TY  - THES
A1  - Ganesh, Bhanu Priya
T1  - Host-microbe interactions in the inflamed gut
T1  - Wirt-Mikroben-Interaktionen im entzündenden Darm
N2  - Initiation and perpetuation of inflammatory bowel diseases (IBD) may result from an exaggerated mucosal immune response to the luminal microbiota in a susceptible host. We proposed that this may be caused either 1) by an abnormal microbial composition or 2) by weakening of the protective mucus layer due to excessive mucus degradation, which may lead to an easy access of luminal antigens to the host mucosa triggering inflammation. We tested whether the probiotic Enterococcus faecium NCIMB 10415 (NCIMB) is capable of reducing chronic gut inflammation by changing the existing gut microbiota composition and aimed to identify mechanisms that are involved in possible beneficial effects of the probiotic. To identify health-promoting mechanisms of the strain, we used interleukin (IL)-10 deficient mice that spontaneously develop gut inflammation and fed these mice a diet containing NCIMB (106 cells g-1) for 3, 8 and 24 weeks, respectively. Control mice were fed an identically composed diet but without the probiotic strain. No clear-cut differences between the animals were observed in pro-inflammatory cytokine gene expression and in intestinal microbiota composition after probiotic supplementation. However, we observed a low abundance of the mucin-degrading bacterium Akkermansia muciniphila in the mice that were fed NCIMB for 8 weeks. These low cell numbers were associated with significantly lower interferon gamma (IFN-γ) and IFN-γ-inducible protein (IP-10) mRNA levels as compared to the NCIMB-treated mice that were killed after 3 and 24 weeks of intervention. In conclusion, NCIMB was not capable of reducing gut inflammation in the IL-10-/- mouse model. To further identify the exact role of A. muciniphila and uncover a possible interaction between this bacterium, NCIMB and the host in relation to inflammation, we performed in vitro studies using HT-29 colon cancer cells. The HT-29 cells were treated with bacterial conditioned media obtained by growing either A. muciniphila (AM-CM) or NCIMB (NCIMB-CM) or both together (COMB-CM) in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) for 2 h at 37 °C followed by bacterial cell removal. HT-29 cells treated with COMB-CM displayed reduced cell viability after 18 h (p<0.01) and no viable cells were detected after 24 h of treatment, in contrast to the other groups or heated COMB-CM. Detection of activated caspase-3 in COMB-CM treated groups indicated that death of the HT-29 cells was brought about by apoptosis. It was concluded that either NCIMB or A. muciniphila produce a soluble and heat-sensitive factor during their concomitant presence that influences cell viability in an in vitro system. We currently hypothesize that this factor is a protein, which has not yet been identified. Based on the potential effect of A. muciniphila on inflammation (in vivo) and cell-viability (in vitro) in the presence of NCIMB, we investigated how the presence of A. muciniphila affects the severity of an intestinal Salmonella enterica Typhimurium (STm)-induced gut inflammation using gnotobiotic C3H mice with a background microbiota of eight bacterial species (SIHUMI, referred to as simplified human intestinal microbiota). Presence of A. muciniphila in STm-infected SIHUMI (SIHUMI-AS) mice caused significantly increased histopathology scores and elevated mRNA levels of IFN-γ, IP-10, tumor necrosis factor alpha (TNF-α), IL-12, IL-17 and IL-6 in cecal and colonic tissue. The number of mucin filled goblet cells was 2- to 3- fold lower in cecal tissue of SIHUMI-AS mice compared to SIHUMI mice associated with STm (SIHUMI-S) or A. muciniphila (SIHUMI-A) or SIHUMI mice. Reduced goblet cell numbers significantly correlated with increased IFN-γ (r2 = -0.86, ***P<0.001) in all infected mice. In addition, loss of cecal mucin sulphation was observed in SIHUMI-AS mice. Concomitant presence of A. muciniphila and STm resulted in a drastic change in microbiota composition of the SIHUMI consortium. The proportion of Bacteroides thetaiotaomicron in SIHUMI, SIHUMI-A and SIHUMI-S mice made up to 80-90% but was completely taken over by STm in SIHUMI-AS mice contributing 94% to total bacteria. These results suggest that A. muciniphila exacerbates STm-induced intestinal inflammation by its ability to disturb host mucus homeostasis. In conclusion, abnormal microbiota composition together with excessive mucus degradation contributes to severe intestinal inflammation in a susceptible host.
