TY - THES A1 - Bojahr, Juliane T1 - Aktivierung des humanen Süßgeschmacksrezeptors im zellbasierten Testsystem T1 - Human sweet taste receptor activation in cell based assay N2 - Zellbasierte heterologe Expressionssysteme bieten ein einfaches und schnelles Verfahren, um neue Süßstoffe oder Süßverstärker zu finden. Unter Verwendung eines solchen Testsystems, konnte ich in Zusammenarbeit mit der Symrise AG, Holzminden und dem Institut für Pflanzenbiochemie in Halle/Saale die vietnamesische Pflanze Mycetia balansae als Quelle eines neuen Süßstoffs identifizieren. Deren Hauptkomponenten, genannt Balansine, aktivieren spezifisch den humanen Süßrezeptor. Chimäre Rezeptoren zeigten, dass die amino-terminalen Domänen der Süßrezeptoruntereinheiten, welche ein Großteil der Liganden des Süßrezeptors binden, für dessen Aktivierung durch Balansin A nicht notwendig sind. Voraussetzung für die Anwendung zellbasierter Testsysteme zum Auffinden neuer Süßstoffe ist jedoch, dass süße Substanzen gesichert identifiziert werden, während nicht süße Substanzen zuverlässig keine Rezeptoraktivierung aufweisen. Während in HEK293 TAS1R2 TAS1R3To Galpha15i3-Zellen Süßrezeptoraktivierung gegenüber nicht süß schmeckenden Substanzen beobachtet wurde, konnte mit den HEK293PEAKrapid Galpha15-Zellen ein zuverlässiges Testsystem identifiziert, welches den Süßgeschmack der untersuchten Substanzen widerspiegelte. Es fanden sich keine Hinweise, dass akzessorische Proteine oder verwandte Rezeptoren des Süßrezeptors das unterschiedliche Verhalten der Zellen verursachen. Es konnte gezeigt werden, dass die Verwendung unterschiedlicher G-Proteine die Signalamplituden des Süßrezeptors beeinflusst, die Unterschiede zwischen den Zellsystemen jedoch nicht vollständig erklärt. Keine der untersuchten Galpha-Proteinchimären spiegelte die intrinsische Süße der Substanzen wider. Wenn auch nicht ursächlich für die Diskrepanz zwischen Süßrezeptoraktivierung in vitro und Süßgeschmack in vivo, so weisen die Ergebnisse dieser Arbeit auf eine Interaktion der Süßrezeptoruntereinheiten mit dem humanen Calcium-sensing Rezeptor hin. Vanillin und Ethylvanillin konnten als neue Agonisten des Calcium-sensing Rezeptors identifiziert werden. Wie die vorliegende Arbeit zeigt, können sich kleine Unterschiede im Zellhintergrund deutlich auf die Funktionsweise heterolog exprimierter Rezeptoren auswirken. Dies zeigt wie wichtig die Wahl der Zellen für solche Screeningsysteme ist. N2 - Screening for new sweeteners or sweet taste modulators by the use of heterologous expression systems is an easy and fast way without time- and cost-intensive sensory studies. Using such cell based expression systems we could show that the main components of the so far undescribed Vietnamese plant Mycetia balansae activate specifically the human sweet taste receptor TAS1R2-TAS1R3. Analysis of chimeric receptors revealed that the TAS1R2-TAS1R3 amino-terminal domain is not involved in the sweet taste receptor activation by balansin A, one of the main components of Mycetia balansae. The usage of such heterologous expression systems strongly depends on their predictive value, e.g. neither false-positives nor false-negatives shall occur when screening for new sweeteners. However, HEK293 TAS1R2 TAS1R3To Galpha15i3 cells showed sweet taste receptor activation for substances that were not perceived as sweet by a sensory panel. The analysis of further cell based systems revealed the HEK293PEAKrapid Galpha15 cell line as a reliable test system that reflected the sweet taste of the analyzed test compounds. These cell systems differ in their heterologously expressed G protein. Nevertheless, this does not explain the different responses of the cell systems. Although the G protein influences their signal amplitudes, none of the analyzed G protein chimeras showed an activation pattern that reflected the sweet taste of the test compounds. No indication was found that accessory proteins or related receptors like the calcium sensing receptor or the GPRC6A are responsible for the different behavior of these cell systems. First hints for an interaction of the human calcium sensing receptor and the sweet taste receptor subunits were observed. Vanillin and Ethylvanillin were identified as new calcium sensing receptor agonists. It appears as small differences in cellular background can strongly influence on the function of heterologously expressed receptors. KW - Süßrezeptor KW - Süßgeschmack KW - Süßstoff KW - Rezeptorscreening KW - sweet taste KW - sweet taste receptor KW - sweetener KW - taste receptor screening KW - HEK293 Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-93331 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Peter Michael T1 - Aktivitätsmessung auf nukleinsäuremodifizierten Oberflächen N2 - Im Bereich der medizinischen Diagnostik spielen DNA-Chips eine immer wichtigere Rolle. Dabei werden Glas- oder Silikon-Oberflächen mit Tausenden von einzelsträngigen DNA-Fragmenten, sog. Sonden, bestückt, die mit den passenden DNA-Fragmenten in der zugefügten Patientenprobe verschmelzen. Die Auswertung solcher Messungen liefert die Diagnose für Krankheiten wie z.B. Krebs, Alzheimer oder für den Nachweis pathogener Erreger. Durch fortschreitende Miniaturisierung dieser Meßsysteme können bis zu 40.000 Genfragmente des Menschen in einer einzigen Messung analysiert werden. Neben den DNA-Fragmenten können Bio-Chips auch für andere biologische Komponenten wie Antikörper und Proteine eingesetzt werden, wobei bei letzteren neben der Bindung auch die Aktivität ein wichtiger Diagnoseparamter ist. Am Fraunhofer-Institut für medizinische Technik und am Lehrstuhl für Analytische Biochemie der Universität Potsdam wurden im Rahmen einer Doktorarbeit Methoden entwickelt, die es ermöglichen auf nukleinsäuremodifizierten Sensoroberflächen die Aktivität von Proteinen zu messen. Es wurden Nukleinsäuren auf Oberflächen optischer Sensoren verankert. Diese fungierten als Rezeptor für die Proteine sowie auch als Substrat für Restriktionsenzyme, die Nukleinsäuren schneiden und Polymerasen, die Nukleinsäuren synthetisieren und verlängern können. Seine Anwendung fand diese Messmethode in der Messung der Aktivität des Proteins Telomerase, das in 90% aller Tumore erhöhte Aktivität gegenüber gesunden Zellen aufweist. Die Vorteile dieses neuen Assays gegenüber älteren Methoden liegt im Verzicht auf radioaktiv-markierten Komponenten und einer deutlich verkürzten Analysezeit. Die Arbeit schliesst mit einem funktionsfähigen Nachweis der Telomeraseaktivität im Zellextrakt von gesunden und kranken Zellen. Der direkte Einfluß von Hemmstoffen auf die Aktivität konnte sichtbar gemacht werden, und steht daher bei der Entwicklung neuer Tumor-Diagnostika und Therapeutika zur Verfügung. N2 - In the field of medical diagnostic the importance of DNA chips is growing continuously. On silica surfaces hundreds of single stranded DNA fragments are immobilised which finally detect the complementary sequences in samples of patients by hybridisation. These methods enable the detection of serious diseases as cancer, Alzheimer's disease or infection by pathogens. Biomolecules as nucleic acids, antibodies and proteins can be used as receptors on the solid surfaces whereas in case of proteins not only the binding but also the activity are of high interest for medical diagnosis. In this thesis a biosensoric approach has been developed to determine the activity of nucleic-acid modifying enzymes. Optical sensors as, e.g., the grating coupler, were used to monitor the association and dissociation of unlabeled compounds on the sensor surface in real time, by virtue of evanescent-field. Furthermore sensors based on total internal reflection fluorescence measured the activity of restriction enzymes and polymerases. The general approach included the immobilisation of oligonucleotides which acted as the receptor for the enzymes as well as the substrate for the enzymatic reaction. Enzymes as EcoRI and Klenow were used to establish a model system to measure the activity of DNA-modifying enzymes on optical surfaces. As most nucleic acid detection systems use amplification steps such as polymerase chain reaction (PCR) to increase the amount of the probe the new optical systems facilitated the analysis of the enzymatic activity by measuring the DNA-synthesis or restriction directly. These systems were finally used to detect the activity of the telomerase, an enzymatic marker for the cancerous development of cells. In 90% of cancer cells the activity of telomerase is higher than in normal cells. Additionally the increase of the telomerase activity in cells induced by carcinogenic substances was detected. Furthermore no purification steps of the samples were required as all measurements were performed with crude cell extract. Also the effect of inhibitors of the telomerase could be shown in real time measurements underlining the potential of this assay for further developments of new cancer therapeutics. KW - Aktivitätsmessung KW - optische