TY - THES A1 - Born, Stephan T1 - Kartierung der Bindungstasche des humanen Bittergeschmacksrezeptors hTAS2R10 T1 - Mapping the binding site of the human bitter taste receptor hTAS2R10 N2 - Die Bittergeschmacksrezeptoren stellen in der Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren eine besondere Gruppe dar. Im Menschen können die 25 Rezeptoren eine große Anzahl unterschiedlichster Bittergeschmacksstoffe detektieren. Diese Substanzen können sowohl schädlich, wie etwa Strychnin, als auch der Gesundheit förderliche Arzneistoffe, wie etwa Chloramphenicol sein. Unter den Bittergeschmacksrezeptoren des Menschen gibt es eine Gruppe von drei Rezeptoren, die besonders viele Bitterstoffe detektieren können. Einer von ihnen ist der Rezeptor hTAS2R10. In dieser Arbeit konnte sowohl experimentell als auch durch computergestützte Modellierung gezeigt werden, dass der hTAS2R10 nur eine Bindungstasche besitzt. Das stimmt mit den bisher ausführlich experimentell und in silico untersuchten Rezeptoren hTAS2R1, -R16, -R38 und -R46 überein. Die für die Agonisteninteraktionen nachweislich wichtigen Transmembrandomänen sind in den bisher untersuchten Bittergeschmacksrezeptoren, wie auch im hTAS2R10, die Transmembrandomänen 3, 5, 6 und 7. Die Untersuchungen zeigten, dass die Bindungstasche des hTAS2R10 in der oberen Hälfte des zum extrazellulären Raum gerichteten Bereichs lokalisiert ist. Insbesondere konnte für die untersuchten Agonisten Strychnin, Parthenolid und Denatoniumbenzoat gezeigt werden, dass die Seitenketten der Aminosäuren in Position 3.29 und 5.40 ausgeprägte agonistenselektive Wechselwirkungen eingehen. Weitere Untersuchungen haben ergeben, dass das weitgefächerte Agonistenspektrum des hTAS2R10 zu Lasten der Sensitivität für einzelne Bitterstoffe geht. Der Vergleich wichtiger Positionen im hTAS2R10, hTAS2R46 und mTas2r105 hat deutlich gemacht, dass sich die Bindungsmodi zwischen diesen Rezeptoren unterscheiden. Dies deutet auf eine getrennte evolutionäre Entwicklung der Bindungseigenschaften dieser Rezeptoren hin. Gleichfalls zeigten die Untersuchungen, dass einige Positionen wie z.B. 7.39 die Funktion aller untersuchten Bittergeschmacksrezeptoren prägen, sich jedoch die genaue Bedeutung im jeweiligen Rezeptor unterscheiden kann. Einzelne dieser Positionen konnten auch bei der Agonisteninteraktion des Rhodopsins und des β2-adrenergen Rezeptors beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit helfen dabei die Wechselwirkungen zwischen Bitterstoffen und den Bittergeschmacksrezeptoren zu verstehen und geben erste Einblicke in die Entwicklung der Rezeptoren in Hinblick auf ihren Funktionsmechanismus. Diese Erkenntnisse können genutzt werden, um Inhibitoren zu entwickeln, die sowohl ein wichtiges Werkzeug in der Rezeptoranalytik wären, als auch dazu genutzt werden könnten, den unerwünschten bitteren Geschmack von Medikamenten oder gesundheitsfördernden sekundären Pflanzenstoffen zu mindern. Damit könnte ein Beitrag zur Gesundheit der Menschen geleistet werden. N2 - In the Superfamily of G protein-coupled receptors the bitter taste receptors form a notable group. The 25 human receptors are able to detect a large group of structurally diverse bitter compounds. These compounds can be toxic – like strychnine – or have beneficial effects on health – like the pharmacological agent chloramphenicol. Three of these bitter taste receptors show a strikingly broad agonist spectrum. One of them is the hTAS2R10. It was shown empirically and by computational modelling that the hTAS2R10 has only one binding pocket. This agrees with the findings of studies on the bitter taste receptors hTAS2R1, -R16, -R38 and -R46. The domains important for agonist interaction in these receptors, as well as in the hTAS2R10, are the transmembrane domains 3, 5, 6 and 7. The results of this thesis show that the binding pocket of the hTAS210 is located in the upper part of the receptor which points into the direction of the extracellular area. Interestingly, it has been shown for the amino acid side chains in the positions 3.29 and 5.40, that they can interact with the analysed agonists strychnine, parthenolide and denatonium benzoate in an agonist-selective way. Further analyses showed that the broad tuning of the hTAS2R10 goes at the expense of the sensitivity to single agonists. The comparison of crucial positions in the hTAS2R10, hTAS2R46 and the mTas2r105 reveal that these receptors differ in their binding mode. These could be evidence that the binding abilities of these receptors evolved independently. However, the results show that some positions, e.g. 7.39, influence the receptor activity in all analysed receptors, but the function of these positions in the receptors could be different. Some of these positions also have an influence on the agonist-receptor interaction of Rhodopsin and the β2-adrenergic receptor. The findings in this thesis contribute to the knowledge about interaction between bitter receptors and bitter compounds. The results also provide insight into the evolvement of receptor functions. These outcomes can be of use for the development of inhibitors which could serve as analytical tools in taste research. Furthermore, such inhibitors could be used to reduce the bitter taste of medicine and healthy plant compounds and thus increase palatability. This could contribute to improve human well-being. KW - Bittergeschmack KW - hTAS2R10 KW - Geschmack KW - Agonisteninteraktion KW - Homologiemodellierung KW - taste KW - hTAS2R10 KW - homology modelling KW - agonists interaction KW - bitter taste Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-61392 ER - TY - THES A1 - Basler, Georg T1 - Mass-balanced randomization : a significance measure for metabolic networks T1 - Massebalancierte Randomisierung : ein Maß für Signifikanz in metabolischen Netzwerken N2 - Complex networks have been successfully employed to represent different levels of biological systems, ranging from gene regulation to protein-protein interactions and metabolism. Network-based research has mainly focused on identifying unifying structural properties, including small average path length, large clustering coefficient, heavy-tail degree distribution, and hierarchical organization, viewed as requirements for efficient and robust system architectures. Existing studies estimate the significance of network properties using a generic randomization scheme - a Markov-chain switching algorithm - which generates unrealistic reactions in metabolic networks, as it does not account for the physical principles underlying metabolism. Therefore, it is unclear whether the properties identified with this generic approach are related to the functions of metabolic networks. Within this doctoral thesis, I have developed an algorithm for mass-balanced randomization of metabolic networks, which runs in polynomial time and samples networks almost uniformly at random. The properties of biological systems result from two fundamental origins: ubiquitous physical principles and a complex history of evolutionary pressure. The latter determines the cellular functions and abilities required for an organism’s survival. Consequently, the functionally important properties of biological systems result from evolutionary pressure. By employing randomization under physical constraints, the salient structural properties, i.e., the smallworld property, degree distributions, and biosynthetic capabilities of six metabolic networks from all kingdoms of life are shown to be independent of physical constraints, and thus likely to be related to evolution and functional organization of metabolism. This stands in stark contrast to the results obtained from the commonly applied switching algorithm. In addition, a novel network property is devised to quantify the importance of reactions by simulating the impact of their knockout. The relevance of the identified reactions is verified by the findings of existing experimental studies demonstrating the severity of the respective knockouts. The results suggest that the novel property may be used to determine the reactions important for viability of organisms. Next, the algorithm is employed to analyze the dependence between mass balance and thermodynamic properties of Escherichia coli metabolism. The thermodynamic landscape in the vicinity of the metabolic network reveals two regimes of randomized networks: those with thermodynamically favorable reactions, similar to the original network, and those with less favorable reactions. The results suggest that there is an intrinsic dependency between thermodynamic favorability and evolutionary optimization. The method is further extended to optimizing metabolic pathways by introducing novel chemically feasibly reactions. The results suggest that, in three organisms of biotechnological importance, introduction of the identified reactions may allow for optimizing their growth. The approach is general and allows identifying chemical reactions which modulate the performance with respect to any given objective function, such as the production of valuable compounds or the targeted suppression of pathway activity. These theoretical developments can find applications in metabolic engineering or disease treatment. The developed randomization method proposes a novel approach to measuring the significance of biological network properties, and establishes a connection between large-scale approaches and biological function. The results may provide important insights into the functional principles of metabolic networks, and open up new possibilities for their engineering. N2 - In der Systembiologie und Bioinformatik wurden in den letzten Jahren immer komplexere Netzwerke zur Beschreibung verschiedener biologischer Prozesse, wie Genregulation, Protein-Interaktionen und Stoffwechsel (Metabolismus) rekonstruiert. Ein Hauptziel der Forschung besteht darin, die strukturellen Eigenschaften von Netzwerken für Vorhersagen über deren Funktion nutzbar zu machen, also eine Verbindung zwischen Netzwerkeigenschaften und Funktion herzustellen. Die netzwerkbasierte Forschung zielte bisher vor allem darauf ab, gemeinsame Eigenschaften von Netzwerken unterschiedlichen Ursprungs zu entdecken. Dazu zählen die durchschnittliche Länge von Verbindungen im Netzwerk, die Häufigkeit redundanter Verbindungen, oder die hierarchische Organisation der Netzwerke, welche als Voraussetzungen für effiziente Kommunikationswege und Robustheit angesehen werden. Dabei muss zunächst bestimmt werden, welche Eigenschaften für die Funktion eines Netzwerks von besonderer Bedeutung (Signifikanz) sind. Die bisherigen Studien verwenden dafür eine Methode zur Erzeugung von Zufallsnetzwerken, welche bei der Anwendung auf Stoffwechselnetzwerke unrealistische chemische Reaktionen erzeugt, da sie physikalische Prinzipien missachtet. Es ist daher fraglich, ob die Eigenschaften von Stoffwechselnetzwerken, welche mit dieser generischen Methode identifiziert werden, von Bedeutung für dessen biologische Funktion sind, und somit für aussagekräftige Vorhersagen in der Biologie verwendet werden können. In meiner Dissertation habe ich eine Methode zur Erzeugung von Zufallsnetzwerken entwickelt, welche physikalische Grundprinzipien berücksichtigt, und somit eine realistische Bewertung der Signifikanz von Netzwerkeigenschaften ermöglicht. Die Ergebnisse zeigen anhand der Stoffwechselnetzwerke von sechs Organismen, dass viele der meistuntersuchten Netzwerkeigenschaften, wie das Kleine-Welt-Phänomen und die Vorhersage der Biosynthese von Stoffwechselprodukten, von herausragender Bedeutung für deren biologische Funktion sind, und somit für Vorhersagen und Modellierung verwendet werden können. Die Methode ermöglicht die Identifikation von chemischen Reaktionen, welche wahrscheinlich von lebenswichtiger Bedeutung für den Organismus sind. Weiterhin erlaubt die Methode die Vorhersage von bisher unbekannten, aber physikalisch möglichen Reaktionen, welche spezifische Zellfunktionen, wie erhöhtes Wachstum in Mikroorganismen, ermöglichen könnten. Die Methode bietet einen neuartigen Ansatz zur Bestimmung der funktional relevanten Eigenschaften biologischer Netzwerke, und eröffnet neue Möglichkeiten für deren Manipulation. KW - Bioinformatik KW - Metabolische Netzwerke KW - Signifikanz KW - Randomisierung KW - Nullmodell KW - computational biology KW - metabolic networks KW - significance KW - randomization KW - null model Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-62037 ER - TY - THES A1 - Branscheid, Anja T1 - Phosphate homeostasis and posttranscriptional gene regulation during arbuscular mycorrhizal symbiosis in Medicago truncatula T1 - Phosphat-Homoeostase und posttranskriptionelle Genregulation waehrend der arbuskulaeren Mykorrhiza-Symbiose in Medicago truncatula N2 - Since available phosphate (Pi) resources in soil are limited, symbiotic interactions between plant roots and arbuscular mycorrhizal (AM) fungi are a widespread strategy to improve plant phosphate nutrition. The repression of AM symbiosis by a high plant Pi-status indicates a link between Pi homeostasis signalling and AM symbiosis development. This assumption is supported by the systemic induction of several microRNA399 (miR399) primary transcripts in shoots and a simultaneous accumulation of mature miR399 in roots of mycorrhizal plants. However, the physiological role of this miR399 expression pattern is still elusive and offers the question whether other miRNAs are also involved in AM symbiosis. Therefore, a deep sequencing approach was applied to investigate miRNA-mediated posttranscriptional gene regulation in M. truncatula mycorrhizal roots. Degradome analysis revealed that 185 transcripts were cleaved by miRNAs, of which the majority encoded transcription factors and disease resistance genes, suggesting a tight control of transcriptional reprogramming and a downregulation of defence responses by several miRNAs in mycorrhizal roots. Interestingly, 45 of the miRNA-cleaved transcripts showed a significant differentially regulated between mycorrhizal and non-mycorrhizal roots. In addition, key components of the Pi homeostasis signalling pathway were analyzed concerning their expression during AM symbiosis development. MtPhr1 overexpression and time course expression data suggested a strong interrelation between the components of the PHR1-miR399-PHO2 signalling pathway and AM symbiosis, predominantly during later stages of symbiosis. In situ hybridizations confirmed accumulation of mature miR399 in the phloem and in arbuscule-containing cortex cells of mycorrhizal roots. Moreover, a novel target of the miR399 family, named as MtPt8, was identified by the above mentioned degradome analysis. MtPt8 encodes a Pi-transporter exclusively transcribed in mycorrhizal roots and its promoter activity was restricted to arbuscule-containing cells. At a low Pi-status, MtPt8 transcript abundance inversely correlated with a mature miR399 expression pattern. Increased MtPt8 transcript levels were accompanied by elevated symbiotic Pi-uptake efficiency, indicating its impact on balancing plant and fungal Pi-acquisition. In conclusion, this study provides evidence for a direct link of the regulatory mechanisms of