzmessungen von Transkriptmengen mittels Mikroarrays und ‚Next Generation‘ Sequenziertechniken stark gefördert. In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene Ansätze zur Verbesserung der Extraktion und Interpretation von Mikroarray-basierten Genexpressionsdaten in vier Schritten beschrieben: (1) Mikroarray-Sonden-Design, (2) Mikroarray Datennormalisierung, (3) Rekonstruktion von Gennetzwerken unter Verwendung von Expressionsdaten und (4) experimentelle Überprüfung von expressionsbasierten „guilt-by-association“ Schlussfolgerungen. Im ersten Teil wird ein Beispiel zur Erstellung eines Mikroarrays für Thelungiella salsuginea gezeigt, einem salz- und trockenresistenten Verwandten von Arabidopsis thaliana. Zur Rekonstruktion der Transkripte wurden sowohl öffentliche ESTs (‚expressed sequence tags‘) als auch neu erzeugte ‚Next Generation‘ Sequenzierdaten genutzt. Da das Design von Mikroarrays speziesspezifische, nicht-redundante Transkriptmodelle erfordert, werden diese Aufgaben nacheinander abgearbeitet und verschiedene technische Lösungsmöglichkeiten aufgezeigt. Im zweiten Teil wird beschrieben, wie übliche Mikroarray-Normalisierungsverfahren wie RMA und GCRMA zu Korrelationsartefakten führen können. Technische sowie mathematische Hintergründe werden erläutert und zur Lösung des Problems wird mit tRMA eine neue Normalisierungsmethode vorgestellt. Der dritte Teil der Arbeit beschäftigt sich der expressionsbasierten Rekonstruktion von Gennetzwerken. Es wird demonstriert, wie dabei verschiedene „Zentralitäten“ bei zur Unterscheidung von spezifischen Genklassen, hier beispielhaft essentielle Gene von Arabidopsis thaliana, genutzt werden können und wie die Verwendung von konditioneller Korrelation tieferes Verständnis des der Transkriptionsregulation zugrundeliegenden Informationsflusses ermöglicht. Weiterhin werden Ansätze zur Netzwerkrekonstruktion verglichen. Besonderes Augenmerk liegt dabei auf der LASSO Technik, einer Art linearer Regression, die trotz ihren theoretischen Vorteilen in Robustheit und Interpretierbarkeit gegenüber Standardmethoden bisher selten zur Rekonstruktion von globalen Gennetzwerken genutzt wurde. Die Leistungsfähigkeit von LASSO wird durch in silico Analysen der Zuverlässigkeit der erstellten Gennetzwerke gemessen. Im letzten Teil der Arbeit wurden LASSO und andere Rekonstruktionsmethoden genutzt um experimentell neue Gene der folgenden zwei Szenarien zu identifizieren: im Samenschleim von Arabidopsis thaliana und während der Knollenentwicklung von Solanum tuberosum unter Sauerstoffmangel. In beiden Fällen wird eine interessante Methodenkomplementarität gezeigt, nach welcher eine Mischung mehrerer Ansätze zu empfehlen ist um Schlüsse aufgrund von Transkriptexpression zu ziehen. Zusammenfassend zielt diese Arbeit darauf ab, das Verständnis der Regulation von Gentranskriptionsnetzwerken durch bessere Interpretation von Hochdurchsatzexpressionsdaten zu verbessern. Ein Teil der in dieser Arbeit beschriebenen Methoden wurden im Programm CorTo zur Gennetzwerkrekonstruktion und annotierten Visualisierung von benutzerdefinierten Transkriptionsdaten verarbeitet. KW - Koexpression KW - Microarrays KW - Essentialität KW - Transkriptionsnetzwerke KW - LASSO KW - Coexpression KW - microarrays KW - essentiality KW - networks KW - LASSO Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-56760 ER - TY - THES A1 - Naaf, Tobias T1 - Floristic homogenization and impoverishment : herb layer changes over two decades in deciduous forest patches of the Weser-Elbe region (NW Germany) T1 - Floristische Homogenisierung und Verarmung : Krautschichtveränderungen über 20 Jahre in Laubwaldfragmenten des Elbe-Weser-Dreiecks (NW-Dtl.) N2 - Human-induced alterations of the environment are causing biotic changes worldwide, including the extinction of species and a mixing of once disparate floras and faunas. One type of biological communities that is expected to be particularly affected by environmental alterations are herb layer plant communities of fragmented forests such as those in the west European lowlands. However, our knowledge about current changes in species diversity and composition in these communities is limited due to a lack of adequate long-term studies. In this thesis, I resurveyed the herb layer communities of ancient forest patches in the Weser-Elbe region (NW Germany) after two decades using 175 semi-permanent plots. The general objectives were (i) to quantify changes in plant species diversity considering also between-community (β) and functional diversity, (ii) to determine shifts in species composition in terms of species’ niche breadth and functional traits and (iii) to find indications on the most likely environmental drivers for the observed changes. These objectives were pursued with four independent research papers (Chapters 1-4) whose results were brought together in a General Discussion. Alpha diversity (species richness) increased by almost four species on average, whereas β diversity tended to decrease (Chapter 1). The latter is interpreted as a beginning floristic homogenization. The observed changes were primarily the result of a spread of native habitat generalists that are able to tolerate broad pH and moisture ranges. The changes in α and β diversity were only significant when species abundances were neglected (Chapters 1 and 2), demonstrating that the diversity changes resulted mainly from gains and losses of low-abundance species. This study is one of the first studies in temperate Europe that demonstrates floristic homogenization of forest plant communities at a larger than local scale. The diversity changes found at the taxonomic level did not result in similar changes at the functional level (Chapter 2). The likely reason is that these communities are functionally “buffered”. Single communities involve most of the functional diversity of the regional pool, i.e., they are already functionally rich, while they are functionally redundant among each other, i.e., they are already homogeneous. Independent of taxonomic homogenization, the abundance of 30 species decreased significantly (Chapter 4). These species included 12 ancient forest species (i.e., species closely tied to forest patches with a habitat continuity > 200 years) and seven species listed on the Red List of endangered plant species in NW Germany. If these decreases continue over the next decades, local extinctions may result. This biotic impoverishment would seriously conflict with regional conservation goals. Community assembly mechanisms changed at the local level particularly at sites that experienced disturbance by forest management activities between the sampling periods (Chapter 3). Disturbance altered community assembly mechanisms in two ways: (i) it relaxed environmental filters and allowed the coexistence of different reproduction strategies, as reflected by a higher diversity of reproductive traits at the time of the resurvey, and (ii) it enhanced light availability and tightened competitive filters. These limited the functional diversity with respect to canopy height and selected for taller species. Thirty-one winner and 30 loser species, which had significantly increased or decreased in abundance, respectively, were characterized by various functional traits and ecological performances to find indications on the most likely environmental drivers for the observed floristic changes (Chapter 4). Winner species had higher seed longevity, flowered later in the season and had more often an oceanic distribution compared to loser species. Loser species tended to have a higher specific leaf area, to be more susceptible to deer browsing and to have a performance optimum at higher soil pH values compared to winner species. Multiple logistic regression analyses indicated that disturbances due to forest management interventions were the primary cause of the species shifts. As one of the first European resurvey studies, this study provides indications that an enhanced browsing pressure due to increased deer densities and increasingly warmer winters are important drivers. The study failed to demonstrate that eutrophication and acidification due to atmospheric deposition substantially drive herb layer changes. The restriction of the sample to the most base-rich sites in the region is discussed as a likely reason. Furthermore, the decline of several ancient forest species is discussed as an indication that the forest patches are still paying off their “extinction debt”, i.e., exhibit a delayed response to forest fragmentation. N2 - Umweltveränderungen beeinträchtigen weltweit die Artenvielfalt. Die Lebensgemeinschaften fragmentierter Lebensräume gelten als besonders anfällig für Veränderungen. In dieser Arbeit wurden Untersuchungen an Krautschichtgemeinschaften historisch alter Waldfragmente im Elbe-Weser-Dreieck nach zwei Jahrzehnten wiederholt. Ziel war es anhand von 175 semi-permanenten Aufnahmeflächen (i) die Veränderungen der Pflanzenartendiversität zu quantifizieren, (ii) Artenverschiebungen in Bezug auf Nischenbreite und funktionale Merkmale festzustellen und (iii) Hinweise auf die verantwortlichen Umweltveränderungen zu finden. Die α-Diversität (Artenzahl) stieg durchschnittlich um vier Arten an. Die β-Diversität (Artenturnover zwischen den Flächen) nahm tendenziell ab. Letzteres wird als Beginn einer floristischen Homogenisierung interpretiert. Diese Studie ist eine der ersten im gemäßigten Europa, die eine floristische Homogenisierung von Waldpflanzengemeinschaften auf einer größeren als der lokalen Ebene aufzeigt. Die Diversitätsveränderungen auf taxonomischer Ebene führten nicht zu ähnlichen Veränderungen auf funktionaler Ebene. Bereits einzelne Gemeinschaften wiesen den Großteil der funktionalen Vielfalt des regionalen Artenpools, also ein Maximum an funktionaler Diversität auf. Gleichzeitig waren sie untereinander funktional redundant, also bereits homogen. Die mit der beginnenden taxonomischen Homogenisierung verbundene floristische Verarmung wird als gering eingestuft, da die Homogenisierung primär das Ergebnis der Zuwanderung häufig vorkommender Standortgeneralisten war. Unabhängig von der Homogenisierung gingen 30 Arten signifikant in ihrer Abundanz zurück, darunter 12 an historisch alte Wälder gebundene Arten sowie sieben Rote-Liste-Arten. Ein weiterer Rückgang oder ein lokales Aussterben dieser Arten stünde im Widerspruch zu regionalen Naturschutzzielen. Nullmodelltests und der Vergleich funktionaler und taxonomischer Diversitätskomponenten lassen auf regionaler Ebene auf eine zeitliche Konstanz der grundlegenden Mechanismen der Artenvergesellschaftung schließen. Auf der lokalen Ebene veränderten sich die Vergesellschaftungsmechanismen erheblich, insbesondere auf forstwirtschaftlich gestörten Standorten. Einerseits ermöglichte dort eine Abschwächung der Umweltfilter die Koexistenz von Arten mit unterschiedlichen Reproduktionsstrategien. Andererseits führte die erhöhte Lichtverfügbarkeit zu einer Verstärkung der Konkurrenzfilter und einer Selektion hochwüchsiger Arten. Gewinner- und Verliererarten wurden anhand funktionaler Merkmale und ihres ökologischen Verhaltens charakterisiert, um Hinweise auf die verantwortlichen Umweltveränderungen zu finden. Gewinnerarten wiesen eine höhere Langlebigkeit der Samen auf, blühten später in der Vegetationsperiode und hatten öfter eine ozeanische Verbreitung. Verliererarten hatten eine höhere spezifische Blattfläche, einen höheren Attraktivitätswert als Wildäsung und ein ökologisches Optimum bei höheren pH-Werten. Logistische Regressionsanalysen zeigen, dass Störung durch forstwirtschaftliche Eingriffe hauptverantwortlich für die Artenverschiebungen war. Zusätzlich liefert diese Wiederholungsstudie als eine der ersten in Europa Hinweise darauf, dass ein erhöhter Äsungsdruck sowie zunehmend mildere Winter entscheidende Einflussfaktoren darstellen. Der Rückgang mehrerer an historisch alte Wälder gebundener Arten wird als Anzeichen für eine verspätete Reaktion auf die Waldfragmentierung diskutiert. KW - Beta-Diversität KW - Funktionelle Diversität KW - Globaler Wandel KW - Langzeitveränderung KW - Wiederholungsstudie KW - beta diversity KW - functional diversity KW - global change KW - long-term change KW - resurvey Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-52446 ER - TY - THES A1 - Kittner, Madeleine T1 - Folding and aggregation of amyloid peptides T1 - Faltung und Aggregation von Amyloidpeptiden N2 - Aggregation of the Amyloid β (Aβ) peptide to amyloid fibrils is associated with the outbreak of Alzheimer’s disease. Early aggregation intermediates in form of soluble oligomers are of special interest as they are believed to be the major toxic components in the process. These oligomers are of disordered and transient nature. Therefore, their detailed molecular structure is difficult to access experimentally and often remains unknown. In the present work extensive, fully atomistic replica exchange molecular dynamics simulations were performed to study the preaggregated, monomer states and early aggregation intermediates (dimers, trimers) of Aβ(25-35) and Aβ(10-35)-NH2 in aqueous solution. The folding and aggregation of Aβ(25-35) were studied at neutral pH and 293 K. Aβ(25-35) monomers mainly adopt β-hairpin conformations characterized by a β-turn formed by residues G29 and A30, and a β-sheet between residues N27–K28 and I31–I32 in equilibrium with coiled conformations. The β-hairpin conformations served as initial configurations to model spontaneous aggregation of Aβ(25-35). As expected, within the Aβ(25-35) dimer and trimer ensembles many different poorly populated conformations appear. Nevertheless, we were able to distinguish between disordered and fibril-like oligomers. Whereas disordered oligomers are rather compact with few intermolecular hydrogen bonds (HBs), fibril-like oligomers are characterized by the formation of large intermolecular β-sheets. In most of the fibril-like dimers and trimers individual peptides are fully extended forming in- or out-of-register antiparallel β-sheets. A small amount of fibril-like trimers contained V-shaped peptides forming parallel β-sheets. The dimensions of extended and V-shaped oligomers correspond well to the diameters of two distinct morphologies found for Aβ(25-35) fibrils. The transition from disordered to fibril-like Aβ(25-35) dimers is unfavorable but driven by energy. The lower energy of fibril-like dimers arises from favorable intermolecular HBs and other electrostatic interactions which compete with a loss in entropy. Approximately 25 % of the entropic cost correspond to configurational entropy. The rest relates to solvent entropy, presumably caused by hydrophobic and electrostatic effects. In contrast to the transition towards fibril-like dimers the first step of aggregation is driven by entropy. Here, we compared structural and thermodynamic properties of the individual monomer, dimer and trimer ensembles to gain qualitative information about the aggregation process. The β-hairpin conformation observed for monomers is successively dissolved in dimer and trimer ensembles while instead intermolecular β-sheets are formed. As expected upon aggregation the configurational entropy decreases. Additionally, the solvent accessible surface area (SASA), especially the hydrophobic SASA, decreases yielding a favorable solvation free energy which overcompensates the loss in configurational entropy. In