Biosensoren KW - Nukleinsäuren KW - Telomerase KW - Telomerase KW - TRAP-assay KW - fibre optic KW - G-quartettes KW - grating coupler KW - on-chip enzymatic assay Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000797 ER - TY - THES A1 - Blenau, Wolfgang T1 - Aminerge Signaltransduktion bei Insekten T1 - Aminergic signal transduction in insects N2 - Biogene Amine sind kleine organische Verbindungen, die sowohl bei Wirbeltieren als auch bei Wirbellosen als Neurotransmitter, Neuromodulatoren und/oder Neurohormone wirken können. Sie bilden eine bedeutende Gruppe von Botenstoffen und entfalten ihre Wirkungen über die Bindung an eine bestimmte Klasse von Rezeptorproteinen, die als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bezeichnet werden. Bei Insekten gehören zur Substanzklasse der biogenen Amine die Botenstoffe Dopamin, Tyramin, Octopamin, Serotonin und Histamin. Neben vielen anderen Wirkung ist z.B. gezeigt worden, daß einige dieser biogenen Amine bei der Honigbiene (Apis mellifera) die Geschmacksempfindlichkeit für Zuckerwasser-Reize modulieren können. Ich habe verschiedene Aspekte der aminergen Signaltransduktion an den „Modellorganismen“ Honigbiene und Amerikanische Großschabe (Periplaneta americana) untersucht. Aus der Honigbiene, einem „Modellorganismus“ für das Studium von Lern- und Gedächtnisvorgängen, wurden zwei Dopamin-Rezeptoren, ein Tyramin-Rezeptor, ein Octopamin-Rezeptor und ein Serotonin-Rezeptor charakterisiert. Die Rezeptoren wurden in kultivierten Säugerzellen exprimiert, um ihre pharmakologischen und funktionellen Eigenschaften (Kopplung an intrazelluläre Botenstoffwege) zu analysieren. Weiterhin wurde mit Hilfe verschiedener Techniken (RT-PCR, Northern-Blotting, in situ-Hybridisierung) untersucht, wo und wann während der Entwicklung die entsprechenden Rezeptor-mRNAs im Gehirn der Honigbiene exprimiert werden. Als Modellobjekt zur Untersuchung der zellulären Wirkungen biogener Amine wurden die Speicheldrüsen der Amerikanischen Großschabe genutzt. An isolierten Speicheldrüsen läßt sich sowohl mit Dopamin als auch mit Serotonin Speichelproduktion auslösen, wobei Speichelarten unterschiedlicher Zusammensetzung gebildet werden. Dopamin induziert die Bildung eines völlig proteinfreien, wäßrigen Speichels. Serotonin bewirkt die Sekretion eines proteinhaltigen Speichels. Die Serotonin-induzierte Proteinsekretion wird durch eine Erhöhung der Konzentration des intrazellulären Botenstoffs cAMP vermittelt. Es wurden die pharmakologischen Eigenschaften der Dopamin-Rezeptoren der Schaben-Speicheldrüsen untersucht sowie mit der molekularen Charakterisierung putativer aminerger Rezeptoren der Schabe begonnen. Weiterhin habe ich das ebony-Gen der Schabe charakterisiert. Dieses Gen kodiert für ein Enzym, das wahrscheinlich bei der Schabe (wie bei anderen Insekten) an der Inaktivierung biogener Amine beteiligt ist und im Gehirn und in den Speicheldrüsen der Schabe exprimiert wird. N2 - Biogenic amines are small organic compounds that act as neurotransmitters, neuromodulators and/or neurohormones in vertebrates and in invertebrates. They form an important group of messenger substances and mediate their diverse effects by binding to membrane receptors that primarily belong to the large gene-family of G protein-coupled receptors. In insects, the group of biogenic amine messengers consists of five members: dopamine, tyramine, octopamine, serotonin, and histamine. Besides many other effects, some of these biogenic amines were shown, for example, to modulate gustatory sensitivity to sucrose stimuli in the honeybee (Apis mellifera). I have investigated various aspects of the aminergic signal transduction in the “model organisms” honeybee and American cockroach (Periplaneta americana). So far, I have characterized two dopamine receptors, a tyramine receptor, an octopamine receptor and a serotonin receptor of the honeybee, which is well-known for its learning and memory capacities. The receptors where expressed in cultivated mammalian cells in order to analyze their pharmacological and functional (i.e., second messenger coupling) properties. The spatiotemporal expression patterns of the respective receptor mRNA were investigated in the honeybee brain by using different techniques (RT PCR, Northern blotting, in situ-hybridization). The salivary glands of the American cockroach were used as a model object in order to investigate the cellular effects of biogenic amines. Both dopamine and serotonin trigger salivary secretion in isolated salivary glands. The quality of the secreted saliva is, however, different. Stimulation of the glands by serotonin results in the production of a protein-rich saliva, whereas stimulation by dopamine results in saliva that is protein-free. Serotonin-induced protein secretion is mediated by an increase in the intracellular concentration of cAMP. The pharmacological properties of dopamine receptors associated with cockroach salivary glands were investigated and the molecular characterization of putative aminergic receptors of the cockroach was initiated. Furthermore, I have characterized the ebony gene of the cockroach. This gene encodes an enzyme that is probably involved in the inactivation of biogenic amines in the cockroach (as in other insects). The ebony gene is expressed in the brain and in the salivary glands of the cockroach. KW - Neurotransmitter-Rezeptor KW - Dopamin KW - Tyramin KW - Octopamin KW - Serotonin KW - Insekten KW - Biene KW - Amerikanische Schabe KW - Biogene Amine KW - G-Protein-gekoppelte-Rezeptoren KW - biogenic amines KW - G protein-coupled receptors KW - honeybee KW - salivary gland Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-7568 ER - TY - THES A1 - Radon, Christin T1 - Analyse der Funktion der dualen Lokalisation der 3-Mercaptopyruvat Sulfurtransferase im Menschen Y1 - 2017 ER - TY - THES A1 - Himmel, Mirko T1 - Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen und der in vivo Phosphorylierung des Sarkomerproteins Myomesin T1 - Analysis of Protein-Protein Interactions and in vivo Phosphorylation of the Sarcomeric Protein Myomesin N2 - Für ein tiefergehendes Verständnis von Entwicklung und Funktion der quergestreiften Muskulatur ist eine Betrachtung der am Aufbau der Myofibrillen, den kontraktilen Organellen, beteiligten Proteine essentiell. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Myomesin, einem Protein der sarkomeren M-Bande. Zunächst wurde die cDNA des humanen Myomesins vollständig kloniert, sequenziert und nachfolgend die komplette Größe der aminoterminalen Kopfdomäne bestimmt. Es konnte gezeigt werden, daß Myomesin in vitro mit den Domänen 1 und 12 an Myosin bindet. Die muskelspezifische Isoform der Kreatinkinase bindet an die Domänen 7 und 8. Stimulations- und Inhibitionsexperimente belegen, daß Myomesin an Serin 618 in vivo durch die Proteinkinase A phosphoryliert wird und daß diese Phosphorylierung durch Aktivierung beta2-adrenerger Rezeptoren stimulierbar ist. In Muskelgewebeproben von Patienten, die an der Hypertrophen Kardiomyopathie, einer genetisch bedingten Herzmuskelkrankheit, erkrankt sind, konnte mit einem neu hergestellten phosphorylierungsabhängigen Antikörper eine Verminderung der Menge phosphorylierten Myomesins nachgewiesen werden. Mögliche Ursachen werden diskutiert. Myomesin bildet Dimere, wie durch hefegenetische und biochemische Experimente gezeigt werden konnte. Die Dimerisierung von Myomesin könnte eine zentrale Rolle für den Einbau der Myosinfilamente in die naszierende Myofibrille haben. Anhand der gewonnenen Daten wurde ein verbessertes Modell der zentralen M-Bande erstellt. N2 - A deep understanding of the development and function of the sarcomeric muscle depends on the careful study of proteins involved in the assembly of myofibrills, the contractile organelles in cross-striated muscle. This thesis deals with the sarcomeric M-band protein myomesin. First, the complete cDNA of human myomesin was cloned, sequenced, and subsequently the size of the aminoterminal head domain of myomesin was determined. Myomesin binds to myosin in vitro via domains 1 and 12. Musclespecific creatine kinase is binding to the domains 7 and 8 of myomesin. Stimulation and inhibition experiments revealed, that serin 618 in human myomesin is phosphorylated in vivo by protein kinase A and that this phosphorylation can be stimulated by activation of beta2-adrenergic receptors. In muscle tissue of patients showing symptoms of the hypertrophic cardiomyopathy, a cardiac disease caused by genetic defects, the amount of phosphorylated myomesin was lowered as detected by a phosphospecific antibody which was established new. Myomesin dimerizes as shown by yeast two hybrid and biochemical experiments. Myomesin dimerization could be a central point in myofibrillogenesis, when myosin filaments were incorporated in nascent myofibrills. Taking all the data together, an improved model of the central M-band was developed. KW - Proteine KW - Myofibrille KW - Sarkomer KW - Phosphorylierung KW - M-Bandenmodell