plant Pi-homeostasis and AM symbiosis at a cell-specific level. The results of this study, especially the interaction of miR399 and MtPt8 provide a fundamental step for future studies of plant-microbe-interactions with regard to agricultural and ecological aspects. N2 - Phosphat ist ein essentieller Bestandteil der pflanzlichen Ernährung und ein Mangel führt zu schwerwiegenden Folgen für Wachstum, Entwicklung und Reproduktion der Pflanze. Eine der wichtigsten Strategien, um einen Mangel an löslichem Phosphat im Boden auszugleichen, ist die arbuskuläre Mykorrhiza, einer Wurzelsymbiose zwischen Pflanzen und im Boden lebenden Mykorrhizapilzen. Die Symbiose dient dem gegenseitigen Nährstoffaustausch, der über bäumchenartige Strukturen in Wurzelzellen, den Arbuskeln, realisiert wird. Über ein weit reichendes Netzwerk im Boden verbessert der Pilz die Phosphatversorgung der Pflanzen, wohingegen die Pflanze photosynthetisch erzeugte Zucker zur Verfügung stellt. Ein erhöhter Phosphatgehalt in der Pflanze führt zur Unterdrückung der Symbiose. Da weitestgehend unbekannt ist, wie genau Pflanzen diese Einschränkung der Symbiose regulieren, kann die Erforschung dieses Zusammenhangs einen wichtigen Beitrag für Agrarwirtschaft und Umweltschutz leisten. Im Rahmen dieser Arbeit konnte durch die Entdeckung eines neuen, bisher unbekannten Zielgens aufgezeigt werden, dass die für den Ausgleich des pflanzlichen Phosphathaushalts wichtige Mikro-RNA (miR) 399 auch in der Regulation der arbuskulären Mykorrhizasymbiose von besonderer Bedeutung ist. MiRNAs regulieren die Aktivität von Zielgenen indem sie die jeweiligen Transkripte durch Bindung für den Abbau markieren. In kolonisierten Wurzeln, insbesondere in arbuskelhaltigen Wurzelzellen, konnte eine erhöhte Anhäufung der miR399 beobachtet werden. Durch das Verfahren der Hochdurchsatz-Sequenzierung des Wurzeldegradoms, bei dem alle abgebauten Transkripte analysiert werden, konnte das neue Zielgen der miR399 Familie, MtPT8, identifiziert werden. Dieses codiert für einen Phosphat-Transporter, der diesen Studien zufolge ausschließlich in mykorrhizierten Wurzeln vorkommt und dessen Transkription auf arbuskelhaltige Zellen beschränkt ist. Mit der Identifizierung dieses neuen Zielgens konnte erstmals der Beweis für die direkte Verbindung der pflanzlichen Phosphathomöostase durch miR399 und der arbuskulären Mykorrhizasymbiose gezeigt werden. Die Untersuchung der physiologischen Funktion dieses mykorrhizaspezifischen Phosphat-Transporters bietet die Möglichkeit, die Zusammenhänge der phosphatabhängigen Regulation der Symbiose aufzuklären und weit reichende Einblicke in die Regulationsmechanismen während der Pflanze-Pilz-Interaktion zu erhalten. KW - Mykorrhizasymbiose KW - Phosphat KW - mikroRNA399 KW - Degradom KW - symbiose-relevante mikroRNA-Targets KW - Mycorrhizal symbiosis KW - phosphate KW - microRNA399 KW - degradome KW - symbiosis-relevant microRNA targets Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-62106 ER - TY - THES A1 - Kluth, Oliver T1 - Einfluss von Glucolipotoxizität auf die Funktion der β-Zellen diabetessuszeptibler und –resistenter Mausstämme T1 - Effects of glucolipotoxicity on beta-cells of diabetes-susceptible and diabetes-resistant mouse strains N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Auswirkungen von Glucose- und Lipidtoxizität auf die Funktion der β-Zellen von Langerhans-Inseln in einem diabetesresistenten (B6.V-Lepob/ob, ob/ob) sowie diabetessuszeptiblen (New Zealand Obese, NZO) Mausmodell zu untersuchen. Es sollten molekulare Mechanismen identifiziert werden, die zum Untergang der β-Zellen in der NZO-Maus führen bzw. zum Schutz der β-Zellen der ob/ob-Maus beitragen. Zunächst wurde durch ein geeignetes diätetisches Regime in beiden Modellen durch kohlenhydratrestriktive Ernährung eine Adipositas(Lipidtoxizität) induziert und anschließend durch Fütterung einer kohlenhydrathaltigen Diät ein Zustand von Glucolipotoxizität erzeugt. Dieses Vorgehen erlaubte es, in der NZO-Maus in einem kurzen Zeitfenster eine Hyperglykämie sowie einen β-Zelluntergang durch Apoptose auszulösen. Im Vergleich dazu blieben ob/ob-Mäuse längerfristig normoglykämisch und wiesen keinen β-Zelluntergang auf. Die Ursache für den β-Zellverlust war die Inaktivierung des Insulin/IGF-1-Rezeptor-Signalwegs, wie durch Abnahme von phospho-AKT, phospho-FoxO1 sowie des β-zellspezifischen Transkriptionsfaktors PDX1 gezeigt wurde. Mit Ausnahme des Effekts einer Dephosphorylierung von FoxO1, konnten ob/ob-Mäuse diesen Signalweg aufrechterhalten und dadurch einen Verlust von β-Zellen abwenden. Die glucolipotoxischen Effekte wurden in vitro an isolierten Inseln beider Stämme und der β-Zelllinie MIN6 bestätigt und zeigten, dass ausschließlich die Kombination hoher Glucose und Palmitatkonzentrationen (Glucolipotoxizität) negative Auswirkungen auf die NZO-Inseln und MIN6-Zellen hatte, während ob/ob-Inseln davor geschützt blieben. Die Untersuchung isolierter Inseln ergab, dass beide Stämme unter glucolipotoxischen Bedingungen keine Steigerung der Insulinexpression aufweisen und sich bezüglich ihrer Glucose-stimulierten Insulinsekretion nicht unterscheiden. Mit Hilfe von Microarray- sowie immunhistologischen Untersuchungen wurde gezeigt, dass ausschließlich ob/ob-Mäuse nach Kohlenhydratfütterung eine kompensatorische transiente Induktion der β-Zellproliferation aufwiesen, die in einer nahezu Verdreifachung der Inselmasse nach 32 Tagen mündete. Die hier erzielten Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, dass der β-Zelluntergang der NZO-Maus auf eine Beeinträchtigung des Insulin/IGF-1-Rezeptor-Signalwegs sowie auf die Unfähigkeit zur β- Zellproliferation zurückgeführt werden kann. Umgekehrt ermöglichen der Erhalt des Insulin/IGF-1-Rezeptor-Signalwegs und die Induktion der β-Zellproliferation in der ob/ob-Maus den Schutz vor einer Hyperglykämie und einem Diabetes. N2 - The aim of the project was to investigate the impact of glucose- and fatty acid toxicity on β-cell function in a diabetes susceptible (New Zealand Obese, NZO) and resistant (B6.V-Lepob/ob, ob/ob)mouse model. Specifically, the molecular mechanisms of glucolipotoxicity-induced β-cell failure in the NZO mouse and pathways which contribute to protection of ob/ob mice against diet-induced type 2 diabetes should be elucidated. First, the animals were fed a fat-enriched carbohydrate-free diet which resulted in severe obesity and insulin resistance (lipotoxicity). Subsequently, mice were exposed to a carbohydrate-containing diet to induce conditions of glucolipotoxicity. This sequential dietary regimen provides a convenient method to induce rapid hyperglycaemia with β-cell destruction by apoptosis in a short time frame in NZO mice. In contrast, long-term exposure of ob/ob mice to the same dietary regimen leads to normoglycaemia and a protection against β-cell failure. The molecular mechanism behind carbohydrate-mediated β-cell destruction in NZO mice was an inactivation of the insulin/IGF-1 receptor signaling pathway including loss of phospho-AKT, phospho-FoxO1 and of the β-cell specific transcription factor PDX1. With the exception of FoxO1-dephosphorylation, ob/ob mice maintained this survival pathway and therefore were protected against loss of β-cells. The adverse effects of glucolipotoxicity on β-cells were verified in vitro by treatment of isolated NZO-islets and MIN6-cells under glucolipotoxic conditions. Only the combination of high glucose in the presence of palmitate caused deterioration of NZO-islets and MIN6-cells whereas ob/ob-islets were protected. The investigation of the insulin expression pattern showed, that glucolipotoxic conditions inhibited a glucose-induced increase in insulin expression in both, NZO and ob/ob islets. Furthermore, NZO and ob/ob-islets did not differ in glucose-stimulated insulin secretion. Expression profiling and immunohistochemical analyses of islets from NZO and ob/ob mice before and after carbohydrate intervention revealed a transient induction of a compensatory β-cell proliferation. During a 32 day carbohydrate feeding islet mass of ob/ob mice increased almost 3-fold. In conclusion, β-cell failure in NZO mice was induced via impairment of the insulin/IGF-1 signaling pathway and the inability to adequately increase β-cell mass by proliferation. Conversely, maintenance of the insulin/IGF-1 receptor signaling pathway and the induction of β-cell proliferation protected ob/ob mice against hyperglycaemia and type 2 diabetes. KW - Glucolipotoxizität KW - Beta-Zelle KW - NZO KW - ob/ob KW - Diabetes KW - glucolipotoxicity KW - beta-cell KW - NZO KW - ob/ob KW - diabetes Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-61961 ER - TY - THES A1 - Kamann, Stefanie T1 - Die Bedeutung von Entzündung und reaktiven Sauerstoffspezies in der Intimahyperplasie T1 - The role of inflammation and reactive oxygen species in intimal hyperplasia N2 - Die Restenose stellt ein zentrales Problem der interventionellen Kardiologie dar und ist häufigste Komplikation nach perkutanen Angioplastieverfahren. Hauptursache dieser Wiederverengung des Gefäßes ist die Bildung einer Neointima durch die Proliferation transdifferenzierter vaskulärer glatter Muskelzellen und die Sekretion extrazellulärer Matrix. Die Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und die Entzündungsreaktion nach der Gefäßverletzung werden als frühe, die Neointimabildung induzierende Prozesse diskutiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mehrere Projekte bearbeitet, die Aufschluss über die während der Neointimabildung statt findenden Prozesse geben sollen. Mit Hilfe eines Verletzungsmodells der murinen Femoralarterie wurde der Einfluss der Entzündung und der ROS-Bildung auf die Neointimabildung in der Maus untersucht. Die Behandlung mit dem mitochondrialen Superoxiddismutase-Mimetikum MitoTEMPO verminderte die Bildung der Neointima besser, als die Behandlung mit dem globalen ROS-Fänger N-Acetylcystein. Die stärkste Hemmung der Neointimabildung wurde jedoch durch die Immunsuppression mit Rapamycin erreicht. Interferon-γ (INFγ) ist ein wichtiges Zytokin der Th1-Immunantwort, das in Folge der Gefäßverletzung freigesetzt wird und die proinflammatorischen Chemokine CXCL9 (MIG, Monokine Induced by INF), CXCL10 (IP-10, INF inducible Protein of 10 kDa) und CXCL11 (I-TAC, Interferon inducible T cell-Chemoattractant) induziert. CXCL9, CXCL10 und CXCL11 sind Liganden des CXC-Chemokinrezeptors 3 (CXCR3) und locken chemotaktisch CXCR3 positive Entzündungszellen zum Ort der Gefäßverletzung. Daher wurde die spezielle Bedeutung des Chemokins CXCL10 in der Restenose untersucht. Dazu wurden CXCL10-defiziente Mäuse dem Femoralisverletzungsmodell unterzogen und die Gefäße nach 14 Tagen morphometrisch und immunhistologisch untersucht. CXCL10-Defizienz führte in Mäusen zu einer verminderten Neointimabildung, die mit einer verringerten Inflammation, Apoptose und Proliferation im verletzten Gefäß korrelierte. Neben der Inflammation beeinflusst aber auch die Reendothelialisierung der verletzten Gefäßwand die Restenose. Interessanterweise war im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen in den CXCL10-Knockout-Mäusen auch die Reendothelialisierung erheblich verbessert. Offensichtlich ist das CXCR3-Chemokinsystem also in völlig unterschiedliche biologische Prozesse involviert und beeinflusst nicht nur die Bildung der Neoimtima durch die Förderung der Entzündung, sondern auch die Unterdrückung der Reendothelialisierung der verletzten Gefäßwand. Tatsächlich wird der CXCR3 nicht nur auf Entzündungszellen, sondern auch auf Endothelzellen exprimiert. Zur separaten Untersuchung der Rolle des CXCR3 in der Inflammation und der Reendothelialisierung wurde im Rahmen dieser Arbeit damit begonnen konditionelle CXCR3-Knockout-Mäuse zu generieren, in denen der CXCR3 entweder in Entzündungszellen oder in Endothelzellen ausgeschaltet ist. Zum besseren Verständnis der molekularen Mechanismen, mit denen der CXCR3 seine Funktionen vermittelt, wurde zudem untersucht ob dieser mit anderen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) interagiert. Die Analyse von Coimmunpräzipitaten deutet auf eine Homodimerisierung der beiden CXCR3 Splicevarianten CXCR3A und CXCR3B, sowie auf die Heterodimerbildung von CXCR3A und CXCR3B mit sich, sowie jeweils mit CCR2, CCR3, CCR5 und den Opioidrezeptoren MOR und KOR hin. Die getestete Methode des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) erwies sich jedoch als ungeeignet zur Untersuchung von CXCR3, da dieser in HEK293T-Zellen nicht korrekt transient exprimiert wurde. Insgesamt deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass das CXCR3-Chemokinsystem eine zentrale Rolle in unterschiedlichen, die Neointimabildung beeinflussenden Prozessen spielt. Damit könnten der CXCR3 und insbesondere das Chemokin CXCL10 interessante Zielmoleküle in der Entwicklung neuer verbesserter Therapien zur Verhinderung der Restenose darstellen. N2 - Restenosis represents a central problem after coronary angioplasty procedures and is caused by intimal hyperplasia, also called neointima, as a result of transdifferentiation, proliferation of vascular smooth muscle cells and secretion of extracellular matrix. Formation of reactive oxygen species (ROS) and inflammation after vascular injury caused by angioplasty are discussed as early inducers of neointima formation. In several projects the processes causing the development of intimal hyperplasia were investigated. First of all, the impact of inflammation and ROS in neointima formation was investigated using the mouse femoral injury model. The mitochondrial superoxide dismutase mimetic mitoTEMPO could reduce neointima formation better than the global ROS scavenger N-acetylcystein. However, the strongest reduction of neointima formation was achieved by the treatment with the immunosuppressant rapamycin. Interferon-γ(INFγ) is a major cytokine of the Th1 immune response. It is released as a result of vessel injury and induces the proinflammatory chemokines CXCL9 (MIG, Monokine Induced by INF), CXCL10 (IP-10, INF inducible Protein of 10 kDa) and CXCL11 (I-TAC, Interferon inducible T-cell-Chemoattractant), which are ligands of the CXC chemokine receptor 3 (CXCR3) and by this chemotactically recruit CXCR3 positive cells to the site of vessel injury. In this work the special role of CXCL10 in restenosis was investigated. Therefore, CXCL10 decient mice underwent the mouse femoral injury model. The vessels were analysed morphometrically and immunohistologically 14 days after injury. CXCL10 deciency lead to decreased neointima formation that correlated with a reduced recruitment of inflammatory cells as well as diminished numbers of apoptotic and proliferating cells at the site of vessel injury. In addition to inflammation the reconstitution of the endothelium has also impact on the development of restenosis. Interestingly reendothelialisation was strongly improved in CXCL10 decient mice compared to wildtype mice. Obviously the CXCR3 chemokine system is involved in different biological prosesses and impairs neointima formation on one hand by the advancement of inflammation and on the other hand by the suppression of reendothelialisation. In fact the CXCR3 is not