summary, the hydrophobic effect, possibly combined with electrostatic effects, yields an increase in solvent entropy which is believed to be one major driving force towards aggregation. Spontaneous folding of the Aβ(10-35)-NH2 monomer was modeled using two force fields, GROMOS96 43a1 and OPLS/AA, and compared to primary NMR data collected at pH 5.6 and 283 K taken from the literature. Unexpectedly, the two force fields yielded significantly different main conformations. Comparison between experimental and calculated nuclear Overhauser effect (NOE) distances is not sufficient to distinguish between the different force fields. Additionally, the comparison with scalar coupling constants suggest that the chosen protonation in both simulations corresponds to a pH lower than in the experiment. Based on this analysis we were unable to determine which force field yields a better description of this system. Dimerization of Aβ(10-35)-NH2 was studied at neutral pH and 300 K. Dimer conformations arrange in many distinct, poorly populated and rather complex alignments or interlocking patterns which are rather stabilized by side chain interactions than by specific intermolecular hydrogen bonds. Similar to Aβ(25-35) dimers, transition towards β-sheet-rich, fibril-like Aβ(10-35) dimers is driven by energy competing with a loss in entropy. Here, transition is mediated by favorable peptide-solvent and solvent-solvent interactions mainly arising from electrostatic interactions. N2 - Die Aggregation des Amyloid β (Aβ) Peptids zu Amyloidfibrillen wird mit dem Ausbruch der Alzheimer Krankheit in Verbindung gebracht. Die toxische Wirkung auf Zellen wird vor allem den zeitigen Intermediaten in Form von löslichen Oligomeren zugeschrieben. Aufgrund deren ungeordneter und flüchtiger Natur kann die molekulare Struktur solcher zeitigen Oligomere oft experimentell nicht aufgelöst werden. In der vorliegenden Arbeit wurden aufwendige atomistische Replica-Exchange-Molekulardynamik-Simulationen durchgeführt, um die molekulare Struktur von Monomeren und Oligomeren der Fragmente Aβ(25-35) und Aβ(10-35)-NH2 in Wasser zu untersuchen. Die Faltung und Aggregation von Aβ(25-35) wurde bei neutralem pH und 293 K untersucht. Monomere dieses Fragments bilden hauptsächlich β-Haarnadelkonformationen im Gleichgewicht mit Knäulstrukturen. Innerhalb der β-Haarnadelkonformationen bilden die Residuen G29 und A30 einen β-turn, während N27–K28 and I31–I32 ein β-Faltblatt bilden. Diese β-Haarnadelkonformationen bildeten den Ausgangspunkt zur Modellierung spontaner Aggregation. Wie zu erwarten, bilden sich eine Vielzahl verschiedener, gering besetzter Dimer- und Trimerkonformationen. Mit Hilfe einer gröberen Einteilung können diese in ungeordnete und fibrillähnliche Oligomere unterteilt werden. Ungeordnete Oligomere bilden kompakte Strukturen, die nur durch wenige intermolekulare Wasserstoffbrückenbindungen (HBB) stabilisiert sind. Typisch für fibrillähnliche Oligomere ist hingegen die Ausbildung großer intermolekularer β-Faltblätter. In vielen dieser Oligomere finden wir antiparallele, in- oder out-of-register β-Faltblätter gebildet durch vollständig ausgestreckte Peptide. Ein kleiner Teil der fibrillähnlichen Trimere bildet parallele, V-förmige β-Faltblätter. Die Ausdehnungen ausgestreckter und V-förmiger Oligomere entspricht in etwa den Durchmessern von zwei verschiedenen, experimentell gefundenen Fibrillmorphologien für Aβ(25-35). Die Umwandlung von ungeordneten zu fibrillähnlichen Aβ(25-35) Dimeren ist energetisch begünstigt, läuft aber nicht freiwillig ab. Fibrillähnliche Dimere haben eine geringere Energie aufgrund günstiger Peptidwechselwirkungen (HBB, Salzbrücken), welche durch den Verlust an Entropie kompensiert wird. Etwa 25 % entsprechen dem Verlust an Konfigurationsentropie. Der restliche Anteil wird einem Verlust an Lösungsmittelentropie aufgrund von hydrophoben und elektrostatischen Effekten zugesprochen. Im Gegensatz zur Umwandlung in fibrillähnliche Dimere, ist die Assoziation von Monomeren oder Oligomeren entropisch begünstigt. Beim Vergleich thermodynamischer Eigenschaften der Monomer-, Dimer- und Trimersysteme zeigt sich im Verlauf der Aggregation, wie erwartet, eine Abnahme der Konfigurationsentropie. Zusätzlich nimmt die dem Lösungsmittel zugängliche Oberfläche (SASA), insbesondere die hydrophobe SASA, ab. In Verbindung damit beobachten wir eine Abnahme der freien Solvatisierungsenergie, welche den Verlust an Konfigurationsentropie kompensiert. Mit anderen Worten, der hydrophobe Effekt in Kombination mit elektrostatischen Wechselwirkungen führt zu einem Ansteigen der Lösungsmittelentropie und begünstigt damit die Aggegation. Die spontane Faltung des Aβ(10-35)-NH2 Monomers wurde für zwei verschiedene Proteinkraftfelder, GROMOS96 43a1 und OPLS/AA, untersucht und mit primären NMR-Daten aus der Literatur, gemessen bei pH 5.6 und 283 K, verglichen. Beide Kraftfelder generieren unterschiedliche Hauptkonformationen. Der Vergleich zwischen experimentellen und berechneten Kern-Overhauser-Effekt (NOE) Abständen ist nicht ausreichend, um zwischen beiden Kraftfeldern zu unterscheiden. Der Vergleich mit Kopplungskonstanten aus Experiment und Simulation zeigt, dass beide Simulationen einem pH-Wert geringer als 5.6 ensprechen. Basierend auf den bisherigen Ergebnissen können wir nicht entscheiden, welches Kraftfeld eine bessere Beschreibung für dieses System liefert. Die Dimerisierung von Aβ(10-35)-NH2 wurde bei neutralem pH und 300 K untersucht. Wir finden eine Vielzahl verschiedener, gering besetzter Dimerstrukturen, welche eher durch Seitenkettenkontakte als durch spezifische HBB stabilisiert sind. Wie bei den Aβ(25-35) Dimeren, ist die Umwandlung zu β-Faltblattreichen, fibrillähnlichen Aβ(10-35) Dimeren energetisch begünstigt, konkurriert aber mit einem Entropieverlust. Die Umwandlung wird in diesem Fall durch elektrostatische Wechselwirkungen zwischen Peptid und Lösungsmittel und innerhalb des Lösungsmittels bestimmt. KW - Amyloid beta KW - Proteinaggregation KW - Alzheimer KW - Molekulardynamik-Simulation KW - Thermodynamische Stabilität KW - amyloid beta KW - protein aggregation KW - Alzheimer KW - molecular dynamics simulation KW - thermodynamic stability Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-53570 ER - TY - THES A1 - Samereier, Matthias T1 - Functional analyses of microtubule and centrosome-associated proteins in Dictyostelium discoideum T1 - Funktionelle Analyse von Mikrotubuli- und Centrosom-assoziierten Proteinen in Dictyostelium discoideum N2 - Understanding the role of microtubule-associated proteins is the key to understand the complex mechanisms regulating microtubule dynamics. This study employs the model system Dictyostelium discoideum to elucidate the role of the microtubule-associated protein TACC (Transforming acidic coiled-coil) in promoting microtubule growth and stability. Dictyostelium TACC was localized at the centrosome throughout the entire cell cycle. The protein was also detected at microtubule plus ends, however, unexpectedly only during interphase but not during mitosis. The same cell cycle-dependent localization pattern was observed for CP224, the Dictyostelium XMAP215 homologue. These ubiquitous MAPs have been found to interact with TACC proteins directly and are known to act as microtubule polymerases and nucleators. This work shows for the first time in vivo that both a TACC and XMAP215 family protein can differentially localize to microtubule plus ends during interphase and mitosis. RNAi knockdown mutants revealed that TACC promotes microtubule growth during interphase and is essential for proper formation of astral microtubules in mitosis. In many organisms, impaired microtubule stability upon TACC depletion was explained by the failure to efficiently recruit the TACC-binding XMAP215 protein to centrosomes or spindle poles. By contrast, fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) analyses conducted in this study demonstrate that in Dictyostelium recruitment of CP224 to centrosomes or spindle poles is not perturbed in the absence of TACC. Instead, CP224 could no longer be detected at the tips of microtubules in TACC mutant cells. This finding demonstrates for the first time in vivo that a TACC protein is essential for the association of an XMAP215 protein with microtubule plus ends. The GFP-TACC strains generated in this work also turned out to be a valuable tool to study the unusual microtubule dynamics in Dictyostelium. Here, microtubules exhibit a high degree of lateral bending movements but, in contrast most other organisms, they do not obviously undergo any growth or shrinkage events during interphase. Despite of that they are affected by microtubuledepolymerizing drugs such as thiabendazole or nocodazol which are thought to act solely on dynamic microtubules. Employing 5D-fluorescence live cell microscopy and FRAP analyses this study suggests Dictyostelium microtubules to be dynamic only in the periphery, while they are stable at the centrosome. In the recent years, the identification of yet unknown components of the Dictyostelium centrosome has made tremendous progress. A proteomic approach previously conducted by our group disclosed several uncharacterized candidate proteins, which remained to be verified as genuine centrosomal components. The second part of this study focuses on the investigation of three such candidate proteins, Cenp68, CP103 and the putative spindle assembly checkpoint protein Mad1. While a GFP-CP103 fusion protein could clearly be localized to isolated centrosomes that are free of microtubules, Cenp68 and Mad1 were found to associate with the centromeres and kinetochores, respectively. The investigation of Cenp68 included the generation of a polyclonal anti-Cenp68 antibody, the screening for interacting proteins and the generation of knockout mutants which, however, did not display any obvious phenotype. Yet, Cenp68 has turned out as a very useful marker to study centromere dynamics during the entire cell cycle. During mitosis, GFP-Mad1 localization strongly resembled the behavior of other Mad1 proteins, suggesting the existence of a yet uncharacterized spindle assembly checkpoint in Dictyostelium. N2 - Die Kenntnis der Funktion von Mikrotubuli-assoziierenden Proteinen (MAPs) ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Mikrotubuli-Dynamik und deren Regulation. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle des Mikrotubuli-assoziierenden Proteins TACC (Transforming acidic coiled-coil), welches in vielen Organismen an der Stabilisierung und dem Wachstum von Mikrotubuli beteiligt ist, im Modellorganismus Dictyostelium discoideum untersucht. Das Dictyostelium TACC Protein konnte während des gesamten Zellzyklus am Centrosom nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde es an den Mikrotubuli-Plus-Enden vorgefunden, überraschenderweise jedoch ausschließlich während der Interphase. Die gleiche Zellzyklusabhängige Lokalisation wurde für CP224 beobachtet, einem Homologen der XMAP215 Proteine in Dictyostelium. Diese ubiquitären MAPs sind konservierte, direkte Interaktionspartner der TACC Proteine und spielen eine zentrale Rolle bei der Nukleation und der Polymerisation von Mikrotubuli. Durch diese Arbeit konnte erstmals in vivo gezeigt werden, dass TACC und XMAP215 Proteine während der Interphase und Mitose unterschiedlich stark mit Mikrotubuli-Plus-Enden assoziiert sein können. Durch Untersuchungen an Knockdown-Mutanten wurde ersichtlich, dass Dictyostelium TACC eine Rolle beim Mikrotubuli-Wachstum während der Interphase spielt und über weite Strecken der Mitose essentiell für die Ausbildung von astralen Mikrotubuli ist. In anderen Organismen konnte als Ursache instabiler Mikrotubuli in TACC Mutanten häufig unzureichendes Rekrutieren des jeweiligen XMAP215 Proteins an das Centrosom ausgemacht werden. Um entsprechende Auswirkungen auf die Lokalisation von CP224 durch den Knockdown von TACC in Dictyostelium zu untersuchen, wurden Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP) Experimente durchgeführt. Diese ergaben, dass CP224 auch in Abwesenheit von TACC in vollem Umfang an die Centrosomen und Spindelpole rekrutiert wird. Anders als im Wildtyp, konnte in TACC Mutanten allerdings kein CP224 an den Mikrotubuli-Plus-Enden nachgewiesen werden. Somit konnte erstmals in vivo gezeigt werden, dass ein TACC Protein essentiell für die Assoziation eines XMAP215 Proteins mit den Mikrotubuli-Plus-Enden ist. Im Laufe der genannten Experimente stellte sich heraus, dass sich die GFP-TACC Stämme aufgrund ihrer markierten Plus-Enden sehr gut für Untersuchungen zur ungewöhnlichen Mikrotubuli-Dynamik in Dictyostelium eignen. Zwar weisen Mikrotubuli hier über die gesamte Länge ausgeprägte Krümmungs- und Seitwärtsbewegungen auf, es können jedoch im Vergleich zu anderen Organismen während der Interphase kaum Wachstums- oder Verkürzungsvorgänge beobachtet werden. Dennoch können Dictyostelium Mikrotubuli unter Verwendung von Agenzien wie Thiabendazol oder Nocodazol, welche ausschließlich auf dynamische Mikrotubuli wirken, signifikant verkürzt werden. Durch FRAP Experimente und Einsatz von 5D Fluoreszenz-Mikroskopie an lebenden Zellen konnte in dieser Arbeit erstmalig nachgewiesen werden, dass Dictyostelium Mikrotubuli nur in der Zellperipherie, nicht aber im pericentrosomalen Bereich dynamisch sind. Die Identifikation bislang unbekannter Bestandteile des Dictyostelium Centrosoms erfuhr in den vergangenen Jahren große Fortschritte. Ein von unserer Gruppe durchgeführter Proteomics-Ansatz brachte eine Vielzahl potentiell centrosomaler Proteine zu Tage, von welchen bereits viele am Centrosom nachgewiesen werden konnten. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung dreier noch unbekannter Proteine aus dem Proteomics-Ansatz, Cenp68, CP103 und dem Dictyostelium Homologen des Spindle Assembly Checkpunkt Proteins Mad1. Hierbei zeigte sich, dass lediglich CP103 Bestandteil isolierter, Mikrotubuli-freier Centrosomen ist, während Cenp68 an die Centromere und Mad1 an die Kinetochoren lokalisieren. Die Charakterisierung von Cenp68 umfasste außerdem die Herstellung eines polyklonalen anti-Cenp68 Antikörpers, das Suchen nach Interaktionspartnern und die Erzeugung eines Cenp68 Knockout-Stammes. Letzterer wies jedoch keinen offensichtlichen Phänotyp auf. Das Verhalten des Dictyostelium Mad1 Proteins während der Mitose stimmte in großen Teilen mit dem anderer Mad1 Proteine überein, was auf die Existenz eines bislang unerforschten Spindle Assembly Chekpunkts in Dictyostelium hinweisen könnte. KW - Dictyostelium KW - Mikrotubuli KW - TACC KW - Centrosom KW - Centromere KW - Dictyostelium KW - Microtubules KW - TACC KW - Centrosome KW - Centromeres Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-52835 ER - TY - GEN A1 - Henze, Andrea A1 - Aumer, Franziska A1 - Grabner, Arthur A1 - Raila, Jens A1 - Schweigert, Florian J. T1 - Genetic differences in the serum proteome of horses, donkeys and mules are detectable by protein profiling T2 - Postprints der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe N2 - Although horses and donkeys belong to the same genus, their genetic characteristics probably result in specific proteomes and post-translational modifications (PTM) of proteins. Since PTM can alter protein properties, specific PTM may contribute to species-specific characteristics. Therefore, the aim of the present study was to analyse differences in serum protein profiles of horses and donkeys as well as mules, which combine the genetic backgrounds of both species. Additionally, changes in PTM of the protein transthyretin (TTR) were analysed. Serum protein profiles of each species (five animals per species) were determined using strong anion exchanger ProteinChips (R) (Bio-Rad, Munich, Germany) in combination with surface-enhanced laser desorption ionisation-time of flight MS. The PTM of TTR were analysed subsequently by immunoprecipitation in combination with matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight MS. Protein profiling revealed species-specific differences in the proteome, with some protein peaks present in all three species as well as protein peaks that were unique for donkeys and mules, horses and mules or for horses alone. The molecular weight of TTR of horses and donkeys differed by 30Da, and both species revealed several modified forms of TTR besides the native form. The mass spectra of mules represented a merging of TTR spectra of horses and donkeys. In summary, the present study indicated that there are substantial differences in the proteome of horses and donkeys. Additionally, the results probably indicate that the proteome of mules reveal a higher similarity to donkeys than to horses. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 567 KW - mass spectrometry KW - post-translational modifications KW - proteome KW - species differences Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-412886 SN - 1866-8372 IS - 567 ER - TY - THES A1 - Castro Prieto, Aines del Carmen T1 - Immunogenetics of free-ranging felids on Namibian farmlands T1 - Immungenetik freilebender Raubkatzen in landwirtschaftlich genutzten Regionen Namibias N2 - Genetic variation is crucial for the long-term survival of the species as it provides the potential for adaptive responses to environmental changes such as emerging diseases. The Major Histocompatibility Complex (MHC) is a gene family that plays a central role in the vertebrate’s immune system by triggering the adaptive immune response after exposure to pathogens. MHC genes have become highly suitable molecular markers of adaptive significance. They synthesize two primary cell surface molecules namely MHC class I and class II that recognize short fragments of proteins derived respectively from intracellular (e.g. viruses) and extracellular (e.g. bacteria, protozoa, arthropods) origins and present them to immune cells. High levels of MHC polymorphism frequently observed in natural populations are interpreted as an adaptation to detect and present a wide array of rapidly evolving pathogens. This variation appears to be largely maintained by positive selection driven mainly by pathogenic selective pressures. For my doctoral research I focused on MHC I and II variation in free-ranging cheetahs (Acinonyx jubatus) and leopards (Panthera pardus) on Namibian farmlands. Both felid species are sympatric thus subject to similar pathogenic pressures but differ in their evolutionary and demographic histories. The main aims were to investigate 1) the extent and patterns of MHC variation at the population level in both felids, 2) the association between levels of MHC variation and disease resistance in free-ranging cheetahs, and 3) the role of selection at different time scales in shaping MHC variation in both felids. Cheetahs and leopards represent the largest free-ranging carnivores in Namibia. They concentrate in unprotected areas on privately owned farmlands where domestic and other wild animals also occur and the risk of pathogen transmission is increased. Thus, knowledge on adaptive genetic variation involved in disease resistance may be pertinent to both felid species’ conservation. The cheetah has been used as a classic example in conservation genetics textbooks due to overall low levels of genetic variation. Reduced variation at MHC genes has been associated with high susceptibility to infectious diseases in cheetahs. However, increased disease susceptibility has only been observed in captive cheetahs whereas recent studies in free-ranging Namibian cheetahs revealed a good health status. This raised the question whether the diversity at MHC I and II genes in free-ranging cheetahs is higher than previously reported. In this study, a total of 10 MHC I alleles and four MHC II alleles were observed in 149 individuals throughout Namibia. All alleles but one likely belong to functional MHC genes as their expression was confirmed. The observed alleles belong to four MHC I and three MHC II genes in the species as revealed by phylogenetic analyses. Signatures of historical positive selection acting on specific sites that interact directly with pathogen-derived proteins were detected in both MHC classes. Furthermore, a high genetic differentiation at MHC I was observed between Namibian cheetahs from east-central and north-central regions known to differ substantially in exposure to feline-specific viral pathogens. This suggests that the patterns of MHC I variation in the current population mirrors different pathogenic selective pressure imposed by viruses. Cheetahs showed low levels of MHC diversity compared with other mammalian species including felids, but this does not seem to influence the current immunocompetence of free-ranging cheetahs in Namibia and contradicts the previous conclusion that the cheetah is a paradigm species of disease susceptibility. However, it cannot be ruled out that the low MHC variation might limit a prosperous immunocompetence in the case of an emerging disease scenario because none of the remaining alleles might be able to recognize a novel pathogen. In contrast to cheetahs, leopards occur in most parts of Africa being perhaps the most abundant big cat in the continent. Leopards seem to have escaped from large-scale declines due to epizootics in the past in contrast to some free-ranging large carnivore populations in Africa that have been afflicted by epizootics. Currently, no information about the MHC sequence variation and constitution in African leopards exists. In this study, I characterized genetic variation at MHC I and MHC II genes in free-ranging leopards from Namibia. A total of six MHC I and six MHC II sequences were detected in 25 individuals from the east-central region. The maximum number of sequences observed per individual suggests that they likely correspond to at least three MHC I and three MHC II genes. Hallmarks of MHC evolution were confirmed such as historical positive selection, recombination and trans-species polymorphism. The low MHC variation detected in Namibian leopards is not conclusive and further research is required to assess the extent of MHC variation in different areas of its geographic range. Results from this thesis will contribute to better understanding the evolutionary significance of MHC and conservation implications in free-ranging felids. Translocation of wildlife is an increasingly used management tool for conservation purposes that should be conducted carefully as it may affect the ability of the translocated animals to cope with different pathogenic selective pressures. N2 - Genetische Variabilität ist entscheidend für das langfristige Überleben von Arten, denn es ermöglicht dem Organismus sich Umweltveränderungen, wie z.B. neu aufkommende Krankheiten, schneller anzupassen. Der Haupthistocompatibilitätskomplex (MHC) ist eine Familie von Genen, der eine zentrale Rolle im Immunsystem von Wirbeltieren zukommt, da sie nach Pathogenkontakt das adaptive Immunsystem aktivieren. Zudem sind MHC Gene geeignete molekulare Marker um Anpassungsfähigkeiten aufzuzeigen. MHC Gene kodieren primär für Zelloberflächenmoleküle, die kurze Peptidfragmente erkennen und den Immunzellen präsentieren, die im Falle der Klasse I Gene intrazellulären (z.B. von Viren) oder im Falle der Klasse II Gene extrazellulären (z.B. von Bakterien, Protozoen, Arthropoden) Ursprungs sein können. In der Regel wird in natürlich vorkommenden Populationen ein hoher Grad an Polymorphismus im MHC beobachtet, was als Anpassung an das Erkennen und Präsentieren einer großen Anzahl sich schnell entwickelnder Pathogene interpretiert wird. Das Bestehen vieler MHC Varianten über große Zeiträume hinweg wird hauptsächlich durch positive Selektion bewirkt, der ein pathogengetriebener Selektionsdruck zugrunde liegt. In meiner Doktorarbeit habe ich mich mit der Variation von MHC I and MHC II in freilebenden Geparden (Acinonyx jubatus) und Leoparden (Panthera pardus) in Farmgebieten innerhalb Namibias beschäftigt. Beide Felidenarten leben sympatrisch und sind so demselben Pathogendruck ausgesetzt, sie unterscheiden sich allerdings in ihrem evolutionären und demographischen Hintergrund. Mein Hauptziel war es 1) das Ausmaß und Muster der MHC Variation auf Populationsebene beider Feliden zu untersuchen; 2) einen möglichen Zusammenhang zwischen dem Grad der MHC Variation und der Krankheitsresistenz in frei lebenden Geparden aufzudecken und 3) zu untersuchen, welche Rolle der Selektion auf die MHC Variabilität beider Arten in der Vergangenheit wie auch gegenwärtig zukommt. Geparden und Leoparden repräsentieren die größten frei lebenden Carnivoren Namibias. Beide Arten kommen hauptsächlich in Farmgebieten vor, die sich in Privatbesitz befinden, und können dort mit anderen Wild- aber auch Haustieren zusammentreffen und potentiell Krankheitserreger austauschen. Die Kenntnis über die adaptive genetische Variation, die für Krankheitsresistenzen mitverantwortlich ist, kann für den Schutz beider Felidenarten von Bedeutung sein. Geparden werden häufig in Lehrbüchern als klassische Beispiele für eine Tierart mit einer generell geringen genetischen Diversität verwendet. Neben neutralen Markern ist bei Geparden auch eine geringe Variabilität der MHC Gene beschrieben worden, die als Ursache einer hohen Anfälligkeit für infektiöse Krankheiten gesehen wird. Bisher wurde allerdings eine erhöhte Krankheitsanfälligkeit nur bei Geparden aus Gefangenschaft beschrieben, wohingegen neuste Studien an frei lebenden Geparden diesen einen guten Gesundheitsstatus attestierten. Dadurch stellt sich die Frage, ob die MHC I und II Diversität in frei lebenden Geparden nicht höher sein könnte als bisher angenommen. In dieser Arbeit konnten insgesamt 10 MHC I und vier MHC II Allele in 149 frei lebenden Geparden aus ganz Namibia nachgewiesen werden. Die Zugehörigkeit zu funktionellen MHC Genen wurde durch Expressionsanalysen bei allen Allelen, außer einem, bestätigt. Durch phylogenetische Analysen konnten die Allele vier MHC I und drei MHC II Genen zu geordnet werden. Das Wirken von positiver Selektion in der Vergangenheit konnte an spezifischen Aminosäuren des Proteins, die in direktem Kontakt zu den pathogenen Antigenen stehen, festgestellt werden. Dies traf für beide MHC Klassen zu. Des Weiteren konnte eine starke genetische Differenzierung des MHC I zwischen Geparden aus einer nord-zentralen und einer ost-zentralen Region festgestellt werden, von denen auch bekannt ist, dass sie unterschiedlichen, felidenspezifischen, viralen Pathogenen ausgesetzt sind. Das lässt vermuten, dass die unterschiedlichen Muster der MHC I Variation in der gegenwärtigen Population den unterschiedlichen pathogengetriebenen Selektionsdruck durch Viren in den beiden Regionen widerspiegelt. Verglichen mit anderen Säugetierarten, insbesondere andere Feliden, zeigen Geparden einen geringen Grad an MHC Diversität, doch das scheint die derzeitige Immunkompetenz frei lebender Geparden in Namibia nicht einzuschränken und widerspricht der bisherigen Meinung dass Geparden ein typisches Beispiel für eine krankheitsanfällige Tierart sind. Es kann allerdings nicht ausgeschlossen werden, dass bei neu auftauchenden Krankheiten die geringe MHC Variation eine erfolgreiche Immunkompetenz verhindert, da möglicherweise keines der gegenwärtigen Allele die Fähigkeit besitzt neue Pathogene zu erkennen. Im Gegensatz zu Geparden kommen Leoparden in allen Teilen Afrikas vor und sind wahrscheinlich die am weitverbreiteste Großkatze des afrikanischen Kontinents. Es scheint, dass Leoparden, im Gegensatz zu anderen afrikanischen Großkatzen, einer ausgedehnten Dezimierung durch Tierseuchen in der Vergangenheit, der einige Populationen afrikanischer Großkatzen ausgesetzt waren, entkommen sind. Bisher fehlten Information über die MHC Variabilität in afrikanischen Leoparden. In dieser Studie konnte ich die genetische Variation der MHC I und MHC II Gene frei lebender namibischer Leoparden charakterisieren. In 25 Tieren aus einer Population der ost-zentralen Region konnten sechs MHC I sowie sechs MHC II Sequenzen nachgewiesen werden. Aus der maximalen Anzahl Allele pro Tier kann auf drei MHC I und auf drei MHC II Gene geschlossen werden. Außerdem konnten die typischen Kennzeichen einer variationserhaltenden MHC Evolution betätigt werden, wie positive Selektion in der Vergangenheit, Rekombination und über Artgrenzen hinaus bestehender Polymorphismus. Der geringe Grad an MHC Variation in namibischen Leoparden ist jedoch noch nicht endgültig und weitere Untersuchungen in unterschiedlichen Regionen aus der gesamten geographischen Verbreitung des Leoparden sind notwendig um die MHC Variation der Leoparden in Gänze einschätzen zu können. Die Ergebnisse dieser Arbeit werden zu einem besseren Verständnis des evolutionären Stellenwerts des MHC und in Folge zu einem besseren Schutz von frei lebenden Feliden beitragen. Die Umsiedelung von Wildtieren ist ein zunehmend angewendetes Hilfsmittel im Natur- und Artenschutz, welches jedoch mit Sorgfalt eingesetzt werden sollte, da die umgesiedelten Tiere möglicherweise einem anderen pathogenen Selektionsdruck ausgesetzt sind, dem sie nichts entgegenzusetzen haben. KW - MHC KW - genetische Vielfalt KW - Evolution KW - Acinonyx jubatus KW - Panthera Pardus KW - MHC KW - genetic diversity KW - evolution KW - Acinonyx jubatus KW - Panthera pardus Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-55505 ER - TY - GEN A1 - Raila, Jens A1 - Rohn, Sascha A1 - Schweigert, Florian J. A1 - Abraham, Getu T1 - Increased antioxidant capacity in the plasma of dogs after a single oral dosage of tocotrienols T2 - Postprints der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe N2 - The intestinal absorption of tocotrienols (TCT) in dogs is, to our knowledge, so far unknown. Adult Beagle dogs (n 8) were administered a single oral dosage of a TCT-rich fraction (TRF; 40 mg/kg body weight) containing 32 % a-TCT, 2 % b-TCT, 27 % g-TCT, 14 % d-TCT and 25 % a-tocopherol (a-TCP). Blood was sampled at baseline (fasted), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 and 12 h after supplementation. Plasma and chylomicron concentrations of TCT and a-TCP were measured at each time point. Plasma TAG were measured enzymatically, and plasma antioxidant capacity was assessed by the Trolox equivalent antioxidant capacity assay. In fasted dogs, levels of TCT were 0·07 ( SD 0·03) mmol/l. Following the administration of the TRF, total plasma TCT peaked at 2 h (7·16 ( SD 3·88) mmol/l; P, 0·01) and remained above baseline levels (0·67 ( SD 0·44) mmol/l; P, 0·01) at 12 h. The TCT response in chylomicrons paralleled the increase in TCT in plasma with a maximum peak (3·49 ( SD 2·06) mmol/l; P, 0·01) at 2 h post-dosage. a-TCP was the major vitamin E detected in plasma and unaffected by TRF supplementation. The Trolox equivalent values increased from 2 h (776 ( SD 51·2) mmol/l) to a maximum at 12 h (1130 ( SD 7·72) mmol/l; P,0·01). The results show that TCT are detected in postprandial plasma of dogs. The increase in antioxidant capacity suggests a potential beneficial role of TCT supplementation in the prevention or treatment of several diseases in dogs. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 571 KW - dogs KW - tocotrienols KW - intestinal absorption KW - antioxidant capacity Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-413085 SN - 1866-8372 IS - 571 ER - TY - GEN A1 - Van Donk, Ellen A1 - Ianora, Adrianna A1 - Vos, Matthijs T1 - Induced defences in marine and freshwater phytoplankton BT - a review T2 - Postprints der Universität Potsdam : Mathematisch Naturwissenschaftliche Reihe N2 - Many organisms have developed defences to avoid predation by species at higher trophic levels. The capability of primary producers to defend themselves against herbivores affects their own survival, can modulate the strength of trophic cascades and changes rates of competitive exclusion in aquatic communities. Algal species are highly flexible in their morphology, growth form, biochemical composition and production of toxic and deterrent compounds. Several of these variable traits in phytoplankton have been interpreted as defence mechanisms against grazing. Zooplankton feed with differing success on various phytoplankton species, depending primarily on size, shape, cell wall structure and the production of toxins and deterrents. Chemical cues associated with (i) mechanical damage, (ii) herbivore presence and (iii) grazing are the main factors triggering induced defences in both marine and freshwater phytoplankton, but most studies have failed to disentangle the exact mechanism(s) governing defence induction in any particular species. Induced defences in phytoplankton include changes in morphology (e.g. the formation of spines, colonies and thicker cell walls), biochemistry (such as production of toxins, repellents) and in life history characteristics (formation of cysts, reduced recruitment rate). Our categorization of inducible defences in terms of the responsible induction mechanism provides guidance for future work, as hardly any of the available studies on marine or freshwater plankton have performed all the treatments that are required to pinpoint the actual cue(s) for induction. We discuss the ecology of inducible defences in marine and freshwater phytoplankton with a special focus on the mechanisms of induction, the types of defences, their costs and benefits, and their consequences at the community level. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 881 KW - defenses KW - algae KW - review KW - plankton community KW - cyanobacteria KW - toxins Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-435130 SN - 1866-8372 IS - 881 ER - TY - THES A1 - Mutwil, Marek T1 - Integrative transcriptomic approaches to analyzing plant co-expression networks T1 - Integrative Ansätze zur Analyse von Koexpressionsnetzwerken in Pflanzen N2 - It is well documented that transcriptionally coordinated genes tend to be functionally related, and that such relationships may be conserved across different species, and even kingdoms. (Ihmels et al., 2004). Such relationships was initially utilized to reveal functional gene modules in yeast and mammals (Ihmels et al., 2004), and to explore orthologous gene functions between different species and kingdoms (Stuart et al., 2003; Bergmann et al., 2004). Model organisms, such as Arabidopsis, are readily used in basic research due to resource availability and relative speed of data acquisition. A major goal is to transfer the acquired knowledge from these model organisms to species that are of greater importance to our society. However, due to large gene families in plants, the identification of functional equivalents of well characterized Arabidopsis genes in other plants is a non-trivial task, which often returns erroneous or inconclusive results. In this thesis, concepts of utilizing co-expression networks to help infer (i) gene function, (ii) organization of biological processes and (iii) knowledge transfer between species are introduced. An often overlooked fact by bioinformaticians is that a bioinformatic method is as useful as its accessibility. Therefore, majority of the work presented in this thesis was directed on developing freely available, user-friendly web-tools accessible for any biologist. N2 - Es ist bereits ausgiebig gezeigt worden, dass Gene, deren Expression auf Transkriptionsebene koordiniert ist, häufig auch funktional in verwandten Stoffwechselwegen vorkommen, und dass sich dies wahrscheinlich auch Spezies- und sogar Reichübergreifend sagen lässt (Ihmels et al., 2004). Anfänglich wurden solche Beziehungen verwendet, um sogenannte Genfunktionsmodule in Hefe und Säugern aufzudecken (Ihmels et al., 2004), um dann orthologe Genfunktionen zwischen verschiedene Spezies und Reichen zu entdecken (Stuart et al., 2003; Bergmann et al., 2004). Modellorganismen wie Arabidopsis werden bevorzugt in der Forschung verwendet, weil man durch die schnelle Generationszeit in kurzer Zeit viele Daten erheben kann und aufgrund dessen die Ressourcen- und Informationsvielfalt um ein Vielfaches größer ist. Ein Hauptziel ist der Wissenstransfer von Modellorganismen auf Spezies, die gesellschaftlich von höherer Bedeutung sind wie z.B. Getreidearten oder andere Feldfrüchte. Pflanzen besitzen oft große Genfamilien und die eindeutige Identifizierung von gut charakterisierten Arabidopsisorthologen in besagten Nutzpflanzen ist kein triviales Vorhaben. In der vorliegenden Arbeit werden Konzepte zur Nutzung von Co-expressionsnetzwerken beschrieben, die helfen sollen (i) Genfunktionen zu identifizieren, (ii) die Organisation von biologischen Prozessen aufzuklären und (iii) das erworbene Wissen auf andere Spezies übertragbar zu machen. Ein häufig von Bioinformatikern übersehender Umstand ist, dass bioinformatische Methoden nur so sinnvoll sind wie ihre Zugänglichkeit. Deshalb basiert der Großteil dieser Arbeit auf freiverfügbaren und vor allem für Biologen nutzerfreundlichen Webtools. KW - Koexpression KW - vergleichend KW - Transkriptom KW - co-expression KW - comparative KW - transcriptomics Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-50752 ER - TY - THES A1 - Schatz, Daniela T1 - LNA-clamp-PCR zum sensitiven Nachweis von Punktmutationen im Rahmen der Entwicklung eines Darmkrebsfrüherkennungstests T1 - LNA-clamp-PCR as a method for sensitive detection of point mutations as part of the development of an assay for the early diagnosis of colon cancer N2 - Darmkrebs ist die zweithäufigste malignombedingte Todesursache in den westlichen Industrieländern. Durch eine frühzeitige Diagnose besteht jedoch eine hohe Chance auf Heilung. Der Goldstandard zur Darmkrebsfrüherkennung ist gegenwärtig die Koloskopie. Eine Darmspiegelung ist jedoch invasiv und mit Unannehmlichkeiten für den Patienten verbunden. Die Akzeptanz in der Bevölkerung ist daher gering. Ziel des BMBF- Projektes „Entwicklung eines nichtinvasiven Nachweissystems zur Früherkennung von humanem Darmkrebs“, in dessen Rahmen diese Arbeit entstand, ist die Bereitstellung eines nichtinvasiven Nachweisverfahrens zur Darmkrebsfrüherkennung. Der Nachweis soll über die Detektion von aus neoplastischen Zellen stammender DNA in Stuhl erfolgen. Die Entartung dieser Zellen beruht auf Veränderungen im Erbgut, welches unter anderem Mutationen sind. Im ersten Teil des BMBF-Projektes wurde ein Set von Mutationen zusammengestellt, welches eine hohe Sensitivität für Vorstufen von Darmkrebs aufweist. Ziel dieser Arbeit war es, eine Nachweismethode für die zuvor identifizierten Punktmutationen zu entwickeln. Das Nachweisverfahren musste dabei unempfindlich gegen einen hohen Hintergrund nichtmutierter DNA sein, da im Stuhl geringe Mengen DNA aus neoplastischen Zellen bei einem hohen Hintergrund von DNA aus gesunden Zellen vorliegen. Hierzu wurden Plasmidmodellsysteme für die aus dem Marker-Set stammenden Genfragmente BRAF und dessen Mutante V600E, CTNNB1 und T41I, T41A, S45P und K-ras G12C hergestellt. Mit Hilfe dieser Plasmidmodellsysteme wurde dann das Nachweissystem entwickelt. Der entscheidende Schritt für die Detektion von Punktmutationen bei hohem Wildtypüberschuss ist eine vorhergehende Anreicherung. In der vorliegenden Arbeit wurde dazu die Methode der LNA-clamp-PCR (locked nucleic acid) etabliert. Die Bewertung der erzielten Anreicherung erfolgte über das relative Detektionslimit. Zur Bestimmung des Detektionslimits wurde die Schmelzkurvenanalyse von Hybridisierungssonden eingesetzt; diese wurde im Rahmen dieser Arbeit für die drei oben genannten Genfragmente und ihre Mutanten entwickelt. Die LNA-clamp-PCR wird in Anwesenheit eines LNA-Blockers durchgeführt. Das Nukleotidanalogon LNA weist im Vergleich zu DNA eine erhöhte Affinität zu komplementären DNA-Strängen auf. Gleichzeitig kommt es bei Anwesenheit einer Basenfehlpaarung zu einer größeren Destabilisierung der Bindung. Als Blocker werden kurze LNA-DNA-Hybridoligonukleotide eingesetzt, die den mutierten Sequenzbereich überspannen und selbst der Wildtypsequenz entsprechen. Durch Bindung an die Wildtypsequenz wird deren Amplifikation während der PCR verhindert (clamp = arretieren, festklemmen). Der Blocker selbst wird dabei nicht verlängert. Der Blocker bindet unter optimalen Bedingungen jedoch nicht an die mutierte Sequenz. Die Mutante wird daher ungehindert amplifiziert und somit gegenüber dem Wildtyp-Fragment angereichert. Die Position des Blockers kann im Bindungsbereich eines der Primer sein und hier dessen Hybridisierung an dem Wildtyp-Fragment verhindern oder zwischen den beiden Primern liegen und so die Synthese durch die Polymerase inhibieren. Die Anwendbarkeit beider Systeme wurde in dieser Arbeit gezeigt. Die LNA-clamp-PCR mit Primerblocker wurde für BRAF etabliert. Es wurde ein Detektionslimit von mindestens 1:100 erzielt. Die LNA-clamp-PCR mit Amplifikationsblocker wurde erfolgreich für BRAF, K-ras und CTNNB1: T41I, T41A mit einem Detektionslimit von 1:1000 bis 1:10 000 entwickelt. In Stuhlproben liegt DNA aus neoplastischen Zellen nach Literaturangaben zu einem Anteil von 1% bis 0,1% vor. Die LNA-clamp-PCR weist also mit Amplifikationsblockern ein ausreichend hohes Detektionslimit für die Analyse von Stuhlproben auf. Durch die erfolgreiche Etablierung der Methode auf drei verschiedenen Genfragmenten und vier unterschiedlichen Punktmutationen konnte deren universelle Einsetzbarkeit gezeigt werden. Für die Ausweitung der LNA-clamp-PCR auf die übrigen Mutationen des Marker-Sets wurden Richtlinien ausgearbeitet und die Blockereffizienz als Kennzahl eingeführt. Die LNA-clamp-PCR ist ein schnelles, kostengünstiges Verfahren, welches einen geringen Arbeitsaufwand erfordert und wenig fehleranfällig ist. Sie ist somit ein geeignetes Anreicherungsverfahren für Punktmutationen in einem diagnostischen System zur Darmkrebsfrüherkennung. Darüber hinaus kann die LNA-clamp-PCR auch in anderen Bereichen, in denen die Detektion von Punktmutationen in einem hohen Wildtyphintergrund erforderlich ist, eingesetzt werden. N2 - Colon cancer is the second leading cause of cancer related deaths in the western world. However if diagnosed early there is a great chance curing the disease. Coloscopy is the gold standard for early detection of colorectal cancer today. Its greatest disadvantage is the fact that it is an invasive technique and provides some discomfort for the patients. Therefore, the compliance to undergo such a procedure is extremely low. This work was generated in the context of the BMBF-project „Development of a non-invasive assay for the early detection of preneoplastic and neoplastic lesions in the human colon“. The aim of the work described here is the development of a non-invasive assay for the early detection of colon cancer. The assay should detect DNA from neoplastic cells in feces samples. The transformation of these cells is based on alterations in the genome predominantly mutations. In the first part of the BMBF-project a mutation panel with high sensitivity for preneoplastic lesions of colon cancer was determined. The aim of this work was to develop a detection method for the point mutations of the determined mutation panel. The rare mutant DNA needs to be detected in the presence of a great amount of wild-type DNA shed from healthy tissue. The assay system needs to be insensitive to this high background of healthy DNA. Therefore a model system of plasmid DNA containing gene fragments of BRAF and its mutation V600E, CTNNB1 and T41I, T41A, S45P and K-ras G12C obtained from the marker panel was established. Using these plasmid system the detection method was developed. The most critical parameter for the detection of rare point mutations is an enrichment of these rare DNA molecules. In this work LNA-clamp-PCR (locked nucleic acid) technology was used to enrich the mutant DNA.. For the estimation of the achieved enrichment the relative detection limit was used. The detection limit was determined by melting curve analysis of hybridization probes. These assays were established in the present work for the three above mentioned gene fragments. LNA-clamp-PCR is performed in the presence of an LNA blocker. LNA is a synthetic DNA analog. LNA nucleotide analog bind to complementary DNA strands with higher affinity. In addition a single mismatch in the LNA-DNA duplex causes a much greater destabilization compared to a DNA-DNA duplex. Short LNA-DNA-hybrids were used as clamp, which cover the mutated region and represent the wild-type sequence. Within an appropriate temperature range, LNA can specifically bind to wild type template and can inhibit its amplification. The clamp itself will not be elongated. Under optimal conditions the LNA clamp will not interfere with the amplification of the mismatched template. Therefore the mutated gene fragment will be enriched in comparison to the wild-type. The position of the LNA clamp can either be at the primer binding site inhibiting primer hybridization on the wild-type fragment or the LNA clamp is positioned between the two primer binding sites inhibiting chain elongation of the perfectly matched template. In the present work both systems were applied. For the gene fragment BRAF the LNA was used at the primer binding site. The achieved detection limit was at least 1:100. The LNA-clamp-PCR with LNA inhibiting the chain elongation were developed successfully for BRAF, K-ras and CTNNB1: T41I, T41A achieving a detection limit of 1:1000 to 1:10 000. According to the literature 1% to 0.1% of the DNA in feces derives from neoplastic cells. Therefore the detection limit achieved by LNA-clamp-PCR with LNA inhibiting chain elongation would be sufficient for analyzing feces samples. LNA-clamp-PCR protocols were established for three different gene fragments and four diverse point mutations indicating that the technology can generally be used for high sensitive detection of DNA mutations. For the development of LNA-clamp-PCR protocols for the other mutations of the marker panel development guidelines were established. Clamp efficiency was identified as a quantitative parameter for protocol optimization. The LNA-clamp-PCR is a robust, fast and cost-saving technique which needs low labor input. Therefore the method is adequate for enriching point mutated gene fragments in a diagnostic assay for the detection of early colon cancer stages. In