TY  - THES
A1  - Geisendörfer, Birte
T1  - Autologer Ansatz zur Entwicklung von 2D- und 3D-Kokultivierungsmethoden für die Bestimmung des sensibilisierenden Potenzials von Xenobiotika
N2  - Die allergische Kontaktdermatitis ist eine immunologisch bedingte Hauterkrankung mit insbesondere in den westlichen Industrienationen hoher und weiter ansteigender Prävalenz. Es handelt sich hierbei um eine Hypersensitivitätsreaktion vom Typ IV, die sich nach Allergenkontakt durch Juckreiz, Rötung, Bläschenbildung und Abschälung der Haut äußert. Zahlreiche Xenobiotika besitzen das Potenzial, Kontaktallergien auszulösen, darunter Konservierungsstoffe, Medikamente, Duftstoffe und Chemikalien. Die wirksamste Maßnahme zur Eindämmung der Erkrankung ist die Expositionsprophylaxe, also die Vermeidung des Kontakts mit den entsprechenden Substanzen. Dies wiederum setzt die Kenntnis des jeweiligen sensibilisierenden Potenzials einer Substanz voraus, dessen Bestimmung aus diesem Grund eine hohe toxikologische Relevanz besitzt. Zu diesem Zweck existieren von der OECD veröffentlichte Testleitlinien, welche auf entsprechend validierten Testmethoden basieren. Goldstandard bei der Prüfung auf hautsensibilisierendes Potenzial war über lange Zeit der murine Lokale Lymphknotentest. Seit der 7. Änderung der EU-Kosmetikrichtlinie, welche Tierversuche für Kosmetika und deren Inhaltsstoffe untersagt, wurden vermehrt Alternativmethoden in die OECD-Testleitlinien implementiert.. Die bestehenden in vitro Methoden sind jedoch alleinstehend nur begrenzt aussagekräftig, da sie lediglich singuläre Mechanismen bei der Entstehung einer Kontaktallergie abbilden. Die Entwicklung von Testmethoden, welche mehrere dieser Schlüsselereignisse berücksichtigen, erscheint daher richtungsweisend. Einen vielversprechenden Ansatz liefert hierbei der Loose-fit coculture-based sensitisation assay (LCSA), welcher eine Kokultur aus primären Keratinozyten und PBMC darstellt. Bei der Kokultivierung von Immunzellen mit anderen Zelltypen stellt sich allerdings die Frage, inwiefern die Nutzung von Zellen derselben Spender*innen (autologe Kokultur) bzw. verschiedener Spender*innen (allogene Kokultur) einen Einfluss nimmt. Zu diesem Zweck wurden im Rahmen dieser Arbeit Hautzellen spenderspezifisch aus gezupften Haarfollikeln isoliert und der LCSA mit den generierten HFDK in autologen und allogenen Ansätzen verglichen. Zusätzlich wurde auch ein Vergleich zwischen der Nutzung von HFDK und NHK, welche aus humaner Vorhaut isoliert wurden, im LCSA durchgeführt. Dabei ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen autologen und allogenen Kokulturen bzw. zwischen der Verwendung von HFDK und NHK. Die Verwendung allogener Zellen aus anonymem Spendermaterial sowie die Nutzung von Keratinozyten aus unterschiedlichen Quellen scheint im Rahmen des LCSA problemlos möglich. Einige der getesteten Kontaktallergene, darunter DNCB und NiCl2, erwiesen sich im LCSA jedoch als problematisch und konnten nicht zufriedenstellend als sensibilisierend detektiert werden. Daher wurde eine Optimierung der Kokultur durch Verwendung ex vivo differenzierter Langerhans Zellen (MoLC) angestrebt, welche ein besseres Modell primärer epidermaler Langerhans Zellen darstellen als die dendritischen Zellen aus dem LCSA. Zusätzlich wurden weitere, den Erfolg der Kokultur beeinflussende Faktoren, wie die Art und Zusammensetzung des Mediums und die Kokultivierungsdauer, untersucht und angepasst. Das schlussendlich etablierte Kokultivierungsprotokoll führte zu einer maßgeblich verstärkten Expression von CD207 (Langerin) auf den MoLC, was auf eine wirkungsvolle Interaktion zwischen Haut- und Immunzellen in der Kokultur hindeutete. Des Weiteren konnten DNCB und NiCl2 im Gegensatz zum LCSA durch Verwendung des kostimulatorischen Moleküls CD86 sowie des Reifungsmarkers CD83 als Ausleseparameter eindeutig als Kontaktallergene identifiziert werden. Die Untersuchungen zur Kokultur von MoLC und HFDK wurden jeweils vergleichend in autologen und allogenen Ansätzen durchgeführt. Ähnlich wie beim LCSA kam es aber auch hier zu keinen signifikanten Unterschieden, weder hinsichtlich der Expression von Charakterisierungs- und Aktivierungsmarkern auf MoLC noch hinsichtlich der Zytokinsekretion in den Zellkulturüberstand. Die Hinweise aus zahlreichen Studien im Mausmodell, dass Zellen des angeborenen Immunsystems zur Erkennung von und Aktivierung durch allogene Zellen bzw. Gewebe in der Lage sind, bestätigten sich im Rahmen dieser Arbeit dementsprechend nicht. Aus diesem Grund wurden abschließend CD4+ T-Lymphozyten, die Effektorzellen des adaptiven Immunsystems, in die Kokultur aus MoLC und autologen bzw. allogenen HFDK integriert. Überraschenderweise traten auch hier keine verstärkten Aktivierungen in allogener Kokultur im Vergleich zur autologen Kokultur auf. Die Nutzung autologer Primärzellen scheint im Rahmen der hier getesteten Methoden nicht notwendig zu sein, was die Validierung von Kokulturen und deren Implementierung in die OECD-Testleitlinien erleichtern dürfte. Zuletzt wurde eine Kokultivierung primärer Haut- und Immunzellen auch im 3D-Vollhautmodell durchgeführt, wobei autologe MoLC in die Epidermisäquivalente entsprechender Modelle integriert werden sollten. Obwohl die erstellten Hautmodelle unter Verwendung autologer Haarfollikel-generierter Keratinozyten und Fibroblasten eine zufriedenstellende Differenzierung und Stratifizierung aufwiesen, gestaltete sich die Inkorporation der MoLC als problematisch und konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht erreicht werden.