only expressed on inflammatory cells but also on endothelial cells. To investigate the role of CXCR3 in inflammation and reendothelialisation separatly the generation of conditional CXCR3 knockout mice with a CXCR3 knockout in T-cells or endothelial cells was started in an additional project. For a better understanding of the molecular mechanisms on which the CXCR3 mediates its biological functions the protein-protein interactions of the CXCR3 with other G-protein coupled recteptors (GPCR) was analysed. Coimmunoprecipitation showed homodimerization of the CXCR3 splice variants CXCR3A and CXCR3B, as well as heterodimerization of CXCR3A and CXCR3B with each other and with the chemokine receptors CXCR4, CCR2, CCR3, CCR5 and the opioid receptors MOR and KOR. The additional tested Fluorecence resonance energy transfer (FRET) method proved to be not suitable to measure interactions of CXCR3, since this receptor could not be expressed correctly on the cell surface after transient transfection. To summarise, the results indicate that the CXCR3 chemokine system plays a central role in different processes that mediate neointima formation. Thus, the CXCR3 and especially the chemokine CXCL10 could be interesting therapeutic targets in the development of new or improved treatments to reduce the risk of restenosis. KW - Intimahyperplasie KW - Neointima KW - Reaktive Sauerstoffspezies KW - Entzündung KW - CXCL10 KW - Intimal Hyperplasia KW - Neointima KW - Reactive Oxygen Species KW - Inflammation KW - CXCL10 Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-64683 ER - TY - GEN A1 - Ebert, Birgitta E. A1 - Lamprecht, Anna-Lena A1 - Steffen, Bernhard A1 - Blank, Lars M. T1 - Flux-P BT - automating metabolic flux analysis T2 - Postprints der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe N2 - Quantitative knowledge of intracellular fluxes in metabolic networks is invaluable for inferring metabolic system behavior and the design principles of biological systems. However, intracellular reaction rates can not often be calculated directly but have to be estimated; for instance, via 13C-based metabolic flux analysis, a model-based interpretation of stable carbon isotope patterns in intermediates of metabolism. Existing software such as FiatFlux, OpenFLUX or 13CFLUX supports experts in this complex analysis, but requires several steps that have to be carried out manually, hence restricting the use of this software for data interpretation to a rather small number of experiments. In this paper, we present Flux-P as an approach to automate and standardize 13C-based metabolic flux analysis, using the Bio-jETI workflow framework. Exemplarily based on the FiatFlux software, it demonstrates how services can be created that carry out the different analysis steps autonomously and how these can subsequently be assembled into software workflows that perform automated, high-throughput intracellular flux analysis of high quality and reproducibility. Besides significant acceleration and standardization of the data analysis, the agile workflow-based realization supports flexible changes of the analysis workflows on the user level, making it easy to perform custom analyses. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 1054 KW - 13C metabolic flux analysis KW - MFA KW - high-throughput analysis KW - scientific workflows KW - workflow management KW - Bio-jETI Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-476696 SN - 1866-8372 IS - 1054 SP - 872 EP - 890 ER - TY - GEN A1 - Jing, Runchun A1 - Ambrose, Michael A. A1 - Knox, Maggie R. A1 - Smykal, Petr A1 - Hybl, Miroslav A1 - Ramos, Á. A1 - Caminero, Constantino A1 - Burstin, Judith A1 - Duc, Gerard A1 - van Soest, L. J. M. A1 - Święcicki, W. K. A1 - Pereira, M. Graca A1 - Vishnyakova, Margarita A1 - Davenport, Guy F. A1 - Flavell, Andrew J. A1 - Ellis, T. H. Noel T1 - Genetic diversity in European Pisum germplasm collections T2 - Postprints der Universität Potsdam : Mathematisch Naturwissenschaftliche Reihe N2 - The distinctness of, and overlap between, pea genotypes held in several Pisum germplasm collections has been used to determine their relatedness and to test previous ideas about the genetic diversity of Pisum. Our characterisation of genetic diversity among 4,538 Pisum accessions held in 7 European Genebanks has identified sources of novel genetic variation, and both reinforces and refines previous interpretations of the overall structure of genetic diversity in Pisum. Molecular marker analysis was based upon the presence/absence of polymorphism of retrotransposon insertions scored by a high-throughput microarray and SSAP approaches. We conclude that the diversity of Pisum constitutes a broad continuum, with graded differentiation into sub-populations which display various degrees of distinctness. The most distinct genetic groups correspond to the named taxa while the cultivars and landraces of Pisum sativum can be divided into two broad types, one of which is strongly enriched for modern cultivars. The addition of germplasm sets from six European Genebanks, chosen to represent high diversity, to a single collection previously studied with these markers resulted in modest additions to the overall diversity observed, suggesting that the great majority of the total genetic diversity collected for the Pisum genus has now been described. Two interesting sources of novel genetic variation have been identified. Finally, we have proposed reference sets of core accessions with a range of sample sizes to represent Pisum diversity for the future study and exploitation by researchers and breeders. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 871 KW - germplasm collection KW - insertion polymorphism KW - retrotransposon insertion KW - broad continuum KW - SSAP marker Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-434743 SN - 1866-8372 IS - 871 SP - 367 EP - 380 ER - TY - THES A1 - Buchmann, Carsten M. T1 - Modelling the structuring of animal communities in heterogeneous landscapes : the role of individual home range formation, foraging movement, competition and habitat configuration T1 - Modellierung zur Strukturierung von Tiergemeinschaften in heterogenen Landschaften : die Bedeutung von individuellen Aktionsräumen, Bewegung, Konkurrenz und Habitatkonfiguration N2 - This thesis aims at a better mechanistic understanding of animal communities. Therefore, an allometry- and individual-based model has been developed which was used to simulate mammal and bird communities in heterogeneous landscapes, and to to better understand their response to landscape changes (habitat loss and fragmentation). N2 - Diese Doktorarbeit strebt ein besseres mechanistisches Verständnis von Tiergemeinschaften an. Dafür wurde ein allometrie- und individuen-basiertes Modell entwickelt und dazu benutzt, Säugetier- und Vogelgemeinschaften in heterogenen Landschaften zu simulieren, und ihre Reaktion auf Landschaftsveränderungen (Habitatverlust und -fragmentierung) besser zu verstehen. KW - Allometrie KW - Aktionsraum KW - Artengemeinschaft KW - Bewegung KW - Modell KW - home range KW - allometry KW - individual-based model KW - allometry KW - community Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-59031 ER - TY - GEN A1 - Larhlimi, Abdelhalim A1 - David, Laszlo A1 - Selbig, Joachim A1 - Bockmayr, Alexander T1 - F2C2 BT - a fast tool for the computation of flux coupling in genome-scale metabolic networks T2 - Postprints der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe N2 - Background: Flux coupling analysis (FCA) has become a useful tool in the constraint-based analysis of genome-scale metabolic networks. FCA allows detecting dependencies between reaction fluxes of metabolic networks at steady-state. On the one hand, this can help in the curation of reconstructed metabolic networks by verifying whether the coupling between reactions is in agreement with the experimental findings. On the other hand, FCA can aid in defining intervention strategies to knock out target reactions. Results: We present a new method F2C2 for FCA, which is orders of magnitude faster than previous approaches. As a consequence, FCA of genome-scale metabolic networks can now be performed in a routine manner. Conclusions: We propose F2C2 as a fast tool for the computation of flux coupling in genome-scale metabolic networks. F2C2 is freely available for non-commercial use at https://sourceforge.net/projects/f2c2/files/. T3 - Zweitveröffentlichungen der Universität Potsdam : Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe - 921 KW - balance analysis KW - reconstruction KW - pathways KW - models KW - metabolic network KW - couple reaction KW - reversible reaction KW - linear programming problem KW - coupling relationship Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-432431 SN - 1866-8372 IS - 921 ER - TY - THES A1 - Breitenstein, Michael T1 - Ortsaufgelöster Aufbau von DNA-Nanostrukturen auf Glasoberflächen T1 - Assembly of DNA nanostructures on glass surfaces N2 - Im Fokus dieser Arbeit stand der Aufbau einer auf DNA basierenden Nanostruktur. Der universelle Vier-Buchstaben-Code der DNA ermöglicht es, Bindungen auf molekularer Ebene zu adressieren. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften der DNA prädestinieren dieses Makromolekül für den Einsatz und die Verwendung als Konstruktionselement zum Aufbau von Nanostrukturen. Das Ziel dieser Arbeit war das Aufspannen eines DNA-Stranges zwischen zwei Fixpunkten. Hierfür war es notwendig, eine Methode zu entwickeln, welche es ermöglicht, Funktionsmoleküle als Ankerelemente ortsaufgelöst auf eine Oberfläche zu deponieren. Das Deponieren dieser Moleküle sollte dabei im unteren Mikrometermaßstab erfolgen, um den Abmaßen der DNA und der angestrebten Nanostruktur gerecht zu werden. Das eigens für diese Aufgabe entwickelte Verfahren zum ortsaufgelösten Deponieren von Funktionsmolekülen nutzt das Bindungspaar Biotin-Neutravidin. Mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops (AFM) wurde eine zu einem „Stift“ umfunktionierte Rasterkraftmikroskopspitze so mit der zu deponierenden „Tinte“ beladen, dass das Absetzen von Neutravidin im unteren Mikrometermaßstab möglich war. Dieses Neutravidinmolekül übernahm die Funktion als Bindeglied zwischen der biotinylierten Glasoberfläche und dem eigentlichen Adressmolekül. Das somit generierte Neutravidin-Feld konnte dann mit einem biotinylierten Adressmolekül durch Inkubation funktionalisiert werden. Namensgebend für dieses Verfahren war die Möglichkeit, Neutravidin mehrmals zu deponieren und zu adressieren. Somit ließ sich sequenziell ein Mehrkomponenten-Feld aufbauen. Die Einschränkung, mit einem AFM nur eine Substanz deponieren zu können, wurde so umgangen. Ferner mußten Ankerelemente geschaffen werden, um die DNA an definierten Punkten immobilisieren zu können. Die Bearbeitung der DNA erfolgte mit molekularbiologischen Methoden und zielte darauf ab, einen DNA-Strang zu generieren, welcher an seinen beiden Enden komplementäre Adressequenzen enthält, um gezielt mit den oberflächenständigen Ankerelementen binden zu können. Entsprechend der Geometrie der mit dem AFM erzeugten Fixpunkte und den oligonukleotidvermittelten Adressen kommt es zur Ausbildung einer definierten DNA-Struktur. Mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden wurde die aufgebaute DNA-Nanostruktur nachgewiesen. Der Nachweis der nanoskaligen Interaktion von DNA-bindenden Molekülen mit der generierten DNA-Struktur wurde durch die Bindung von PNA (peptide nucleic acid) an den DNA-Doppelstrang erbracht. Diese PNA-Bindung stellt ihrerseits ein funktionales Strukturelement im Nanometermaßstab dar und wird als Nanostrukturbaustein verstanden. N2 - The main aim of this work was the development of a DNA-based nanostructure. The universal four-letter code of DNA allows addressing bonds at the molecular level. The chemical and physical property of DNA makes this macromolecule an ideal candidate as a construction element for nanostructures. The aim of this work was to span a DNA strand between two fixed points. For this purpose it was necessary to develop a method which makes it possible to deposit functional molecules as anchoring elements with highly spatial resolution on a surface. These molecules should be immobilized on the lower micrometer scale to meet the requirements of the desired nanostructure. The method that has been developed for this task, which enables to deposit functional molecules, uses the binding pair biotin-neutravidin. Using the tip of an atomic force microscope (AFM), which can be uses like a pen, it was possible to deposit neutravidin on the lower micrometer scale. This neutravidin molecule is the linking element between the biotinylated glass surface and the actual address molecule. The thus generated neutravidin field could then be functionalized with a biotinylated molecule by incubation. The method has been published as sequential spotting method because it enables a sequential functionalization of neutravidin after it has been deposited. It was so possible to build up a multi-component array. The limitation of being able to deposit only one single substance with an AFM has been circumvented. It also was necessary to create anchor elements in order to immobilize the DNA at defined positions. The processing of the DNA was carried out using molecular biological methods and aimed at generating a DNA strand, which at both ends has a complementary sequence for binding to the surface bound anchor elements. The defined structure is a result of the geometry of the fixed points, generated by the AFM. Using fluorescence microscopy, the constructed DNA nanostructure was detected. The proof of the interaction of DNA-binding molecules with the DNA structure was carried out by the binding of PNA (peptide nucleic acid), which is capable of binding to double stranded DNA. The PNA and its DNA-interaction is a functional building block in the nanometer scale and can be regarded as a promising nanostructure. KW - Nanostruktur KW - DNA KW - Rasterkraftmikroskop KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Oberflächenfunktionalisierung KW - nanostructure KW - DNA KW - atomic force microscope KW - fluorescence microscopy KW - surface chemistry Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-61857 ER - TY - THES A1 - Röser, Claudia T1 - Charakterisierung der Serotonin-Rezeptoren in den Speicheldrüsen von Calliphora vicina T1 - Characterization of serotonin receptors in the salivary gland of Calliphora vicina N2 - Die Fähigkeit, mit anderen Zellen zu kommunizieren, ist eine grundlegende Eigenschaft aller lebenden Zellen und essentiell für die normale Funktionsweise vielzelliger Organismen. Die Speicheldrüsen der Schmeißfliege Calliphora vicina bilden ein ausgezeichnetes physiologisches Modellsystem um zelluläre Signaltransduktionsprozesse an einem intakten Organ zu untersuchen. Die Speichelsekretion wird dabei hormonell durch das biogene Amin Serotonin (5-Hydroxytryptamin; 5-HT) reguliert. 