N2  - Die Initiation and die Manifestation von entzündlichen Darmerkrankungen (inflammatory bowel diseases - IBD) können aus einer übersteigerten mukosalen Immunreaktion auf die luminale Mikrobiota in einem empfänglichen Wirt resultieren. Wir schlagen vor, dass dies entweder durch 1) eine abnormale mikrobielle Zusammensetzung oder 2) die Abschwächung der schützenden Schleimschicht, eingeleitet durch deren fortgeschrittenen Abbau, verursacht werden kann. Diese Entwicklung ermöglicht einen erleichterten Zugang des luminalen Antigens zu der Mukosa des Wirts und somit die Auslösung der Entzündung. Wir haben getestet, ob das probiotische Bakterium Enterococcus faecium NCIMB 10415 (NCIMB) in der Lage ist, der chronischen Darmentzündung durch Veränderung der Zusammensetzung der Darmmikrobiota entgegenzuwirken und strebten an, die zugrunde liegenden Mechanismen der probiotischen Wirkungsweise zu identifizieren. Für die Aufklärung der gesundheitsfördernden Mechanismen dieses Bakterienstammes wurden Interleukin-10 defiziente Mäuse verwendet, die spontan eine Darmentzündung entwickeln. Den Mäusen wurde für 3, 8 und 24 Wochen eine NCIMB enthaltende Diät verabreicht. Nach der Fütterung waren keine eindeutigen Unterschiede zwischen den Gruppen hinsichtlich der Genexpression von pro-inflammatorischen Zytokinen und der Zusammensetzung der Darmmikrobiota zu beobachten, obwohl eine geringere Zellzahl des schleimabbauenden Bakteriums Akkermansia muciniphila in den mit NCIMB gefütterten Mäusen nach 8 Wochen festgestellt wurde. Daraus folgt, dass NCIMB nicht in der Lage ist, dem Verlauf der Darmentzündung im IL-10-/--Mausmodell entgegenzuwirken. In der nachfolgenden Studie wurde untersucht, wie die Anwesenheit von A. muciniphila den Ausprägungsgrad einer intestinalen Salmonella enterica Typhimurium (STm) induzierten Darmentzündung beeinflusst. Dafür wurden gnobiotische C3H-Mäuse mit einem mikrobiellen Hintergrund von acht Bakterienspezies (SIHUMI) verwendet. Die gleichzeitige Anwesenheit von A. muciniphila und STm verursachte eine drastische Veränderung der Mikrobiota-Zusammensetzung des SIHUMI-Konsortiums. Diese Ergebnisse zeigen, dass A. muciniphila durch seine Fähigkeit, die Homöostase/Selbstregulation der Schleimbildung zu stören, die STm-induzierte Darmentzündung verschärft. Es kann geschlußfolgert werden, dass eine abweichende Zusammensetzung der Mikrobiota in Kombination mit einem massiven Abbau des Mucus zur schweren intestinalen Entzündung im empfänglichen Wirt beiträgt.
KW  - IBD
KW  - probiotics
KW  - immune response
KW  - mucus
KW  - goblet cells
KW  - chronic and acute inflammation
KW  - apoptosis
KW  - commensal
KW  - cytokines
KW  - pathogen
KW  - infection
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-69558
ER  - 
TY  - THES
A1  - Slezak, Kathleen
T1  - Impact of intestinal bacteria on the anatomy and physiology of the intestinal tract in the PRM/Alf mouse model
T1  - Einfluss intestinaler Bakterien auf die Anatomie und Physiologie des Darmes in der PRM/Alf Maus
N2  - Introduction: Intestinal bacteria influence gut morphology by affecting epithelial cell proliferation, development of the lamina propria, villus length and crypt depth [1]. Gut microbiota-derived factors have been proposed to also play a role in the development of a 30 % longer intestine, that is characteristic of PRM/Alf mice compared to other mouse strains [2, 3]. Polyamines and SCFAs produced by gut bacteria are important growth factors, which possibly influence mucosal morphology, in particular villus length and crypt depth and play a role in gut lengthening in the PRM/Alf mouse. However, experimental evidence is lacking. Aim: The objective of this work was to clarify the role of bacterially-produced polyamines on crypt depth, mucosa thickness and epithelial cell proliferation. For this purpose, C3H mice associated with a simplified human microbiota (SIHUMI) were compared with mice colonized with SIHUMI complemented by the polyamine-producing Fusobacterium varium (SIHUMI + Fv). In addition, the microbial impact on gut lengthening in PRM/Alf mice was characterized and the contribution of SCFAs and polyamines to this phenotype was examined. Results: SIHUMI + Fv mice exhibited an up to 1.7 fold higher intestinal polyamine concentration compared to SIHUMI mice, which was mainly due to increased putrescine concentrations. However, no differences were observed in crypt depth, mucosa thickness and epithelial proliferation. In PRM/Alf mice, the intestine of conventional mice was 8.5 % longer compared to germfree mice. In contrast, intestinal lengths of C3H mice were similar, independent of the colonization status. The comparison of PRM/Alf and C3H mice, both associated with SIHUMI + Fv, demonstrated that PRM/Alf mice had a 35.9 % longer intestine than C3H mice. However, intestinal SCFA and polyamine concentrations of PRM/Alf mice were similar or even lower, except N acetylcadaverine, which was 3.1-fold higher in PRM/Alf mice. When germfree PRM/Alf mice were associated with a complex PRM/Alf microbiota, the intestine was one quarter longer compared to PRM/Alf mice colonized with a C3H microbiota. This gut elongation correlated with levels of the polyamine N acetylspermine. Conclusion: The intestinal microbiota is able to influence intestinal length dependent on microbial composition and on the mouse genotype. Although SCFAs do not contribute to gut elongation, an influence of the polyamines N acetylcadaverine and N acetylspermine is conceivable. In addition, the study clearly demonstrated that bacterial putrescine does not influence gut morphology in C3H mice.