KW - PKA KW - M-band model KW - PKA Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5153 ER - TY - THES A1 - Schwonbeck, Susanne T1 - Analyse von Single Nucleotide Polymorphisms an Glas-Oberflächen N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer SNP-Genotypisierungsmethode mit auf Mikroarrays immobilisierten PCR-Produkten. Für die Analyse wurde ein faseroptischer Affinitätssensor bzw. ein Durchfluss-Biochip-Scanner mit integrierter Fluoreszenzdetektion verwendet. An den immobilisierten Analyten (PCR-Produkten) wurde eine Fluoreszenzoligonukleotidsonde hybridisiert und anschließend die Dissoziation der Sonde im Fluss verfolgt. Die Diskriminierung von Wildtyp- und Mutanten-DNA erfolgte durch die kinetische Auswertung der Dissoziationskurven sowie durch die Analyse der Fluoreszenzintensität. Die Versuche am faseroptischen Affinitätssensor zeigten, dass DNA-DNA-Hybride sowohl von Oligonukleotiden als auch von PCR-Produkten ein typisches Dissoziationsverhalten aufweisen, wobei fehlgepaarte Hybride eine signifikant schnellere Dissoziation zeigen als perfekt passende Hybride. Dieser Geschwindigkeitsunterschied lässt sich durch den Vergleich der jeweiligen kinetischen Geschwindigkeitskonstanten kD quantitativ erfassen. Da die Kopplung des Analyten an der Chipoberfläche sowie die Hybridisierungs- und Dissoziationsparameter essentiell für die Methodenentwicklung war, wurden die Parameter für ein optimales Spotting und die Immobilisierung von PCR-Produkten ermittelt. Getestet wurden die affine Kopplung von biotinylierten PCR-Produkten an Streptavidin-, Avidin- und NeutrAvidin-Oberflächen sowie die kovalente Bindung von phosphorylierten Amplifikaten mit der EDC/Methylimidazol-Methode. Die besten Ergebnisse sowohl in Spotform und -homogenität als auch im Signal/Rausch-Verhältnis wurden an NeutrAvidin-Oberflächen erreicht. Für die Etablierung der Mikroarray-Genotypisierungsmethode durch kinetische Analyse nach einem Hybridisierungsexperiment wurden Sondenlänge, Puffersystem, Spotting-Konzentration des Analyten sowie Temperatur optimiert. Das Analysensystem erlaubte es, PCR-Produkte mit einer Konzentration von 250 ng/µl in einem HEPES-EDTA-NaCl-Puffer auf mit NeutrAvidin beschichtete Glasträger zu spotten. In den anschließenden Hybridisierungs- und Dissoziationsexperimenten bei 30 °C konnte die Diskriminierung von homocygoter Wildtyp- und homocygoter Mutanten- sowie heterocygoter DNA am Beispiel von Oligonukleotid-Hybriden erreicht werden. In einer Gruppe von 24 homocygoten Patienten wurde ein Polymorphismus im SULT1A1-Gen analysiert. Sowohl durch kinetische Auswertung als auch mit der Analyse der Fluoreszenzintensität wurde der Genotyp der Proben identifiziert. Die Ergebnisse wurden mit dem Referenzverfahren, der Restriktionschnittstellenanalyse (PCR-RFLP) validiert. Lediglich ein Genotyp wurde falsch bestimmt, die Genauigkeit lag bei 96%. In einer Gruppe von 44 Patienten wurde der Genotyp eines SNP in der Adiponectin-Promotor-Region untersucht. Nach Vergleich der Analysenergebnisse mit denen eines Referenzverfahrens konnten lediglich 14 der untersuchten Genotypen bestätigt werden. Ursache für die unzureichende Genauigkeit der Methode war vor allem das schlechte Signal/Rausch-Verhältnis. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das in dieser Arbeit entwickelte Analysesystem für die Genotypisierung von Einzelpunktmutationen geeignet ist, homocygote Patientenproben zuverlässig zu analysieren. Prinzipiell ist das auch bei heterocygoter DNA möglich. Da nach aktuellem Kenntnisstand eine SNP-Analysemethode an immobilisierten PCR-Produkten noch nicht veröffentlicht wurde, stellt das hier entwickelte Verfahren eine Alternative zu bisher bekannten Mikroarray-Verfahren dar. Als besonders vorteilhaft erweist sich der reverse Ansatz der Methode. Der hier vorgestellte Ansatz ist eine kostengünstigere und weniger hoch dimensionierte Lösung für Fragestellungen beispielsweise in der Ernährungswissenschaft, bei denen meist eine mittlere Anzahl Patienten auf nur einige wenige SNPs zu untersuchen ist. Wenn es gelingt, durch die Weiterentwicklung der Hardware bzw. weiterer Optimierung, eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses und damit die Diskriminierung von heterocygoter DNA zu erreichen, kann diese Methode zukünftig bei der Analyse von mittelgroßen Patientengruppen alternativ zu anderen Genotypisierungsmethoden verwendet werden. N2 - The aim of this thesis was the development of a SNP genotyping method involving PCR products immobilised on microarrays. For the analysis a fibre optic affinity biosensor and a flow-through biochip scanner were used. Fluorescent probes were hybridized with the immobilised PCR products. In order to start the dissociation process the surface was rinsed with buffer and the fluorescence intensity was measured. Two different cases were studied: First, the full-matched DNA hybrid (wildtyp single strand with complementary wildtype single strand), second the mis-matched hybrid (wildtype single strand and mutant single strand). After determinating the reaction rates (kD) as kinetic parameter the kD values of both cases were compared. The experiments showed a significant difference in the kD value of the full- and the mis-match hybrids. Therefore, mutant and wildtype DNA were discriminated by kinetic analysis of the dissociation process and analysis of the fluorescence intensity. To set up the complete analysis process the reaction parameters like coupling of the PCR products had to be optimised. Both affininty coupled (streptavidin, neutravidin, avidin - biotin) and covalent methods (EDC/methylimidazol) were carried out. Best results in spot homogeinity and spot appearance were obtained with coupling of biotinylated PCR products on neutravidin coated chip surfaces. Additionally, the length of the probe, the spotting concentration, the spotting buffer and the reaction temperature were optimised. In the optimised analysis PCR products (250 µg/µl) were spotted onto neutravidin coated surfaces. The hybridisation and dissociation processes were carried out at 30°C. A HEPES-EDTA-NaCl buffer was used for spotting, diluting of the fluorescent probe and rinsing the microarray surface. A fluorescent probe was used with 13 nucleotides in length. The mis- or full-matching base indicating the polymorphism was located in the center position of the probe. The analysis system was tested with the genomic DNA of a group of 24 homocygote individuals with a SNP in the SULT1A1 gene region. The hybridisation and dissociation processes were carried out and the reaction rates were determinated. Subsequently after the analysis in the flow-through biochip scanner the fluorescence intensity of the spots were measured. The results showed very good comparability with results of a PCR-RFLP analysis (one false genotype). Additionally, a group of 44 heterocygote DNA samples with one SNP in the adiponectin promotor region were also genotyped. Compared to a reference method only 14 genotypes were correctly determined. This was mostly due to a low signal-noise-ratio and needs to be further investigated. Besides the problem in analysing heterocygote DNA samples the developed analysis system is very useful for genotyping SNP in homocygote DNA samples. The successful analysis of heterocygote sample is principally possible and with further investigations/optimisation, a better analysis should be possible. The most important advantage of the developed method is the reverse approach of binding PCR products at the surface instead of oligonucleotides. This allows the parallel genotyping of several individuals. Other advantages include low costs and medium sized dimensions in terms of throughput. KW - Einzelbasenaustausch KW - SNP KW - Mikrochip KW - DNA-Chip KW - SULT1A1 KW - Adiponectin KW - kinetische Analyse KW - Dissoziation KW - Durchfluß-Biochip-Scanner KW - Fließsystem KW - single nucleotide polymorphisms KW - SNP KW - microarray KW - DNA KW - kinetic analysis KW - dissociation KW - SULT1A1 KW - flow-through biochip scanner Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001853 ER - TY - THES A1 - Neuber, Corinna T1 - Analytik zur Biotransformation des Sphingosin 1-phosphat-abbauproduktes (2E)-Hexadecenal Y1 - 2017 ER - TY - THES A1 - Maier, Natalia T1 - Aufbau eines Testsystems zum Nachweis von Ethylglucuronid (EtG) in Haaren Y1 - 2016 ER - TY - THES A1 - Geisendörfer, Birte T1 - Autologer Ansatz zur Entwicklung von 2D- und 3D-Kokultivierungsmethoden für die Bestimmung des sensibilisierenden Potenzials von Xenobiotika N2 - Die allergische Kontaktdermatitis ist eine immunologisch bedingte Hauterkrankung mit insbesondere in den westlichen Industrienationen hoher und weiter ansteigender Prävalenz. Es handelt sich hierbei um eine Hypersensitivitätsreaktion vom Typ IV, die sich nach Allergenkontakt durch Juckreiz, Rötung, Bläschenbildung und Abschälung der Haut äußert. Zahlreiche Xenobiotika besitzen das Potenzial, Kontaktallergien auszulösen, darunter