5-HT aktiviert in den sekretorischen Zellen der Drüsen über die Bindung an mindestens zwei membranständige G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) zwei separate Signalwege, den IP3/Ca2+- und den cAMP-Signalweg. Zur Identifizierung und Charakterisierung der 5-HT-Rezeptoren in den Speicheldrüsen von Calliphora wurden unter Anwendung verschiedener Klonierungsstrategien zwei cDNAs (Cv5-ht2α und Cv5-ht7) isoliert, die große Ähnlichkeit zu 5-HT2- und 5-HT7-Rezeptoren aus Säugetieren aufweisen. Die Hydropathieprofile der abgeleiteten Aminosäuresequenzen postulieren die für GPCRs charakteristische heptahelikale Architektur. Alle Aminosäuremotive, die für die Ligandenbindung, die Rezeptoraktivierung und die Kopplung an G-Proteine essentiell sind, liegen konserviert vor. Interessanterweise wurde für den Cv5-HT7-Rezeptor eine zusätzliche hydrophobe Domäne im N Terminus vorhergesagt. Die Cv5-HT2α-mRNA liegt in zwei alternativ gespleißten Varianten vor. Mittels RT-PCR-Experimenten konnte die Expression beider Rezeptoren in Gehirn und Speicheldrüsen adulter Fliegen nachgewiesen werden. Ein Antiserum gegen den Cv5-HT7 Rezeptor markiert in den Speicheldrüsen die basolaterale Plasmamembran. Die Expression der Rezeptoren in einem heterologen System (HEK 293-Zellen) bestätigte diese als funktionelle 5-HT Rezeptoren. So führte die Stimulation mit Serotonin für den Cv5-HT2α zu einer dosis-abhängigen Erhöhung der intrazellulären Ca2+ Konzentration ([Ca2+]i, EC50 = 24 nM). In Cv5-HT7-exprimierenden Zellen löste 5-HT dosisabhängig (EC50 = 4,1 nM) einen Anstieg der intrazellulären cAMP Konzentration ([cAMP]i) aus. Für beide heterolog exprimierten Rezeptoren wurden pharmakologische Profile erstellt. Liganden, die eine Rezeptorsubtyp-spezifische Wirkung vermuten ließen, wurden daraufhin auf ihre Wirkung auf das transepitheliale Potential (TEP) intakter Speicheldrüsenpräparate getestet. Drei 5-HT-Rezeptoragonisten: AS 19, R-(+)-Lisurid und 5-Carboxamidotryptamin führten zu einer cAMP-abhängigen Positivierung des TEP durch eine selektive Aktivierung der 5 HT7-Rezeptoren. Eine selektive Aktivierung des Ca2+-Signalweges durch den Cv5-HT2 Rezeptor ist mit Hilfe von 5-Methoxytryptamin möglich. Dagegen konnte Clozapin im TEP als selektiver Cv5-HT7-Rezeptorantagonist bestätigt werden. Die Kombination eines molekularen Ansatzes mit physiologischen Messungen ermöglichte somit die Identifikation selektiver Liganden für 5-HT2- bzw. 5-HT7-Rezeptoren aus Calliphora vicina. Dies ermöglicht zukünftig eine separate Aktivierung der 5-HT-gesteuerten Signalwege und erleichtert dadurch die weitere Erforschung der intrazellulären Signalwege und ihrer Wechselwirkungen. N2 - Cellular communication is a fundamental property of living cells and essential for normal functioning of multicellular organisms. The salivary glands of the blowfly Calliphora vicina are a well established physiological model system to study cellular signaling in an intact organ. Fluid secretion in this gland is hormonally regulated by the biogenic amine serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT). In the secretory cells, 5-HT causes a parallel activation of the InsP3/Ca2+- and the cAMP-signaling pathways through binding and stimulation of at least two G protein coupled receptors (GPCR). In order to characterize the respective 5-HT receptors on the secretory cells, we have cloned two cDNAs (Cv5-ht2α, Cv5-ht7) that share high similarity with mammalian 5-HT2 and 5-HT7 receptor classes. Analysis of the deduced amino acid sequences postulates the typical heptahelical architecture of GPCRs for both receptors. Sequence motifs that are essential for ligand binding, receptor activation and coupling to G-proteins are well conserved. Interestingly, a computer-based structural analysis of Cv5-HT7 predicts an additional eighth hydrophobic region in the N-terminus of the receptor. We also found an alternative splice variant of the Cv5-HT2α mRNA. Using RT-PCR experiments, transcripts of both receptor mRNAs could be detected in brain and salivary gland tissue. An antiserum raised against the Cv5 HT7 receptor stained the basolateral region of the salivary glands. Heterologous receptor expression in HEK 293 cells leads to a dose-dependent increase in the intracellular Ca2+-concentration ([Ca2+]i) for Cv5-HT2α (EC50 = 24 nM) and cAMP-concentration for Cv5-HT7 (EC50 = 4,1 nM) upon application of 5-HT. A pharmacological profile was established for both receptors. Ligands that appeared to act as specific ligands of either Cv5-HT2α or Cv5-HT7 in this approach, were then tested for their effect on the transepithelial potential (TEP) of intact blowfly salivary gland preparations. Three 5-HT receptor agonists: AS 19, R-(+)-lisuride and 5-carboxamidotryptamine showed a cAMP dependent positivation of the TEP, caused by a selective activation of the Cv5-HT7 receptor. 5-methoxytryptamine exclusively activates the Ca2+ pathway via Cv5-HT2α. Clozapine antagonizes the effects of 5-HT in blowfly salivary glands and was confirmed as a Cv5-HT7 antagonist. The combination of a molecular approach with physiological measurements enabled us to identify selective ligands for 5-HT2 and 5-HT7 receptors of Calliphora vicina. These results facilitate a selective activation of the intracellular signaling pathways activated by 5-HT and will facilitate future research on different aspects of intracellular signaling and crosstalk mechanisms. KW - Calliphora KW - GPCR KW - Serotonin KW - Rezeptor KW - zelluläre Signalübertragung KW - Calliphora KW - G-protein-coupled receptors KW - serotonin KW - cellular signalling Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-61486 ER - TY - THES A1 - Korn, Ulrike T1 - Der Einfluss unterschiedlich aggressiver Fusarium culmorum- und Fusarium graminearum-Isolate auf die Schadbildausprägung bei Winterweizen sowie die Möglichkeit der Befallskontrolle mit Mykorrhiza T1 - Impact of aggressiveness of Fusarium culmorum and Fusarium graminearum isolates on the degree of symptoms as well as the possibility to control Fusarium spp. with mycorrhiza N2 - Der Einfluss unterschiedlich aggressiver Fusarium culmorum- und F. graminearum-Isolate auf die Schadbildausprägung bei Winterweizen sowie die Möglichkeit der Befallskontrolle mit Mykorrhiza Die durch Pilzarten der Gattung Fusarium spp. hervorgerufene partielle Taubährigkeit ist ein ernstes Problem im weltweiten Weizenanbau. Eine für die Schaderreger günstige feuchte Witterung zum Zeitpunkt der Weizenblüte in Kombination mit befallsfördernden agrotechnischen Maßnahmen löst immer wieder Epidemien aus. Hauptsächlich verursacht durch F. culmorum und F. graminearum führt eine Erkrankung zu Ertrags- und Qualitätseinbußen sowie zu einer Belastung des Ernteguts mit Mykotoxinen, die bereits in niedrigen Konzentrationen toxisch auf den tierischen und menschlichen Organismus wirken. Die am häufigsten vorkommenden Fusarium-Toxine in Weizen sind Deoxynivalenol (DON) und Zearalenon (ZEA). Isolate von F. graminearum- und F. culmorum können in ihrem DON- und ZEA-Bildungsvermögen und ihrem Potential, Nekrosen zu verursachen, stark variieren. In Laborversuchen (in vitro) wurden F. graminearum- und F. culmorum-Isolate hinsichtlich dieser Eigenschaften (hier als Aggressivität bezeichnet) charakterisiert und anschließend wurde im Feldversuch überprüft, ob die in vitro-ermittelte Aggressivität die Schadbildausprägung bei Weizenpflanzen beeinflusst. Nur im ersten Versuchsjahr, das durch hohe Niederschläge gekennzeichnet war, konnte ein Einfluss der Aggressivität und einer zusätzlichen Beregnung im Feldversuch nachgewiesen werden. Die als hoch-aggressiv eingestuften Fusarium-Isolate reduzierten unter dem Einfluss der Beregnung den Ertrag und das Tausendkorngewicht. Die Beregnung führte zu einer Erhöhung des Pilzwachstums und der DON- und ZEA-Produktion. Ein extrem trockener Sommer verhinderte die Infektion der Weizenpflanzen durch die beimpften Fusarium-Isolate und ein anschließendes Pilzwachstum in den Ähren im zweiten Versuchsjahr. Um den Befall von Weizenpflanzen mit Fusarium spp. vorzubeugen, stehen verschiedene pflanzenbauliche Maßnahmen zur Verfügung. Eine Möglichkeit stellen in diesem Zusammenhang die symbiotischen Mykorrhizapilze (MP) dar. Die Pilze sind in der Lage, Pflanzen zu stärken und antagonistisch auf pilzliche Schaderreger zu wirken. Um zu überprüfen, ob MP dazu beitragen könnten, den Befall von Weizenpflanzen mit Fusarium spp. niedrig zu halten, wurden Weizenpflanzen mit MP und Fusarium spp. beimpft und die Auswirkungen der Interaktionen auf die Weizenpflanzen in einem Klimakammer- und einem Feldversuch getestet. In der Klimakammer wurde eine Reduzierung des Fusarium-Befalls nachgewiesen. Die mykorrhizierten Weizenpflanzen wiesen außerdem höhere Photosyntheseraten, höhere Sprosstrockenmassen und mehr Ähren im Vergleich zu den nicht-mykorrhizierten und mit Fusarium-beimpften Weizenpflanzen auf. Insgesamt wurde durch die Mykorrhizierung der negative Einfluss von Fusarium spp. kompensiert. Im Freiland konnte kein Einfluss der MP auf Fusarium spp. beobachtet werden. Im ersten Versuchsjahr führte das Beimpfen der Weizenpflanzen mit MP zu höheren Wurzel- und Sprosstrockenmassen sowie zu höheren Tausendkorngewichten im Vergleich zu den mit Fusarium spp.-beimpften Weizenpflanzen. Im zweiten Versuchsjahr konnte dieses Ergebnis nicht wiederholt werden. N2 - Impact of aggressiveness of Fusarium culmorum and Fusarium graminearum isolates on the degree of symptoms as well as the possibility to control Fusarium spp. with mycorrhiza Fusarium Head Blight (FHB) is a serious problem worldwide and is mainly caused by Fusarium (F). culmorum and F. graminearum. Humid weather conditions, especially at anthesis and agricultural measures forcing pathogen attack cause epidemics repeatedly. FHB leads to yield and quality losses and also to contamination of harvest with mycotoxins that are toxic to humans and animals already in low concentrations. The most frequently occurring Fusarium toxins in wheat are deoxynivalenol (DON) and zearalenone (ZEA). F. culmorum and F. graminearum isolates can differ in their potential to produce mycotoxins and to cause necrosis. Isolates of these two species were assigned to three different groups of aggressiveness on the basis of mycotoxin production and necrotic activity. Afterwards these isolates were inoculated on wheat in fields to ascertain their aggressiveness on the degree of symptoms. Only in the first year of the trial that was characterized by high precipitation amounts an influence of the aggressiveness and of an additional irrigation could be determined. Influenced by irrigation isolates of high aggressiveness reduced yield and 1000-kernel-weight. Besides, irrigation led to an increase of fungal growth and DON and ZEA production. An extremely dry summer in the second year of the trial prevented wheat infection by Fusarium isolates and subsequent colonization of the ears. Various agricultural measures are available to prevent Fusarium infection. The release of mycorrhizal fungi is one possibility. These fungi are able to strengthen plants and affect fungal pathogens antagonistically. Mycorrhizal fungi and Fusarium isolates were inoculated on wheat plants in climate chamber and fields to determine their potential for pest management. The impact of the interactions of these two organisms on wheat plants was analyzed. In climate chamber a reduction of Fusarium colonization was observed. Furthermore a higher rate of photosynthesis, a higher shoot dry weight and a higher number of ears were detected for the mycorrhizal plants compared to the non-mycorrhizal Fusarium inoculated plants. Altogether the negative effects of Fusarium spp. on the wheat plants were compensated by mycorrhizal colonization. In fields no influence of mycorrhizal colonization on Fusarium spp. could be determined. In the first year of the trial inoculation of wheat plants with mycorrhiza led to higher root and shoot dry weight as well as to higher 1000-kernel-weight in comparison to the wheat plants inoculated with Fusarium spp. These results could not be reproduced in the second year of the trial. KW - Fusarium KW - Aggressivität KW - Mykotoxine KW - Arbuskuläre Mykorrhiza KW - Weizen KW - Fusarium KW - aggressiveness KW - mycotoxins KW - arbuscular mycorrhiza KW - wheat Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-62908 ER - TY - THES A1 - Hammer, Paul T1 - Transkriptomweite Untersuchungen von Prostata-Krebszelllinien im Kontext medizinischer Strahlentherapie T1 - Transcriptome-wide studies of prostate cancer cell lines in the context of medical radiation N2 - Die Strahlentherapie ist neben der Chemotherapie und einer operativen Entfernung die stärkste Waffe für die Bekämpfung bösartiger Tumore in der Krebsmedizin. Nach Herz-Kreislauf-Erkrankungen ist Krebs die zweithäufigste Todesursache in der westlichen Welt, wobei Prostatakrebs heutzutage die häufigste, männliche Krebserkrankung darstellt. Trotz technologischer Fortschritte der radiologischen Verfahren kann es noch viele Jahre nach einer Radiotherapie zu einem Rezidiv kommen, was zum Teil auf die hohe Resistenzfähigkeit einzelner, entarteter Zellen des lokal vorkommenden Tumors zurückgeführt werden kann. Obwohl die moderne Strahlenbiologie viele Aspekte der Resistenzmechanismen näher beleuchtet hat, bleiben Fragestellungen, speziell über das zeitliche Ansprechen eines Tumors auf ionisierende Strahlung, größtenteils unbeantwortet, da systemweite Untersuchungen nur begrenzt vorliegen. Als Zellmodelle wurden vier Prostata-Krebszelllinien (PC3, DuCaP, DU-145, RWPE-1) mit unterschiedlichen Strahlungsempfindlichkeiten kultiviert und auf ihre Überlebensfähigkeit nach ionisierender Bestrahlung durch einen Trypanblau- und MTT-Vitalitätstest geprüft. Die proliferative Kapazität wurde mit einem Koloniebildungstest bestimmt. Die PC3 Zelllinie, als Strahlungsresistente, und die DuCaP Zelllinie, als Strahlungssensitive, zeigten dabei die größten Differenzen bezüglich der Strahlungsempfindlichkeit. Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurden die beiden Zelllinien ausgewählt, um anhand ihrer transkriptomweiten Genexpressionen, eine Identifizierung potentieller Marker für die Prognose der Effizienz einer Strahlentherapie zu ermöglichen. Weiterhin wurde mit der PC3 Zelllinie ein Zeitreihenexperiment durchgeführt, wobei zu 8 verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 1 Gy die mRNA mittels einer Hochdurchsatz-Sequenzierung quantifiziert wurde, um das dynamisch zeitversetzte Genexpressionsverhalten auf Resistenzmechanismen untersuchen zu können. Durch das Setzen eines Fold Change Grenzwertes in Verbindung mit einem P-Wert < 0,01 konnten aus 10.966 aktiven Genen 730 signifikant differentiell exprimierte Gene bestimmt werden, von denen 305 stärker in der PC3 und 425 stärker in der DuCaP Zelllinie exprimiert werden. Innerhalb dieser 730 Gene sind viele stressassoziierte Gene wiederzufinden, wie bspw. die beiden Transmembranproteingene CA9 und CA12. Durch Berechnung eines Netzwerk-Scores konnten aus den GO- und KEGG-Datenbanken interessante Kategorien und Netzwerke abgeleitet werden, wobei insbesondere die GO-Kategorien Aldehyd-Dehydrogenase [NAD(P)+] Aktivität (GO:0004030) und der KEGG-Stoffwechselweg der O-Glykan Biosynthese (hsa00512) als relevante Netzwerke auffällig wurden. Durch eine weitere Interaktionsanalyse konnten zwei vielversprechende Netzwerke mit den Transkriptionsfaktoren JUN und FOS als zentrale Elemente identifiziert werden. Zum besseren Verständnis des dynamisch zeitversetzten Ansprechens der strahlungsresistenten PC3 Zelllinie auf ionisierende Strahlung, konnten anhand der 10.840 exprimierten Gene und ihrer Expressionsprofile über 8 Zeitpunkte interessante Einblicke erzielt werden. Während es innerhalb von 30 min (00:00 - 00:30) nach Bestrahlung zu einer schnellen Runterregulierung der globalen Genexpression kommt, folgen in den drei darauffolgenden Zeitabschnitten (00:30 - 01:03; 01:03 - 02:12; 02:12 - 04:38) spezifische Expressionserhöhungen, die eine Aktivierung schützender Netzwerke, wie die Hochregulierung der DNA-Reparatursysteme oder die Arretierung des Zellzyklus, auslösen. In den abschließenden drei Zeitbereichen (04:38 - 09:43; 09:43 - 20:25; 20:25 - 42:35) liegt wiederum eine Ausgewogenheit zwischen Induzierung und Supprimierung vor, wobei die absoluten Genexpressionsveränderungen ansteigen. Beim Vergleich der Genexpressionen kurz vor der Bestrahlung mit dem letzten Zeitpunkt (00:00 - 42:53) liegen mit 2.670 die meisten verändert exprimierten Gene vor, was einer massiven, systemweiten Genexpressionsänderung entspricht. Signalwege wie die ATM-Regulierung des Zellzyklus und der Apoptose, des NRF2-Signalwegs nach oxidativer Stresseinwirkung und die DNA-Reparaturmechanismen der homologen Rekombination, des nicht-homologen End Joinings, der MisMatch-, der Basen-Exzision- und der Strang-Exzision-Reparatur spielen bei der zellulären Antwort eine tragende Rolle. Äußerst interessant sind weiterhin die hohen Aktivitäten RNA-gesteuerter Ereignisse, insbesondere von small nucleolar RNAs und Pseudouridin-Prozessen. Demnach scheinen diese RNA-modifizierenden Netzwerke einen bisher unbekannten funktionalen und schützenden Einfluss auf das Zellüberleben nach ionisierender Bestrahlung zu haben. All diese schützenden Netzwerke mit ihren zeitspezifischen Interaktionen sind essentiell für das Zellüberleben nach Einwirkung von oxidativem Stress und zeigen ein komplexes aber im Einklang befindliches Zusammenspiel vieler Einzelkomponenten zu einem systemweit ablaufenden Programm. N2 - The use of radiotherapy in addition to chemotherapy and surgical removal is the most powerful instrument in the fight against malignant tumors in cancer medicine. After cardiovascular diseases, cancer is the second leading cause of death in the western world, in which prostate cancer is the most frequent male cancer. Despite continuous technological improvements in radiological instruments and prognosis, it may occur a recurrence up to many years after radiotherapy due to a high resistance capability of individual malignant cells of the locally occurring tumor. Although modern radiation biology has studied many aspects of the resistance mechanisms, questions are largely unanswered especially in regards to prognostic terms and time response of tumor cells to ionizing radiation. As cellular models four prostate cancer cell lines with different radiation sensitivities (PC3, DuCaP, DU-145, RWPE-1) were cultured and tested for their ability to survive after exposure to ionizing radiation by a trypane blue and MTT viability assay. The proliferative capacity of the four cell lines was determined using a colony formation assay. The PC3 cell line (radiation-resistant) and the DuCaP cell line (radiation-sensitive) showed the maximal differences in terms of radiation sensitivity. Based on these results the two cell lines were selected to allow identification of potential prognostic marker for predicting the effectiveness of radiation therapy via their transcriptome-wide gene expression. Furthermore, a time series experiment with the radiation-resistant PC3 cell line was performed. At 8 different time points, during the period from 00:00 - 42:53 (hh:mm) after exposure with 1 Gy, the mRNA was quantified by next generation sequencing to investigate the dynamic behavior of time-delayed gene expression and to discover resistance mechanisms. Of 10,966 expressed genes 730 were significant differentially expressed, determined by setting a fold change threshold in conjunction with a P-value < 0.01. Of those 305 were more strongly expressed in PC3 cell line and 425 were more strongly expressed in the DuCaP cell line. Within these 730 genes many known stress-associated genes could be found, such as the two trans-membrane protein genes CA9 and CA12, which are associated with increased radiation resistance. By calculating a network score interesting networks were derived by the GO and KEGG databases. In particular the GO categories aldehyde dehydrogenase [NAD(P)+] activity (GO:0004030) as well as the KEGG pathway of O-glycan biosynthesis (hsa00512) seems to be remarkably relevant. An interaction analysis revealed two promising networks with the transcription factors JUN and FOS as central elements. High expression of the JUN network would be stand as indicator for radiation resistance whereas a high expression of the FOS network is equated with radiation sensitivity. Interesting insights could be achieved by analyzing the 10,840 expressed genes of the PC3 cell line and its expression profile over the 8 time points. Shortly after irradiation (00:00 - 00:30) a transcriptome-wide down-regulation occurred, within the next three, short time periods (00:30 - 01:03; 01:03 - 02:12; 02:12 - 04:38) a predominant increase of gene expression and the activation of protective networks followed, such as the up-regulation of DNA repair systems or the arresting of cell cycle. In the ensuing three time periods (4:38 - 09:43; 09:43 - 20:25; 20:25 - 42:35) a balance between gene induction and suppression was present and the absolute gene expression change was increased. When comparing the gene expression prior to irradiation with the last time point (00:00 - 42:53) 2,670 genes were differentially expressed, suggesting a massive and system-wide change of gene expression. Signaling pathways such as the ATM-regulated cell cycle and apoptosis, the Nrf2 pathway after oxidative stress exposure, the DNA repair mechanisms of homologous recombination, the non-homologous end joining, the mismatch repair, base-excision repair and strand-excision repair play a major role. Very interesting are the high activity of RNA-driven events, especially activities of small nucleolar RNAs and pseudouridine processes. This suggests that these RNA-modifying networks could have a hitherto unknown functional and protective effect on cell survival after exposure to ionizing radiation. All these protective networks and their time-specific interactions are essential for the survival of cells after exposure to oxidative stress and show a complex but consistent interaction of many individual components to a system-wide running program. KW - Strahlenbiologie KW - Sequenzierung KW - Resistenzmechanismen KW - Genexpression KW - Prostatakrebs KW - radiation biology KW - next generation sequencing KW - prostate cancer KW - resistance mechanisms KW - gene expression Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-63190 ER - TY - THES A1 - Pusch, Martin T1 - Horizontale und vertikale Konnektivität in Fließgewässern und Seen : ökologische Funktionen und anthropogene Überformung T1 - Horizontal and vertical connectivity in rivers and lakes : ecological functions and anthropogenic transformation N2 - Gewässer werden traditionellerweise als abgeschlossene Ökosysteme gesehen, und insbeson¬dere das Zirkulieren von Wasser und Nährstoffen im Pelagial von Seen wird als Beispiel dafür angeführt. Allerdings wurden in der jüngeren Vergangenheit wichtige Verknüpfungen des Freiwasserkörpers von Gewässern aufgezeigt, die einerseits mit dem Benthal und andererseits mit dem Litoral, der terrestrischen Uferzone und ihrem Einzugsgebiet bestehen. Dadurch hat in den vergangen Jahren die horizontale und vertikale Konnektivität der Gewässerökosysteme erhöhtes wissenschaftliches Interesse auf sich gezogen, und damit auch die ökologischen Funktionen des Gewässergrunds (Benthal) und der Uferzonen (Litoral). Aus der neu beschriebenen Konnektivität innerhalb und zwischen diesen Lebensräumen ergeben sich weitreichende Konsequenzen für unser Bild von der Funktionalität der Gewässer. In der vorliegenden Habilitationsschrift wird am Beispiel von Fließgewässern und Seen des nordostdeutschen Flachlandes eine Reihe von internen und externen funktionalen Verknüpfungen in den horizontalen und vertikalen räumlichen Dimensionen aufgezeigt. Die zugrunde liegenden Untersuchungen umfassten zumeist sowohl abiotische als auch biologische Variablen, und umfassten thematisch, methodisch und hinsichtlich der Untersuchungsgewässer ein breites Spektrum. Dabei wurden in Labor- und Feldexperimenten sowie durch quantitative Feldmes¬sungen ökologischer Schlüsselprozesse wie Nährstoffretention, Kohlenstoffumsatz, extrazellu¬läre Enzymaktivität und Ressourcenweitergabe in Nahrungsnetzen (mittels Stabilisotopen¬methode) untersucht. In Bezug auf Fließgewässer wurden dadurch wesentliche Erkenntnisse hinsichtlich der Wirkung einer durch Konnekticität geprägten Hydromorphologie auf die die aquatische Biodiversität und die benthisch-pelagische Kopplung erbracht, die wiederum einen Schlüsselprozess darstellt für die Retention von in der fließenden Welle transportierten Stoffen, und damit letztlich für die Produktivität eines Flussabschnitts. Das Litoral von Seen wurde in Mitteleuropa jahrzehntelang kaum untersucht, so dass die durchgeführten Untersuchungen zur Gemeinschaftsstruktur, Habitatpräferenzen und Nahrungs¬netzverknüpfungen des eulitoralen Makrozoobenthos grundlegend neue Erkenntnisse erbrach¬ten, die auch unmittelbar in Ansätze zur ökologischen Bewertung von Seeufern gemäß EG-Wasserrahmenrichtlinie eingehen. Es konnte somit gezeigt werden, dass die Intensität sowohl die internen als auch der externen ökologischen Konnektivität durch die Hydrologie und Morphologie der Gewässer sowie durch die Verfügbarkeit von Nährstoffen wesentlich beeinflusst wird, die auf diese Weise vielfach die ökologische Funktionalität der Gewässer prägen. Dabei trägt die vertikale oder horizontale Konnektivität zur Stabilisierung der beteiligten Ökosysteme bei, indem sie den Austausch ermöglicht von Pflanzennährstoffen, von Biomasse sowie von migrierenden Organismen, wodurch Phasen des Ressourcenmangels überbrückt werden. Diese Ergebnisse können im Rahmen der Bewirtschaftung von Gewässern dahingehend genutzt werden, dass die Gewährleistung horizontaler und vertikaler Konnektivität in der Regel mit räumlich komplexeren, diverseren, zeitlich und strukturell resilienteren sowie leistungsfähi¬geren Ökosystemen einhergeht, die somit intensiver und sicherer nachhaltig genutzt werden können. Die Nutzung einer kleinen Auswahl von Ökosystemleistungen der Flüsse und Seen durch den Menschen hat oftmals zu einer starken Reduktion der ökologischen Konnektivität, und in der Folge zu starken Verlusten bei anderen Ökosystemleistungen geführt. Die Ergebnisse der dargestellten Forschungen zeigen auch, dass die Entwicklung und Implementierung von Strategien zum integrierten Management von komplexen sozial-ökologischen Systemen wesentlich unterstützt werden kann, wenn die horizontale und vertikale Konnektivität gezielt entwickelt wird. N2 - Surface waters are seen traditionally as closed ecosystems, and the recirculation of water and nutrients in the pelagic zone of lakes is cited as an example fort his. However, recently important linkages have been demonstrated between the pelagic zone on one side, and the benthic and the littoral zones, the terrestrial shore area and the catchment on the other side. Therby, the horizontal and vertical connectivity of aquatic ecosystems has attracted intense scientific interest, and together with this the ecological functions of the bottom zone (benthic zone) and of the shore zone (littoral zone), too. From this newly described connectivity far-reaching consequences arise for our picture of the functionality of surface waters. In this habilitation thesis a number of internal and external functional linkages are depicted in the horizontal and vertical spatial dimensions, as exemplified by running waters and lakes of the north-east German lowlands. The underlying studies mostly comprised both abiotic and biotic variables, and a broad range of topics, methods and studied surface waters. Thereby, experiments in the lab and the field, as well as quantitative field measurements were used to investigate ecological key processes as nutrient retention, carbon dynamics, extracellular enzyme activity, and resource transfer in food webs (using stabile isotope technique). In respect to running waters this resulted in substantial insights into the effects of a hydromorphology exhibiting intense connectivity on aquatic biodiversity and benthic-pelagic coupling, which represents a key process for the retention of transported matter, and thus for the productivity of a river section. The littoral zone of lakes has hardly been studied in Central Europe for several decades. Thus, the results on community structure, habitat preference and food web linkages of eulittoral macrozoobenthos enabled fundamentally new insights, which can directly be used within approaches for the ecological assessment of lake shores according to the EU Water Framework Directive. Research results show that the development and implementation of strategies for an integrated management of complex social-ecological systems may be substantially underpinned by targeted development of horizontal and vertical connectivity. KW - Limnology KW - Aquatic Ecology KW - Connectivity KW - Lake KW - River KW - Limnologie KW - Gewässerökologie KW - Konnektivität KW - See KW - Fluss Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-63713 ER - TY - THES A1 - Lerm, Stephanie T1 - Mikroorganismen in geothermischen Aquiferen : Einfluss mikrobieller Prozesse auf den Anlagenbetrieb T1 - Microorganisms in geothermal plants : influence of microbial processes on plant operation N2 - In Fluid-, Filter- und Sedimentproben von vier geothermischen Anlagen des Norddeutschen Beckens wurden mit molekulargenetischen Verfahren unterschiedliche mikrobielle Gemeinschaften nachgewiesen. Die mikrobielle Zusammensetzung in den Prozesswässern wurde dabei durch die Aquiferteufe, die Salinität, die Temperatur und den verfügbaren Elektronendonatoren und -akzeptoren beeinflusst. Die in den anoxischen Prozesswässern identifizierten Organismen zeichneten sich durch einen chemoheterotrophen oder chemoautotrophen Stoffwechsel aus, wobei Nitrat, Sulfat, Eisen (III) oder Bikarbonat als terminale Elektronenakzeptoren fungierten. Mikroorganismen beeinflussten den Betrieb von zwei Anlagen negativ. So reduzierten im Prozesswasser des Kältespeichers am Berliner Reichstag vorhandene Eisenoxidierer, nahe verwandt zu der Gattung Gallionella, die Injektivität der Bohrungen durch Eisenhydroxidausfällungen in den Filterschlitzen. Biofilme, die von schwefeloxidierenden Bakterien der Gattung Thiothrix in den Filtern der obertägigen Anlage gebildet wurden, führten ebenfalls zu Betriebsstörungen, indem sie die Injektion des Fluids in den Aquifer behinderten. Beim Wärmespeicher in Neubrandenburg