N2  - Einleitung: Die intestinale Mikrobiota beeinflusst die Morphologie des Darmes durch Beeinflussung der Epithelzellproliferation, Entwicklung der Lamina Propria, Zottenlänge und Kryptentiefe [1]. Zudem stehen bakterielle Faktoren im Verdacht, die Entwicklung eines 30 % längeren Darmes in der PRM/Alf Maus gegenüber anderen Mausstämmen zu begünstigen [2, 3]. Die von der intestinalen Mikrobiota produzierten Polyamine und kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) stellen wichtige Wachstumsfaktoren dar, die bei der Ausbildung des Darmes sowie an der Darmverlängerung in der PRM/Alf Maus beteiligt sein könnten. Zielstellung: Ziel dieser Arbeit war, den Einfluss von bakteriell-produzierten Polyaminen auf die Kryptentiefe, Schleimhautdicke und Epithelzellproliferation zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden keimfreie C3H Mäuse mit einer vereinfachten menschlichen Mikrobiota (SIHUMI) assoziiert und mit C3H Mäusen, die mit einer SIHUMI plus dem polyaminproduzierendem Fusobacterium varium (SIHUMI + Fv) besiedelt worden waren, verglichen. Weiterhin sollte der mikrobielle Einfluss sowie die Rolle von SCFAs und Polyaminen bei der Ausbildung eines verlängerten Darms in der PRM/Alf Maus untersucht werden. Ergebnisse: Die SIHUMI + Fv Mäuse zeigten eine bis zu 1,7 fach höhere intestinale Polyaminkonzentration im Vergleich zu SIHUMI-Mäusen, welche vor allem auf eine Erhöhung von Putrescin zurückzuführen war. Trotz der höheren Polyaminkonzentrationen wurden keine Unterschiede in der Kryptentiefe, Schleimhautdicke und Epithelzellproliferation beobachtet. Die Untersuchung der Darmlänge in PRM/Alf Mäusen in Abhängigkeit vom Besiedlungsstatus ergab einen 8,5 % längeren Darm in konventionell besiedelten PRM/Alf Mäusen im Vergleich zu keimfreien PRM/Alf Mäusen. Im Gegensatz dazu wurden in C3H-Mäusen keine Unterschiede in der Darmlänge in Abhängigkeit von der Besiedlung beobachtet. Der Vergleich zwischen PRM/Alf und C3H Mäusen, die beide mit der SIHUMI + Fv Mikrobiota assoziiert wurden, zeigte einen 35,9 % längeren Darm in PRM/Alf Mäusen. Trotz des längeren Darmes waren die intestinalen SCFA- und Polyaminkonzentrationen vergleichbar bzw. geringer als in C3H Mäusen, mit einer Ausnahme: Die Konzentration von N Acetylcadaverin war in PRM/Alf Mäusen 3,1-fach erhöht. Wurden keimfreie PRM/Alf Mäuse mit einer komplexen PRM/Alf Mikrobiota assoziiert, so war ihr Darm ein Viertel länger als bei PRM/Alf Mäusen, die mit einer C3H Mikrobiota besiedelt wurden. Dieser längere Darm korrelierte mit der N Acetylsperminkonzentration. Schlussfolgerung: Die intestinale Mikrobiota ist in der Lage, die Darmlänge abhängig von der mikrobiellen Zusammensetzung und von dem Genotyp des Wirtes zu beeinflussen. Obwohl SCFAs die Darmlänge nicht beeinflussten, ist eine Beteiligung der Polyamine N Acetylcadaverin und N Acetylspermin denkbar. Darüber hinaus zeigte die Studie, dass Putrescin die Anatomie des Darmes in C3H Mäusen nicht beeinflusst.