KW  - Kontaktallergie
KW  - Langerhans Zellen
KW  - Alternativmethoden
KW  - Kokultur
KW  - Hautmodell
Y1  - 2022
ER  - 
TY  - THES
A1  - Finke, Hannah
T1  - Toxicological Characterization of Arsenolipids in vitro and Analysis of Global DNA (Hydroxy)methylation in the Context of Aging, Trace Element Status, and Genomic Stability
Y1  - 2020
ER  - 
TY  - THES
A1  - Lieske, Stefanie
T1  - Regulaton des mIndy-Gens durch Interleukin-6, Oncostatin M und Glucagon und die physiologischen Konsequenzen im Lipidstoffwechsel primärer Hepatozyten
Y1  - 2015
ER  - 
TY  - THES
A1  - Scherwinski, Ann-Christin
T1  - Die Phyllosphäre
BT  - eine Reservoir für humaneffektive Bakterien
Y1  - 2015
ER  - 
TY  - THES
A1  - Tanner, Norman
T1  - Methoden zur routinemäßigen Untersuchung von Bienenprodukten mittels Fourier-transformierter Infrarotspektroskopie
Y1  - 2022
ER  - 
TY  - THES
A1  - Neuber, Corinna
T1  - Analytik zur Biotransformation des Sphingosin 1-phosphat-abbauproduktes (2E)-Hexadecenal
Y1  - 2017
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wetzel, Alexandra
T1  - Epigenetische Regulation des Epstein-Barr Virus-induzierten Gens 3 (EBI3) und dessen Bedeutung bei Colitis ulcerosa
N2  - Epigenetische Mechanismen spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von Colitis ulcerosa (CU). Ihr Einfluss auf das beobachtete Ungleichgewicht zwischen pro- und anti-inflammatorischen Cytokinen ist hingegen weitgehend unerforscht. Einige der wichtigsten immunmodulatorischen Cytokine sind die Mitglieder der heterodimeren Interleukin- (IL-) 12-Familie, die durch das Kombinieren einer der drei α-Ketten (IL-12p35, IL-27p28, IL-23p19) mit den ß-Untereinheiten IL-12p40 oder EBI3 (Epstein-Barr Virus-induziertes Gen 3) charakterisiert sind. IL-35 (IL-12p35/EBI3) spielt eine bedeutende anti-inflammatorische Rolle bei verschiedenen Erkrankungen, wohingegen seine Level bei chronischen Entzündungen erniedrigt sind. Eine mögliche Ursache könnte eine transkriptionelle Stilllegung über epigenetische Modifikationen sein. Tatsächlich konnte durch die Stimulation mit dem DNA-Methyltransferase-Inhibitor (DNMTi) Decitabin (DAC; Dacogen®) eine Induktion von EBI3 in humanen Epithelzellen aus gesundem Colon (HCEC) erreicht werden, die als Modell für ein lokales Entzündungsgeschehen dienten. Diese Regulation über DNA-Methylierung konnte in weiteren humanen Zellen unterschiedlichen Ursprungs sowie durch Stimulation von HCEC-Zellen mit zwei weiteren DNMTi, dem Cytosin-Analogon Azacytidin (AZA; Vidaza®) und dem natürlich vorkommenden, epigenetisch wirksamen Polyphenol Epigallocatechingallat (EGCG), verifiziert werden. Die kombinierte Inkubation mit Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα) resultierte jeweils in einer über-additiven Induktion von EBI3. 
Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass TNFα trotz Beeinflussung der epigenetischen DNMT- und Ten-eleven Translocation- (TET-) Enzyme keinen Einfluss auf die globalen Methylierungs- oder Hydroxymethylierungslevel hatte, jedoch eine genspezifische DNA-Hypomethylierung im EBI3-Promotor induzierte. Durch Nutzung verschiedener Inhibitoren konnte darüber hinaus nachgewiesen werden, dass der beobachtete synergistische Effekt der gemeinsamen DAC und TNFα-Stimulation hauptsächlich über NFκB (Nuclear factor “kappa-light-chain-enhancer” of activated B-cells) vermittelt wird. Ein Teil verläuft dabei über p38 MAPK (mitogen-activated protein kinases), während die JNK- (c-Jun N-terminale Kinasen-) und ERK- (extracellular-signal-regulated kinases) Signalwege keine Rolle spielen. 
In der vorliegenden Arbeit wurde zudem gezeigt, dass die DNA-Hypomethylierung während eines entzündlichen Zustandes auch in einer erhöhten EBI3-Proteinexpression resultiert. Die Höhe der immunologisch detektierten Banden wies auf eine Dimerbildung sowohl im Zelllysat als auch im Überstand hin. Humane Colonepithelzellen sind demnach in der Lage, Cytokine zu bilden und zu sezernieren, was die Bedeutung von Nicht-Immunzellen bei der lokalen Immunantwort unterstreicht. Mittels Genexpressionsanalysen wurden IL-12p35 und IL-23p19 als mögliche Bindungspartner identifiziert. Aufgrund kreuzreaktiver Antikörper ist ein direkter Nachweis der EBI3-Dimere derzeit nicht möglich. Die stattdessen genutzte Kombination verschiedener Methoden dient als geeigneter Ersatz für die problematischen Antikörper-basierten Analysen wie Immunpräzipitation oder ELISA. Durch molekularbiologische, immunologische und massenspektrometrische Methoden konnte IL-35 identifiziert werden, während IL-39 (IL-23p19/EBI3) nicht detektiert wurde. Dies ist in Einklang mit den Erkenntnissen mehrerer Forschungsgruppen, die eine Bildung des nativen humanen Dimers aus IL-23p19 und EBI3 bezweifeln. Des Weiteren wurde die biologische Aktivität des behandlungsinduzierten IL 35-Proteins durch einen Funktionsassay nachgewiesen.
Neben einer DNMTi-bedingten transkriptionellen Aktivierung konnte eine Regulation von EBI3 über Histonacetylierungen gezeigt werden. Der EBI3-induzierende Effekt des Histondeacetylasen-Inhibitors (HDACi) Trichostatin A (TSA) wurde durch SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid (Vorinostat; Zolinza®)) verifiziert. Ähnlich zu der Stimulation mit den hypomethylierenden Substanzen wurde ein synergistischer Effekt bei paralleler Inkubation mit TNFα beobachtet, der in einer gesteigerten Bildung des EBI3-Proteins resultierte.
Um die Befunde in einem komplexeren in vivo-Modell zu untersuchen, wurde eine chronische Colitis in Ebi3-defizienten Mäusen und dem dazugehörigen Wildtypstamm C57BL/6 durch zyklische Applikation von Natriumdextransulfat (Dextran sodium sulfate (DSS)) induziert. Der Vergleich klinischer Parameter wie Mortalitätsrate und Körper- sowie Milzgewicht wies bei Abwesenheit von Ebi3 signifikant stärkere colitische Symptome auf. Dies bestätigte die zentrale Rolle von Ebi3 in der Colitisentwicklung und deutete auf eine bevorzugte Bildung des anti-inflammatorisch wirkenden IL-35 statt des pro-inflammatorischen IL-39 in den Wildtyptieren hin. Durch zusätzliche therapeutische Behandlung der C57BL/6-Mäuse nach der DSS-Gabe konnte die in der Literatur beschriebene positive Wirkung von SAHA auf die Colitismanifestation bestätigt werden. Im Gegensatz dazu war der HDACi in den Ebi3-defizienten Tieren nicht in der Lage, die colitischen Parameter zu verbessern beziehungsweise verschlimmerte den Krankheitsphänotyp. Expressionsanalysen von Up- und Downstream-Target-Genen lieferten weitere Hinweise darauf, dass bei Anwesenheit von Ebi3 IL-35 statt IL-39 gebildet wird, was in Einklang mit den in vitro-Untersuchungen steht.
Die vorliegende Arbeit konnte durch den Vergleich der C57BL/6-Mäuse mit den Ebi3-defizienten Tieren neue Erkenntnisse über die Wirkungsweise von SAHA erbringen. Histonacetylierende Bedingungen verbessern colitische Symptome über einen Mechanismus, der die epigenetische Induktion von Ebi3 mit nachfolgender IL-35-Bildung involviert. Durch Kooperation der epigenetischen Mechanismen Hypomethylierung und Histonacetylierung wurde der stärkste Effekt auf die EBI3-Induktion bewirkt. 