addition LNA-clamp-PCR can be applied in other fields where rare sequence variations need to be detected in the presence of high wild-type DNA background. KW - LNA-clamp-PCR KW - Darmkrebsdiagnostik KW - Punktmutation KW - BRAF KW - K-ras KW - LNA- clamp-PCR KW - colon cancer diagnosis KW - point mutation KW - BRAF KW - K-ras Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-52308 ER - TY - THES A1 - Ivakov, Alexander T1 - Metabolic interactions in leaf development in Arabidopsis thaliana T1 - Metabolische Interaktionen während der Blattentwicklung in Arabidopsis thaliana N2 - Das Wachstum und Überleben von Pflanzen basiert auf der Photosynthese in den Blättern. Diese beinhaltet die Aufnahme von Kohlenstoffdioxid aus der Atmosphäre und das simultane Einfangen von Lichtenergie zur Bildung organischer Moleküle. Diese werden nach dem Eintritt in den Metabolismus in viele andere Komponenten umgewandelt, welche die Grundlage für die Zunahme der Biomasse bilden. Blätter sind Organe, die auf die Fixierung von Kohlenstoffdioxid spezialisiert sind. Die Funktionen der Blätter beinhalten vor allem die Optimierung und Feinregulierung vieler Prozesse, um eine effektive Nutzung von Ressourcen und eine maximale Photosynthese zu gewährleisten. Es ist bekannt, dass sich die Morphologie der Blätter den Wachstumsbedingungen der Pflanze anpasst und eine wichtige Rolle bei der Optimierung der Photosynthese spielt. Trotzdem ist die Regulation dieser Art der Anpassung bisher nicht verstanden. Die allgemeine Zielsetzung dieser vorliegenden Arbeit ist das Verständnis wie das Wachstum und die Morphologie der Blätter im Modellorganismus Arabidopsis thaliana reguliert werden. Besondere Aufmerksamkeit wurde hierbei der Möglichkeit geschenkt, dass es interne metabolische Signale in der Pflanze geben könnte, die das Wachstum und die Entwicklung von Blättern beeinflussen. Um diese Fragestellung zu untersuchen, muss das Wachstum und die Entwicklung von Blättern oberhalb des Levels des einzelnen Organs und im Kontext der gesamten Pflanze betrachtet werden, weil Blätter nicht eigenständig wachsen, sondern von Ressourcen und regulatorischen Einflüssen der ganzen Pflanze abhängig sind. Aufgrund der Komplexität dieser Fragestellung wurden drei komplementäre Ansätze durchgeführt. Im ersten und spezifischsten Ansatz wurde untersucht ob eine flussabwärts liegende Komponente des Zucker-Signalwegs, Trehalose-6-Phosphat (Tre-6-P), das Blattwachstum und die Blattentwicklung beinflussen kann. Um diese Frage zu beantworten wurden transgene Arabidopsis-Linien mit einem gestörten Gehalt von Tre-6-P durch die Expression von bakteriellen Proteinen die in dem metabolismus von trehalose beteiligt sind. Die Pflanzen-Linien wurden unter Standard-Bendingungen in Erde angebaut und ihr Metabolismus und ihre Blattmorphologie untersucht. Diese Experimente führten auch zu einem unerwarteten Projekt hinsichtlich einer möglichen Rolle von Tre-6-P in der Regulation der Stomata. In einem zweiten, allgemeineren Ansatz wurde untersucht, ob Änderungen im Zucker-Gehalt der Pflanzen die Morphogenese der Blätter als Antwort auf Licht beeinflussen. Dazu wurden eine Reihe von Mutanten, die im Zentralmetabolismus beeinträchtigt sind, in derselben Lichtbedingung angezogen und bezüglich ihrer Blattmorphologie analysiert. In einem dritten noch allgemeineren Ansatz wurde die natürliche Variation von morphologischen Ausprägungen der Blätter und Rosette anhand von wilden Arabidopsis Ökotypen untersucht, um zu verstehen wie sich die Blattmorphologie auf die Blattfunktion und das gesamte Pflanzenwachstum auswirkt und wie unterschiedliche Eigenschaften miteinander verknüpft sind. Das Verhältnis der Blattanzahl zum Gesamtwachstum der Pflanze und Blattgröße wurde gesondert weiter untersucht durch eine Normalisierung der Blattanzahl auf das Frischgewicht der Rosette, um den Parameter „leafing Intensity“ abzuschätzen. Leafing Intensity integrierte Blattanzahl, Blattgröße und gesamtes Rosettenwachstum in einer Reihe von Kompromiss-Interaktionen, die in einem Wachstumsvorteil resultieren, wenn Pflanzen weniger, aber größere Blätter pro Einheit Biomasse ausbilden. Dies führte zu einem theoretischen Ansatz in dem ein einfaches allometrisch mathematisches Modell konstruiert wurde, um Blattanzahl, Blattgröße und Pflanzenwachstum im Kontext der gesamten Pflanze Arabidopsis zu verknüpfen. N2 - Plant growth and survival depend on photosynthesis in the leaves. This involves the uptake of carbon dioxide from the atmosphere and the simultaneous capture of light energy to produce organic molecules, which enter metabolism and are converted to many other compounds which then serve as building blocks for biomass growth. Leaves are organs specialised for photosynthetic carbon dioxide fixation. The function of leaves involves many trade-offs which must be optimised in order to achieve effective use of resources and maximum photosynthesis. It is known that the morphology of leaves adjusts to the growth environment of plants and this is important for optimising their function for photosynthesis. However, it is unclear how this adjustment is regulated. The general aim of the work presented in this thesis is to understand how leaf growth and morphology are regulated in the model species Arabidopsis thaliana. Special attention was dedicated to the possibility that there might be internal metabolic signals within the plant which affect the growth and development of leaves. In order to investigate this question, leaf growth and development must be considered beyond the level of the single organ and in the context of the whole plant because leaves do not grow autonomously but depend on resources and regulatory influences delivered by the rest of the plant. Due to the complexity of this question, three complementary approaches were taken. In the first and most specific approach it was asked whether a proposed down-stream component of sucrose signalling, trehalose-6-phosphate (Tre-6-P), might influence leaf development and growth. To investigate this question, transgenic Arabidopsis lines with perturbed levels of Tre-6-P were generated using the constitutive 35S promoter to express bacterial enzymes involved in trehalose metabolism. These experiments also led to an unanticipated project concerning a possible role for Tre-6-P in stomatal function, which is another very important function in leaves. In a second and more general approach it was investigated whether changes in sugar levels in plants affect the morphogenesis of leaves in response to light. For this, a series of metabolic mutants impaired in central metabolism were grown in one light environment and their leaf morphology was analysed. In a third and even more general approach the natural variation in leaf and rosette morphological traits was investigated in a panel of wild Arabidopsis accessions with the aim of understanding how leaf morphology affects leaf function and whole plant growth and how different traits relate to each other. The analysis included measurements of leaf morphological traits as well as the number of leaves in the plant to put leaf morphology in a whole plant context. The variance in plant growth could not be explained by variation in photosynthetic rates and only to a small degree by variation in rates of dark respiration. There were four key axes of variation in rosette and leaf morphology – leaf area growth, leaf thickness, cell expansion and leaf number. These four processes were integrated in the context of whole plant growth by models that employed a multiple linear regression approach. This then led to a theoretical approach in which a simple allometric mathematical model was constructed, linking leaf number, leaf size and plant growth rate together in a whole plant context in Arabidopsis. KW - Blattmorphologie KW - Entwicklung KW - Arabidopsis KW - Metabolismus KW - Ökotypen KW - leaf KW - morphology KW - Arabidopsis KW - metabolism KW - accessions Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-59730 ER - TY - THES A1 - Krüger, Anne T1 - Molekulare Charakterisierung von NE81 und CP75, zwei kernhüllen- und centrosomassoziierten Proteinen in Dictyostelium discoideum T1 - Molecular characterization of NE81 and CP75, two nuclear envelope and centrosome associated proteins in Dictyostelium discoideum N2 - Lamine bilden zusammen mit laminassoziierten Proteinen die nukleäre Lamina. Diese ist notwendig für die mechanische Stabilität von Zellen, die Organisation des Chromatins, der Genexpression, dem Fortgang des Zellzyklus und der Zellmigration. Die vielfältigen Funktionen der Lamine werden durch die Pathogenese von Laminopathien belegt. Zu diesen Erkrankungen, welche ihre Ursache in Mutationen innerhalb der laminkodierenden Gene, oder der Gene laminassoziierter bzw. laminprozessierender Proteine haben, zählen unter anderem das „Hutchinson-Gilford Progerie Syndrom“, die „Emery-Dreifuss“ Muskeldystrophie und die dilatierte Kardiomyopathie. Trotz der fundamentalen Bedeutung der Lamine, wurden diese bisher nur in Metazoen und nicht in einzelligen Organismen detektiert. Der amöbide Organismus Dictyostelium discoideum ist ein haploider Eukaryot, der häufig als Modellorganismus in den verschiedensten Bereichen der Zellbiologie eingesetzt wird. Mit der Entdeckung von NE81, einem Protein das mit der inneren Kernhülle von Dictyostelium discoideum assoziiert ist, wurde erstmals ein Protein identifiziert, dass man aufgrund seiner Eigenschaften als laminähnliches Protein in einem niederen Eukaryoten bezeichnen kann. Diese Merkmale umfassen die Existenz lamintypischer Sequenzen, wie die CDK1-Phosphorylierungsstelle, direkt gefolgt von einer zentralen „Rod“-Domäne, sowie eine typische NLS und die hoch konservierte CaaX-Box. Für die Etablierung des NE81 als „primitives“ Lamin, wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Experimente durchgeführt, die strukturelle und funktionelle Gemeinsamkeiten zu den Laminen in anderen Organismen aufzeigen konnten. Die Herstellung eines polyklonalen Antikörpers ermöglichte die Verifizierung der subzellulären Lokalisation des NE81 durch Elektronenmikroskopie und gab Einblicke in das Verhalten des endogenen Proteins innerhalb des Zellzyklus. Mit der Generierung von NE81-Nullmutanten konnte demonstriert werden, dass NE81 eine wichtige Rolle bei der nukleären Integrität und der Chromatinorganisation von Zellen spielt. Des Weiteren führte die Expression von zwei CaaX-Box deletierten NE81 - Varianten dazu, den Einfluss des Proteins auf die mechanische Stabilität der Zellen nachweisen zu können. Auch die Bedeutung der hochkonservierten CaaX-Box für die Lokalisation des Proteins wurde durch die erhaltenen Ergebnisse deutlich. Mit der Durchführung von FRAP-Experimente konnte außerdem die strukturgebende Funktion von NE81 innerhalb des Zellkerns bekräftigt werden. Zusätzlich wurde im Rahmen dieser Arbeit damit begonnen, den Einfluss der Isoprenylcysteincarboxylmethyltransferase auf die Lokalisation des Proteins aufzuklären. Die Entdeckung eines laminähnlichen Proteins in einem einzelligen Organismus, der an der Schwelle zu den Metazoen steht, ist für die evolutionäre Betrachtung der Entwicklung der sozialen Amöbe und für die Erforschung der molekularen Basis von Laminopathien in einem einfachen Modellorganismus sehr interessant. Die Arbeit mit Dictyostelium discoideum könnte daher Wege aufzeigen, dass Studium der Laminopathien am Tiermodell drastisch zu reduzieren. In den letzten Jahren hat die Erforschung unbekannter Bestandteile des Centrosoms in Dictyostelium discoideum große Fortschritte gemacht. Eine zu diesem Zwecke von unserer Arbeitsgruppe durchgeführte Proteomstudie, führte zur Identifizierung weiterer, potentiell centrosomaler Kandidatenproteine. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung eines solchen Kandidatenproteins, dem CP75. Es konnte gezeigt werden, dass CP75 einen echten, centrosomalen Bestandteil darstellt, der mikrotubuli-unabhängig mit der Core Struktur des Zellorganells assoziiert ist. Weiterhin wurde deutlich, dass die Lokalisation am Centrosom in Abhängigkeit vom Zellzyklus erfolgt und CP75 vermutlich mit CP39, einem weiteren centrosomalen Core Protein, interagiert. N2 - Lamins build the nuclear lamina together with lamin-associated proteins. The latter is required for mechanical stabilization of cells, chromatin organization, gene expression, cell cycle progression and cell migration. This became evident by the pathogenesis of laminopathies. Laminopathies are diseases which arise from mutations in genes encoding lamins, lamin-associated-or lamin-processing proteins. Prominent examples are the „Hutchinson-Gilford progeria syndrome“, the „Emery-Dreifuss“muscular dystrophy and dilated cardiomyopathy. Despite their universal importance, lamins have only been found in metazoans, but not in unicellular organisms so far. The amoeboid organism Dictyostelium discoideum is a haploid eukaryote widely used in different fields of cell biology. With the discovery of NE81, a protein associated with the inner nuclear membrane of Dictyostelium discoideum, for the first time a protein was identified, whose properties jutify denomination as a lamin-like protein in a lower eukaryote. This is based on the presence of lamin-typical sequences such as a CDK1 phosphorylation consensus sequence, followed by a central rod domain, a typical nuclear localization sequence and the highly conserved CaaX box. For the verification of NE81 as a primitive lamin, various different experiments were conducted in the frame of this work, which revealed structural and functional similarities to lamins of other organisms. Analysis of the behavior of the endogenous protein in cell cycle and the verification of the subcellular localization with electron microscopy was done with the generation of a polyclonal antibody. With a NE81 null mutant, it could be shown, that NE81 plays an important role in nuclear integrity and chromatin organization. The expression of two CaaX-box deleted protein variants confirmed the influence of NE81 on the mechanical stability of cells. These results furthermore underlined the importance of the presence of the highly conserved CaaX-box. FRAP-experiments further emphasized the structural function of NE81 in the nucleus. Furthermore, first steps were undertaken to determine the influence of the Isoprenylcysteinecarboxylmethyltransferase on the localization of NE81. In the light of evolution the discovery of a lamin-like protein in a unicellular organism is very interesting and could provide a simple experimental system for studies of the molecular basis of laminopathies. Hence, the study on laminopathies in animal models could be reduced dramatically. The identification of unknown centrosomal components in Dictyostelium discoideum has made significant proceedings in the last years. A proteomic approach which was accomplished for this purpose, yielded several potential centrosomal candidate proteins. The second part of this work focuses on the characterization of one of these proteins, CP75. It could be shown that CP75 is a genuine, centrosomal component, which is associated with the centrosomal core structure independently of microtubules. Furthermore, it could be demonstrated, that the localization of CP75 is cell cycle-dependent and that it presumably interacts with the core protein CP39. KW - Kernhülle KW - Lamin KW - Dictyostelium KW - Centrosom KW - nuclear envelope KW - lamin