KW  - Darmbakterien
KW  - Darmlänge
KW  - Polyamine
KW  - Kurzkettige Fettsäuren
KW  - PRM/Alf Maus
KW  - gut microbiota
KW  - gut length
KW  - polyamines
KW  - short chain fatty acids
KW  - PRM/Alf mouse
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-68946
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TY  - THES
A1  - Schumann, Sara
T1  - Influence of intestinal inflammation on bacterial protein expression in monoassociated mice
T1  - Der Einfluss chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen auf die Proteinexpression intestinaler E. coli
N2  - Background: Increased numbers of intestinal E. coli are observed in inflammatory bowel disease, but the reasons for this proliferation and it exact role in intestinal inflammation are unknown. Aim of this PhD-project was to identify E. coli proteins involved in E. coli’s adaptation to the inflammatory conditions in the gut and to investigate whether these factors affect the host. Furthermore, the molecular basis for strain-specific differences between probiotic and harmful E. coli in their response to intestinal inflammation was investigated. Methods: Using mice monoassociated either with the adherent-invasive E. coli (AIEC) strain UNC or the probiotic E. coli Nissle, two different mouse models of intestinal inflammation were analysed: On the one hand, severe inflammation was induced by treating mice with 3.5% dextran sodium sulphate (DSS). On the other hand, a very mild intestinal inflammation was generated by associating interleukin 10-deficient (IL-10-/-) mice with E. coli. Differentially expressed proteins in the E. coli strains collected from caecal contents of these mice were identified by two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis. Results DSS-experiment: All DSS-treated mice revealed signs of a moderate caecal and a severe colonic inflammation. However, mice monoassociated with E. coli Nissle were less affected. In both E. coli strains, acute inflammation led to a downregulation of pathways involved in carbohydrate breakdown and energy generation. Accordingly, DSS-treated mice had lower caecal concentrations of bacterial fermentation products than the control mice. Differentially expressed proteins also included the Fe-S cluster repair protein NfuA, the tryptophanase TnaA, and the uncharacterised protein YggE. NfuA was upregulated nearly 3-fold in both E. coli strains after DSS administration. Reactive oxygen species produced during intestinal inflammation damage Fe-S clusters and thereby lead to an inactivation of Fe-S proteins. In vitro data indicated that the repair of Fe-S proteins by NfuA is a central mechanism in E. coli to survive oxidative stress. Expression of YggE, which has been reported to reduce the intracellular level of reactive oxygen species, was 4- to 8-fold higher in E. coli Nissle than in E. coli UNC under control and inflammatory conditions. In vitro growth experiments confirmed these results, indicating that E. coli Nissle is better equipped to cope with oxidative stress than E. coli UNC. Additionally, E. coli Nissle isolated from DSS-treated and control mice had TnaA levels 4- to 7-fold higher than E. coli UNC. In turn, caecal indole concentrations resulting from cleavage of tryptophan by TnaA were higher in E. coli Nissle- associated control mice than in the respective mice associated with E. coli UNC. Because of its anti-inflammatory effect, indole is hypothesised to be involved in the extension of the remission phase in ulcerative colitis described for E. coli Nissle. Results IL-10-/--experiment: Only IL-10-/- mice monoassociated with E. coli UNC for 8 weeks exhibited signs of a very mild caecal inflammation. In agreement with this weak inflammation, the variations in the bacterial proteome were small. Similar to the DSS-experiment, proteins downregulated by inflammation belong mainly to the central energy metabolism. In contrast to the DSS-experiment, no upregulation of chaperone proteins and NfuA were observed, indicating that these are strategies to overcome adverse effects of strong intestinal inflammation. The inhibitor of vertebrate C-type lysozyme, Ivy, was 2- to 3-fold upregulated on mRNA and protein level in E. coli Nissle in comparison to E. coli UNC isolated from IL-10-/- mice. By overexpressing ivy, it was demonstrated in vitro that Ivy contributes to a higher lysozyme resistance observed for E. coli Nissle, supporting the role of Ivy as a potential fitness factor in this E. coli strain. Conclusions: The results of this PhD-study demonstrate that intestinal bacteria sense even minimal changes in the health status of the host. While some bacterial adaptations to the inflammatory conditions are equal in response to strong and mild intestinal inflammation, other reactions are unique to a specific disease state. In addition, probiotic and colitogenic E. coli differ in their response to the intestinal inflammation and thereby may influence the host in different ways.