Insgesamt konnte in der vorliegenden Arbeit durch in vitro- und in vivo-Analysen die epigenetische und NFκB-vermittelte Induktion von EBI3 über DNA-Demethylierung und Histonacetylierung mit nachfolgender IL-35-Bildung und –Sezernierung nachgewiesen werden. Da IL-35 in der Lage ist, colitische Symptome zu mildern, stellt die epigenetische Reaktivierbarkeit von EBI3 durch DNMTi und HDACi eine vielversprechende Alternative für die derzeit genutzten, oft nicht oder nur kurzfristig wirksamen Therapien bei der Behandlung einer CU dar. Einer übermäßigen Immunantwort während schubweiser entzündlicher Phasen könnte entgegengewirkt und Komplikationen wie die Bildung Colitis-assoziierter Karzinome verhindert werden.
N2  - Aberrant epigenetic alterations are becoming increasingly relevant in the development of multiple diseases. Epigenetic mechanisms also play a crucial role in the pathogenesis of ulcerative colitis (CU). In contrast, their influence on the observed imbalance between pro- and anti-inflammatory cytokines is largely unexplored. Several of the most important immunomodulatory cytokines are the members of the heterodimeric interleukin- (IL-) 12 family, which are characterized by combining one of the three α-chains (IL-12p35, IL-27p28, IL-23p19) with the ß-subunits IL-12p40 or EBI3 (Epstein-Barr virus induced gene 3). IL-35 (IL-12p35/EBI3) plays a significant anti-inflammatory role in various diseases, while its levels are decreased in chronic inflammation. One possible reason could be transcriptional silencing via epigenetic modifications. Indeed, stimulation with the DNA methyltransferase inhibitor (DNMTi) decitabine (DAC; Dacogen®) resulted in reactivation of EBI3 in Human Colon Epithelial Cells (HCEC) generated from healthy tissue, which served as a model for a local inflammatory process. This regulation via DNA methylation could be verified in other human cells of different origin as well as by stimulating HCEC cells with two additional DNMTi, the cytosine analog azacytidine (AZA; Vidaza®) and the naturally occurring, epigenetically active polyphenol epigallocatechin gallate (EGCG). Combined incubation with tumor necrosis factor α (TNFα) resulted in synergistic induction of EBI3. 
Further studies showed that TNFα had no effect on global methylation or hydroxymethylation levels despite its influence on epigenetic DNMT and ten-eleven translocation (TET) enzymes, but induced gene-specific DNA hypomethylation in the EBI3 promoter. Moreover, by using several inhibitors, it has been demonstrated that the synergistic effect of DAC and TNFα stimulation is mediated mainly via NFκB (nuclear factor "kappa-light-chain-enhancer" of activated B-cells). Part of this occurs via p38 MAPK (mitogen-activated protein kinases), while the JNK (c-Jun N-terminal kinases) and ERK (extracellular-signal-regulated kinases) signaling pathways are not involved.
In the present work, it was also shown that DNA hypomethylation during an inflammatory condition also results in increased EBI3 protein expression. The level of immunologically detected bands indicated dimer formation in both cell lysate and supernatant. Human epithelial cells are therefore capable of producing and secreting cytokines, underlining the importance of non-immune cells in the local immune response. Gene expression analyses identified IL-12p35 and IL-23p19 as possible binding partners. Due to cross-reactive antibodies, direct detection of EBI3 dimers is currently not possible. The combination of different methods used instead serves as a suitable alternative to the problematic antibody-based analyses such as immunoprecipitation or ELISA. Molecular biology, immunology, and mass spectrometry methods identified IL-35, whereas IL-39 (IL-23p19/EBI3) was not detected. This is in agreement with the findings of several research groups that doubt formation of the native human dimer. Furthermore, the biological activity of treatment-induced IL-35 protein was detected by a functional assay. 
In addition to DNMTi-induced reactivation, regulation of EBI3 via histone acetylation was demonstrated. The EBI3-inducing effect of the histone deacetylase inhibitor (HDACi) trichostatin A (TSA) was verified by SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid (Vorinostat; Zolinza®)). Similar to stimulation with the hypomethylating agents, a synergistic effect was observed with parallel incubation with TNFα, resulting in increased EBI3 protein formation.
To investigate the effects in a more complex in vivo model, chronic colitis was induced in Ebi3-deficient mice and the corresponding wild-type strain C57BL/6 by cyclic application of dextran sodium sulfate (DSS). Comparison of clinical parameters such as mortality rate and body as well as spleen weight showed significantly more severe colitic symptoms in the absence of Ebi3. This confirmed the central role of Ebi3 in colitis development and indicated preferential formation of the anti-inflammatory IL-35 rather than the pro-inflammatory IL-39 in wild-type animals. Additional therapeutic treatment of C57BL/6 mice after DSS administration confirmed the beneficial effect of SAHA on colitis manifestation reported in the literature. In contrast, HDACi in the Ebi3-deficient animals was not able to improve colitic parameters and even appeared to exacerbate the disease phenotype. Expression analyses of up- and downstream target genes provided further evidence that IL-35 rather than IL-39 is produced in the presence of Ebi3, consistent with the in vitro studies. 
Thus, comparison of the C57BL/6 mice with the Ebi3-deficient animals could provide insights into the mode of action of SAHA. Histone acetylating conditions ameliorate colitic symptoms via a mechanism involving epigenetic induction of Ebi3 followed by IL-35 formation. Based on the cooperation of epigenetic mechanisms and the drastic EBI3 induction shown by parallel hypomethylating and histone acetylating conditions, combined treatment with low-dose DNMTi and HDACi represents a therapeutic option for CU.

In summary, the present work demonstrated epigenetic and NFκB-mediated reactivation of EBI3 via DNA demethylation and histone acetylation with subsequent IL-35 formation and secretion by in vitro and in vivo analyses. Since IL-35 is able to alleviate colitic symptoms, the epigenetic inducibility of EBI3 by DNMTi and HDACi represents a promising alternative for the currently used therapies in the treatment of CU, which are often not successful or only short-term effective. An excessive immune response during relapsing inflammatory phases could be counteracted and complications such as the formation of colitis-associated carcinomas prevented.