Konservierungsstoffe, Medikamente, Duftstoffe und Chemikalien. Die wirksamste Maßnahme zur Eindämmung der Erkrankung ist die Expositionsprophylaxe, also die Vermeidung des Kontakts mit den entsprechenden Substanzen. Dies wiederum setzt die Kenntnis des jeweiligen sensibilisierenden Potenzials einer Substanz voraus, dessen Bestimmung aus diesem Grund eine hohe toxikologische Relevanz besitzt. Zu diesem Zweck existieren von der OECD veröffentlichte Testleitlinien, welche auf entsprechend validierten Testmethoden basieren. Goldstandard bei der Prüfung auf hautsensibilisierendes Potenzial war über lange Zeit der murine Lokale Lymphknotentest. Seit der 7. Änderung der EU-Kosmetikrichtlinie, welche Tierversuche für Kosmetika und deren Inhaltsstoffe untersagt, wurden vermehrt Alternativmethoden in die OECD-Testleitlinien implementiert.. Die bestehenden in vitro Methoden sind jedoch alleinstehend nur begrenzt aussagekräftig, da sie lediglich singuläre Mechanismen bei der Entstehung einer Kontaktallergie abbilden. Die Entwicklung von Testmethoden, welche mehrere dieser Schlüsselereignisse berücksichtigen, erscheint daher richtungsweisend. Einen vielversprechenden Ansatz liefert hierbei der Loose-fit coculture-based sensitisation assay (LCSA), welcher eine Kokultur aus primären Keratinozyten und PBMC darstellt. Bei der Kokultivierung von Immunzellen mit anderen Zelltypen stellt sich allerdings die Frage, inwiefern die Nutzung von Zellen derselben Spender*innen (autologe Kokultur) bzw. verschiedener Spender*innen (allogene Kokultur) einen Einfluss nimmt. Zu diesem Zweck wurden im Rahmen dieser Arbeit Hautzellen spenderspezifisch aus gezupften Haarfollikeln isoliert und der LCSA mit den generierten HFDK in autologen und allogenen Ansätzen verglichen. Zusätzlich wurde auch ein Vergleich zwischen der Nutzung von HFDK und NHK, welche aus humaner Vorhaut isoliert wurden, im LCSA durchgeführt. Dabei ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen autologen und allogenen Kokulturen bzw. zwischen der Verwendung von HFDK und NHK. Die Verwendung allogener Zellen aus anonymem Spendermaterial sowie die Nutzung von Keratinozyten aus unterschiedlichen Quellen scheint im Rahmen des LCSA problemlos möglich. Einige der getesteten Kontaktallergene, darunter DNCB und NiCl2, erwiesen sich im LCSA jedoch als problematisch und konnten nicht zufriedenstellend als sensibilisierend detektiert werden. Daher wurde eine Optimierung der Kokultur durch Verwendung ex vivo differenzierter Langerhans Zellen (MoLC) angestrebt, welche ein besseres Modell primärer epidermaler Langerhans Zellen darstellen als die dendritischen Zellen aus dem LCSA. Zusätzlich wurden weitere, den Erfolg der Kokultur beeinflussende Faktoren, wie die Art und Zusammensetzung des Mediums und die Kokultivierungsdauer, untersucht und angepasst. Das schlussendlich etablierte Kokultivierungsprotokoll führte zu einer maßgeblich verstärkten Expression von CD207 (Langerin) auf den MoLC, was auf eine wirkungsvolle Interaktion zwischen Haut- und Immunzellen in der Kokultur hindeutete. Des Weiteren konnten DNCB und NiCl2 im Gegensatz zum LCSA durch Verwendung des kostimulatorischen Moleküls CD86 sowie des Reifungsmarkers CD83 als Ausleseparameter eindeutig als Kontaktallergene identifiziert werden. Die Untersuchungen zur Kokultur von MoLC und HFDK wurden jeweils vergleichend in autologen und allogenen Ansätzen durchgeführt. Ähnlich wie beim LCSA kam es aber auch hier zu keinen signifikanten Unterschieden, weder hinsichtlich der Expression von Charakterisierungs- und Aktivierungsmarkern auf MoLC noch hinsichtlich der Zytokinsekretion in den Zellkulturüberstand. Die Hinweise aus zahlreichen Studien im Mausmodell, dass Zellen des angeborenen Immunsystems zur Erkennung von und Aktivierung durch allogene Zellen bzw. Gewebe in der Lage sind, bestätigten sich im Rahmen dieser Arbeit dementsprechend nicht. Aus diesem Grund wurden abschließend CD4+ T-Lymphozyten, die Effektorzellen des adaptiven Immunsystems, in die Kokultur aus MoLC und autologen bzw. allogenen HFDK integriert. Überraschenderweise traten auch hier keine verstärkten Aktivierungen in allogener Kokultur im Vergleich zur autologen Kokultur auf. Die Nutzung autologer Primärzellen scheint im Rahmen der hier getesteten Methoden nicht notwendig zu sein, was die Validierung von Kokulturen und deren Implementierung in die OECD-Testleitlinien erleichtern dürfte. Zuletzt wurde eine Kokultivierung primärer Haut- und Immunzellen auch im 3D-Vollhautmodell durchgeführt, wobei autologe MoLC in die Epidermisäquivalente entsprechender Modelle integriert werden sollten. Obwohl die erstellten Hautmodelle unter Verwendung autologer Haarfollikel-generierter Keratinozyten und Fibroblasten eine zufriedenstellende Differenzierung und Stratifizierung aufwiesen, gestaltete sich die Inkorporation der MoLC als problematisch und konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht erreicht werden. KW - Kontaktallergie KW - Langerhans Zellen KW - Alternativmethoden KW - Kokultur KW - Hautmodell Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Borschewski, Aljona T1 - Bedeutung der Interaktion von Calcineurin und SORLA für die Regulation des Na⁺,K⁺,2Cl⁻-Kotransporters (NKCC2) in der Niere T1 - Importance of the interaction between calcineurin and SORLA for the regulation of the renal Na⁺-K⁺-2Cl⁻−cotransporter (NKCC2) N2 - Der Na⁺-K⁺-2Cl⁻-Kotransporter (NKCC2) wird im distalen Nephron der Niere exprimiert. Seine Verteilung umfasst die Epithelien der medullären und kortikalen Teile der dicken aufsteigenden Henle-Schleife (Thick ascending limb, TAL) und die Macula densa. Resorptiver NaCl-Transport über den NKCC2 dient dem renalen Konzentrierungsmechanismus und reguliert systemisch auch Volumenstatus und Blutdruck. Die Aktivität des NKCC2 ist mit der Phosphorylierung seiner N-terminalen Aminosäurereste Serin 126 und Threonin 96/101 verbunden. Vermittelt wird diese durch die homologen Kinasen SPAK (SPS-related proline/alanine-rich kinase) und OSR1 (Oxidative stress responsive kinase 1), die hierzu ihrerseits phosphoryliert werden müssen. Der regulatorische Kontext dieser Kinasen ist mittlerweile gut charakterisiert. Über Mechanismen und Produkte, die den NKCC2 deaktivieren, war hingegen weniger bekannt. Ziel der Arbeit war daher zu untersuchen, welche Wege zur Deaktivierung des Transporters führen. Der intrazelluläre Sortierungsrezeptor SORLA (Sorting-protein-related receptor with A-type repeats) war zuvor in seiner Bedeutung für das Nephron charakterisiert worden. Ein SORLA-defizientes Mausmodell weist unter anderem eine stark verringerte NKCC2-Phosphorylierung auf. Unter osmotischem Stress können SORLA-defiziente Mäuse ihren Urin weniger effizient konzentrieren. Meine Resultate zeigen mit hochauflösender Technik, dass SORLA apikal im TAL lokalisiert ist und dass mit NKCC2 eine anteilige Kolokalisation besteht. Unter SORLA Defizienz war die für die NKCC2 Aktivität maßgebliche SPAK/OSR1-Phosphorylierung gegenüber dem Wildtyp nicht verändert. Jedoch war die ebenfalls im TAL exprimierte Phosphatase Calcineurin Aβ (CnAβ) per Western blot um das zweifache gesteigert. Parallel hierzu wurde immunhistochemisch die Kolokalisation von verstärktem CnAβ-Signal und NKCC2 bestätigt. Beide Befunde geben zusammen den Hinweis auf einen Bezug zwischen der reduzierten NKCC2-Phosphorylierung und der gesteigerten Präsenz von CnAβ bei SORLA Defizienz. Die parallel induzierte Überexpression von SORLA in HEK-Zellen zeigte entsprechend eine Halbierung der CnAβ Proteinmenge. SORLA steuert demzufolge sowohl die Abundanz als auch die zelluläre Verteilung der Phosphatase. Weiterhin ließ sich die Interaktion zwischen CnAβ und SORLA (intrazelluläre Domäne) mittels Co-Immunpräzipitation bzw. GST-pulldown assay nachweisen. Auch die Interaktion zwischen CnAβ und NKCC2 wurde auf diesem Weg belegt. Da allerdings weder SORLA noch NKCC2 ein spezifisches Bindungsmuster für CnAβ aufweisen, sind vermutlich intermediäre Adapterproteine bei ihrer Bindung involviert. Die pharmakologische Inhibition von CnAβ mittels Cyclosporin A (CsA; 1 h) führte bei SORLA Defizienz zur Normalisierung der NKCC2-Phosphorylierung. Entsprechend führte in vitro die Gabe von CsA bei TAL Zellen zu einer 7-fach gesteigerten NKCC2-Phosphorylierung. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Phosphatase CnAβ über ihre Assoziation mit NKCC2 diesen im adluminalen Zellkompartiment deaktivieren kann. Gesteuert wird dieser Vorgang durch die Eigenschaft von SORLA, CnAβ apikal zu reduzieren und damit die adluminale Phosphorylierung und Aktivität von NKCC2 zu unterstützen. Da Calcineurin-Inhibitoren derzeit die Grundlage der immunsupprimierenden Therapie darstellen, haben die Ergebnisse eine klinische Relevanz. Angesichts der Co-Expression von SORLA und CnAβ in verschiedenen anderen Organen können die Ergebnisse auch über die Niere hinaus Bedeutung erlangen. N2 - The Na⁺-K⁺-2Cl⁻-cotransporter (NKCC2) of the thick ascending limb (TAL) is critical for renal salt handling. Activity of the cotransporter is facilitated by its phosphorylation at conserved N-terminal threonine and serine residues provided by homologous SPAK (SPS-related proline/alanine-rich kinase) and OSR1 (oxidative stress responsive kinase 1) kinases. The identification of factors which modulate the phosphorylation and hence, the activity of NKCC2 has received recent interest. SORLA (sorting-protein-related receptor with A-type repeats) is co-expressed with NKCC2 in TAL epithelium. Genetically engineered mice lacking SORLA show near-complete absence of NKCC2 phosphorylation at the SPAK/OSR1-dependent phosphoacceptors, indicating that SORLA acts as a mediator between these reaction partners, possibly by a cellular trafficking step involving additional molecules. The present study addresses molecular pathways modulating NKCC2 activity by phosphorylation or dephosphorylation reactions with a special focus on SORLA. Comparative evaluation of SORLA-deficient and wild-type mouse kidneys revealed similar levels of phosphorylated, catalytically active SPAK and OSR1 kinases, whereas abundance of the phosphatase calcineurin Aβ (CnAβ) was increased by approximately two-fold in the renal medulla of SORLA-deficient mice likely reflecting changes in TAL. In line with this, confocal microscopy revealed accumulation of CnAβ in the apical compartment of TAL in SORLA-deficient kidneys. In contrast, overexpression of SORLA in HEK cells resulted in approximately two-fold decreased CnAβ levels suggesting that SORLA modulates both the cellular abundance and distribution of the phosphatase. This data was further corroborated by co-immunoprecipitation and GST pull down assays which showed an interaction between the cytoplasmic tail of SORLA and CnAβ. Acute administration of the calcineurin inhibitor, cyclosporin A (CsA), for 1 h rapidly normalized NKCC2 phosphorylation in SORLA-deficient mice which demonstrates that the decrease in phospho-NKCC2 was functionally related with CnAβ. In sum, our data elucidate the role of calcineurin in the regulation of NKCC2 and establish SORLA as an endogenous regulator of the phosphatase. KW - Salztransport KW - Niere KW - Henlesche Schleife KW - Calcineurin KW - Phosphatase KW - SORLA KW - Calcineurin-Inhibitoren KW - Transporteraktivierung KW - Phosphorylierung KW - kidney KW - phosphorylation KW - thick ascending limb KW - epithelial salt transport KW - calcineurin inhibitors KW - cell signaling Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-89205 ER - TY - THES A1 - Becker, Marion T1 - Bedeutung eines hydrophoben Seitenkettenstapels für Stabilität, Faltung und Struktur des P22 Tailspikeproteins T1 - Importance of a hydrophobic side chain stack for stability, folding and structure of the P22 tailspike protein N2 - Das homotrimere Tailspikeadhäsin des Bakteriophagen P22 ist ein etabliertes Modellsystem, dessen Faltung, Assemblierung und Stabilität in vivo und in vitro umfassend charakterisiert ist. Das zentrale Strukturmotiv des Proteins ist eine parallele beta-Helix mit 13 Windungen, die von einer N‑terminalen Kapsidbindedomäne und einer C‑terminalen Trimerisierungsdomäne flankiert wird. Jede Windung beinhaltet drei kurze beta-Stränge, die durch turns und loops unterschiedlicher Länge verbunden sind. Durch den sich strukturell wiederholenden, spulenförmigen Aufbau formen beta-Stränge benachbarter Windungen elongierte beta-Faltblätter. Das Lumen der beta-Helix beinhaltet größtenteils hydrophobe Seitenketten, welche linear und sehr regelmäßig entlang der Längsachse gestapelt sind. Eine hoch repetitive Struktur, ausgedehnte beta-Faltblätter und die regelmäßige Anordnung von ähnlichen oder identischen Seitenketten entlang der beta-Faltblattachse sind ebenfalls typische Kennzeichen von Amyloidfibrillen, die bei Proteinfaltungskrankheiten wie Alzheimer, der Creutzfeld-Jakob-Krankheit, Chorea Huntington und Typ-II-Diabetes gebildet werden. Es wird vermutet, dass die hohe Stabilität des Tailspikeproteins und auch die der Amyloidfibrille durch Seitenkettenstapelung, einem geordneten Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen und den rigiden, oligomeren Verbund bedingt ist. Um den Einfluss der Seitenkettenstapelung auf die Stabilität, Faltung und Struktur des P22 Tailspikeproteins zu untersuchen, wurden sieben Valine in einem im Lumen der beta-Helix begrabenen Seitenkettenstapel gegen das kleinere und weniger hydrophobe Alanin und das voluminösere Leucin substituiert. Der Einfluss der Mutationen wurde anhand zweier Tailspikevarianten, dem trimeren, N‑terminal verkürzten TSPdeltaN‑Konstrukt und der monomeren, isolierten beta-Helix Domäne analysiert. Generell wurde in den Experimenten deutlich, dass Mutationen zu Alanin stärkere Effekte auslösen als Mutationen zu Leucin. Die dichte und hydrophobe Packung im Kern der beta-Helix bildet somit die Basis für Stabilität und Faltung des Proteins. Anhand hoch aufgelöster Kristallstrukturen jeweils zweier Alanin‑ und Leucin‑Mutanten konnte verdeutlicht werden, dass das Strukturmotiv der parallelen beta-Helix stark formbar ist und mutationsbedingte Änderungen des Seitenkettenvolumens durch kleine und lokale Verschiebung der Haupt‑ und Seitenketten ausgeglichen werden, sodass mögliche Kavitäten gefüllt und sterische Spannung abgebaut werden können. Viele Mutanten zeigten in vivo und in vitro einen temperatursensitiven Faltungsphänotyp (temperature sensitive for folding, tsf), d.h. bei Temperaturerhöhung waren die Ausbeuten des N‑terminal verkürzten Trimers im Vergleich zum Wildtyp deutlich verringert. Weiterführende Experimente zeigten, dass der tsf‑Phänotyp durch die Beeinflussung unterschiedlicher Stadien des Reifungsprozesses oder auch durch die Verminderung der kinetischen Stabilität des nativen Trimers ausgelöst wurde. Durch Untersuchungen am vollständigen und am N‑terminal verkürzten Wildtypprotein wurde gezeigt, dass die Entfaltungsreaktion des Tailspiketrimers komplex ist. Die Verläufe der Kinetiken folgen zwar einem apparenten Zweizustandsverhalten, jedoch sind bei Darstellung der Entfaltungsäste im Chevronplot die Abhängigkeiten der Geschwindigkeitskonstanten vom Denaturierungsmittel nicht linear, sondern in unterschiedliche Richtungen gewölbt. Dieses Verhalten könnte durch ein hoch energetisches Entfaltungsintermediat, einen breiten Übergangsbereich oder parallele Entfaltungswege hervorgerufen sein. Mit Hilfe der monomeren, isolierten beta-Helix Domäne, bei der die N‑terminale Capsidbindedomäne und die C‑terminale Trimerisierungsdomäne deletiert sind und welche als unabhängige Faltungseinheit fungiert, wurde gezeigt, dass alle Mutanten im Harnstoff‑induzierten Gleichgewicht analog zum Wildtypprotein einem Zweizustandsverhalten mit vergleichbaren Kooperativitäten folgen. Die konformationellen Stabilitäten von in der beta-Helix zentral gelegenen Alanin‑ und Leucin‑Mutanten sind stark vermindert, während Mutationen in äußeren Bereichen der Domäne keinen Einfluss auf die Stabilität der beta-Helix haben. Bei Verlängerung der Inkubationszeiten der Gleichgewichtsexperimente konnte die langsame Bildung von Aggregaten im Übergangsbereich der destabilisierten Mutanten detektiert werden. Die in der Arbeit erlangten Erkenntnisse lassen vermuten, dass die isolierte beta-Helix einem für die Reifung des Tailspikeproteins entscheidenden thermolabilen Faltungsintermediat auf Monomerebene sehr ähnlich ist. Im Intermediat ist ein zentraler Kern, der die Windungen 4 bis 7 und die „Rückenflosse“ beinhaltet, stabilitätsbestimmend. Dieser Kern könnte als Faltungsnukleus dienen, an den sich sequenziell weitere Helixwindungen anlagern und im Zuge der „Monomerreifung“ kompaktieren. N2 - The homotrimeric tailspike adhesin of bacteriophage P22 is a widely used model system for studying different aspects of multi-domain protein folding, assembly and stability, both in vivo and in vitro. The central domain of the tailspike protein is a 13-turn right-handed parallel beta-helix, flanked by an N-terminal capsid-binding domain and a C-terminal trimerization domain. In the beta-helix motif the polypeptide backbone winds up to form a right-handed helix, with each coil consisting of three short beta-strands connected by turns and loops of varying lengths. Due to this repetitive and solenoidal structure, beta-strands of adjacent coils participate in building up three elongated beta-sheets. The internal lumen of the beta-helix is tightly packed and contains mostly hydrophobic side-chains, which are stacked along the helical axis in a linear and very regular manner. A highly repetitive structure, elongated beta-sheets and stacking of similar or identical side chains along the beta-sheet axis are also typical characteristics of amyloid fibrils, which are associated with protein folding diseases such as Alzheimer’s disease, Creutzfeldt-Jacob disease, Huntington’s disease and type II diabetes. It is assumed that the high stability of both, the tailspike protein and amyloid fibrils, is determined by side chain stacking, a well‑ordered network of H-bonds and the rigid, oligomeric