N2  - Hintergrund: Chronisch entzündliche Darmerkrankungen zeichnen sich unter anderem durch eine starke Proliferation intestinaler E. coli aus. Unbekannt ist jedoch, ob diese Vermehrung eine Ursache oder eine Folge der Erkrankung darstellt. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es daher, E. coli-Proteine zu identifizieren, welche der Anpassung an die entzündlichen Bedingungen im Darmtrakt dienen und unter Umständen einen Effekt auf den Gesundheitszustand des Wirtes haben. Weiterhin sollten die molekularen Ursachen für stammesspezifische Unterschiede zwischen probiotischen und gesundheitsschädlichen E. coli näher untersucht werden. Methoden: In den tierexperimentellen Analysen wurden keimfreie Mäuse entweder mit dem probiotischen E. coli Nissle oder dem adhärent-invasiven E. coli UNC monoassoziiert und in zwei verschiedenen Entzündungsmodellen näher untersucht. Einerseits wurde eine starke Darmentzündung durch die Gabe von 3,5% Natrium-Dextransulfat (DSS) ausgelöst. Andererseits wurde in Interleukin 10-defizienten (IL-10-/-) Mäusen eine sehr milde Form der Entzündung durch Besiedlung mit E. coli induziert. Die E. coli Bakterien wurden am Ende der Versuche aus den Caecuminhalten der Mäuse isoliert und die bakterielle Proteinexpression wurde mittels zwei-dimensionaler Gelelektrophorese analysiert. Ergebnisse des DSS-Versuchs: Alle Tiere des DSS-Versuchs entwickelten unabhängig vom E. coli Stamm, mit dem sie besiedelt waren, eine moderate Entzündung im Caecum und eine starke im Colon, wobei die Entzündungsreaktion durch die Monoassoziation mit E. coli Nissle leicht abgeschwächt wurde. In beiden E. coli Stämmen führte die Darmentzündung zu einer verringerten Expression von Enzymen des Kohlenhydratabbaus und der Energiegewinnung. In Folge dessen waren die intestinalen Konzentrationen bakterieller Fermentationsprodukte in den entzündeten Tieren geringer als in den gesunden Kontrolltieren. Weitere differentiell exprimierte Proteine umfassen das Fe-S- Cluster Reparaturprotein NfuA, die Tryptophanase TnaA und das uncharakterisierte Protein YggE. In beiden E. coli Stämmen, welche aus den DSS-Tieren isoliert wurden, war das NfuA Protein dreifach höher exprimiert. Eine Darmentzündung führt zu einer vermehrten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, welche die Fe-S-Cluster in Eisen-Schwefel-Proteinen zerstören und damit zu einer Inaktivierung dieser Proteine führen. In vitro Untersuchungen bestätigten, dass die Reparatur der Eisen-Schwefel-Proteine durch NfuA ein wichtiger Mechanismus ist um oxidativem Stress entgegenzuwirken. Das YggE Protein, welches laut Literaturangaben einen hemmenden Einfluss auf die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies hat, war in E. coli Nissle 4- bis 8-fach erhöht (verglichen mit E. coli UNC unter Kontroll- und Entzündungsbedingungen). In vitro Versuche bestätigten diese Daten und zeigten, dass E. coli Nissle im Vergleich zu E. coli UNC eine erhöhte Resistenz gegenüber oxidativem Stress aufweist. Außerdem wurde im Vergleich E. coli Nissle vs. E. coli UNC (unter Entzündungs- und Kontrollbedingungen) ein 4- bis 7-fach erhöhter TnaA-Gehalt nachgewiesen. Indol, das Produkt der TnaA-katalysierten Tryptophanspaltung wurde in erhöhten Mengen im Intestinaltrakt E. coli Nissle-assoziierter Kontrolltiere detektiert. Seit längerem werden entzündungshemmende Eigenschaften für Indol postuliert, die aufgrund der Ergebnisse dieser Doktorarbeit nun auch mit den gesundheitsfördenden Eigenschaften von E. coli Nissle in Zusammenhang gebracht werden können. Ergebnisse des IL-10-/-- Versuchs: Nach einer 8-wöchigen Assoziationsdauer wurde nur in den mit E. coli UNC besiedelten IL-10-/- Tieren eine schwache Entzündungsreaktion nachgewiesen. Bedingt durch diese sehr schwach ausgeprägte Entzündungsantwort waren auch die Veränderungen im bakteriellen Proteom von E. coli UNC nur gering. Wie im DSS-Versuch waren Proteine des bakteriellen Energiestoffwechsels reprimiert, allerdings wurde keine Induktion von NfuA beobachtet. Daher scheint die Induktion von NfuA nur der Anpassung an eine starke Entzündung zu dienen. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass E. coli Nissle aus IL-10-/- Tieren den Hemmer für das vertebrate C-Typ Lysozym (Ivy) sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene stärker exprimiert als E. coli UNC. Überexpression von Ivy unter in vitro Bedingungen zeigte, dass es an der erhöhten Lysozymresistenz von E. coli Nissle beteiligt ist und somit eine Rolle als möglicher Fitnessfaktor von E. coli Nissle spielt. Schlussfolgerungen: In dieser Doktorarbeit wurde gezeigt, dass Darmentzündungen die Proteinexpression eines im Darm lebenden Bakteriums beeinflussen. Einige der aufgedeckten bakteriellen Anpassungsreaktionen werden sowohl bei einer starken als auch bei einer schwachen Entzündung ausgelöst; andere wiederum sind spezifisch für nur einen dieser Entzündungszustände. Weiterhin wurde deutlich, dass sich E. coli-Stämme hinsichtlich ihrer Reaktion auf eine Darmentzündung unterscheiden und damit möglicherweise den Wirt beeinflussen. 