KW  - Epigenetik
KW  - Epstein-Barr Virus-induziertes Gen 3
KW  - Colitis ulcerosa
Y1  - 2022
ER  - 
TY  - THES
A1  - Coleman Mac Gregor of Inneregny, Charles Dominic
T1  - Rolle von mPGES1-abhängig gebildetem Prostaglandin E2 bei der Ausbildung von Insulinresistenz und nicht-alkoholischer Fettlebererkrankung durch die Modulation der Funktion von Lebermakrophagen
N2  - Eine Störung des Leberstoffwechsels durch die Ausbildung einer Insulinresistenz kann zu Folgeerkrankungen wie der nicht alkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD) bis hin zur Steatohepatitis (NASH) und zur Entwicklung eines Diabetes Typ II führen. Am Krankheitsverlauf sind residente (Kupfferzellen) sowie infiltrierende Makrophagen beteiligt, die durch inflammatorische Stimuli aktiviert werden und zur Progression von Lebererkrankungen führen können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle von mPGES1-abhängig gebildetem Prostaglandin E2 (PGE2) an der Modulation von aktivierten Lebermakrophagen untersucht. Dazu wurden Kupfferzellen und Peritonealmakrophagen (als Modell für infiltrierende Makrophagen) aus Wildtyp und mPGES1-defizienten Mäusen isoliert. Beide Makrophagen­populationen wurden in Zellkulturversuchen mit Lipopolysacchariden (LPS) aktiviert und auf ihre PGE2-Synthese, Genexpression und Sekretion von verschiedenen Cytokinen hin untersucht. Die beiden Makrophagenpopulationen unterschieden sich hinsichtlich der PGE2-Synthese bei mPGSE1-Defizienz. Während bei Peritonealmakrophagen die LPS-abhängige PGE2-Synthese bei Abwesenheit der mPGES1 fast vollständig reprimiert war, war bei Kupfferzellen nur eine 25%ige Abnahme zu verzeichnen. Die postulierte selbstverstärkende Rückkopplungsschleife von PGE2 im Hinblick auf seine eigene Synthese konnte in isolierten Peritonealmakrophagen, nicht jedoch in Kupfferzellen, bestätigt werden. In Kupfferzellen führte exogenes PGE2 ferner zu einer Repression von den pro-inflammatorischen Cytokinen TNFα und IL-1β und für endogenes PGE2 konnte in diesem Zelltyp kein Effekt festgestellt werden. In Peritonealmakrophagen konnte hingegen auch für endogenes PGE2 eine reprimierende Wirkung auf die Expression von TNFα beobachtet werden. Das ist eventuell auf eine höhere Sensitivität gegenüber PGE2 von Peritonealmakrophagen im Vergleich zu Kupfferzellen zurückzuführen. PGE2 wirkte unter den gewählten Versuchsbedingungen in vitro somit eher anti-inflammatorisch. Cholesterolkristalle induzierten in Kupfferzellen die Expression der PGE2-synthetisierenden Enzyme und verschiedener pro-inflammatorische Cytokine. Sie könnten somit zu einer Progression von NAFL zu NASH beitragen. Die Daten aus dieser Arbeit deuten darauf hin, dass PGE2 im Rahmen von entzündlichen Leberveränderungen eine eher protektive Wirkung im Hinblick auf die Progression von NAFLD und Insulinresistenz haben könnte.
KW  - Insulinresistenz
KW  - Prostaglandin E2
KW  - NAFLD
KW  - Kupfferzellen
Y1  - 
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kamprad, Fanny
T1  - Einfluss von Zink auf die intestinale Mikrobiota im Ferkel und der mono-assoziirten Maus
Y1  - 2014
PB  - Universitätsverlag Potsdam
CY  - Potsdam
ER  - 
TY  - THES
A1  - Büchner, Kerstin
T1  - Modifizierung und Charakterisierung von Wellenleitermaterialien für Biosensoranwendungen
Y1  - 2014
ER  - 
TY  - THES
A1  - Tanne, Johannes
T1  - Direkter Elektronentransfer und Bioelektrokatalyse Häm-haltiger Redoxproteine und -enzyme an geladenen MWCNT-Polyanilin- Hybriden in elektrochemischen Biosensoren
Y1  - 2015
ER  - 
TY  - THES
A1  - Maier, Natalia
T1  - Aufbau eines Testsystems zum Nachweis von Ethylglucuronid (EtG) in Haaren
Y1  - 2016
ER  - 
TY  - THES
A1  - Lehmann, Andreas
T1  - Variability in human life history traits
BT  - an analysis of spatial and temporal variation and their integration into recent conceptual frameworks
Y1  - 2018
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schwuchow, Viola
T1  - Charakterisierung der periplasmatischen Aldehyd-Oxidoreduktase (PaoABC) aus Escherichia coli
N2  - Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen Analysen zur Charakterisierung der periplasmatischen Aldehyd Oxidoreduktase aus E. coli. Kinetische Untersuchungen mit Ferricyanid als Elektronenakzeptor unter anaeroben Bedingungen zeigten für dieses Enzym eine höhere Aktivität als unter aeroben Bedingungen. Die getroffene Hypothese, dass PaoABC fähig ist Elektronen an molekularen Sauerstoff weiter zu geben, konnte bestätigt werden. Für den Umsatz aromatischer Aldehyde mit molekularem Sauerstoff wurde ein Optimum von pH 6,0 ermittelt. Dies steht im Gegensatz zur Reaktion mit Ferricyanid, mit welchem ein pH-Optimum von 4,0 gezeigt wurde. Die Reaktion von PaoABC mit molekularem Sauerstoff generiert zwar Wasserstoffperoxid, die Produktion von Superoxid konnte dagegen nicht beobachtet werden. Dass aerobe Bedingungen einen Einfluss auf das Auslösen der Expression von PaoABC haben, wurde in dieser Arbeit ebenfalls ermittelt.
Im Zusammenhang mit der Produktion von ROS durch PaoABC wurde die Funktion eines kürzlich in Elektronentransfer-Distanz zum FAD identifizierten [4Fe4S]-Clusters untersucht. Ein Austausch der für die Bindung des Clusters zuständigen Cysteine führte zur Instabilität der Proteinvarianten, weswegen für diese keine weiteren Untersuchungen erfolgten. Daher wird zumindest ein struktur-stabilisierender Einfluss des [4Fe4S]-Clusters angenommen. Zur weiteren Untersuchung der Funktion dieses Clusters, wurde ein zwischen FAD und [4Fe4S]-Cluster lokalisiertes Arginin gegen ein Alanin ausgetauscht. Diese Proteinvariante zeigte eine reduzierte Geschwindigkeit der Reaktion gegenüber dem Wildtyp. Die Bildung von Superoxid konnte auch hier nicht beobachtet werden. Die Vermutung, dass dieser Cluster einen elektronen-sammelnden Mechanismus unterstützt, welcher die Radikalbildung verhindert, kann trotz allem nicht ausgeschlossen werden. Da im Umkreis des Arginins weitere geladene und aromatische Aminosäuren lokalisiert sind, können diese den notwendigen Elektronentransfer übernehmen.
Neben der Ermittlung eines physiologischen Elektronenakzeptors und dessen Einfluss auf die Expression von PaoABC zeigt diese Arbeit auch, dass die Chaperone PaoD und MocA während der Reifung des MCD-Kofaktor eine gemeinsame Bindung an PaoABC realisieren. Es konnte im aktiven Zentrum von PaoABC ein Arginin beschrieben werden, welches auf Grund der engen Nachbarschaft zum MCD-Kofaktor und zum Glutamat (PaoABC-EC692) am Prozess der Substratbindung beteiligt ist. Im Zusammenhang mit dem Austausch dieses Arginins gegen ein Histidin oder ein Lysin wurden die Enzymspezifität und der Einfluss physiologischer Bedingungen, wie pH und Ionenstärke, auf die Reaktion des Enzyms untersucht. Gegenüber dem Wildtyp zeigten die Varianten mit molekularem Sauerstoff eine geringere Affinität zum Substrat aber auch eine höhere Geschwindigkeit der Reaktion. Vor allem für die Histidin-Variante konnte im gesamten pH-Bereich ein instabiles Verhalten bestimmt werden. Der Grund dafür wurde durch das Lösen der Struktur der Histidin-Variante beschreiben. Durch den Austausch der Aminosäuren entfällt die stabilisierende Wirkung der delokalisierten Elektronen des Arginins und es kommt zu einer Konformationsänderung im aktiven Zentrum.