KW - Dictyostelium KW - centrosome Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-53915 ER - TY - THES A1 - Winck, Flavia Vischi T1 - Nuclear proteomics and transcription factor profiling in Chlamydomonas reinhardtii T1 - Nukleare Proteomics und Transkriptionsfaktoren : Profiling in Chlamydomonas reinhardtii N2 - The transcriptional regulation of the cellular mechanisms involves many different components and different levels of control which together contribute to fine tune the response of cells to different environmental stimuli. In some responses, diverse signaling pathways can be controlled simultaneously. One of the most important cellular processes that seem to possess multiple levels of regulation is photosynthesis. A model organism for studying photosynthesis-related processes is the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii, due to advantages related to culturing, genetic manipulation and availability of genome sequence. In the present study, we were interested in understanding the regulatory mechanisms underlying photosynthesis-related processes. To achieve this goal different molecular approaches were followed. In order to indentify protein transcriptional regulators we optimized a method for isolation of nuclei and performed nuclear proteome analysis using shotgun proteomics. This analysis permitted us to improve the genome annotation previously published and to discover conserved and enriched protein motifs among the nuclear proteins. In another approach, a quantitative RT-PCR platform was established for the analysis of gene expression of predicted transcription factor (TF) and other transcriptional regulator (TR) coding genes by transcript profiling. The gene expression profiles for more than one hundred genes were monitored in time series experiments under conditions of changes in light intensity (200 µE m-2 s-1 to 700 µE m-2 s-1), and changes in concentration of carbon dioxide (5% CO2 to 0.04% CO2). The results indicate that many TF and TR genes are regulated in both environmental conditions and groups of co-regulated genes were found. Our findings also suggest that some genes can be common intermediates of light and carbon responsive regulatory pathways. These approaches together gave us new insights about the regulation of photosynthesis and revealed new candidate regulatory genes, helping to decipher the gene regulatory networks in Chlamydomonas. Further experimental studies are necessary to clarify the function of the candidate regulatory genes and to elucidate how cells coordinately regulate the assimilation of carbon and light responses. N2 - Pflanzen nutzen das Sonnenlicht um Substanzen, sogenannte Kohlenhydrate, zu synthetisieren. Diese können anschließend als Energielieferant für das eigene Wachstum genutzt werden. Der aufbauende Prozess wird als Photosynthese bezeichnet. Ein wichtiges Anliegen ist deshalb zu verstehen, wie Pflanzen äußere Einflüsse wahrnehmen und die Photosynthese dementsprechend regulieren. Ihre Zellen tragen diese Informationen in den Genen. Die Pflanzen nutzen aber in der Regel nicht alle ihre Gene gleichzeitig, die sie zur Anpassung an Umwelteinflüsse besitzen. Zu meist wird nur eine Teilfraktion der gesamten Information benötigt. Wir wollten der Frage nachgehen, welche Gene die Zellen für welche Situation regulieren. Im Zellkern gibt es Proteine, sogenannte Transkriptionsfaktoren, die spezifische Gene finden können und deren Transkription modulieren. Wenn ein Gen gebraucht wird, wird seine Information in andere Moleküle übersetzt (transkribiert), sogenannte Transkripte. Die Information dieser Transkripte wird benutzt um Proteine, Makromoleküle aus Aminsäuren, zu synthetisieren. Aus der Transkription eines Gens kann eine große Zahl des Transkripts entstehen. Es ist wahrscheinlich, dass ein Gen, dass gerade gebraucht wird, mehr Transkriptmoleküle hat als andere Gene. Da die Transkriptionsfaktoren mit der Transkription der Gene interferieren können, entwickelten wir in der vorliegenden Arbeit Strategien zur Identifikation dieser im Zellkern zu findenden Proteine mittels eines „Proteomics“-Ansatzes. Wir entwickelten weiterhin eine Strategie zur Identififikation von Transkripten Transkriptionsfaktor-codierender Gene in der Zelle und in welche Menge sie vorkommen. Dieser Ansatz wird als „Transcript-Profiling“ bezeichnet. Wir fanden Zellkern-lokalisierte Proteine, die als Signalmoleküle funktionieren könnten und Transkripte, die bei unterschiedlichen Umweltbedingungen in der Zelle vorhanden waren. Wir benutzten, die oben genannten Ansätze um die einzellige Grünalge Chlamydomonas zu untersuchen. Die Informationen, die wir erhielten, halfen zu verstehen welche Transkriptionsfaktoren notwendig sind, damit Chlamydomonas bei unterschiedlichen Umweltbedingungen, wie z.B. unterschiedliche Lichtintensitäten und unterschiedlicher Konzentration von Kohlenstoffdioxid, überlebt. KW - Proteomics KW - Transkriptionsfaktoren KW - Pflanzen KW - Chlamydomonas KW - Transcriptomics KW - Proteomics KW - Transcription factors KW - Plants KW - Chlamydomonas KW - Transcriptomics Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-53909 ER - TY - THES A1 - Devers, Emanuel T1 - Phosphate homeostasis and novel microRNAs are involved in the regulation of the arbuscular mycorrhizal symbiosis in Medicago truncatula T1 - Die Phosphat-Homöostase und neue mikroRNAs sind in die Regulation der arbuskulären Mykorrhiza in Medicago truncatula involviert N2 - Die arbuskuläre Mykorrhiza ist die wahrscheinlich älteste Form der Wurzelsymbiosen zwischen Pflanzen und Pilzen und hat sich vor 420 Millionen Jahren entwickelt. In dieser Symbiose, die zwischen nahezu allen Landpflanzen und Pilzen des Reiches Glomeromycota ausgebildet wird, versorgt der Pilz die Pflanze mit Nährstoffen, wobei die verbesserte Versorgung mit Phosphat für die Pflanze sicher den größten Vorteil darstellt. Im Gegenzug erhält der Pilz Zucker, welche die Pflanze aus der Photosynthese bereitstellt. Zu hohe Phosphatkonzentrationen im Boden oder Dünger führen allerdings zu einer Verringerung in der Ausprägung der arbuskulären Mykorrhiza. Diese Unterdrückung der Symbiose wird nicht durch eine lokale Reaktion der Wurzeln ausgelöst, sondern in erster Linie durch einen hohen Phosphatgehalt im Pflanzenspross. Somit handelt es sich also um eine systemische, also dem Gesamtsystem „Pflanze“ betreffende Antwort. Die molekularen Mechanismen dieser Anpassung sind noch wenig bekannt und sind vor allem für die Agrarwirtschaft von besonderem Interesse. Eine Mikro-RNA (miRNA) des bereits bekannten Phosphathomöostasesignalwegs (PHR1-miRNA399-PHO2 Signalweg) akkumuliert verstärkt in mykorrhizierten Wurzeln. Das deutet daraufhin, dass dieser Signalweg und diese miRNA eine wichtige Rolle in der Regulation der arbuskulären Mykorrhiza spielen. Ziel dieser Studie war es neue Einblicke in die molekularen Mechanismen, die zur Unterdrückung der arbuskulären Mykorrhiza bei hohen Phosphatkonzentrationen führen, zu gewinnen. Dabei sollte der Einfluss von PHO2, sowie von miRNAs in dieser Symbiose genauer untersucht werden. Ein funktionelles Ortholog von PHO2, MtPho2, wurde in der Pflanze Medicago truncatula identifiziert. MtPho2-Mutanten, welche nicht mehr in der Lage waren ein funktionales PHO2 Protein zu exprimieren, zeigten schnellere Kolonisierung durch den AM-Pilz. Jedoch wurde auch in den mtpho2-Mutanten die Symbiose durch hohe Phosphatkonzentrationen unterdrückt. Dies bedeutet, dass PHO2 und somit der PHR1-miRNA399-PHO2 Signalweg eine wichtige Funktion während der fortschreitenden Kolonisierung der Wurzel durch den Pilz hat, aber und weitere Mechanismen in der Unterdückung der Symbiose bei hohen Phosphatkonzentrationen beteiligt sein müssen. Die Analyse von Transkriptionsprofilen von Spross- und Wurzeln mittels Microarrays zeigte, dass die Unterdrückung der AM Symbiose durch hohe Phosphatkonzentrationen möglicherweise auf eine Unterdrückung der Expression einer Reihe symbiosespezifischer Gene im Spross der Pflanze beruht. Um die Rolle weiterer miRNA in der AM Symbiose zu untersuchen, wurden mittels einer Hochdurchsatz-Sequenzierung 243 neue und 181 aus anderen Pflanzen bekannte miRNAs in M. truncatula entdeckt. Zwei dieser miRNAs, miR5229 und miR160f*, sind ausschließlich während der arbuskulären Mykorrhiza zu finden und weitere miRNAs werden während dieser Symbiose verstärkt gebildet. Interessanterweise führen einige dieser miRNAs zum Abbau von Transkripten, die eine wichtige Funktion in der arbuskulären Mykorrhiza und Wurzelknöllchensymbiose besitzen. Die Ergebnisse dieser Studie liefern eine neue Grundlage für die Untersuchung von regulatorischen Netzwerken, die zur zellulären Umprogrammierung während der Interaktion zwischen Pflanzen und arbuskulären Mykorrhiza-Pilzen bei verschiedenen Phosphatbedingungen führen. N2 - AM symbiosis has a positive influence on plant P-nutrition and growth, but little is known about the molecular mechanism of the symbiosis adaptation to different phosphate conditions. The recently described induction of several pri-miR399 transcripts in mycorrhizal shoots and subsequent accumulation of mature miR399 in mycorrhizal roots indicates that local PHO2 expression must be controlled during symbiosis, presumably in order to sustain AM symbiosis development, in spite of locally increased Pi-concentration. A reverse genetic approach used in this study demonstrated that PHO2 and thus the PHR1-miR399-PHO2 signaling pathway, is involved in certain stages of progressive root colonization. In addition, a transcriptomic approach using a split-root system provided a comprehensive insight into the systemic transcriptional changes in mycorrhizal roots and shoots of M. truncatula in response to high phosphate conditions. With regard to the transcriptional responses of the root system, the results indicate that, although the colonization is drastically reduced, AM symbiosis is still functional at high Pi concentrations and might still be beneficial to the plant. Additionally, the data suggest that a specific root-borne mycorrhizal signal systemically induces protein synthesis, amino acid metabolism and photosynthesis at low Pi conditions, which is abolished at high Pi conditions. MiRNAs, such as miR399, are involved in long-distance signaling and are therefore potential systemic signals involved in AM symbiosis. A deep-sequencing approach identified 243 novel miRNAs in the root tissue of M. truncatula. Read-count analysis, qRT-PCR measurements and in situ hybridizations clearly indicated a regulation of miR5229a/b, miR5204, miR160f*, miR160c, miR169 and miR169d*/l*/m*/e.2* during arbuscular mycorrhizal symbiosis. Moreover, miR5204* represses a GRAS TF, which is specifically transcribed in mycorrhizal roots. Since miR5204* is induced by high Pi it might represent a further Pi status-mediating signal beside miR399. This study provides additional evidence that MtNsp2, a key regulator of symbiosis-signaling, is regulated and presumably spatially restricted by miR171h cleavage. In summary, a repression of mycorrhizal root colonization at high phosphate status is most likely due to a repression of the phosphate starvation responses and the loss of beneficial responses in mycorrhizal shoots. These findings provide a new basis for investigating the regulatory network leading to cellular reprogramming during interaction between plants, arbuscular mycorrhizal fungi and different phosphate conditions. KW - Phosphat KW - miRNA KW - Symbiose KW - Medicago KW - phosphate KW - miRNA KW - symbiosis KW - Medicago Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-55572 ER - TY - GEN A1 - Bierbach, David A1 - Schulte, Matthias A1 - Herrmann, Nina A1 - Tobler, Michael A1 - Stadler, Stefan A1 - Jung, Christian T. A1 - Kunkel, Benjamin A1 - Riesch, Rüdiger A1 - Klaus, Sebastian A1 - Ziege, Madlen A1 - Indy, Jeane Rimber A1 - Arias-Rodriguez, Lenin A1 - Plath, Martin T1 - Predator-induced changes of female mating preferences BT - innate and experiential effects T2 - Postprints der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe N2 - Background In many species males face a higher predation risk than females because males display elaborate traits that evolved under sexual selection, which may attract not only females but also predators. Females are, therefore, predicted to avoid such conspicuous males under predation risk. The present study was designed to investigate predator-induced changes of female mating preferences in Atlantic mollies (Poecilia mexicana). Males of this species show a pronounced polymorphism in body size and coloration, and females prefer large, colorful males in the absence of predators. Results In dichotomous choice tests predator-naïve (lab-reared) females altered their initial preference for larger males in the presence of the cichlid Cichlasoma salvini, a natural predator of P. mexicana, and preferred small males instead. This effect was considerably weaker when females were confronted visually with the non-piscivorous cichlid Vieja bifasciata or the introduced non-piscivorous Nile tilapia (Oreochromis niloticus). In contrast, predator experienced (wild-caught) females did not respond to the same extent to the presence of a predator, most likely due to a learned ability to evaluate their predators' motivation to prey. Conclusions Our study highlights that (a) predatory fish can have a profound influence on the expression of mating preferences of their prey (thus potentially affecting the strength of sexual selection), and females may alter their mate choice behavior strategically to reduce their own exposure to predators. (b) Prey species can evolve visual predator recognition mechanisms and alter their mate choice only when a natural predator is present. (c) Finally, experiential effects can play an important role, and prey species may learn to evaluate the motivational state of their predators. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 984 KW - sexual selection KW - female choice KW - non-independent mate choice KW - predator recognition KW - Poecilia mexicana Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-431099 SN - 1866-8372 IS - 984 ER - TY - THES A1 - Barbosa Pfannes, Eva Katharina T1 - Probing the regulatory mechanisms of the actomyosin system in motile cells T1 - Erforschung von Regulationsmechanismen des Aktomyosinsystems in bewegliche Zellen N2 - Actin-based directional motility is important for embryonic development, wound healing, immune responses, and development of tissues. Actin and myosin are essential players in this process that can be subdivided into protrusion, adhesion, and traction. Protrusion is the forward movement of the membrane at the leading edge of the cell. Adhesion is required to enable movement along a substrate, and traction finally leads to the forward movement of the entire cell body, including its organelles. While actin polymerization is the main driving force in cell protrusions, myosin motors lead to the contraction of the cell body. The goal of this work was to study the regulatory mechanisms of the motile machinery by selecting a representative key player for each stage of the signaling process: the regulation of Arp2/3 activity by WASP (actin system), the role of cGMP in myosin II assembly (myosin system), and the influence of phosphoinositide signaling (upstream receptor pathway). The model organism chosen for this work was the social ameba Dictyostelium discoideum, due to the well-established knowledge of its cytoskeletal machinery, the easy handling, and the high motility of its vegetative and starvation developed cells. First, I focused on the dynamics of the actin cytoskeleton by modulating the activity of one of its key players, the Arp2/3 complex. This was achieved using the carbazole derivative Wiskostatin, an inhibitor of the Arp2/3 activator WASP. Cells treated with Wiskostatin adopted a round shape, with no of few pseudopodia. With the help of a microfluidic cell squeezer device, I could show that Wiskostatin treated cells display a reduced mechanical stability, comparable to cells treated with the actin disrupting agent Latrunculin A. Furthermore, the WASP inhibited cells adhere stronger to a surface and show a reduced motility and chemotactic performance. However, the overall F-actin content in the cells was not changed. Confocal microscopy and TIRF microscopy imaging showed that the cells maintained an intact actin cortex. Localized dynamic patches of increased actin polymerization were observed that, however, did not lead to membrane deformation. This indicated that the mechanisms of actin-driven force generation were impaired in Wiskostatin treated cells. It is concluded that in these cells, an altered architecture of the cortical network leads to a reduced overall stiffness of the cell, which is insufficient to support the force generation required for membrane deformation and pseudopod formation. Second, the role of cGMP in myosin II dynamics was investigated. Cyclic GMP is known to regulate the association of myosin II with the cytoskeleton. In Dictyostelium, intracellular cGMP levels increase when cells are exposed to chemoattractants, but also in response to osmotic stress. To study the influence of cyclic GMP on actin and myosin II dynamics, I used the laser-induced photoactivation of a DMACM-caged-Br-cGMP to locally release cGMP inside the cell. My results show that cGMP directly activates the myosin II machinery, but is also able to induce an actin response independently of cAMP receptor activation and signaling. The actin response was observed in both vegetative and developed cells. Possible explanations include cGMP-induced actin polymerization through VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein) or through binding of cGMP to cyclic nucleotide-dependent kinases. Finally, I investigated the role of phosphoinositide signaling using the Polyphosphoinositide-Binding Peptide (PBP10) that binds preferentially to PIP2. Phosphoinositides can recruit actin-binding proteins to defined subcellular sites and alter their activity. Neutrophils, as well as developed Dictyostelium cells produce PIP3 in the plasma membrane at their leading edge in response to an external chemotactic gradient. Although not essential for chemotaxis, phosphoinositides are proposed to act as an internal compass in the cell. When treated with the peptide PBP10, cells became round, with fewer or no pseudopods. PH-CRAC translocation to the membrane still occurs, even at low cAMP stimuli, but cell motility (random and directional) was reduced. My data revealed that the decrease in the pool of available PIP2 in the cell is sufficient to impair cell motility, but enough PIP2 remains so that PIP3 is formed in response to chemoattractant stimuli. My data thus highlights how sensitive cell motility and morphology are to changes in the phosphoinositide signaling. In summary, I have analyzed representative regulatory mechanisms that govern key parts of the motile machinery and characterized their impact on cellular properties including mechanical stability, adhesion and chemotaxis. N2 - Das Ziel der Arbeit war es, die regulatorischen Mechanismen der Zellmotilität zu untersuchen. Dazu habe ich für jedes Stadium dieses Prozesses einen repräsentativen regulatorischen Schritt ausgewählt und genauer untersucht: Die Regelung des Arp2/3 Komplexes durch WASP (Aktinsystem), die Rolle von cGMP in der Myosin II-Regulation (Myosinsystem) und der Einfluss von Phosphoinositiden im intrazellulären Signalprozess (Rezeptor-Signalweg). Die soziale Amöbe Dictyostelium discoideum wurde als Modellorganismus für diese Arbeiten gewählt. Gründe für diese Wahl waren die bereits vorliegenden detaillierten Kenntnisse über das Zytoskelett dieser Zellen, ihre einfache Handhabbarkeit im Labor, und die hohe Motilität der Zellen im vegetativen und entwickelten Zustand. Als Erstes analysierte ich die Dynamik des Aktin-Zytoskeletts durch Modulation der Aktivität des Arp2/3-Komplexes. Dafür benutzte ich das Carbazol-Derivat Wiskostatin, ein Inhibitor des Arp2/3-Aktivators WASP. Zellen, die mit Wiskostatin behandelt wurden, zeigten eine runde Form mit wenigen oder keinen Pseudopodien. Mit Hilfe des mikrofluidischen cell squeezer device konnte ich zeigen, dass Wiskostatin-behandelte Zellen eine geringere mechanische Stabilität aufweisen, vergleichbar mit Zellen unter dem Einfluss des Aktin-depolymerisierenden Wirkstoffes Latrunculin A. Darüber hinaus zeigen Wiskostatin behandelten Zellen eine erhöhte Substratadhäsion und eine verringerte Motilität und chemotaktische Effizienz. Der F-Aktingehalt der Zelle insgesamt blieb jedoch unverändert. Konfokal- und TIRF-mikroskopische Aufnahmen zeigten, dass die Zellen einen intakten Aktinkortex aufweisen. Es konnten lokalisierte dynamische Regionen erhöhter Aktinpolymerisation beobachtet werden, die jedoch nicht zur Ausbildung von Membrandeformationen führten. Daraus kann man rückschließen, dass die Mechanismen der Krafterzeugung im Aktin-Zytoskelett in WASP-inhibierten Zellen beeinträchtigt sind. Vermutlich liegt in diesen Zellen eine veränderte Mikroarchitektur des kortikalen Netzwerks vor, die zu einer verminderten Steifigkeit der Zelle führt, so dass die zur Bildung von Pseudopodien erforderlichen Kräfte nicht entfaltet werden können. Als Zweites wurde die Rolle von cGMP in der Myosin II-Dynamik untersucht. Es ist bekannt, dass cGMP die Assoziation von Myosin II mit dem Zytoskelett reguliert. In Dictyostelium steigt die intrazelluläre Konzentration von cGMP in Gegenwart von chemoattraktiven Lockstoffen sowie in Antwort auf osmotischen Stress. Um den Einfluss von cGMP auf die Aktin und Myosin II -Dynamik zu untersuchen, benutzte ich laserinduzierte Photoaktivierung von DMACM-caged-Br-cGMP, um cGMP lokal innerhalb der Zelle freizusetzen. Meine Ergebnisse zeigten, dass intrazelluläres cGMP direkt zur Aktivierung von Myosin II führt, jedoch auch Aktinantworten unabhängig vom cAMP-Rezeptorsignalweg induzieren kann. Die Aktinreaktion wurde sowohl in vegetativen als auch in entwickelten Zellen beobachtet. Eine mögliche Erklärung könnte die cGMP-induzierte Aktinpolymerisation über VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein) sein oder über die Bindung von cGMP an Nukleotid-abhängige Proteinkinasen. Als dritten Punkt meiner Arbeit untersuchte ich die Rolle der Phosphoinositide mit Hilfe des Phosphoinositide-bindenden Proteins PBP10, das bevorzugt an PIP2 bindet. Phosphoinositiden können Aktin-bindende Proteine zu definierten subzellulären Orten rekrutieren und ihre Aktivität verändern. Sowohl Neutrophile als auch entwickelte Dictyostelium Zellen produzieren PIP3 in der Plasmamembran an ihrer leading edge in Antwort auf externe Gradienten chemischer Lockstoffe. Obwohl Zellen auch ohne PIP3 chemotaktisches Verhalten zeigen, werden Phosphoinositide im Allgemeinen mit dem inneren chemotaktischen Kompass der Zelle in Verbindung gebracht. Mit dem Peptid PBP10 behandelte Zellen nahmen eine runde Form an, mit wenigen oder keinen Pseudopodien. PH-CRAC -Translokation zur Membran konnte in PBP10-behandelten Zellen selbst bei geringen cAMP-Stimuli weiterhin beobachtet werden. Ungerichtete wie auch gerichtete Zellmotiliät waren jedoch beeinträchtigt. Meine Daten zeigen, dass die Abnahme des PIP2-Pools in der Zelle durch PBP10 ausreicht, um die Zellmotilität zu beeinträchtigen, dass jedoch genug PIP2 erhalten bleibt um in Folge einer Rezeptorstimulation PIP3 zu produzieren. Die Ergebnisse demonstrieren daher, wie empfindlich Zellmotilität und -morphologie gegenüber Modifikationen im Phosphoinositid-Signalweg sind. Zusammenfassend habe ich mehrere repräsentative Beispiele für regulatorische Mechanismen der Zellmotilität untersucht und deren Auswirkung auf Eigenschaften der Zelle wie mechanische Stabilität, Zelladhäsion und Chemotaxis charakterisiert. KW - Dictyostelium KW - Aktomyosin KW - Wiskostatin KW - cGMP KW - PBP10 KW - Dictyostelium KW - actomyosin KW - Wiskostatin KW - cGMP KW - PBP10 Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-57812 ER - TY - GEN A1 - Lamprecht, Anna-Lena A1 - Naujokat, Stefan A1 - Margaria, Tiziana A1 - Steffen, Bernhard T1 - Semantics-based composition of EMBOSS services T2 - Postprints der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe N2 - Background More than in other domains the heterogeneous services world in bioinformatics demands for a methodology to classify and relate resources in a both human and machine accessible manner. The Semantic Web, which is meant to address exactly this challenge, is currently one of the most ambitious projects in computer science. Collective efforts within the community have already led to a basis of standards for semantic service descriptions and meta-information. In combination with process synthesis and planning methods, such knowledge about types and services can facilitate the automatic composition of workflows for particular research questions. Results In this study we apply the synthesis methodology that is available in the Bio-jETI workflow management framework for the semantics-based composition of EMBOSS services. EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite) is a collection of 350 tools (March 2010) for various sequence analysis tasks, and thus a rich source of services and types that imply comprehensive domain models for planning and synthesis approaches. We use and compare two different setups of our EMBOSS synthesis domain: 1) a manually defined domain setup where an intuitive, high-level, semantically meaningful nomenclature is applied to describe the input/output behavior of the single EMBOSS tools and their classifications, and 2) a domain setup where this information has been automatically derived from the EMBOSS Ajax Command Definition (ACD) files and the EMBRACE Data and Methods ontology (EDAM). Our experiments demonstrate that these domain models in combination with our synthesis methodology greatly simplify working with the large, heterogeneous, and hence manually intractable EMBOSS collection. However, they also show that with the information that can be derived from the (current) ACD files and EDAM ontology alone, some essential connections between services can not be recognized. Conclusions Our results show that adequate domain modeling requires to incorporate as much domain knowledge as possible, far beyond the mere technical aspects of the different types and services. Finding or defining semantically appropriate service and type descriptions is a difficult task, but the bioinformatics community appears to be on the right track towards a Life Science Semantic Web, which will eventually allow automatic service composition methods to unfold their full potential. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 956 KW - service description KW - synthesis algorithm KW - input type KW - synthesis methodology KW - electronic tool integration Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-431830 SN - 1866-8372 IS - 956 ER - TY - THES A1 - Vosloh, Daniel T1 - Subcellular compartmentation of primary carbon metabolism in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana T1 - Subzelluläre Kompartimentierung des primären Kohlenstoffmetabolismus in Mesophyllzellen von Arabidopsis thaliana N2 - Metabolismus in Pflanzenzellen ist stark kompartimentiert. Viele Stoffwechselwege haben Reaktionen in mehr als einem Kompartiment. Zum Beispiel wird während der Photosynthese in pflanzlichen Mesophyllzellen Kohlenstoff in Form von Stärke in den Chloroplasten synthetisiert, während es im Zytosol in Form von Sacharose gebildet und in der Vakuole gespeichert wird. Diese Reaktionen sind strikt reguliert um ein Gleichgewicht der Kohlenstoffpools der verschiedenen Kompartimente aufrecht zu erhalten und die Energieversorgung aller Teile der Zelle für anabolische Reaktionen sicher zu stellen. Ich wende eine Methode an, bei der die Zellen unter nicht-wässrigen Bedingungen fraktioniert werden und daher der metabolische Status der während der Ernte herrschte über den ganzen Zeitraum der Auftrennung beibehalten wird. Durch die Kombination von nichtwässriger Fraktionierung und verschiedener Massenspektrometrietechniken (Flüssigchromotagraphie- und Gaschromotagraphie basierende Massenspekrometrie) ist es möglich die intrazelluläre Verteilung der meisten Intermediate des photosynthetischen Kohlenstoffstoffwechsels und der Produkte der nachgelagerten metabolischen Reaktionen zu bestimmen. Das Wissen über die in vivo Konzentrationen dieser Metabolite wurde genutzt um die Änderung der freien Gibbs Energie in vivo zu bestimmen. Mit Hilfe dessen kann bestimmt werden, welche Reaktion sich in einem Gleichgewichtszustand befinden und welche davon entfernt sind. Die Konzentration der Enzyme und der Km Werte wurden mit den Konzentrationen der Metabolite in vivo verglichen, um festzustellen, welche Enzyme substratlimitiert sind und somit sensitiv gegenüber Änderungen der Substratkonzentration sind. Verschiedene Intermediate des Calvin-Benson Zyklus sind gleichzeitig Substrate für andere Stoffwechselwege, als da wären Dihyroxyaceton-phosphat (DHAP, Saccharosesynthese), Fructose 6-phosphat (Fru6P, Stärkesynthese), Erythrose 4-phosphat (E4P, Shikimat Stoffwechselweg) und Ribose 5-phosphat (R5P, Nukleotidbiosynthese). Die Enzyme, die diese Intermediate verstoffwechseln, liegen an den Abzweigungspunkten zu diesen Stoffwechselwegen. Diese sind Trisose phosphat isomerase (DHAP), Transketolase (E4P), Sedoheptulose-1,7 biphosphat aldolase (E4P) und Ribose-5-phosphat isomerase (R5P), welche nicht mit ihren Substraten gesättigt sind, da die jeweilige Substratkonzentration geringer als der zugehörige Km Wert ist. Für metabolische Kontrolle bedeutet dies, dass diese Schritte am sensitivsten gegenüber Änderungen der Substratkonzentrationen sind. Im Gegensatz dazu sind die regulierten irreversiblen Schritte von Fructose-1,6.biphosphatase und Sedoheptulose-1,7-biphosphatase relativ insensitiv gegenüber Änderungen der Substratkonzentration. Für den Stoffwechselweg der Saccharosesynthese konnte gezeigt werden, dass die zytosolische Aldolase eine geringer Bindeseitenkonzentration als Substratkonzentration (DHAP) aufweist, und dass die Konzentration von Saccharose-6-phosphat geringer als der Km Wert des synthetisierenden Enzyms Saccharose-phosphatase ist. Sowohl die Saccharose-phosphat-synthase, also auch die Saccharose-phosphatase sind in vivo weit von einem Gleichgewichtszustand entfernt. In Wildtyp Arabidopsis thaliana Columbia-0 Blättern wurde der gesamte Pool von ADPGlc im Chloroplasten gefunden. Das Enzyme ADPGlc pyrophosphorylase ist im Chloroplasten lokalisiert und synthetisiert ADPGlc aus ATP und Glc1P. Dieses Verteilungsmuster spricht eindeutig gegen die Hypothese von Pozueta-Romero und Kollegen, dass ADPGlc im Zytosol durch ADP vermittelte Spaltung von Saccharose durch die Saccharose