KW  - E. coli
KW  - chronisch-entzündliche Darmerkrankungen
KW  - Proteom
KW  - Ivy
KW  - Probiotika
KW  - E. coli
KW  - inflammatory bowel disease
KW  - proteomics
KW  - Ivy
KW  - probiotics
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-67757
ER  - 
TY  - THES
A1  - Mabrok, Hoda Hussein Bakr
T1  - Protective role of lignan-converting bacteria on chemically-induced breast cancer in gnotobiotic rats
T1  - Der protektive Einfluss von Lignan-aktivierenden Bakterien auf chemisch induzierten Brustkrebs im gnotobiotischen Rattenmodell
N2  - Enterolignans (enterodiol and enterolactone) exhibit structural similarity to estradiol and have therefore been hypothesized to modulate hormone related cancers such as breast cancer. The bioactivation of the plant lignan secoisolariciresinol diglucoside (SDG) requires the transformation by intestinal bacteria including the deglycosylation of SDG to secoisolariciresinol (SECO) followed by demethylation and dehydroxylation of SECO to enterodiol (ED). Finally, ED is dehydrogenated to enterolactone (EL). It is unclear whether the bacterial activation of SDG to ED and EL is crucial for the cancer preventing effects of dietary lignans. The possible protective effect of bacterial lignan transformation on a 7,12 dimethylbenz(a)anthracene (DMBA)-induced breast cancer in gnotobiotic rats was investigated. Germ-free rats were associated with a defined lignan-converting consortium (Clostridium saccharogumia, Blautia producta, Eggerthella lenta, and Lactonifactor longoviformis). The rats colonized with lignan-converting bacteria consortium (LCC) were fed a lignan-rich flaxseed diet and breast cancer was chemical induced. Identically treated germ-free rats served as control. All bacteria of the consortium successfully colonized the intestine of the LCC rats. The plant lignan SDG was converted into the enterolignans ED and EL in the LCC rats but not in the germ-free rats. This transformation did not influence cancer incidence but significantly decreased tumor numbers per tumor-bearing rat, and tumor size. Cell proliferation was significantly inhibited and apoptosis was significantly induced in LCC rats. No differences between LCC and control rats were observed in the expression of the genes encoding the estrogen receptors (ERα and ERβ) and G-coupled protein receptor 30 (GPR30). Similar findings were observed for both insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and epidermal growth factor receptor (EGFR) genes involved in tumor growth. Proteome analysis revealed that 24 proteins were differentially expressed in tumor tissue from LCC and germ-free. RanBP-type and C3HC4-type zinc finger-containing protein 1 (RBCK1) and poly(rC)-binding protein 1 (PBCP1) were down-regulated by 3.2- and 2.0-fold, respectively. These proteins are associated with cell proliferation. The activity of selected enzymes involved in the degradation of oxidants in plasma and liver was significantly increased in the LCC rats. However, plasma and liver concentrations of reduced glutathione (non-enzymatic antioxidant) and malondialdehyde (oxidative stress marker) did not differ between the groups. In conclusion, the bacterial conversion of plant lignan to enterolignans beneficially influences their anti-cancer effect. However, the mechanisms involved in these effects remain elusive.
N2  - Enterolignanen (Enterodiol ED und Enterolacton EL) wird aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit zu Estradiol ein modulierender Einfluss auf hormonell bedingte Krebserkrankungen wie Brustkrebs nachgesagt. Das pflanzliche Lignan Secoisolariciresinoldiglucosid (SDG) wird durch Darmbakterien zum Enterolignan aktiviert. Dies erfolgt über dessen Deglykosylierung zu Secoisolariciresinol (SECO) gefolgt durch die Demethylierung und die Dehydroxylierung zu Enterodiol (ED). Schließlich wird ED zu Enterolacton (EL) dehydrogeniert. Es ist allerdings noch nicht bewiesen, dass die bakterielle Aktivierung von SDG zu ED und EL für die antikanzerogenen Wirkungen verantwortlich ist, die für dieses in der menschlichen Ernährung vorkommende Lignan beschrieben wurden. Um dies zu klären, wurde der Einfluss der bakteriellen Lignan-Transformation auf die Protektion gegenüber einem durch 7,12-Dimethylbenz(a)anthracen (DMBA)-induzierten Brustkrebs im gnotobiotischen Rattenmodell untersucht. Keimfreie Ratten wurden hierfür mit einem Konsortium aus vier Bakterienstämmen (Clostridium saccharogumia, Blautia producta, Eggerthella lenta, und Lactonifactor longoviformis) besiedelt, das die Umsetzung von SDG zu ED und EL katalysiert (LCC-Ratten). Ratten, die über den gesamten Versuchszeitraum keimfrei blieben, dienten als Kontrolle. Die Tiere wurden über 16 Wochen mit einer Leinsamen-Diät gefüttert, die reich an pflanzlichen Lignanen war. Während der Fütterung wurde bei allen Tieren Brustkrebs chemisch induziert. Das pflanzliche Lignan SDG wurde nur in den LCC Ratten zu den Enterolignanen ED und EL umgewandelt. Keimfreie Ratten zeigten keine Transformation von SDG. Die bakterielle Transformation von SDG hatte zwar keinen Einfluss auf die Inzidenz von Brustkrebs, jedoch verringerten sich durch die Besiedlung der Ratten mit SDG-transformierenden Bakterien die Anzahl von Tumoren pro tumortragender Ratte und die Tumorgröße deutlich. Zudem wurde die Zellproliferation