Neben der Reaktion von PaoABC mit einer Vielzahl aromatischer Aldehyde konnte auch der Umsatz von Salicylaldehyd zu Salicylsäure durch PaoABC in einer Farbreaktion bestimmt werden. Durch Ausschluss von molekularem Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor, in einer enzym-gekoppelten Reaktion, erfolgte ein Elektronentransport auf Ferrocencarboxylsäure. Die Kombination aus beiden Methoden ermöglichte eine Verwendung von Ferrocen-Derivaten zur Generierung einer enzym-gekoppelten Reaktion mit PaoABC.
Die Untersuchungen zu PaoABC zeigen, dass die Vielfalt der durch das Enzym katalysierten Rektionen weitere Möglichkeiten der enzymatischen Bestimmung biokatalytischer Prozesse bietet.
KW  - Eschericha coli
KW  - Periplasma
KW  - Aldehydoxidase
KW  - Aldehyd
KW  - Oxidoreduktase
KW  - Molybdän
Y1  - 2019
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hiller, Franziska
T1  - Effekte des Selenstatus und des Selenoproteins Glutathionperoxidase 2 auf die experimentelle Colitis in Mäusen
Y1  - 2015
ER  - 
TY  - THES
A1  - Bühning, Martin
T1  - Charakterisierung des Zusammenspiels von FeS-Cluster-Assemblierung, Molybdänkofaktor-Biosynthese und tRNA-Thiolierung in Escherichia coli
Y1  - 2018
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kammel, Anne
T1  - Identifizierung früher epigenetischer Veränderungen, die zur Ausbildung einer Fettleber beitragen
Y1  - 2018
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schwanhold, Nadine
T1  - Die Funktion und Spezifität der Molybdän-Cofaktor-bindenden Chaperone für die Formiat-Dehydrogenasen aus Escherichia coli und Rhodobacter capsulatus
Y1  - 2018
ER  - 
TY  - THES
A1  - Qin, Miaojing
T1  - The role of heat shock proteins (HSP23s and HSP70-4) for heat stress memory in plants
N2  - Heat is a significant climatic condition that threatens crop growth and survival. Extreme temperature occurrences in nature are becoming more severe, more frequent and longer-lasting, all of which have deleterious repercussions for agricultural production. As a result, it is critical to learn more about the mechanisms that lead to increased heat tolerance in plants. To endure and survive, higher plants have evolved complex mechanisms to respond to various amounts of heat stress. Plants have a thermal tolerance that permits them to survive rapid and dramatic temperature rises for a limited time. Plants can also be primed to withstand heat stress (HS) that would otherwise be lethal by exposing them to short, moderate, and non-lethal HS (referred to as a priming stimulus) before being exposed to severe HS. A prepared acquired thermotolerance in primed plants can be maintained for a long time under optimal circumstances, implying that plants can store information during this period. Several studies have shown that acquired thermotolerance (thermopriming) refers to the increased resistance of cells, tissues, and organisms to elevated temperatures after prior heat exposure. Maintenance of acquired thermotolerance (thermomemory) is associated with the synthesis of specialized stress proteins involved in cellular protection and accelerated tissue repair, such as heat shock proteins (HSPs). Recent studies showed a main role of heat shock proteins for turnover of protein quality components, e.g. HSP21 in the chloroplast in the regulation of thermomemory. As an important organelle, mitochondrial function is critical for plant cell responses to heat. However, it is still unknown what the molecular and physiological involvement of HSPs is in mitochondrial function and thermomemory. In our study, we showed that thermopriming induces transcript and protein levels of two mitochondrial small heat shock proteins, HSP23.5 (AT5G51440) and HSP23.6 (AT4G25200), which last for 2-3 days throughout the thermomemory phase. The morphological analysis of HSP23.5/6 transgenic plants demonstrated HSP23.5/6 function redundantly in heat stress. We showed that hsp23.5/6 double knockout plants had abnormalities in thermomemory at the seedling stage, and that mature hsp23.5/6 4 plants are more sensitive to both basal thermotolerance and thermomemory. Heat treatment significantly impacted the respiration rate of hsp23.5/6 seedlings compared to WT, indicating mitochondrial dysfunction dependent on HSP23.5 and HSP23.6. In addition, we tested and confirmed the chaperone activity of HSP23.6 toward the model substrate protein malate dehydrogenase (MDH) in vitro, indicating that HSP23.6 potentially contributes to the maintenance of cellular viability. Furthermore, we discovered a novel HSP23.6 client protein, CIB22, a mitochondrial complex-I subunit protein. According to experimental data (BiFC and Co-IP), HSP23.6 and CIB22 interact in plant cells. We also identified a heat response phenotype in the cib22 mutant compared to WT, as well as CIB22 protein degradation in the hsp23.5/6 mutant when exposed to heat. Our findings suggest that the two mitochondrial-localized heat shock proteins play a role in thermotolerance, presumably by influencing mitochondrial function and structure. More broadly, to identify novel genetic components associated with thermomemory in plants, we performed proteome profiling for Arabidopsis WT (Col-0) seedlings during thermomemory. Multiple time point samples of priming and triggering with controls were collected and analyzed to reveal the dynamic proteome changes during the memory phase in Arabidopsis cells. Among the top memory-associated proteins, we discovered that HSP70-4 was significantly upregulated after priming and remains high (at least 2-fold) for the next four days. By morphologically analyzing their heat stress behaviors, we were able to verify that HSP70-4 is involved in plant heat stress response. More intriguingly, we discovered that following priming, HSP70-4-GFP creates cytosolic foci that persist for a few days into the recovery period. We propose that these foci are linked to SGs due to cycloheximide (CHX) repressing the GFP-foci signal when exposed to heat. These findings indicate an HSP70-4-mediated transcription and translation control link (module) during basal thermotolerance and thermomemory, as well as its potential role(s) in heat stress response. To summarize, our research provides new insight into the role of heat shock proteins in controlling heat stress tolerance and memory.