Synthase erzeugt wird. Basierend auf dieser Beobachtung und anderen veröffentlichten Ergebnissen wurde geschlußfolgert, dass der generell akzeptierte Stoffwechselweg der Stärkesynthese durch ADPGlc Produktion via ADPGlc pyrophosphorylase in den Chloroplasten korrekt ist, und die Hypothese des alternativen Stoffwechselweges unhaltbar ist. Innerhalb des Stoffwechselweges der Saccharosesynthsese wurde festgestellt, dass die Konzentration von ADPGlc geringer als der Km Wert des Stärkesynthase ist, was darauf hindeutet, dass das Enzym substratlimitiert ist. Eine generelle Beobachtung ist, dass viele Enzmye des Calvin-Benson Zyklus ähnliche Bindeseitenkonzentrationen wie Metabolitkonzentrationen aufweisen, wohingegen in den Synthesewegen von Saccharose und Stärke die Bindeseitenkonzentrationen der Enzyme viel geringer als die Metabolitkonzentrationen sind. N2 - Metabolism in plant cells is highly compartmented, with many pathways involving reactions in more than one compartment. For example, during photosynthesis in leaf mesophyll cells, primary carbon fixation and starch synthesis take place in the chloroplast, whereas sucrose is synthesized in the cytosol and stored in the vacuole. These reactions are tightly regulated to keep a fine balance between the carbon pools of the different compartments and to fulfil the energy needs of the organelles. I applied a technique which fractionates the cells under non-aqueous conditions, whereby the metabolic state is frozen at the time of harvest and held in stasis throughout the fractionation procedure. With the combination of non-aqueous fractionation and mass spectrometry based metabolite measurements (LC-MS/MS, GC-MS) it was possible to investigate the intracellular distributions of the intermediates of photosynthetic carbon metabolism and its products in subsequent metabolic reactions. With the knowledge about the in vivo concentrations of these metabolites under steady state photosynthesis conditions it was possible to calculate the mass action ratio and change in Gibbs free energy in vivo for each reaction in the pathway, to determine which reactions are near equilibrium and which are far removed from equilibrium. The Km value and concentration of each enzyme were compared with the concentrations of its substrates in vivo to assess which reactions are substrate limited and so sensitive to changes in substrate concentration. Several intermediates of the Calvin-Benson cycle are substrates for other pathways, including dihydroxyacetone-phosphate (DHAP,sucrose synthesis), fructose 6-phosphate (Fru6P, starch synthesis), erythrose 4-phosphate (E4P,shikimate pathway) and ribose 5-phosphate (R5P, nucleotide synthesis). Several of the enzymes that metabolise these intermediates, and so lie at branch points in the pathway, are triose-phosphate isomerase (DHAP), transketolase (E4P, Fru6P), sedoheptulose-1,7-bisphosphate aldolase (E4P) and ribose-5-phosphate isomerase (R5P) are not saturated with their respective substrate as the metabolite concentration is lower than the respective Km value. In terms of metabolic control these are the steps that are most sensitive to changes in substrate availability, while the regulated irreversible reactions of fructose-1,6-bisphosphatase and sedoheptulose-1,7-bisphosphatase are relatively insensitive to changes in the concentrations of their substrates. In the pathway of sucrose synthesis it was shown that the concentration of the catalytic binding site of the cytosolic aldolase is lower than the substrate concentration of DHAP, and that the concentration of Suc6P is lower than the Km of sucrose-phosphatase for this substrate. Both the sucrose-phosphate synthase and sucrose-phosphatase reactions are far removed from equilibrium in vivo. In wild type A. thaliana Columbia-0 leaves, all of the ADPGlc was found to be localised in the chloroplasts. ADPglucose pyrophosphorylase is localised to the chloroplast and synthesises ADPGlc from ATP and Glc1P. This distribution argues strongly against the hypothesis proposed by Pozueta-Romero and colleagues that ADPGlc for starch synthesis is produced in the cytosol via ADP-mediated cleavage of sucrose by sucrose synthase. Based on this observation and other published data it was concluded that the generally accepted pathway of starch synthesis from ADPGlc produced by ADPglucose pyrophosphorylase in the chloroplasts is correct, and that the alternative pathway is untenable. Within the pathway of starch synthesis the concentration of ADPGlc was found to be well below the Km value of starch synthase for ADPGlc, indicating that the enzyme is substrate limited. A general finding in the comparison of the Calvin-Benson cycle with the synthesis pathways of sucrose and starch is that many enzymes in the Calvin Benson cycle have active binding site concentrations that are close to the metabolite concentrations, while for nearly all enzymes in the synthesis pathways the active binding site concentrations are much lower than the metabolite concentrations. KW - Pflanze KW - Kohlenstoffmetabolismus KW - Mesophyll KW - Zelle KW - plant KW - carbon metabolism KW - mesophyll KW - cell Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-55534 ER - TY - THES A1 - Langer, Marco T1 - The effect of native forest dynamics upon the arrangements of species in oak forests-analysis of heterogeneity effects at the example of epigeal arthropods N2 - The heterogeneity in species assemblages of epigeal spiders was studied in a natural forest and in a managed forest. Additionally the effects of small-scale microhabitat heterogeneity of managed and unmanaged forests were determined by analysing the spider assemblages of three different microhabitat structures (i. vegetation, ii. dead wood. iii. litter cover). The spider were collected in a block design by pitfall traps (n=72) in a 4-week interval. To reveal key environmental factors affecting the spider distribution abiotic and biotic habitat parameters (e.g. vegetation parameters, climate parameters, soil moisture) were assessed around each pitfall trap. A TWINSPAN analyses separated pitfall traps from the natural forest from traps of the managed forest. A subsequent discriminant analyses revealed that the temperature, the visible sky, the plant diversity and the mean diameter at breast height as key discriminant factors between the microhabitat groupings designated by the TWINSPAN analyses. Finally a Redundant analysis (RDA) was done revealing similar environmental factors responsible for the spider species distribution, as a good separation of the different forest types as well as the separation of the microhabitat groupings from the TWINSPAN. Overall the study revealed that the spider communities differed between the forest types as well as between the microhabitat structures and thus species distribution changed within a forest stand on a fine spatial scale. It was documented that the structure of managed forests affects the composition of spider assemblages compared to natural forests significantly and even small scale-heterogeneity seems to influence the spider species composition. N2 - Um die Anpassungsfähigkeit von Organismen, bei sich ändernden Umweltbedingungen, sicher zu stellen, spielt die Erhaltung der Biologischen Vielfalt auf allen ökosystemaren Ebenen eine entscheidende Rolle. Eben diese Anpassungsfähigkeit kann durch waldbauliche Maßnahmen einschränkt werden, und zur Instabilität des Systems führen. Daher kommt der Untersuchung von aus der Nutzung genommenen Naturwaldzellen eine immer größere Bedeutung zu. Einerseits um die potentiell natürliche Diversität in Naturwäldern mit der in Wirtschaftswäldern zu vergleichen, andererseits um die ökologischen Zusammenhänge in einer natürlichen Waldentwicklung zu verstehen. Ziel diese Studie war es eben diese natürlichen Waldynamiken auf das Artengefüge von Spinnen (Araneae) zu untersuchen. Dabei sollte Mithilfe eines experimentellen Fangdesigns, auch der kleinräumige Einfluss von Strukturheterogenität untersucht werden. KW - Wald KW - Spinnen KW - Ökologie KW - Naturwald KW - bodenlebende Gliederfüßer KW - forest KW - spiders KW - virgin forest KW - ecology KW - epigeal arthropods Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-55588 ER - TY - THES A1 - Kartal, Önder T1 - The role of interfacial and 'entropic' enzymes in transitory starch degradation : a mathematical modeling approach T1 - Zur Aufklärung der Rolle grenzflächenaktiver und "entropischer" Enzyme beim Abbau transitorischer Stärke auf Grundlage mathematischer Modelle N2 - Plants and some unicellular algae store carbon in the form of transitory starch on a diurnal basis. The turnover of this glucose polymer is tightly regulated and timely synthesis as well as mobilization is essential to provide energy for heterotrophic growth. Especially for starch degradation, novel enzymes and mechanisms have been proposed recently. However, the catalytic properties of these enzymes and their coordination with metabolic regulation are still to be discovered. This thesis develops theoretical methods in order to interpret and analyze enzymes and their role in starch degradation. In the first part, a novel description of interfacial enzyme catalysis is proposed. Since the initial steps of starch degradation involve reactions at the starch-stroma interface it is necessary to have a framework which allows the derivation of interfacial enzyme rate laws. A cornerstone of the method is the introduction of the available area function - a concept from surface physics - to describe the adsorption step in the catalytic cycle. The method is applied to derive rate laws for two hydrolases, the Beta-amylase (BAM3) and the Isoamylase (DBE/ISA3), as well as to the Glucan, water dikinase (GWD) and a Phosphoglucan phosphatase (DSP/SEX4). The second part uses the interfacial rate laws to formulate a kinetic model of starch degradation. It aims at reproducing the stimulatory effect of reversible phosphorylation by GWD and DSP on the breakdown of the granule. The model can describe the dynamics of interfacial properties during degradation and suggests that interfacial amylopectin side-chains undergo spontaneous helix-coil transitions. Reversible phosphorylation has a synergistic effect on glucan release especially in the early phase dropping off during degradation. Based on the model, the hypothesis is formulated that interfacial phosphorylation is important for the rapid switch from starch synthesis to starch degradation. The third part takes a broader perspective on carbohydrate-active enzymes (CAZymes) but is motivated by the organization of the downstream pathway of starch breakdown. This comprises Alpha-1,4-glucanotransferases (DPE1 and DPE2) and Alpha-glucan-phosphorylases (Pho or PHS) both in the stroma and in the cytosol. CAZymes accept many different substrates and catalyze numerous reactions and therefore cannot be characterized in classical enzymological terms. A concise characterization is provided by conceptually linking statistical thermodynamics and polymer biochemistry. Each reactant is interpreted as an energy level, transitions between which are constrained by the enzymatic mechanisms. Combinations of in vitro assays of polymer-active CAZymes essential for carbon metabolism in plants confirmed the dominance of entropic gradients. The principle of entropy maximization provides a generalization of the equilibrium constant. Stochastic simulations confirm the results and suggest that randomization of metabolites in the cytosolic pool of soluble heteroglycans (SHG) may contribute to a robust integration of fluctuating carbon fluxes coming from chloroplasts. N2 - Stärke hat eine herausragende Bedeutung für die menschliche Ernährung. Sie ist ein komplexes, wasserunlösliches Glucosepolymer und dient - als eine der wichtigsten Speicherformen von Kohlenhydraten in Pflanzen - der Aufrechterhaltung des Energiestoffwechsels. Unterschiedliche Organe enthalten Stärke. In Knollen und Samen wird die sogenannte Speicherstärke über lange Zeiträume auf- und abgebaut. Die im Allgemeinen weniger bekannte transitorische Stärke in Blättern und einigen einzelligen Algen wird in einem täglichen Rhythmus umgesetzt: Sie wird während der Photosynthese aufgebaut und in der Nacht abgebaut. Experimentelle Studien haben nachgewiesen, dass die Fähigkeit der Pflanze, den Abbau transitorischer Stärke zu regeln, essentiell ist, um während der Nacht das Wachstum der Pflanze zu gewährleisten. Da die Geschwindigkeit von biochemischen Reaktionen über Enzyme reguliert wird, ist die Aufklärung ihrer Funktion im Stoffwechsel eine notwendige Voraussetzung, um den komplexen Prozess des Wachstums zu erklären. Die vorliegende Arbeit stellt einen Versuch dar, die Funktion von Enzymen beim Stärkeabbau anhand von mathematischen Modellen und Computersimulationen besser zu verstehen. Dieser Ansatz erlaubt es, Eigenschaften des Systems durch Abstraktion anhand eines idealisierten Abbildes herzuleiten. Die mathematisch notwendigen Folgerungen dienen der Aufstellung von Hypothesen, die wiederum mit experimentellen Resultaten konfrontiert werden können. Stoffwechselsysteme sind komplexe Untersuchungsobjekte, bei denen eine rein qualitative Argumentation schnell an Grenzen gerät, wo mathematische Methoden die Möglichkeit von Aussagen noch zulassen. Der erste Teil der Arbeit entwickelt einen theoretischen Rahmen, um Gleichungen für die Geschwindigkeit oberflächenaktiver Enzyme herzuleiten. Dies ist notwendig, da die ersten Reaktionen, die dem Stärkeabbau zugeordnet werden, an ihrer Oberfläche stattfinden. Die Methode wird auf vier essentielle Enzyme angewandt: zwei abbauende Enzyme (Beta-Amylase und Isoamylase) und zwei den Abbau unterstützende Enzyme (Alpha-Glucan,Wasser-Dikinase und Phosphoglucan Phosphatase). Der zweite Teil entwickelt ein kinetisches Modell des Stärkeabbaus unter Verwendung der hergeleiteten Ratengleichungen. Das Modell bildet die Dynamik des Systems realistisch ab und legt nahe, dass ein spontaner Phasenübergang an der Oberfläche von geordneten zu weniger geordneten Zuständen stattfindet. Ferner wird die Hypothese aufgestellt, dass die reversible Modifikation der Oberfläche durch Enzyme besonders in der Anfangsphase des Abbaus einen synergetischen Effekt hat, d.h. den Abbau enorm beschleunigt. Dies könnte beim schnellen Umschalten von Stärkeaufbau zu Stärkeabbau regulatorisch relevant sein. Im letzten Teil werden kohlenhydrataktive Enzyme betrachtet, die in der löslichen Phase die Produkte des Stärkeabbaus weiterverarbeiten. Da diese sogenannten Transferasen auch in vielen anderen Organismen und Stoffwechselwegen vorkommen, wird ein allgemeiner Standpunkt eingenommen. Anhand von Methoden aus der statistischen Physik wird theoretisch wie experimentell nachgewiesen, dass diese Enzyme spontan die Entropie innerhalb des Stoffwechselsystems erhöhen. Diese Neigung, "Unordnung" zu schaffen, wird vom Organismus aber paradoxerweise ausgenutzt, um die Weiterverarbeitung von Kohlenhydraten im Stärkestoffwechsel zu stabilisieren. Dieser Mechanismus eröffnet einen neuen Blick auf energie- und entropiegetriebene Prozesse in Zellen. KW - Enzymkinetik KW - Enzymadsorption KW - Disproportionierungsenzym KW - Polysaccharide KW - Statistische Physik KW - Enzyme kinetics KW - Enzyme adsorption KW - Disproportionating Enzyme KW - Polysaccharides KW - Statistical Physics Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-53947 ER -