in den LCC-Ratten deutlich gehemmt und die Apoptose induziert. Unterschiede in der Genexpression der Östrogenrezeptoren (ERα und ERß) und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPR30) wurden zwischen den LCC-Ratten und den Kontrolltieren nicht beobachtet. Ebenso verhielt es sich für die Gene des Insulinähnliche Wachstumsfaktoren 1 (IGF-1) und Epidermale Wachstumsfaktor rezeptoren (EGFR), welche in das Tumorwachstum involviert sind. Die Analyse des Proteoms des Tumorgewebes ergab 24 differentiell exprimierte Proteine zwischen keimfreien und LCC-Ratten. So wurden zum Beispiel die Proteine RanBP-type and C3HC4-type zinc finger-containing protein 1 (RBCK1) und poly(rC)-binding protein 1 (PBCP1), die mit der Zellproliferation assoziiert sind, in LCC-Ratten um das 3,2 bzw. 2,0-fache herunterreguliert. Die Aktivität ausgewählter antioxidativer Enzyme in Plasma und Leber war in den LCC-Ratten im Vergleich zu den keimfreien Tieren deutlich erhöht. Allerdings unterschieden sich die Konzentrationen von reduziertem Glutathion (nichtenzymatisches Antioxidans) und Malondialdehyd (oxidativer Stress-Marker) in Plasma und Leber nicht zwischen den beiden Besiedlungs-Gruppen. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die bakterielle Umwandlung von pflanzlichen Lignanen zu Enterolignanen deren antikanzerogene Wirkung entscheidend beeinflusst. Allerdings bleiben die zugrunde liegenden Mechanismen weiterhin ungeklärt.
KW  - Pflanzliches Lignan
KW  - Enterolignanen
KW  - Lignan-umwandelnde Bakterien
KW  - Brustkrebs
KW  - Zellproliferation
KW  - Plant lignan
KW  - Enterolignans
KW  - Lignan-converting bacteria
KW  - Breast cancer
KW  - Cell proliferation
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-64933
ER  - 
TY  - THES
A1  - Rothe, Monique
T1  - Response of intestinal Escherichia coli to dietary factors in the mouse intestine
T1  - Anpassung von Escherichia coli an Ernährungsfaktoren im Intestinaltrakt der Maus
N2  - Diet is a major force influencing the intestinal microbiota. This is obvious from drastic changes in microbiota composition after a dietary alteration. Due to the complexity of the commensal microbiota and the high inter-individual variability, little is known about the bacterial response at the cellular level. The objective of this work was to identify mechanisms that enable gut bacteria to adapt to dietary factors. For this purpose, germ-free mice monoassociated with the commensal Escherichia coli K-12 strain MG1655 were fed three different diets over three weeks: a diet rich in starch, a diet rich in non-digestible lactose and a diet rich in casein. Two dimensional gel electrophoresis and electrospray tandem mass spectrometry were applied to identify differentially expressed proteins of E. coli recovered from small intestine and caecum of mice fed the lactose or casein diets in comparison with those of mice fed the starch diet. Selected differentially expressed bacterial proteins were characterised in vitro for their possible roles in bacterial adaptation to the various diets. Proteins belonging to the oxidative stress regulon oxyR such as alkyl hydroperoxide reductase subunit F (AhpF), DNA protection during starvation protein (Dps) and ferric uptake regulatory protein (Fur), which are required for E. coli’s oxidative stress response, were upregulated in E. coli of mice fed the lactose-rich diet. Reporter gene analysis revealed that not only oxidative stress but also carbohydrate-induced osmotic stress led to the OxyR-dependent expression of ahpCF and dps. Moreover, the growth of E. coli mutants lacking the ahpCF or oxyR genes was impaired in the presence of non-digestible sucrose. This indicates that some OxyR-dependent proteins are crucial for the adaptation of E. coli to osmotic stress conditions. In addition, the function of two so far poorly characterised E. coli proteins was analysed: 2 deoxy-D gluconate 3 dehydrogenase (KduD) was upregulated in intestinal E. coli of mice fed the lactose-rich diet and this enzyme and 5 keto 4 deoxyuronate isomerase (KduI) were downregulated on the casein-rich diet. Reporter gene analysis identified galacturonate and glucuronate as inducers of the kduD and kduI gene expression. Moreover, KduI was shown to facilitate the breakdown of these hexuronates, which are normally degraded by uronate isomerase (UxaC), altronate oxidoreductase (UxaB), altronate dehydratase (UxaA), mannonate oxidoreductase (UxuB) and mannonate dehydratase (UxuA), whose expression was repressed by osmotic stress. The growth of kduID-deficient E. coli on galacturonate or glucuronate was impaired in the presence of osmotic stress, suggesting KduI and KduD to compensate for the function of the regular hexuronate degrading enzymes under such conditions. This indicates a novel function of KduI and KduD in E. coli’s hexuronate metabolism. Promotion of the intracellular formation of hexuronates by lactose connects these in vitro observations with the induction of KduD on the lactose-rich diet. Taken together, this study demonstrates the crucial influence of osmotic stress on the gene expression of E. coli enzymes involved in stress response and metabolic processes. Therefore, the adaptation to diet-induced osmotic stress is a possible key factor for bacterial colonisation of the intestinal environment.