N2  - Hitze ist eine bedeutende klimatische Bedingung, die das Wachstum und das Überleben von Pflanzen bedroht. Extreme Temperaturereignisse in der Natur werden gravierender, häufiger, länger anhaltend, was sich nachteilig auf die landwirtschaftliche Produktion auswirkt. Daher ist es wichtig, mehr über die Mechanismen zu erfahren, die zu einer erhöhten Hitzetoleranz bei Pflanzen führen. Um auszuhalten und zu überleben, haben höhere Pflanzen komplexe Mechanismen entwickelt, um auf verschiedene Intensitäten von Hitzestress zu reagieren. Pflanzen haben eine thermische Toleranz, die es ihnen ermöglicht, schnelle und dramatische Temperaturanstiege für eine begrenzte Zeit zu überleben. Pflanzen können auch darauf vorbereitet werden, Hitzestress (HS) zu widerstehen, der ansonsten tödlich wäre, indem man sie kurzen, moderaten und nicht-tödlichen HS (als Priming-Stimulus bezeichnet) aussetzt, bevor sie hohem HS ausgesetzt werden. Eine erworbene Thermotoleranz kann bei Pflanzen unter optimalen Bedingungen lange aufrechterhalten werden, was bedeutet, dass Pflanzen während dieser Zeit Informationen speichern können. Mehrere Studien haben gezeigt, dass sich erworbene Thermotoleranz (Thermopriming) auf die erhöhte Widerstandsfähigkeit von Zellen, Geweben und Organismen gegenüber erhöhten Temperaturen nach vorheriger Hitzeeinwirkung bezieht. Die Aufrechterhaltung der erworbenen Thermotoleranz (Thermomemory) ist mit der Synthese von speziellen Stressproteinen verbunden, die am Zellschutz und der beschleunigten Gewebereparatur beteiligt sind, wie z. B. Hitzeschockproteine (HSPs). Neuere Studien haben eine Beteiligung von Hitzeschockproteinen, z.B. HSP21, in Chloroplasten an der Regulation des Thermogedächtnisses belegt. Als wichtiges Organell ist die mitochondriale Funktion entscheidend für die Reaktion von Pflanzenzellen auf Hitze. Es ist jedoch noch unbekannt, wie die molekulare und physiologische Beteiligung von HSPs an der mitochondrialen Funktion im Thermogedächtnis erfolgt. In unserer Studie haben wir gezeigt, dass Thermopriming Transkript- und Proteinspiegel von zwei mitochondrialen kleinen Hitzeschockproteinen, HSP23.56 (AT5G51440) und HSP23.6 (AT4G25200), induziert, die während der Thermogedächtnisphase 2-3 Tage andauern. Die morphologische Analyse von HSP23.5/6-transgenen Pflanzen zeigte eine HSP23.5/6-Funktionsredundanz bei Hitzestress. Wir zeigten, dass hsp23.5/6-Doppel-Knockout-Pflanzen Anomalien im Thermogedächtnis im Keimlingsstadium aufwiesen und dass reife hsp23.5/6-Pflanzen sowohl mit basaler Thermotoleranz als auch mit Thermogedächtnis empfindlicher sind. Die Wärmebehandlung beeinflusste die Atmungsrate von hsp23.5/6-Keimlingen im Vergleich zu WT signifikant, was auf eine mitochondriale Dysfunktion in Abhängigkeit von HSP23.5 und HSP23.6 hinweist. Darüber hinaus haben wir die Chaperon-Aktivität von HSP23.6 gegenüber dem Modellsubstratprotein Malatdehydrogenase (MDH) in vitro getestet und bestätigt, was darauf hindeutet, dass HSP23.6 möglicherweise zur Aufrechterhaltung der zellulären Lebensfähigkeit beiträgt. Darüber hinaus entdeckten wir ein neues HSP23.6-Clientprotein, CIB22, ein mitochondriales Komplex-I-Untereinheitsprotein. Nach experimentellen Daten (BiFC und Co-IP) interagieren HSP23.6 und CIB22 in Pflanzenzellen. Wir identifizierten auch einen Hitzereaktionsphänotyp in der cib22-Mutante im Vergleich zu WT sowie einen CIB22-Proteinabbau in der hsp23.5/6-Mutante, wenn sie Hitze ausgesetzt wurde. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die beiden mitochondrial lokalisierten
Hitzeschockproteine eine Rolle bei der Thermotoleranz spielen, vermutlich indem sie die mitochondriale Funktion und Struktur beeinflussen. Um neue genetische Komponenten zu identifizieren, die mit dem Thermogedächtnis in Pflanzen verbunden sind, haben wir weiterhin ein Proteom-Profiling von Arabidopsis WT (Col-0) -Keimlingen während des Thermogedächtnisses durchgeführt. Mehrere Zeitpunkte von Priming und Triggerung mit Kontrollen wurden gesammelt und analysiert, um dynamische Proteomänderungen während der Gedächtnisphase in
Arabidopsis-Zellen aufzudecken. Unter den Top-gedächtnis-assoziierten Proteinen entdeckten wir, dass HSP70-4 nach dem Priming signifikant hochreguliert wurde und für die nächsten vier Tage auf hohem Niveau bleibt (mindestens 2-fach erhöht). Durch Analyse ihres Hitzestressverhaltens konnten wir verifizieren, dass HSP70-4 an der 7 Reaktion von Pflanzen auf Hitzestress beteiligt ist. Interessant ist, dass HSP70-4-GFP nach dem Priming zytosolische Foci erzeugt, die für einige Tage während der Erholungsphase bestehen bleiben. Wir schlagen vor, dass der Fokus mit SGs verbunden ist, da Cycloheximid (CHX) GFP-Foci-Signale unterdrückt, wenn sie der Hitze ausgesetzt werden. Diese Ergebnisse weisen auf eine HSP70-4-vermittelte Transkriptions- und Translationssteuerungsverbindung (Modul) während der basalen Thermotoleranz und des Thermogedächtnisses sowie auf ihre potenzielle(n) Rolle(n) bei der Reaktion auf Hitzestress hin.
Zusammenfassend bietet unsere Forschung neue Einblicke in die Rolle von Hitzeschockproteinen bei der Kontrolle der Hitzestresstoleranz und des Gedächtnisses.
Y1  - 2022
ER  - 
TY  - THES
A1  - Radon, Christin
T1  - Analyse der Funktion der dualen Lokalisation der 3-Mercaptopyruvat Sulfurtransferase im Menschen
Y1  - 2017
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gottmann, Pascal
T1  - In silico Analyse zur Klärung der Beteiligung von micro-RNAs, die in QTL lokalisiert sind, an den metabolischen Erkrankungen Adipositas und Typ-2-Diabetes mit Hilfe von Mausmodellen
Y1  - 2019
ER  - 
TY  - THES
A1  - Dippong, Martin
T1  - Direkte und indirekte Hapten-selektive Immunfluoreszenzmarkierung von Hybridomzellen zur Generierung monoklonaler Antikörper
T1  - Direct and indirect hapten-specific immunofluorescence labeling of hybridoma cells for the generation of monoclonal antibodies
N2  - Die Hybridomtechnik zur Produktion von monoklonalen Antikörpern ermöglichte einen großen Schritt in der Entwicklung von Immunoassays für die biochemische Forschung und klinische Diagnostik. Auch die Produktion von Antikörpern gegen niedermolekulare Analyten, Haptene, typische Targets in der Lebensmittel- und Umweltanalytik, erlangte in den letzten Jahren eine immer größere Bedeutung. Im Zuge der Durchführung der Hybridomtechnik werden tausende Antikörper-sezernierende und nicht-sezernierende Zellen generiert. Die Selektion der wenigen antigenselektiven Hybridomzellen zählt dabei zu den herausforderndsten Schritten für die Antikörpergewinnung. Bisherige Selektionsverfahren, wie die Limiting-Dilution-Klonierung in Verbindung mit Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs), garantieren keine Monoklonalität und erlauben nur das Screening von einigen wenigen Zellklonen. Hingegen ermöglichen Hochdurchsatz-Selektionsmethoden, wie die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS), einen sehr hohen Probendurchsatz. Eine Einzelzellablage garantiert hierbei Monoklonalität. Jedoch sind die dafür erforderlichen Zellmarkierungen oftmals zellschädigend oder aufwendig zu generieren. Auch ist bisher noch keine Markierungsmethode bekannt, die es ermöglicht, Hapten-selektive Hybridomzellen durchflusszytometrisch zu analysieren und eine FACS-Selektion durchzuführen.

Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit zwei Zellmarkierungsmethoden entwickelt, die dies ermöglichen sollten. Die membranständigen Antikörper von Hybridomzellen sollten entweder direkt oder indirekt immunfluoreszenz-markiert und dadurch für die Durchflusszytometrie und FACS-Selektion zugänglich gemacht werden. Die direkte Markierung wurde mittels eines Hapten-Fluorophor-Konjugats durchgeführt. Sie ermöglichte erstmalig den Anteil an Haptenselektiven Hybridomzellen in einer Hybridomzelllinie zu überprüfen. Dies konnte für zwei Hapten-selektive Hybridomzelllinien, die Antikörper gegen das Hormon 17β-Estradiol und das Cardenolid Digoxigenin bilden, gezeigt werden. Durchflusszytometrie und ELISAs lieferten vergleichbare Ergebnisse. Zellen, die Hapten-selektiv markiert werden konnten, sezernierten ebenfalls Hapten-selektive Antikörper. Des Weiteren konnte die direkte Markierung dazu genutzt werden, zwei Mykotoxin-selektive Hybridomzelllinien, welche Antikörper gegen Aflatoxin und Zearalenon bilden, auf Monoklonalität zu testen. Dies ist mittels ELISA nicht möglich. Die Markierungsmethode eignete sich jedoch nur für fixierte Hybridomzellen. Eine Markierung von lebenden Zellen konnte weder durchflusszytometrisch noch mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie gezeigt werden.

Dies gelang erst mit einer neu entwickelten indirekten Immunfluoreszenzmarkierung. Dabei wurden die Zellen zunächst mit einem Hapten-Peroxidase-Konjugat inkubiert, gefolgt von einem Fluorophor-markierten anti-HRP-Antikörper-Konjugat. Dies wurde für zwei Analyten, das Hormon Estron und das Antiepileptikum Carbamazepin, gezeigt. Die indirekte Markierung wurde erfolgreich dazu verwendet, Carbamazepin-selektive Hybridomzellen aus einem Fusionsansatz für die monoklonale Antikörperproduktion auszusortieren. Damit wurde erstmalig eine Zellmarkierungsmethode entwickelt, die eine Hochdurchsatz-Selektion lebender Hybridomzellen aus einem Fusionsansatz ermöglicht. Sie ist nicht zellschädigend und kann zusätzlich zur Selektion Hapten-selektiver Plasmazellen verwendet werden.
N2  - The ability to create monoclonal antibodies has allowed great strides to be made in immunoassay development for biochemical research and clinical diagnostics. Particularly for small molecular weight analytes, haptens, the need of selective antibodies has increased. The hybridoma technique generates thousands of fused antibody-secreting and non-secreting cells, with the majority being irrelevant. The subsequent screening and subcloning process in order to identify and isolate the very few hybrids that are secreting antibodies of the desired selectivity is a major concern. The traditional limiting dilution technique followed by enzymelinked immunosorbent assays (ELISAs) is inefficient and monoclonality is not guaranteed. Often the number of clones that can be screened is limited. High-throughput techniques such as fluorescence-activated cell sorting (FACS) provide an efficient tool to increase the number of cells to be screened. Furthermore, a single-cell deposition of cells would ensure monoclonality. However, antigen-selective cell labeling techniques are often cell damaging or laborious.

The purpose of this study was to explore a cell labeling technique enabling the hapten-selective analysis and isolation of hybridoma cells via FACS. This would reduce much of the effort that has currently to be employed in hybridoma generation. For this reason, a direct and indirect hapten-selective labeling technique was developed. For the direct labeling, a haptenfluorophore conjugate was generated. The conjugate was used to tag membrane-bound immunoglobulin G of hybridoma cells and thereby enabling flow cytometric analysis. Using this kind of conjugate, it was possible to examine the selective antibody expression of hybridoma cell lines producing antibodies against the hormone estradiol and the steroid digoxigenin. Flow cytometric analysis and ELISAs showed comparable results: Cells, which were tagged with the corresponding hapten-fluorophore conjugate also secreted hapten-selective antibodies. Furthermore, it was possible to check hybridoma cell lines producing antibodies against the mycotoxins aflatoxin and zearalenone for monoclonality, which is not possible with ELISA. However, the direct labeling technique was only applicable to fixed cells. Successful labeling of living cells could neither be detected by flow cytometry nor by confocal laser scanning microscopy.

On the contrary, using the newly developed indirect labeling technique, flow cytometric analysis and selection of living cells by FACS was possible. Here, the cells were first incubated with a hapten-peroxidase conjugate followed by a fluorophore-conjugated anti-peroxidase antibody. The technique was established on a hybridoma cell line selective for the hormone estrone. Furthermore, this labeling technique enabled for the first time the sorting of hybridoma cells producing selective antibodies against the medication carbamazepine out of a fusion mixture with high efficiency. The selected clones were used for monoclonal antibody production. The indirect labeling is harmless for cells and could also be applied on haptenselective plasma cells.
KW  - Durchflusszytometrie
KW  - Haptene
KW  - monoklonale Antikörper
KW  - Hybridom
KW  - Immunfluoreszenz
KW  - flow cytometry
KW  - hapten
KW  - monoclonal antibodies
KW  - hybridoma
KW  - immunofluorescence
Y1  - 2017
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schraplau, Anne
T1  - Regulation der Expression von Xenobiotika-metabolisierenden Enzymen und Deiodasen durch die Xenobiotika-abhängige wechselseitige Induktion von Xenosensor-Transkriptionsfaktoren und Prostaglandin E2
BT  - Auswirkung auf die Aktivierung und Inaktivierung von Schilddrüsenhormonen
Y1  - 2017
ER  - 
TY  - THES
A1  - Albers, Philip
T1  - Funktionelle Charakterisierung des bakteriellen Typ-III Effektorproteins HopZ1a in Nicotiana benthamiana
T1  - Functional characterization of the bacterial type-III effector protein HopZ1a in Nicotiana benthamiana
N2  - Um das Immunsystem der Pflanze zu manipulieren translozieren gram-negative pathogene Bakterien Typ-III Effektorproteine (T3E) über ein Typ-III Sekretionssystem (T3SS) in die pflanzliche Wirtszelle. Dort lokalisieren T3Es in verschiedenen subzellulären Kompartimenten, wo sie Zielproteine modifizieren und so die Infektion begünstigen. HopZ1a, ein T3E des Pflanzenpathogens Pseudomonas syringae pv. syringae, ist eine Acetyltransferase und lokalisiert über ein Myristolierungsmotiv an der Plasmamembran der Wirtszelle. Obwohl gezeigt wurde, dass HopZ1a die frühe Signalweiterleitung an der Plasmamembran stört, wurde bisher kein mit der Plasmamembran assoziiertes Zielprotein für diesen T3E identifiziert. Um bisher unbekannte HopZ1a-Zieleproteine zu identifizieren wurde im Vorfeld dieser Arbeit eine Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung mit einer cDNA-Bibliothek aus Tabak durchgeführt, wobei ein nicht näher charakterisiertes Remorin als Interaktor gefunden wurde. 