state. To systematically investigate the influence of side chain stacking for stability, folding and structure of the P22 tailspike protein, a hydrophobic stack located in the lumen of the beta-helix domain was subjected to site-directed mutagenesis. Each of seven valine residues, distributed over the whole length of the beta-helix domain, was substituted by the smaller and less hydrophobic alanine and the bulkier leucine. The influence of these substitutions was investigated with the help of two tailspike protein constructs, namely the N-terminally shortened TSPdeltaN construct and the isolated, monomeric BHX construct. In general, almost all experiments showed that alanine mutations cause a stronger effect than leucine mutations, which demonstrates that the tight and hydrophobic packing in the lumen of the beta-helix domain is the basis for stability and folding of the tailspike protein. High-resolution crystal structures of two alanine and two leucine mutants revealed that the parallel beta-helix motif shows considerable plasticity. Small and local adjustments of side chains and the polypeptide backbone compensate for changes induced by the mutations, herewith potential cavities are filled and steric strain is released. Compared to the wild type, many mutations lead to a temperature sensitive for folding (tsf) phenotype in vivo and in vitro, i.e. mutations reduce folding yields of TSPdeltaN at high temperatures, but had little effect at low temperatures. Our experiments have elucidated that the tsf phenotype was caused either by an impact on different stages of the maturation process or by a reduction of the kinetic stability of the native trimer. Using TSPdeltaN and the complete wild type protein, it was shown that the tailspike trimer unfolds in a complex manner. Although unfolding kinetics exhibit a two-state behaviour, analysis of the apparent rate constants of unfolding in a Chevron plot revealed their non-linear denaturant-dependence. Typically, the natural logarithm of the apparent rate constants depend linearly on the denaturant concentration. However, in case of TSPdeltaN and the complete wild type protein, unfolding branches of the Chevron plot are curved. Such a behaviour could arise from a high energy intermediate on the unfolding pathway, a broad activation barrier or parallel unfolding pathways. The monomeric BHX construct lacks both the N-terminal and C-terminal domain. It folds into a conformation very similar to that of the -helix domain in the tailspike trimer and acts as an independent folding unit. Unfolding and refolding equilibrium transitions of mutant and wild type BHX constructs are reversible and follow a two-state behaviour with comparable cooperativities. However, conformational stabilities of alanine and leucine mutations located in the central part of the beta-helix domain are highly reduced, whereas mutations at the ends of the domain show a wild type-like stability. Furthermore, these destabilizing mutations tend to form aggregates around the transition midpoint when equilibrium experiments were incubated for longer time periods. Taken together, the results suggest that the structure of the isolated beta-helix seems to be similar to an essential, monomeric intermediate during tailspike folding. In this intermediate, a central core including coils 4 to 7 and the dorsal fin determines the stability of the whole folding unit. This core may act as a nucleus on which beta-helix coils can associate in a sequential manner and compact during maturation of the monomer. KW - P22 Tailspikeprotein KW - Seitenkettenstapel KW - beta-Solenoidproteine KW - Proteinfaltung KW - thermodynamische Stabilität KW - P22 tailspike protein KW - side chain stacking KW - beta-solenoid proteins KW - protein folding KW - thermodynamic stability Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-42674 ER - TY - BOOK ED - Bronstert, Axel ED - Itzerott, Sibylle T1 - Bewirtschaftungsmöglichkeiten im Einzugsgebiet der Havel BT - Abschlussbericht zum BMBF-Forschungsprojekt N2 - Das Verbundprojekt "Bewirtschaftungsmöglichkeiten im Einzugsgebiet der Havel" hat Methoden und Werkzeuge entwickelt, welche zur Bewertung alternativer Bewirtschaftungsmöglichkeiten im Einzugsgebiet der Havel mit dem Ziel der Verbesserung der Gewässergüte dienen. Neben den naturräumlichen Gegebenheiten dieses typischen, langsam fließenden Tieflandflusses mit eingelagerten Flachseen, weit gespannten Auen und der direkten Kopplung von Grund- und Oberflächenwasser galt das Interesse einer Reihe von Nutzungsansprüchen mit ihren Auswirkungen auf den Wasser- und Stoffhaushalt. Im Mittelpunkt stehen hierbei die Stoffeinträge aus Landwirtschafts- und Siedlungsflächen sowie Aspekte der wasserwirtschaftlichen Steuerung. Es werden die Auswirkungen verschiedener Bewirtschaftungsoptionen der Gewässer und ihrer Einzugsgebiete auf die Wassermenge und -qualität untersucht. Damit werden die wissenschaftlichen Grundlagen für die Bewertung des Zustandes der Gewässer sowie künftiger Handlungsoptionen und Entwicklungsszenarios nach der EG-Wasserrahmenrichtlinie (EG-WRRL) geschaffen. Neben den methodischen Aufgaben zur Erstellung, Anpassung und Kopplung von Modellwerkzeugen (Systemmodelle, Szenarientechniken) werden naturraumspezifische und sozioökonomische Bewertungsmaßstäbe, umsetzungsorientierte Handlungsoptionen sowie Werkzeuge für die Verwertung der Ergebnisse durch die Fachverwaltung erarbeitet. T3 - Brandenburgische Umwelt-Berichte - 18 KW - EG-Wasserrahmenrichtlinie KW - Flusseinzugsgebietsmanagement KW - Gewässergüte KW - Havel Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-8177 SN - 978-3-939469-17-9 SN - 1434-2375 SN - 1611-9339 IS - 18 PB - Universitätsverlag Potsdam CY - Potsdam ER - TY - THES A1 - Reim, Tina T1 - Biogene Aminrezeptoren bei der Honigbiene Apis mellifera T1 - Biogenic amine receptors in the honey bee Apis mellifera BT - Charakterisierung des Tyramin 2-Rezeptors und die Beteiligung der Octopamin- und Tyraminrezeptoren an der Steuerung der altersabhängigen Arbeitsteilung N2 - Die Honigbiene Apis mellifera zeigt innerhalb einer Kolonie eine an das Alter gekoppelte Arbeitsteilung. Junge Honigbienen versorgen die Brut (Ammenbienen), während ältere Honigbienen (Sammlerinnen) außerhalb des Stocks Pollen und Nektar eintragen. Die biogenen Amine Octopamin und Tyramin sind an der Steuerung der Arbeitsteilung maßgeblich beteiligt. Sie interagieren mit Zielzellen über die Bindung an G Protein gekoppelte Rezeptoren. A. mellifera besitzt fünf charakterisierte Octopaminrezeptoren (AmOctαR1, AmOctβR1-4), einen charakterisierten Tyraminrezeptor (AmTyr1) sowie einen weiteren putativen Tyraminrezeptor. In der vorliegenden Arbeit wurde dieser putative Aminrezeptor als zweiter Tyraminrezeptor (AmTyr2) identifiziert, lokalisiert und pharmakologisch charakterisiert. Die von der cDNA abgeleitete Aminosäuresequenz weist strukturelle Eigenschaften und konservierte Motive von G Protein gekoppelten Rezeptoren auf. Phylogenetisch ordnet sich der AmTyr2 Rezeptor bei den Tyramin 2 Rezeptoren anderer Insekten ein. Die funktionelle und pharmakologische Charakterisierung des putativen Tyraminrezeptors erfolgte in modifizierten HEK293 Zellen, die mit der Rezeptor cDNA transfiziert wurden. Die Applikation von Tyramin aktiviert Adenylylcyclasen in diesen Zellen und resultiert in einem Anstieg des intrazellulären cAMP Gehalts. Der AmTyr2 Rezeptor kann durch Tyramin in nanomolaren Konzentrationen halbmaximal aktiviert werden. Während es sich bei Octopamin um einen wirkungsvollen Agonisten des Rezeptors handelt, sind Mianserin und Yohimbin effektive Antagonisten. Für die Lokalisierung des Rezeptorproteins wurde ein polyklonaler Antikörper generiert. Eine AmTyr2-ähnliche Immunreaktivität zeigt sich im Gehirn in den optischen Loben, den Antennalloben, dem Zentralkomplex und in den Kenyon Zellen der Pilzkörper. Des Weiteren wurde die Rolle der Octopamin- und Tyraminrezeptoren bei der Steuerung der altersabhängigen Arbeitsteilung analysiert. Die Genexpression des AmOctαR1 in verschiedenen Gehirnteilen korreliert unabhängig vom Alter mit der sozialen Rolle, während sich die Genexpression von AmOctβR3/4 und den Tyraminrezeptoren AmTyr1 und AmTyr2 maximal mit dem Alter aber nicht der sozialen Rolle ändert. Sammlerinnen weisen einen höheren Octopamingehalt im Gesamtgehirn auf als Ammenbienen; bei Tyramin zeigen sich keine Unterschiede. Während Tyramin offensichtlich keine direkte Rolle spielt, werden durch Octopamin gesteuerte Prozesse der altersabhängigen Arbeitsteilung bei der Honigbiene vermutlich über den AmOctαR1 vermittelt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen die wichtige Rolle von biogenen Aminen, insbesondere Octopamin bei der sozialen Organisation von Insektenstaaten. N2 - The honey bee Apis mellifera exhibits an age-dependent division of labour. Young bees take care of the brood (nurse bees), while older honey bees (foragers) leave the hive to provide the colony with pollen and nectar. The biogenic amines