waren Sulfatreduzierer vermutlich an der Bildung von Eisensulfidausfällungen in den obertägigen Filtern und im bohrlochnahen Bereich beteiligt und verstärkten Korrosionsprozesse an der Pumpe im Bohrloch der kalten Aquiferseite. Organische Säuren in den Fluiden sowie mineralische Ausfällungen in den Filtern der obertägigen Anlagen waren Belege für die Aktivität der in den verschiedenen Anlagen vorhandenen Mikroorganismen. Es wurde zudem deutlich, dass Mikroorganismen auf Grund der hohen Durchflussraten in den Anlagen chemische Veränderungen in den Prozesswässern deutlich sensitiver anzeigen als chemische Analyseverfahren. So deuteten Änderungen in der Zusammensetzung der mikrobiellen Biozönosen und speziell die Identifikation von Indikatororganismen wie Eisen- und Schwefeloxidierern, fermentativen Bakterien und Sulfatreduzierern auf eine erhöhte Verfügbarkeit von Elektronendonatoren oder akzeptoren in den Prozesswässern hin. Die Ursachen für die an den Geothermieanlagen auftretenden Betriebsstörungen konnten dadurch erkannt werden. N2 - Distinct microbial communities were found in fluid, filter, and sediment samples taken from four geothermal plants in the North German Basin by using molecular genetic techniques. The microbial composition in process fluids was influenced by aquifer depth, salinity, temperature, and available electron donors and acceptors. The organisms identified in the anoxic process fluids were closely related to chemoheterotrophs and chemoautotrophs that use nitrate, sulfate, ferric iron, and bicarbonate as the terminal electron acceptor. Microorganisms adversely affected operation of two geothermal plants. For example, Gallionella-related iron oxidizing bacteria, abundant in process fluids of the cold store at the Berliner Reichstag caused operation failures due to the formation of iron hydroxide scale that clogged the filter slots in the wells and led to a reduction of injectivity. In addition, biofilms formed by sulfur oxidizing Thiothrix sp. in filters of the topside facility drastically reduced injectivity. At the heat store in Neubrandenburg, sulfate reducing bacteria were probably involved in the formation of iron sulfides in filters of the topside facility and in the near wellbore area, and may have increased corrosion processes on the well pump at the cold side of the aquifer. Volatile fatty acids in process fluids and mineral scales in filters of the topside facility indicated the activity of microorganisms present in the different geothermal plants. In addition, it was shown that microorganisms react more sensitive than chemical analyses because of the high fluid flow in the plants, and thus indicate chemical changes in process fluids. Changes in the microbial community composition, and particularly the identification of indicator organisms, such as iron and sulfur oxidizer, fermentative, and sulfate reducing bacteria were suitable for the detection of increased availability of electron donors and acceptors. Thus, reasons for operation failures occurring at geothermal plants could be identified. KW - Mikroorganismen KW - Aquifer KW - Biofilme KW - Korrosion KW - genetisches Fingerprinting KW - Microorganisms KW - geothermal aquifer KW - biofilm KW - corrosion KW - genetic fingerprinting Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-63705 ER - TY - THES A1 - Schad, Julia T1 - Evolution of major histocompatibility complex genes in New World bats and their functional importance in parasite resistance and life-history decisions in the lesser bulldog bat (Noctilio albiventris) T1 - Evolution und Diversität von MHC Immungenen bei Fledermäusen und ihre funktionelle Bedeutung für fitness-relevante Merkmale bei einer neotropischen Fledermaus (Noctilio albiventris) N2 - Immune genes of the major histocompatibility complex (MHC) constitute a central component of the adaptive immune system and play an essential role in parasite resistance and associated life-history strategies. In addition to pathogen-mediated selection also sexual selection mechanisms have been identified as the main drivers of the typically-observed high levels of polymorphism in functionally important parts of the MHC. The recognition of the individual MHC constitution is presumed to be mediated through olfactory cues. Indeed, MHC genes are in physical linkage with olfactory receptor genes and alter the individual body odour. Moreover, they are expressed on sperm and trophoplast cells. Thus, MHC-mediated sexual selection processes might not only act in direct mate choice decisions, but also through cryptic processes during reproduction. Bats (Chiroptera) represent the second largest mammalian order and have been identified as important vectors of newly emerging infectious diseases affecting humans and wildlife. In addition, they are interesting study subjects in evolutionary ecology in the context of olfactory communication, mate choice and associated fitness benefits. Thus, it is surprising that Chiroptera belong to the least studied mammalian taxa in terms of their MHC evolution. In my doctoral thesis I aimed to gain insights in the evolution and diversity pattern of functional MHC genes in some of the major New World bat families by establishing species-specific primers through genome-walking into unknown flanking parts of familiar sites. Further, I took a free-ranging population of the lesser bulldog bat (Noctilio albiventris) in Panama as an example to understand the functional importance of the individual MHC constitution in parasite resistance and reproduction as well as the possible underlying selective forces shaping the observed diversity. My studies indicated that the typical MHC characteristics observed in other mammalian orders, like evidence for balancing and positive selection as well as recombination and gene conversion events, are also present in bats shaping their MHC diversity. I found a wide range of copy number variation of expressed DRB loci in the investigated species. In Saccopteryx bilineata, a species with a highly developed olfactory communication system, I found an exceptionally high number of MHC loci duplications generating high levels of variability at the individual level, which has never been described for any other mammalian species so far. My studies included for the first time phylogenetic relationships of MHC genes in bats and I found signs for a family-specific independent mode of evolution of duplicated genes, regardless whether the highly variable exon 2 (coding for the antigen binding region of the molecule) or more conserved exons (3, 4; encoding protein stabilizing parts) were considered indicating a monophyletic origin of duplicated loci within families. This result questions the general assumed pattern of MHC evolution in mammals where duplicated genes of different families usually cluster together suggesting that duplication occurred before speciation took place, which implies a trans-species mode of evolution. However, I found a trans-species mode of evolution within genera (Noctilio, Myotis) based on exon 2 signified by an intermingled clustering of DRB alleles. The gained knowledge on MHC sequence evolution in major New World bat families will facilitate future MHC investigations in this order. In the N. albiventris study population, the single expressed MHC class II DRB gene showed high sequence polymorphism, moderate allelic variability and high levels of population-wide heterozygosity. Whereas demographic processes had minor relevance in shaping the diversity pattern, I found clear evidence for parasite-mediated selection. This was evident by historical positive Darwinian selection maintaining diversity in the functionally important antigen binding sites, and by specific MHC alleles which were associated with low and high ectoparasite burden according to predictions of the ‘frequency dependent selection hypothesis’. Parasite resistance has been suggested to play an important role in mediating costly life history trade-offs leading to e.g. MHC- mediated benefits in sexual selection. The ‘good genes model’ predicts that males with a genetically well-adapted immune system in defending harmful parasites have the ability to allocate more resources to reproductive effort. I found support for this prediction since non-reproductive adult N. albiventris males carried more often an allele associated with high parasite loads, which differentiated them genetically from reproductively active males as well as from subadults, indicating a reduced transmission of this allele in subsequent generations. In addition, they suffered from increased ectoparasite burden which presumably reduced resources to invest in reproduction. Another sign for sexual selection was the observation of gender-specific difference in heterozygosity, with females showing lower levels of heterozygosity than males. This signifies that the sexes differ in their selection pressures, presumably through MHC-mediated molecular processes during reproduction resulting in a male specific heterozygosity advantage. My data make clear that parasite-mediated selection and sexual selection are interactive and operate together to form diversity at the MHC. Furthermore, my thesis is one of the rare studies contributing to fill the gap between MHC-mediated effects on co-evolutionary processes in parasite-host-interactions and on aspects of life-history evolution. N2 - Innerhalb des adaptiven Immunsystems spielen die Gene des MHC (Major Histocompatibility Complex) eine zentrale Rolle. Neben ihrer Funktion für die körpereigene Parasitenabwehr haben sie auch einen entscheidenden Einfluss auf damit verbundene ‚life-history’ Strategien. Typischerweise sind die funktional für die Pathogenerkennung wichtigen Genabschnitte hoch variabel, was evolutiv nicht nur durch die Vielfalt der Pathogene bedingt ist, sondern im Zuge der sexuellen Selektion durch entsprechende Partnerwahl gefördert wird. Dabei wird die individuelle MHC-Konstitution sehr wahrscheinlich über körpereigene Duftstoffe vermittelt, denn MHC Gene bestimmen nicht nur den individuellen Körpergeruch, sondern liegen in chromosomaler Kopplung mit olfaktorischen Rezeptorgenen. Außerdem werden sie auch auf Sperma- und Trophoplastenzellen exprimiert, so dass MHC-bedingte sexuelle Selektionsmechanismen nicht nur über die direkte Partnerwahl, sondern auch durch kryptische Mechanismen während der Fortpflanzung wirken können. Fledermäuse und Flughunde (Chiroptera) bilden die zweitgrößte Säugetiergruppe und gelten als wichtiges Reservoir und Überträger für den Menschen und andere Wildtiere hoch infektiöser Krankheiten. Innerhalb der evolutionären Ökologie sind sie außerdem auf Grund ihrer z.T. komplexen olfaktorischen Kommunikation während der Partner-wahl und den damit verbundenen fitness relevanten Vorteilen interessante Forschungsobjekte. In Anbetracht dessen ist es erstaunlich, dass bisher so gut wie nichts über den MHC in dieser Säugergruppe bekannt ist. Das Ziel meiner Dissertation war es, zum einen Einblicke in die Evolution und Diversität funktional wichtiger MHC Gene (MHC Klasse II DRB) bei Fledermäusen zu erhalten, und zum anderen zu untersuchen, inwieweit die individuelle MHC-Konstitution am Beispiel der kleinen Hasenmaulfledermaus (Noctilio albiventris) einen Einfluss auf Parasitenresistenz und Fortpflanzung hat und welche Selektionsmechanismen dabei für das entstandene genetische Diversitätsmuster verantwortlich sind. Meine Arbeit zeigt, dass Prozesse, die bei anderen Vertebratenordnungen das Diversitätsmuster am MHC hervorrufen, wie balancierende und positive Selektion, Rekombination und Genkonversion ebenfalls für Fledermäuse zutreffen. In der Anzahl exprimierter DRB loci unterscheiden sich die untersuchten Fledermausarten allerdings beträchtlich. Bemerkenswert ist die extrem hohe Anzahl DRB loci bei Saccopteryx bilineata, die in dieser Ausprägung noch bei keiner anderen Säugetierart beschrieben wurde, einer Fledermaus mit einem hoch entwickelten olfaktorischen Kommunikations-system. Die hier erstmals durchgeführten phylogenetischen Untersuchungen zeigen, dass sich anders als für die meisten anderen Säugetiergruppen beschrieben, die duplizierten DRB Loci unabhängig voneinander entwickelt haben. Dieser mono-phyletische Ursprung duplizierter Loci innerhalb von Fledermausfamilien bestätigte sich für alle Bereiche des Genes: dem hochvariablen Exon 2, das für den funktional entscheidenden Pathogen-bindenden Bereich des Proteins kodiert, sowie für Exon 3 und 4, die für die Molekülstruktur erhaltende Bereiche des Proteins kodieren. Innerhalb der Gattungen (Noctilio, Myotis), basierend auf Exon 2, fand ich das für andere Säugergruppen typische Bild eines ‚trans-species polymorphism’, bei dem MHC-Allele von verschiedenen Arten sich untereinander ähnlicher sein können als Allele der gleichen Art. Meine Ergebnisse sind ein wichtiger Beitrag zum Verständnis der MHC Evolution in der Gruppe der Fledermäuse und liefern hilfreiche Kenntnisse für zukünftige Studien zum MHC in dieser Säugetierordnung. Meine Studien an einer frei lebenden Population der kleinen Hasenmaulfledermaus zeigten dass der exprimierte DRB Locus typische Anzeichen pathogenbedingter aber auch sexueller Selektionsmechanismen zeigt. Ich fand eine ausgeprägte populations-weite Heterozygotie, positive darwinsche Selektion, die den Polymorphismus in Codons die direkt an der Pathogenerkennung beteiligt sind erhält, sowie spezifische Allele die entweder mit einer erhöhten oder einer geringen Parasitenbelastung einhergehen, entsprechend den Annahmen der ‚Frequenz-abhängigen Selektions-Hypothese’. Die individuelle Parasitenresistenz gilt als ein wichtiger Faktor um ressourceabhängige ‚life-history’ Strategien auszuloten. Vor allem Männchen mit einem effektiven Immunsystem, sollten mehr Energien für die Fortpflanzung zur Verfügung haben (‚good-genes model’). Meine Daten bestätigen diese Annahme, Männchen die stärker parasitisiert waren, waren weniger häufig reproduktiv aktiv und trugen häufiger ein DRB-Allele das mit erhöhter Parasitenbelastung einherging. Genetisch unterschieden sie sich darin nicht nur von den reproduktiv aktiven Männchen der Population sondern auch von den Jungtieren. Die Jungtiere trugen zudem häufiger ein für die Parasitenabwehr vorteilhaftes Allel. Die Ergebnisse zeigen dass die individuelle MHC-Konstitution einen nicht zu unterschätzenden Einfluss auch auf den Reproduktionserfolg eines Männchens haben kann und vorteilhafte Allele sich bereits in nachfolgenden Generationen durchsetzen. Meine Doktorarbeit gehört damit zu einer der seltenen Studien, die nicht nur zeigen konnte inwieweit der MHC an co-evolutionären Prozessen der Parasit-Wirt-Interaktion beteiligt ist, sondern dass er darüber hinaus auch direkt für die individuelle ‚life-history’ Entwicklung von Bedeutung ist. KW - MHC Klasse II KW - DRB Evolution KW - Fledermäuse KW - Chiroptera KW - Parasit KW - Fortpflanzung KW - Gute-Gene KW - Noctilio albiventris KW - MHC polymorphism KW - DRB evolution KW - selection KW - Chiroptera KW - ectoparasites KW - reproduction KW - good-genes-model KW - life history Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-63513 ER - TY - THES A1 - Hinz, Justyna T1 - Factors