Bei dem Remorin handelt es sich um einen Vertreter der Gruppe 4 der Remorin-Familie, weshalb es in NbREM4 umbenannt wurde. Durch den Einsatz verschiedener Interaktionsstudien konnte demonstriert werden, dass HopZ1a mit NbREM4 in Hefe, in vitro und in planta wechselwirkt. Es wurde ferner deutlich, dass HopZ1a auf spezifische Weise mit dem konservierten C-Terminus von NbREM4 interagiert, das Remorin jedoch in vitro nicht acetyliert. Analysen mittels BiFC haben zudem ergeben, dass NbREM4 in Homodimeren an der Plasmamembran lokalisiert, wo auch die Interaktion mit HopZ1a stattfindet. 
Eine funktionelle Charakterisierung von NbREM4 ergab, dass das Remorin eine spezifische Rolle im Immunsystem der Pflanze einnimmt. Die transiente Expression in N. benthamiana induziert die Expression von Abwehrgenen sowie einen veränderten Blattphänotyp. In A. thaliana wird HopZ1a über das Decoy ZED1 und das R-Protein ZAR1 erkannt, was zur Auslösung einer starken Hypersensitiven Antwort (HR von hypersensitive response) führt. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass ZAR1 in N. benthamiana konserviert ist, NbREM4 jedoch nicht in der ETI als Decoy fungiert. Mit Hilfe einer Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung mit NbZAR1 als Köder konnten zwei Proteine, die Catalase CAT1 und der Protonenpumpeninteraktor PPI1, als Interaktoren von NbZAR1 identifiziert werden, welche möglicherweise in der Regulation der HR eine Rolle spielen. 
Aus Voruntersuchungen war bekannt, dass NbREM4 mit weiteren, nicht näher charakterisierten Proteinen aus Tabak interagieren könnte. Eine phylogenetische Einordnung hat gezeigt, dass es sich um die bekannte Immun-Kinase PBS1 sowie zwei E3-Ubiquitin-Ligasen, NbSINA1 und NbSINAL3, handelt. PBS1 interagiert mit NbREM4 an der Plasmamembran und phosphoryliert das Remorin innerhalb des intrinsisch ungeordneten N-Terminus. Mittels Massenspektrometrie konnten die Serine an Position 64 und 65 innerhalb der Aminosäuresequenz von NbREM4 als PBS1-abhängige Phosphorylierungsstellen identifiziert wurden. 
NbSINA1 und NbSINAL3 besitzen in vitro Ubiquitinierungsaktivität, bilden Homo- und Heterodimere und interagieren ebenfalls mit dem N-terminalen Teil von NbREM4, wobei sie das Remorin in vitro nicht ubiquitinieren.
Aus den in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass der bakterielle T3E HopZ1a gezielt mit dem Tabak-Remorin NbREM4 an der Plasmamembran interagiert und über einen noch unbekannten Mechanismus mit dem Immunsystem der Pflanze interferiert, wobei NbREM4 möglicherweise eine Rolle als Adapter- oder Ankerprotein zukommt, über welches HopZ1a mit weiteren Immunkomponenten interagiert. NbREM4 ist Teil eines größeren Immunnetzwerkes, zu welchem die bekannte Immun-Kinase PBS1 und zwei E3-Ubiquitin-Ligasen gehören. Mit NbREM4 konnte damit erstmalig ein membranständiges Protein mit einer Funktion im Immunsystem der Pflanze als Zielprotein von HopZ1a identifiziert werden.
N2  - In order to manipulate the plant's immune system, gram-negative pathogenic bacteria inject type-III effector proteins (T3E) via a type III secretion system (T3SS) into the plant host cell. Inside the cell, T3Es localize to different subcellular compartments, where they modify target proteins and thereby promote the infection. HopZ1a, a T3E of the plant pathogen Pseudomonas syringae pv. syringae is an acetyltransferase and localizes to the plasma membrane. Although it has been shown that HopZ1a interferes with early signal transduction at the plasma membrane, no dedicated plasma membrane-associated target protein has been identified so far. 
To identify unknown HopZ1a target proteins, a yeast two-hybrid screening using a cDNA library from tobacco was performed in advance of this work. The screen identified a previously uncharacterized remorin-family protein as a putative interactor of HopZ1a. 
Using phylogenetic analyses, the remorin could be classified as a group 4 remorin family member and therefore was renamed NbREM4. By using different interaction studies, it has could be demonstrated that HopZ1a interacts with NbREM4 in yeast, in vitro, and in planta. It also became evident that HopZ1a specifically interacts with the conserved C-terminus of NbREM4 but does not acetylate it. BiFC analyses showed that NbREM4 localizes in homodimers at the plasma membrane, and NbREM4 interacts with HopZ1a in this subcellular compartment. 
From preliminary studies it was known that NbREM4 may interact with other uncharacterized proteins from tobacco. A phylogenetic analysis revealed the immune kinase NbPBS1 and two E3 ubiquitin ligases, NbSINA1 and NbSINAL3, as putative NbREM4 interacting proteins. Analysis showed that NbPBS1 interacts with NbREM4 at the plasma membrane and phosphorylates the Remorin within the intrinsically disordered N-terminus. By means of mass spectrometry, serines at position 64 and 65 within the amino acid sequence of NbREM4 were identified as PBS1-dependent phosphorylation sites. 

NbSINA1 and NbSINAL3 have in vitro ubiquitination activity and also interact with the N-terminal part of NbREM4, but do not ubiquitinate it.

It has already been shown that, in Arabidopsis thaliana, HopZ1a is recognized by the R protein ZAR1. In the presence of the effector, ZAR1 induces a strong hypersensitive response (HR) of the cell. In this study it could be confirmed that ZAR1 is conserved in Nicotiana benthamiana and is also responsible for the recognition of HopZ1a. In addition, a yeast two-hybrid screen revealed the catalase CAT1 and the proton pump interactor PPI1 as putative NbZAR1-interacting proteins, possibly contributing to the downstream activation of HR.

From the results obtained in this work, it can be deduced that the bacterial T3E HopZ1a specifically interacts with the Remorin NbREM4 at the plasma membrane and interferes with the immune system via a yet unknown mechanism. NbREM4 is part of a larger immune network that includes NbPBS1 and two E3 ligases. With NbREM4, the first membrane-associated target protein of HopZ1a could have been identified.
KW  - Pseudomonas syringae
KW  - Remorin
KW  - HopZ1a
KW  - PBS1
KW  - pflanzliches Immunsystem
KW  - Pseudomonas syringae
KW  - Remorin
KW  - HopZ1a
KW  - PBS1
KW  - plant immune system
Y1  - 2018
ER  - 
TY  - THES
A1  - Nieschalke, Kai
T1  - Proteinaddukte und Urinmetaboliten des Nagetierkanzerogens Methyleugenol als Biomarker der Exposition
Y1  - 2021
ER  - 
TY  - THES
A1  - Meyer, Susann
T1  - Wirkung und Wirkungsweise von Ectoin auf DNA-Moleküle
Y1  - 2018
ER  - 
TY  - THES
A1  - Nowotny, Kerstin
T1  - The impact of collagen modifications by methylglyoxal on fibroblast function and the role in aging
Y1  - 2016
ER  - 
TY  - THES
A1  - Zhang, Yunming
T1  - Understanding the functional specialization of poly(A) polymerases in Arabidopsis thaliana
Y1  - 2018
ER  -