octopamine and tyramine are significantly involved in regulating the division of labour. They interact with target cells via binding to G protein-coupled receptors. A. mellifera has five characterised octopamine receptors (AmOctαR1, AmOctβR1-4), one characterised tyramine receptor (AmTyr1) and an additional putative tyramine receptor. In the present study, the putative amine receptor was identified as a second tyramine receptor (AmTyr2), was localized and characterised pharmacologically. The deduced amino acid sequence shows structural properties and conserved motifs of G protein-coupled receptors. Phylogenetically the AmTyr2 receptor clusters with tyramine 2 receptors from other insect species. Functional and pharmacological characterisation of the putative tyramine receptor was carried out using modified HEK293 cells trans¬fected with the receptor cDNA. Application of tyramine activates adenylyl cyclases in these cells, which leads to an elevated intracellular cAMP level. Half maximal activation can be achieved by applying tyramine with concentrations in the nanomolar range. While octopa¬mine is an effective agonist of the receptor, mianserin and yohimbine are the most effective antagonists. A polyclonal antibody was generated for the localisation of the receptor protein. AmTyr2 like immunoreactivity can be observed in the optic lobes, the Kenyon cells of the mushroom bodies, the antennal lobes and the central complex of the brain. Furthermore, the role of the octopamine and tyramine receptors in regulating the age-dependent division of labour was analysed. The gene expression of the AmOctαR1 in different brain neuropiles correlates with the social role of the honey bee, while the gene expression of AmOctβR3/4, AmTyr1 and AmTyr2 mostly changes with age but not social role. Additionally, foragers have higher octopamine brain titres than nurse bees. No differences can be observed for the titre of tyramine. Octopamine-regulated processes in age-dependent division of labour are probably mediated via the AmOctαR1. Tyramine has obviously no direct impact on the age-dependent division of labour. The present study shows the important role of biogenic amines, particularly octopamine in the social organisation of insect societies. KW - Apis mellifera KW - honey bee KW - Honigbiene KW - biogene Amine KW - biogenic amines KW - Octopamin KW - octopamine KW - Tyramin KW - tyramine KW - Arbeitsteilung KW - division of labor Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-80982 ER - TY - THES A1 - Krach, Christian T1 - Biogene Aminrezeptoren der Schabe Periplaneta americana : Identifizierung, Charakterisierung und Lokalisierung von PeaTYR1 und PeaDOP2 T1 - Biogenic amine receptors of Periplaneta americana : identification, characterization and localization of PeaTYR1 and PeaDOP2 N2 - Biogene Amine sind eine Substanzklasse, die bei Vertebraten und Invertebraten eine wichtige Komponente des endokrinen Systems darstellen. Sie binden an spezifische Rezeptoren der Gruppe der G-Protein gekoppelten Rezeptoren. In dieser Arbeit wurden zwei neue Rezeptoren aus der Schabe Periplaneta americana kloniert. Durch verschiedene Ansätze konnten zwei vollständige cDNA-Sequenzen isoliert werden. Die Aminosäuresequenzen weisen die größte Ähnlichkeit zu bereits bekannten Tyraminrezeptoren aus Locusta/Bombyx bzw. zu Dopaminrezeptoren aus Apis/Drosophila auf. Entsprechend wurden diese Rezeptoren Pea (P. americana) TYR1 und PeaDOP2 genannt. Deutliche Hinweise auf ihre Funktion lassen sich an den abgeleiteten Aminosäuresequenzen ablesen. Aminosäuren, die wichtig bei der Bildung der Bindungstasche, der Rezeptoraktivierung und der Kopplung eines G-Proteins sind, treten bei beiden Rezeptoren auf. Sequenzalignments stellen die Rezeptoren in die Gruppe anderer Tyraminrezeptoren bzw. der Invertebraten-Typ Dopaminrezeptoren. Das Transkript der beiden Rezeptoren konnte durch RT-PCR in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden. Ein Ziel der Arbeit war die Gewinnung eines polyklonalen Antiserums gegen PeaTYR1. Dieses Serum detektiert im Homogenat von Gehirnen mehrere Banden, darunter auch eine mit der kalkulierten Masse von PeaTYR1. Präabsorption des Serums mit dem Peptid, welches zur Reinigung verwendet wurde, zeigt dessen Spezifität. An Gehirnschnitten markiert das Serum große Teile des Protocerebrums aber auch feinere Strukturen der Antennalloben, der optischen Loben und des Zentralkomplexes. Ein weiteres Serum gegen Tyramin führte zu einer Markierung von mehreren Neuronengruppen, welche sich in die optischen Loben und den Zentralkomplex verzweigen. Der αPeaTYR1-CPL3 Antikörper markierte die Plasmamembran von transfizierten HEK293-Zellen. Die Lokalisierung von Rezeptor und Ligand deuten darauf hin, dass Tyramin die optische und olfaktorische Wahrnehmung beeinflussen könnte. N2 - Biogenic amines form a group of substances which play an important role in the endocrine system of invertebrates and vertebrates. They bind to specific receptors of the G-protein coupled type. In this work two new receptors from Periplaneta americana were cloned. By several approaches two full-length cDNA sequences were obtained. The amino acid sequence is very similar to known tyramine receptors of Locusta/Bombyx or dopamine receptors from Apis/Drosophila, respectively. Therefore they were named PeaTYR1 and PeaDOP2. Residues which are important for forming the binding pocket, activation of the receptor or G-protein coupling could be identified in both receptors. Sequence alignments group them together with other tyramine receptors or insect-type dopamine receptors. The corresponding mRNA can be detected in different tissues by RT-PCR. One aim of this work was the preparation of a polyclonal antiserum against PeaTYR1. This serum detects several bands in a brain homogenate; one has the calculated mass of PeaTYR1. Its specificity was proven by praeabsorption. On brain slices the serum labels large regions in the protocerebrum, but also fine structures in the antennal lobes, the optic lobes or the central complex. Another serum against tyramine labels several cell clusters, which ramify within the optic lobes and the central complex. On transfected HEK293 cells the receptor can be detected on the plasma membrane. The localization of receptor and ligand may indicate a role of tyramine in optical/olfactory perception. KW - Rezeptor KW - Tyramin KW - Dopamin KW - Periplaneta americana KW - receptor KW - tyramine KW - dopamine KW - Periplaneta americana Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-15561 ER - TY - THES A1 - Frahnow, Turid T1 - Bioinformatische Analyse der NUGAT-Studie (NUtriGenomic Analysis in Twins) T1 - Bioinformatic analysis of the NUGAT study (NUtriGenomic Analysis in Twins) BT - Verfahren zur Integration lipidomischer, transkriptomischer und metabolischer Daten BT - methods for the integration of lipidomic, transcriptomic and metabolic data N2 - Durch die Zunahme metabolischer Stoffwechselstörungen und Erkrankungen in der Weltbevölkerung wird in der Medizin und den Lebenswissenschaften vermehrt nach Präventionsstrategien und Ansatzpunkten gesucht, die die Gesundheit fördern, Erkrankungen verhindern helfen und damit auch die Gesamtlast auf die Gesundheitssysteme erleichtern. Ein Ansatzpunkt wird dabei in der Ernährung gesehen, da insbesondere der Konsum von gesättigten Fetten die Gesundheit nachträglich zu beeinflussen scheint. Dabei wird übersehen, dass in vielen Studien Hochfettdiäten nicht ausreichend von den Einflüssen einer zum Bedarf hyperkalorischen Energiezufuhr getrennt werden, sodass die Datenlage zu dem Einfluss von (gesättigten) Fetten auf den Metabolismus bei gleichbleibender Energieaufnahme noch immer unzureichend ist. In der NUtriGenomic Analysis in Twins-Studie wurden 46 Zwillingspaare (34 monozygot, 12 dizygot) über einen Zeitraum von sechs Wochen mittels einer kohlenhydratreichen, fettarmen Diät nach Richtlinien der Deutschen Gesellschaft für Ernährung für ihr Ernährungsverhalten standardisiert, ehe sie zu einer kohlenhydratarmen, fettreichen Diät, die insbesondere gesättigte Fette enthielt, für weitere sechs Wochen wechselten. Beide Diäten waren dem individuellen Energiebedarf der Probanden angepasst, um so sowohl akut nach einerWoche als auch längerfristig nach sechs Wochen Änderungen des Metabolismus beobachten zu können, die sich in der vermehrten Aufnahme von (gesättigten) Fetten begründeten. Die über die detaillierte Charakterisierung der Probanden an den klinischen Untersuchungstagen generierten Datensätze wurden mit statistischen und mathematischen Methoden (z.B. lineare gemischte Modellierung) analysiert, die der Größe der Datensätze und damit ihrem Informationsvolumen angepasst waren. Es konnte gezeigt werden, dass die metabolisch gesunden und relativ jungen Probanden, die eine gute Compliance zeigten, im Hinblick auf ihren Glukosestoffwechsel adaptieren konnten, indem die Akutantwort nach einer Woche im Nüchterninsulin und dem Index für Insulinresistenz in den weiteren fünf