modifying the aggregation of atrophin-1 acting in cis and in trans T1 - Faktoren welche die Aggregation der Atrophin-1 in cis und in trans beeinflussen N2 - Ten polyQ (polyglutamine) diseases constitute a group of hereditary, neurodegenerative, lethal disorders, characterized by neuronal loss and motor and cognitive impairments. The only common molecular feature of polyQ disease-associated proteins is the homopolymeric polyglutamine repeat. The pathological expansion of polyQ tract invariably leads to protein misfolding and aggregation, resulting in formation of the fibrillar intraneuronal deposits (aggregates) of the disease protein. The polyQ-related cellular toxicity is currently attributed to early, small, soluble aggregate species (oligomers), whereas end-stage, fibrillar, insoluble aggregates are considered to be benign. In the complex cellular environment aggregation and toxicity of mutant polyQ proteins can be affected by both the sequences of the corresponding disease protein (factors acting in cis) and the cellular environment (factors acting in trans). Additionally, the nucleus has been suggested to be the primary site of toxicity in the polyQ-based neurodegeneration. In this study, the dynamics and structure of nuclear and cytoplasmic inclusions were examined to determine the intrinsic and extrinsic factors influencing the cellular aggregation of atrophin-1, a protein implicated in the pathology of dentatorubral-pallidoluysian atrophy (DRPLA), a polyQ-based disease with complex clinical features. Dynamic imaging, combined with biochemical and biophysical approaches revealed a large heterogeneity in the dynamics of atrophin-1 within the nuclear inclusions compared with the compact and immobile cytoplasmic aggregates. At least two types of inclusions of polyQ-expanded atrophin-1 with different mobility of the molecular species and ability to exchange with the surrounding monomer pool coexist in the nucleus of the model cell system, neuroblastoma N2a cells. Furthermore, our novel cross-seeding approach which allows for monitoring of the architecture of the aggregate core directly in the cell revealed an evolution of the aggregate core of the polyQ-expanded ATN1 from one composed of the sequences flanking the polyQ domain at early aggregation phases to one dominated by the polyQ stretch in the later aggregation phase. Intriguingly, these changes in the aggregate core architecture of nuclear and cytoplasmic inclusions mirrored the changes in the protein dynamics and physico-chemical properties of the aggregates in the aggregation time course. 2D-gel analyses followed by MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry) were used to detect alterations in the interaction partners of the pathological ATN1 variant compared to the non-pathological ATN1. Based on these results, we propose that the observed complexity in the dynamics of the nuclear inclusions provides a molecular explanation for the enhanced cellular toxicity of the nuclear aggregates in polyQ-based neurodegeneration. N2 - Zehn Polyglutamin-basierte (polyQ) Erkrankungen bilden eine Gruppe von erblichen, neurogenerativen, letalen Krankheiten, die durch neuronalen Zellverlust und motorischen und kognitiven Störungen charakterisiert sind. Die mit polyQ Erkrankungen-assoziierten Proteine enthalten eine repetitive Abfolge der Aminosäure Glutamin (den polyQ-Bereich, der die einzige gemeinsame Sequenz aller polyQ Proteine ist). Durch die pathologische Verlängerung des PolyQ-Bereiches bekommen die polyQ Proteine eine Neigung zu aggregieren, und bilden damit unlösliche, fibrilläre Ablagerungen in Neuronen. Es wird vermutet, dass die sich anfangs bildenden kleinen löslichen Ablagerungsvorstufen (Oligomere) toxisch, und die später gebildeten, unlöslichen fibrillären Aggregate jedoch harmlos sind. Im zellulären Milieu werden Aggregations-Prozess und Toxizität durch die polyQ-flankierenden (benachbarten) Sequenzen des jeweiligen Proteins (in cis agierende Faktoren) und unterschiedliche zelluläre Proteine (in trans agierende Faktoren) beeinflusst. Außerdem kann die nukleare Lokalisation der polyQ Spezies mit verlängertem PolyQ-Bereich ihren toxischen Effekt erhöhen. Die Verlängerung des polyQ-Bereiches im Protein Atrophin-1 (ATN1) über 49 Glutamine hinaus, verursacht Dentatorubro-Pallidoluysische Atrophie (DRPLA), eine progressive Erkrankung, die sich durch Muskelzuckungen, Epilepsie, Ataxie und Demenz äußern kann. In dieser Arbeit wurden die dynamischen Eigenschaften und die Struktur der nuklearen und zytoplasmatischen Aggregate systematisch untersucht, um die Faktoren, die das Aggregations-Verhältnis der Atrophin-1 in cis und in trans beeinflussen zu erkennen. Mittels des mit biochemischen und biophysikalischen Analysen kombinierten Dynamic Imaging, konnte gezeigt werden, dass Aggregate der mutierten ATN1 in vivo, im Säugetier-Zellen Model (Neuroblastoma N2a Zellen), sich von den frühen, löslichen zu später gebildeten unlöslichen Spezies entwickeln. Die Resultate der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Cross-Seeding Methode zeigen, dass das Aggregatcore der früheren Aggregate von den polyQ-Bereich flankierenden Sequenzen kontrolliert wurde, während die Transformation zu unlöslichen Aggregaten von dem expandierten polyQ-Bereich dominiert ist. Außerdem, wie die 2D-Gelelectrophorese und die MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) Analysen beweisen, beeinflusst die Länge des PolyQ-Bereiches die Interaktionen mit zellulären Proteinen. Wir haben auch festgestellt, dass das in nuklearen Aggregaten abgelagerte polyQ-expandierte ATN1 im Vergleich zu den zytoplasmatischen Ablagerungen eine erhöhte Mobilität aufwies. Mindestens zwei Aggregat-Typen mit unterschiedlichen Mobilitäten von mutierten ATN1 koexistieren im Zellkern der N2a Zellen, während im Gegensatz dazu das Protein in den kompakten zytoplasmatischen Aggregaten ausnahmslos immobil erscheint. Dies stellt eine molekulare Erklärung der erhöhten Toxizität der nuklearen ATN1-Aggregate dar. KW - polyQ KW - Atrophin-1 KW - Proteinmissfaltung KW - Proteinaggregation KW - polyQ KW - atrophin-1 KW - misfolding KW - aggregation Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-60385 ER - TY - THES A1 - Frasca, Stefano T1 - Biocatalysis on nanostructured surfaces : investigation and application of redox proteins using spectro-electrochemical methods T1 - Biokatalyse auf nanostrukturierten Oberflächen : Untersuchung und Anwendung von Redox-Proteinen unter Verwendung von Spektro-Elektrochemischen Verfahren N2 - In this thesis, different aspects within the research field of protein spectro- and electro-chemistry on nanostructured materials are addressed. On the one hand, this work is related to the investigation of nanostructured transparent and conductive metal oxides as platform for the immobilization of electroactive enzymes. On the other hand the second part of this work is related to the immobilization of sulfite oxidase on gold nanoparticles modified electrode. Finally direct and mediated spectroelectrochemistry protein with high structure complexity such as the xanthine dehydrogenase from Rhodobacter capsulatus and its high homologues the mouse aldehyde oxidase homolog 1. Stable immobilization and reversible electrochemistry of cytochrome c in a transparent and conductive tin-doped and tin-rich indium oxide film with a well-defined mesoporosity is reported. The transparency and good conductivity, in combination with the large surface area of these materials, allow the incorporation of a high amount of electroactive biomolecules (between 250 and 2500 pmol cm-2) and their electrochemical and spectroscopic investigation. Both, the electrochemical behavior and the immobilization of proteins are influenced by the geometric parameters of the porous material, such as the structure and pore shape, the surface chemistry, as well as the protein size and charge. UV-Vis and resonance Raman spectroscopy, in combination with direct protein voltammetry, are employed for the characterization of cytochrome c immobilized in the mesoporous indium tin oxide and reveal no perturbation of the structural integrity of the redox protein. A long term protein immobilization is reached using these unmodified mesoporous indium oxide based materials, i.e. more than two weeks even at high ionic strength. The potential of this modified material as an amperometric biosensor for the detection of superoxide anions is demonstrated. A sensitivity of about 100 A M-1 m-2, in a linear measuring range of the superoxide concentration between 0.13 and 0.67 μM, is estimated. In addition an electrochemical switchable protein-based optical device is designed with the core part composed of cytochrome c immobilized on a mesoporous indium tin oxide film. A color developing redox sensitive dye is used as switchable component of the system. The cytochrome c-catalyzed oxidation of the dye by hydrogen peroxide is spectroscopically investigated. When the dye is co-immobilized with the protein, its redox state is easily controlled by application of an electrical potential at the supporting material. This enables to electrochemical reset the system to the initial state and repetitive signal generation. The case of negative charged proteins, which does not have a good interaction with the negative charged indium oxide based films, is also explored. The modification of an indium tin oxide film with a positive charged polymer and the employment of a antimony doped tin oxide film were investigated in this work in order to overcome the repulsion induced by similar charges of the protein and electrode. Human sulfite oxidase and its separated heme-containing domain are able to direct exchange electrons with the supporting material. A study of a new approach for sulfite biosensing, based on enhanced direct electron transfer of a human sulfite oxidase immobilized on a gold nanoparticles modified electrode is reported. The spherical gold nanoparticles were prepared via a novel method by reduction of HAuCl4 with branched poly(ethyleneimine) in an ionic liquid resulting in particles of about 10 nm in hydrodynamic diameter. These nanoparticles were covalently attached to a mercaptoundecanoic acid modified Au-electrode and act as platform where human sulfite oxidase is adsorbed. An enhanced interfacial electron transfer and electrocatalysis is therefore achieved. UV-Vis and resonance Raman spectroscopy, in combination with direct protein voltammetry, were employed for the characterization of the system and reveal no perturbation of the structural integrity of the redox protein. The proposed biosensor exhibited a quick steady-state current response, within 2 s and a linear detection range between 0.5 and 5.4 μM with high sensitivity (1.85 nA μM-1). The investigated system provides remarkable advantages, since it works at low applied potential and at very high ionic strength. Therefore these properties could make the proposed system useful in the development of bioelectronic devices and its application in real samples. Finally protein with high structure complexity such as the xanthine dehydrogenase from Rhodobacter capsulatus and the mouse aldehyde oxidase homolog 1 were spectroelectrochemically studied. It could be demonstrated that different cofactors present in the protein structure, like the FAD and the molybdenum cofactor, are able to directly exchange electrons with an electrode and are displayed as a single peak in a square wave voltammogram. Protein mutants bearing a serine substituted to the cysteines, bounding to the most exposed iron sulfur cluster additionally showed direct electron transfer which can be attributable to this cluster. On the other hand a mediated spectroelectrochemical titration of the protein bound FAD cofactor was performed in presence of transparent iron and cobalt complex mediators. The results showed the formation of the stable semiquinone and the fully reduced flavin. Two formal potentials for each single electron exchange step were then determined. N2 - In dieser Arbeit werden verschiedenen Aspekte im Forschungsfeld der Protein-Spekro- und Elektro-Chemie an nanostrukturierte Materialien behandelt. Zum einen werden in dieser Arbeit nanostrukturierte, transparente und leitfähige Metalloxide als Basis für die Immobilisierung von elektroaktiven Enzym untersucht. Des Weiteren behandelt diese Arbeit die Immobilisierung von humaner Sulfitoxidase auf einer Gold-Nanopartikel-modifizierten Elektrode. Schließlich wird die direkte und die vermittelte Elektrochemie von Xanthindehydrogenase aus Rhodobacter capsulatus und Aldehydoxidase Homolog 1, aus Mause, vorgestellt. Im ersten Teil der Arbeit wird über die stabile Immobilisierung und reversible Elektrochemie von Cytochrom c in einem transparenten und leitfähigen Zinn-dotierten und Zinn-reichen Indiumoxid Film mit einer gut definierten Mesoporosität berichtet. Die Transparenz und gute Leitfähigkeit in Kombination mit der großen Oberfläche dieser Materialien erlauben die Inkorporation einer große Menge elektroaktiver Biomoleküle (zwischen 250 und 2500 pmol cm-2) und deren elektrochemische und spektroskopische Untersuchung. Das elektrochemische Verhalten und die Proteinimmobilisierung sind durch die geometrischen Parameter des porösen Materials, wie die Struktur und Porenform, die Oberflächenchemie, sowie die Größe und Ladung des Proteins beeinflusst. UV-Vis und Resonanz-Raman-Spektroskopie in Kombination mit direkter Protein-Voltammetrie werden für die Charakterisierung von Cytochrom c eingesetzt und zeigen keine Störung der strukturellen Integrität des Redox-Proteins durch die Immobilisierung. Eine langfristige Immobilisierung des Proteins von mehr als zwei Wochen auch bei hoher Ionenstärke wurde unter Verwendung dieser unmodifizierten mesoporösen Indiumoxid-basierten Materialien erreicht. Das Potential dieses modifizierten Materials für die Verwendung in einem amperometrischen Biosensor zum Nachweis von Superoxid-Anionen wurde aufgezeigt. Es wurde eine Empfindlichkeit von etwa 100 A M-1 m-2, in einem linearen Messbereich der Superoxidkonzentration zwischen 0,13 und 0,67 µM, erreicht. Außerdem wurde ein elektrochemisch umschaltbares Protein-basiertes optisches Gerät konzipiert mit Cytochrom c und der mesoporösen Indiumzinnoxidschicht. Ein redox-sensitiver Farbstoff wurde als schaltbare Komponente des Systems verwendet. Die Cytochrom c Oxidation des Farbstoffs durch Wasserstoffperoxid wurde spektroskopisch untersucht. Der Redox-Zustand des Farbstoffs, co-immobilisiert mit dem Protein, ist leicht durch das Anlegen eines elektrischen Potentials an das Trägermaterial kontrollierbar. Dadurch wird die elektrochemische Zurücksetzung des Systems auf den Anfangszustand und eine repetitive Signalerzeugung ermöglicht. Für negativ geladene Proteine, die keine gute Interaktion mit dem negativ geladenen Indiumoxid-basierten Film zeigen wurden die Modifikation der Indiumzinnoxidschicht mit einem positiv geladenen Polymer sowie die Verwendung eines Antimon-dotierten Zinnoxid Films vorgeschlagen. Dadurch konnte die Abstoßung induziert durch die ähnliche Ladung des Proteins und der Elektrode überwunden werden. Es gelang für die humane Sulfit-Oxidase und die separate