N2  - Sowohl Humanstudien als auch Untersuchungen an Tiermodellen haben gezeigt, dass die Ernährung einen entscheidenden Einfluss auf die Zusammensetzung der Darmmikrobiota hat. Aufgrund der Komplexität der Mikrobiota und der inter individuellen Unterschiede sind die zellulären Mechanismen, die dieser Beobachtung zugrunde liegen, jedoch weitgehend unbekannt. Das Ziel dieser Arbeit war deshalb, Anpassungsmechanismen von kommensalen Darmbakterien auf unterschiedliche Ernährungsfaktoren mittels eines simplifizierten Modells zu untersuchen. Dazu wurden keimfreie Mäuse mit Escherichia coli MG1655 besiedelt und drei Wochen mit einer stärkehaltigen, einer laktosehaltigen oder einer kaseinhaltigen Diät gefüttert. Mittels zwei dimensionaler Gelelektrophorese und Elektrospray Ionenfallen-Massenspektrometrie wurde das Proteom der intestinalen E. coli analysiert und differentiell exprimierte bakterielle Proteine in Abhängigkeit der gefütterten Diät identifiziert. Die Funktion einiger ausgewählter Proteine bei der Anpassung von E. coli auf die jeweilige Diät wurde im Folgenden in vitro untersucht. E. coli Proteine wie z.B. die Alkylhydroperoxid Reduktase Untereinheit F (AhpF), das DNA Bindeprotein Dps und der eisenabhängige Regulator Fur, deren Expression unter der Kontrolle des Transkriptionsregulators OxyR steht, wurden stärker exprimiert, wenn die Mäuse mit der laktosehaltigen Diät gefüttert wurden. Reportergenanalysen zeigten, dass nicht nur oxidativer Stress, sondern auch durch Kohlenhydrate ausgelöster osmotischer Stress zu einer OxyR abhängigen Expression der Gene ahpCF and dps führte. Weiterhin wiesen E. coli Mutanten mit einer Deletion der ahpCF oder oxyR Gene ein vermindertes Wachstum in Gegenwart von nicht fermentierbarer Saccharose auf. Das spricht dafür, dass OxyR abhängige Proteine eine wichtige Rolle bei der Anpassung von E. coli an osmotischen Stress spielen. Weiterhin wurde die Funktion von zwei bisher wenig charakterisierten E. coli Proteinen untersucht: die 2 Deoxy D Glukonate 3 Dehydrogenase (KduD) wurde im Darm von Mäusen, die mit der laktosehaltigen Diät gefüttert wurden, induziert, während dieses Protein und die 5 Keto 4 Deoxyuronate Isomerase (KduI) nach Fütterung der kaseinhaltigen Diät herunterreguliert wurden. Mittels Reportergenanalysen wurde gezeigt, dass Galakturonat und Glukuronat die kduD und kduI Expression induzierten. KduI begünstigte die Umsetzung dieser Hexuronate. In E. coli wird die Umsetzung von Galakturonat und Glukuronat typischerweise von den Enzymen Uronate Isomerase (UxaC), Altronate Oxidoreduktase (UxaB), Altronate Dehydratase (UxaA), Mannonate Oxidoreduktase (UxuB) und Mannonate Dehydratase (UxuA) katalysiert. Weitere Experimente verdeutlichten, dass osmotischer Stress die Expression der Gene uxaCA, uxaB und uxuAB verminderte. Darüber hinaus zeigten kduID defiziente E. coli Mutanten in Gegenwart von Galakturonat oder Glukuronat und durch Saccharose ausgelösten osmotischen Stress eine Verlangsamung des Wachstums. Das deutet darauf hin, dass KduI und KduD die durch osmotischen Stress bedingten Funktionseinschränkungen der regulären hexuronatabbauenden Enzyme kompensieren. Die beobachtete Bildung von intrazellulären Hexuronaten während des Laktosekatabolismus in vitro stellt eine Verbindung zu dem ursprünglichen Tierexperiment her und deutet darauf hin, dass der Ernährungsfaktor Laktose die Verfügbarkeit von Hexuronat für intestinale E. coli beeinflusst. Diese Studie weist somit den Einfluss von osmotischem Stress auf die Expression von OxyR abhängigen Genen, die für Stressantwortproteine sowie für metabolische Enzymen kodieren, in E. coli nach. Durch Nahrungsfaktoren entstandener osmotischer Stress stellt demnach einen entscheidenden Faktor für die bakterielle Kolonisation des Darmes dar.
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Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-66387
ER  -