Häm-haltige Domäne der Austausch von Elektronen mit dem Trägermaterial. Im zweiten Teil der Arbeit wird über eine neue Methode für die Biosensorik von Sulfit berichtet, bei der direkte Elektronentransfer von humaner Sulfitoxidase immobilisierten auf einer mit Gold-Nanopartikeln modifizierten Elektrode verstärkt wurde. Die sphärischen Gold-Nanopartikeln, von etwa 10 nm im Durchmesser, wurden über eine neue Methode durch Reduktion von HAuCl4 mit verzweigtem Polyethylenimin in einer ionischen Flüssigkeit synthetisiert. Diese Nanopartikel wurden kovalent an eine mit Mercaptoundecansäure modifizierten Gold-Elektrode immobilisiert und dienen als Basis für die Adsorption von Sulfitoxidase adsorbiert wurde. Dadurch wurde ein schneller heterogener Elektronen-Transfer und verbesserte Elektrokatalyse erreicht. Für die Charakterisierung des verwendeten Systems eingesetzt wurden UV-Vis und Resonanz-Raman-Spektroskopie in Kombination mit direkter Protein-Voltammetrie. Es wurde keine Störung der strukturellen Integrität des Redox-Proteins beobachtet. Der vorgeschlagene Biosensor zeigte eine schnelle steady-state Stromantwort innerhalb von 2 s, eine lineare Detektion im Bereich zwischen 0,5 und 5,4 µM Sulfit mit einer hohen Empfindlichkeit (1,85 nA µM-1). Das untersuchte System bietet bemerkenswerte Vorteile da es ermöglicht bei niedriger angelegter Spannung und bei sehr hoher Ionenstärke zu arbeiten. Aufgrund dieser Eigenschaften hat das vorgeschlagene System großes Potential für die Entwicklung von bioelektronischen Geräten und der Anwendung in realen Proben. Schließlich werden im letzten Teil der Arbeit die komplexeren Enzymen Xanthindehydrogenase aus Rhodobacter capsulatus und Maus Aldehydoxidase Homolog 1 spektro- und elektrochemisch untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass verschiedene Kofaktoren in der Proteinstruktur, wie FAD und der Molybdän Kofaktor direkt Elektronen mit einer Elektrode austauschen können, was durch einzelne Peaks im Square Wave Voltammogramm angezeigt wird. Es konnte eine zusätzliche redoxaktive Gruppe mit direktem Elektronen-Transfer nach Austausch eines Cysteins durch Serin am exponierten Eisen-Schwefel-Cluster gezeigt werden. Außerdem wurde eine vermittelte spektroelektrochemische Titration des FAD-Kofaktors in Anwesenheit von Mediatoren der Klasse der Eisen und Kobalt-Komplexe durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass FAD in R. capsulatus XDH zu einem stabilen Semichinone reduziert werden kann. Es gelang die formalen Potentiale für die zwei einzigen Elektrontransferprozesse zu bestimmen. KW - Protein Spektroelektrochemie KW - nanostrukturierte Materialien KW - Sulfitoxidase KW - Xanthindehydrogenase KW - Biosensor KW - Protein spectroelectrochemistry KW - nanostructured materials KW - sulfite oxidase KW - xanthine dehydrogenase KW - biosensor Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-58131 ER - TY - THES A1 - Reinert, Armin T1 - Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von für die arbuskuläre Mykorrhizasymbiose spezifischen Genen in Medicago truncatula T1 - Identification and functional characterization of genes specific for the arbuscular mycorrhizal symbiosis in Medicago truncatula N2 - Die Mykorrhiza (griechisch: mýkēs für „Pilz”; rhiza für „Wurzel”) stellt eine Symbiose zwischen Pilzen und einem Großteil der Landpflanzen dar. Der Pilz verbessert durch die Symbiose die Versorgung der Pflanze mit Nährstoffen, während die Pflanze den Pilz mit Kohlenhydraten versorgt. Die arbuskuläre Mykorrhiza (AM) stellt dabei einen beson-dere Form der Mykorrhiza dar. Der AM-Pilz bildet dabei während der Symbiose die namensgebenden Arbuskeln innerhalb der Wurzelzellen als Ort des primären Nährstoff- austausches aus. Die AM-Symbiose (AMS) ist der Forschungsschwerpunkt dieser Arbeit. Als Modellorganismen wurden Medicago truncatula und Glomus intraradices verwendet. Es wurden Transkriptionsanalysen durchgeführt um u.a. AMS regulierte Transkriptions- faktoren (TFs) zu identifizieren. Die Aktivität der Promotoren von drei der so identifizier-ten AMS-regulierten TFs (MtOFTN, MtNTS, MtDES) wurde mit Hilfe eine Reportergens visualisiert. Der Bereich der größten Promotoraktivität waren in einem Fall nur die ar- buskelhaltigen Zellen (MtOFTN). Im zweiten Fall war der Promotor auch aktiv in nicht arbuskelhaltigen Zellen, jedoch am stärksten aktiv in den arbuskelhaltigen Zellen (MtNTS). Ein weiterer Promotor war in arbuskelhaltigen Zellen und den diesen benach-barten Zellen gleich aktiv (MtDES). Zusätzlich wurden weitere Gene als AMS-reguliert identifiziert und es wurde für drei dieser Gene (MtPPK, MtAmT, MtMDRL) ebenfalls eine Promotor::Reporter-Aktivitäts- studie durchgeführt. Die Promotoren der Kinase (MtPPK) und des Ammoniumtrans-porters (MtAmt) waren dabei ausschließlich in arbuskelhaltigen Zellen aktiv, während die Aktivität des ABC-Transporters (MtMDRL) keinem bestimmten Zelltyp zuzuordnen war. Für zwei weitere identifizierte Gene, ein Kupfertransporter (MtCoT) und ein Zucker- bzw. Inositoltransporter (MtSuT), wurden RNA-Interferenz (RNAi)-Untersuchungen durchgeführt. Dabei stellte sich in beiden Fällen heraus, dass, sobald ein RNAi-Effekt in den transformierten Wurzeln vorlag, diese in einem deutlich geringerem Ausmaß wie in der Wurzelkontrolle von G. intraradices kolonisiert worden sind. Im Falle von MtCoT könnte das aus dem selben Grund geschehen, wie im Falle von MtPt4. Welche Rolle MtSuT genau in der Ausbildung der AMS spielt und welche Rolle Inositol in der Aus- bildung der AMS spielt müsste durch weitere Untersuchungen am Protein untersucht werden. Weitere Untersuchen an den in dieser Arbeit als spezifisch für arbuskelhaltige Zellen gezeigten Genen MtAmT, MtPPK und MtOFTN könnten ebenfalls aufschlussreich für das weitere Verständnis der AMS sein. Dies trifft auch auf die TFs MtNTS und MtDES zu, die zwar nicht ausschließlich arbuskelspezifisch transkribiert werden, aber auch eine Rolle in der Regulation der AMS innerhalb von M. truncatula Wurzeln zu spielen scheinen. N2 - The mycorrhiza (Greek: mýkēs for "mushroom"; rhiza for "root") is a symbiosis between fungi and the vast majority of land plants. The fungus improves the nutrient supply of the plant, while the plant provides the fungus with carbohydrates. The arbuscular my-corrhiza (AM) represents a special type of mycorrhiza. The AM forms during the sym-biosis eponymous arbuscules within the root cells as the supposed site of the major nu-trient exchange. The AM symbiosis (AMS) is the research focus of this work. Medicago truncatula and Glomus intraradices were used as model organisms. During the project several transcription analysis were performed to identify AMS re-gulated transcription factors (TFs). The activity of the promoters of three of the identified AMS regulated TFs (MtOFTN, MtNTS, MtDES) were visualised using a reporter gene. Cells with promoter activity were in one case the arbuscle containing cells (MtOFTN). In the another case, the promoter was also weakly active in non arbuscle containing cells, however the major site of activity were the arbuscle containing cells (MtNTS). Another promoter was active in arbuscle containing and adjacent cells (MtDES). In addition, other genes were identified as AMS regulated and for three of these genes (MtPPK, MtAmT, MtMDRL) a promoter::reporter activity study was conducted, too. The promoters of the kinase (MtPPK) and the ammonium transporter (MtAmT) were active exclusively in arbuscle containing cells, whereas the activity of the ABC-transporter (MtMDRL) could not be assigned to a specific cell type. For two other identified genes (a copper transporter (MtCoT) and a sugar/ inositol transporter (MtSuT)) RNA-interference (RNAi) studies were carried out. The studies revealed in both cases that, once an RNAi effect was present in the transformed roots, the roots were colonised by G. intraradices in a much lesser extent as in the vector-control. In the case of MtCoT it maybe has the same basic principle as in the case of the phosphate transporter MtPt4. Which role MtSuT and inositol plays during the fo-rmation of the AMS has to be reviewed. Further examinations on the genes MtAmT, MtPPK and MtOFTN could also be reveal-ing for the understanding of the AMS, as their promotors, as shown in this thesis, are exclusively active in arbuscle containing cells The same can be said for the TFs MtNFTS and MtDES. They are not exclusively transcripted in arbuscle containing cells, but nevertheless seem to play a role in the formation of the AMS within M. truncatula roots. KW - Mykorrhiza KW - Medicago truncatula KW - Transkriptom KW - RNAi KW - Promotor KW - Mycorrhiza KW - Medicago truncatula KW - transcriptomics KW - RNAi KW - Promotor Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-63805 ER - TY - THES A1 - Matallana-Ramírez, Lilian Paola T1 - Unraveling the ORE1 regulon in Arabidopsis thaliana : molecular and functional characterization of up- and down-stream components T1 - Aufklärung des ORE1-Regulationsnetzwerks in Arabidopsis thaliana : molekulare und funktionelle Charakterisierung von Über- und untergeordneten Komponenten N2 - Leaf senescence is an active process required for plant survival, and it is flexibly controlled, allowing plant adaptation to environmental conditions. Although senescence is largely an age-dependent process, it can be triggered by environmental signals and stresses. Leaf senescence coordinates the breakdown and turnover of many cellular components, allowing a massive remobilization and recycling of nutrients from senescing tissues to other organs (e.g., young leaves, roots, and seeds), thus enhancing the fitness of the plant. Such metabolic coordination requires a tight regulation of gene expression. One important mechanism for the regulation of gene expression is at the transcriptional level via transcription factors (TFs). The NAC TF family (NAM, ATAF, CUC) includes various members that show elevated expression during senescence, including ORE1 (ANAC092/AtNAC2) among others. ORE1 was first reported in a screen for mutants with delayed senescence (oresara1, 2, 3, and 11). It was named after the Korean word “oresara,” meaning “long-living,” and abbreviated to ORE1, 2, 3, and 11, respectively. Although the pivotal role of ORE1 in controlling leaf senescence has recently been demonstrated, the underlying molecular mechanisms and the pathways it regulates are still poorly understood. To unravel the signaling cascade through which ORE1 exerts its function, we analyzed particular features of regulatory pathways up-stream and down-stream of ORE1. We identified characteristic spatial and temporal expression patterns of ORE1 that are conserved in Arabidopsis thaliana and Nicotiana tabacum and that link ORE1 expression to senescence as well as to salt stress. We proved that ORE1 positively regulates natural and dark-induced senescence. Molecular characterization of the ORE1 promoter in silico and experimentally suggested a role of the 5’UTR in mediating ORE1 expression. ORE1 is a putative substrate of a calcium-dependent protein kinase named CKOR (unpublished data). Promising data revealed a positive regulation of putative ORE1 targets by CKOR, suggesting the phosphorylation of ORE1 as a requirement for its regulation. Additionally, as part of the ORE1 up-stream regulatory pathway, we identified the NAC TF ATAF1 which was able to transactivate the ORE1 promoter in vivo. Expression studies using chemically inducible ORE1 overexpression lines and transactivation assays employing leaf mesophyll cell protoplasts provided information on target genes whose expression was rapidly induced upon ORE1 induction. First, a set of target genes was established and referred to as early responding in the ORE1 regulatory network. The consensus binding site (BS) of ORE1 was characterized. Analysis of some putative targets revealed the presence of ORE1 BSs in their promoters and the in vitro and in vivo binding of ORE1 to their promoters. Among these putative target genes, BIFUNCTIONAL NUCLEASE I (BFN1) and VND-Interacting2 (VNI2) were further characterized. The expression of BFN1 was found to be dependent on the presence of ORE1. Our results provide convincing data which support a role for BFN1 as a direct target of ORE1. Characterization of VNI2 in age-dependent and stress-induced senescence revealed ORE1 as a key up-stream regulator since it can bind and activate VNI2 expression in vivo and in vitro. Furthermore, VNI2 was able to promote or delay senescence depending on the presence of an activation domain located in its C-terminal region. The plasticity of this gene might include alternative splicing (AS) to regulate its function in different organs and at different developmental stages, particularly during senescence. A model is proposed on the molecular mechanism governing the dual role of VNI2 during senescence. N2 - Der Alterungsprozess lebender Organismen wird seit vielen Jahren wissenschaftlich untersucht. In Pflanzen wird der Alterungsprozess Seneszenz genannt. Er ist für das Überleben der Pflanze von großer Bedeutung. Dennoch ist unser Wissen über die molekularen Mechanismen der Blattseneszenz, dessen komplexe Steuerung und die Wechselwirkungen mit Umweltsignale noch sehr limitiert. Ein wichtiges Steuerungselement besteht in der Aktivierung bestimmter Transkriptionsfaktoren (TFs) die während der Seneszenz unterschiedlich exprimiert werden. Aus der Literatur ist bekannt, dass Mitglieder der NAC TF Familie (NAM/ATAF/CUC) an der Regulation der Seneszenz bei Pflanzen beteiligt sind. ORE1 (ANAC092/AtNAC2), ein NAC TF mit erhöhter Genexpression während der Seneszenz, wurde erstmals in Mutanten mit verzögerte Seneszenz beschrieben, die molekularen Mechanismen, wie ORE1 die Seneszenz kontrolliert und die Stoffwechselwege reguliert, sind aber noch weitgehend unbekannt. Die Arbeiten im Rahmen dieser Dissertation wurden durchgeführt, um einen tieferen Einblick in die Regulationsmechanismen von ORE1 auf natürliche, dunkel induzierte sowie Salzstress-induzierte Seneszenz zu erhalten. Ergebnisse von Untersuchungen an zwei unterschiedlichen Pflanzenspezies (Arabidopsis thalinana und Nicotiana tabacum) deuten auf ein ähnliches Expressionsmuster von ORE1 während der natürlichen als auch der Salz-induzierten Seneszenz hin. In der Promotorregion von ORE1 wurde ein für natürliche Seneszenz charakteristisches Muster identifiziert. In vivo Analysen ergaben darüber hinaus. Hinweise auf zwei weitere ORE1 Regulatoren. Debei handelt es sich umeinen weiteren NAC TF (ATAF1) und (ii) CKOR, einer Calcium-abhängige Protein-Kinase (CDPK).In weiteren Studien wurden sechs Gene identifiziert, die durch ORE1 reguliert werden. In den Promotoren dieser Gene wurden entsprechende Bindestellen für ORE1 lokalisiert. Die ORE1-Bindung an die Promotoren wurde daraufhin sowohl in vitro als auch in vivo verifiziert. Zwei dieser Gene, die BIFUNCTIONAL Nuclease I (BFNI) und VND-Interacting2 (VNI2), wurden zudem auf molekularer und physiologischer Ebene untersucht. KW - Blattalterung KW - Transkriptionsfaktor KW - Regulationsweg KW - Leaf senescence KW - transcription factor KW - regulatory pathway Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-62646 ER -