Wochen ausgeglichen wurde. Der Lipidstoffwechsel in Form der klassischen Marker wie Gesamtcholesterin, LDL und HDL war dagegen stärker beeinflusst und auch nach insgesamt sechs Wochen deutlich erhöht. Letzteres unterstützt die Beobachtung im Transkriptom des weißen, subkutanen Fettgewebes, bei der eine Aktivierung der über die Toll-like receptors und das Inflammasom vermittelten subklinischen Inflammation beobachtet werden konnte. Die auftretenden Veränderungen in Konzentration und Komposition des Plasmalipidoms zeigte ebenfalls nur eine teilweise und auf bestimmte Spezies begrenzte Gegenregulation. Diesbezüglich kann also geschlussfolgert werden, dass auch die isokalorische Aufnahme von (gesättigten) Fetten zu Veränderungen im Metabolismus führt, wobei die Auswirkungen in weiteren (Langzeit-)Studien und Experimenten noch genauer untersucht werden müssen. Insbesondere wäre dabei ein längerer Zeitraum unter isokalorischen Bedingungen von Interesse und die Untersuchung von Probanden mit metabolischer Vorbelastung (z.B. Insulinresistenz). Darüber hinaus konnte in NUGAT aber ebenfalls gezeigt werden, dass die Nutrigenetik und Nutrigenomik zwei nicht zu vernachlässigende Faktoren darstellen. So zeigten unter anderem die Konzentrationen einiger Lipidspezies eine starke Erblichkeit und Abhängigkeit der Diät. Zudem legen die Ergebnisse nahe, dass laufende wie geplante Präventionsstrategien und medizinische Behandlungen deutlich stärker den Patienten als Individuum mit einbeziehen müssen, da die Datenanalyse interindividuelle Unterschiede identifizierte und Hinweise lieferte, dass einige Probanden die nachteiligen, metabolischen Auswirkungen einer Hochfettdiät besser ausgleichen konnten als andere. N2 - Based on the increasing incidence of metabolic disorders and diseases in the world population, medicine and life sciences aim for (new) prevention strategies and targets to promote health, prevent diseases and thereby ease the overall financial burden on health systems. One approach is seen in diet and nutrition. According to recent studies and nutritional guide lines, especially the consumption of saturated fats affects health negatively. Nevertheless, in many studies high fat diets are not separated from the influences of a hypercaloric energy intake. In conclusion the available data for the isolated effects of (saturated) fats on metabolism are still insufficient. In the NUtriGenomic Analysis in Twins study, 46 healthy twin pairs (34 monozygotic, 12 dizygotic) were standardized for their nutritional behavior over a period of six weeks on a high-carbohydrate, low-fat diet according to the DGE guidelines. This standardization was followed by an interventional low-carbohydrate, high-fat diet for another six weeks. Both diets were isocaloric to the individuals' requirements in order to evaluate rapid after 1 week) and long-term (after 6 weeks) effects on metabolism, which were based on the higher intake of (saturated) fatty acids. The data sets, which were generated by a detailed characterization of the subjects at the clinical investigation days, were analyzed with statistical and mathematical methods (e.g. linear mixed modeling), which aimed to cover the size of the data sets and thereby the whole amount of information within the data sets. We could show that the metabolically healthy and relatively young subjects, who showed good compliance, were able to adapt in terms of their glucose metabolism, since the acute increase after one week in fasting insulin and the loss of insulin sensitivity was balanced after additional five weeks. In contrast, lipid metabolism, represented by the classical marker total cholesterol as well as LDL and HDL, was more strongly influenced and still increased after six weeks on high-fat diet. The latter supports the observations in the transcriptome of white, subcutaneous adipose tissue, where Toll-like receptors and inflammasome seemed to mediate the activation of a low-grade inflammation. The changes occurring in the concentration and composition of the plasma lipidome also showed a partial counterregulation limited to certain lipid species. In this regard, we conclude that independent of the energy intake, the consumption of (saturated) fatty acids leads to changes in metabolism, although further studies and experiments are needed to investigate the isolated effects further. Especially studies of extended periods under isocaloric conditions and studies in patients with pathological conditions (e.g. insulin resistance) would be of interest. Nevertheless, the results in NUGAT emphasize the importance of nutrigenetics and nutrigenomics, since the concentrations of some lipid species seemed to be highly heritable and diet-dependent. Moreover, our results suggest that ongoing and planned prevention strategies and medical treatments have to treat patients much more as individuals. Our analysis identified interindividual differences and indicated that some participants were able to compensate the adverse and unfavorable metabolic effects of a high fat diet better than others. KW - Hochfettdiät KW - Zwillingsstudie KW - Lipidomics KW - Heritabilität KW - linear gemischte Modelle KW - twin study KW - high fat diet KW - lipidomics KW - heritability KW - linear mixed models Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-394902 ER - TY - THES A1 - Dreyer, Ingo T1 - Biophysikalische und molekulare Grundlagen der Regulation des Kaliumtransports in Pflanzen T1 - Biophysical and molecular bases of the regulation of potassium transport in plants N2 - Kaliumionen (K+) sind die am häufigsten vorkommenden anorganischen Kationen in Pflanzen. Gemessen am Trockengewicht kann ihr Anteil bis zu 10% ausmachen. Kaliumionen übernehmen wichtige Funktionen in verschiedenen Prozessen in der Pflanze. So sind sie z.B. essentiell für das Wachstum und für den Stoffwechsel. Viele wichtige Enzyme arbeiten optimal bei einer K+ Konzentration im Bereich von 100 mM. Aus diesem Grund halten Pflanzenzellen in ihren Kompartimenten, die am Stoffwechsel beteiligt sind, eine kontrollierte Kaliumkonzentration von etwa 100 mM aufrecht. Die Aufnahme von Kaliumionen aus dem Erdreich und deren Transport innerhalb der Pflanze und innerhalb einer Pflanzenzelle wird durch verschiedene Kaliumtransportproteine ermöglicht. Die Aufrechterhaltung einer stabilen K+ Konzentration ist jedoch nur möglich, wenn die Aktivität dieser Transportproteine einer strikten Kontrolle unterliegt. Die Prozesse, die die Transportproteine regulieren, sind bis heute nur ansatzweise verstanden. Detailliertere Kenntnisse auf diesem Gebiet sind aber von zentraler Bedeutung für das Verständnis der Integration der Transportproteine in das komplexe System des pflanzlichen Organismus. In dieser Habilitationsschrift werden eigene Publikationen zusammenfassend dargestellt, in denen die Untersuchungen verschiedener Regulationsmechanismen pflanzlicher Kaliumkanäle beschrieben werden. Diese Untersuchungen umfassen ein Spektrum aus verschiedenen proteinbiochemischen, biophysikalischen und pflanzenphysiologischen Analysen. Um die Regulationsmechanismen grundlegend zu verstehen, werden zum einen ihre strukturellen und molekularen Besonderheiten untersucht. Zum anderen werden die biophysikalischen und reaktionskinetischen Zusammenhänge der Regulationsmechanismen analysiert. Die gewonnenen Erkenntnisse erlauben eine neue, detailliertere Interpretation der physiologischen Rolle der Kaliumtransportproteine in der Pflanze. N2 - Potassium ions (K+) are the most abundant anorganic cations in plants. They can constitute up to 10% of the plant dry weight. Potassium ions play important roles in different processes in the plant. For example, they are essential for growth and for metabolism. Many important enzymes work optimally at a K+ concentration within the range of about 100 mM. Therefore, plant cells maintain a controlled potassium concentration of approximately 100 mM in their compartments, which are involved in metabolism. The uptake of potassium ions from the soil and their transport within the plant and within a plant cell is accomplished by different potassium transporter proteins. However, the maintenance of a stable K+ concentration is only possible if the activity of these transporter proteins is subject to strict control. Up today the processes regulating the transporter proteins are only rudimentarily understood. More detailed knowledge in this area is, however, of central importance for the understanding of the integration of the transporter proteins into the complex system of the plant organism. This Habilitation-thesis summarizes own publications, in which the investigations of different regulation mechanisms of plant potassium channels are described. These investigations cover a spectrum of different protein-biochemical, biophysical and plant-physiological analyses. In order to understand the regulation mechanisms, on the one hand their structural and molecular characteristics are examined. On the other hand the biophysical and reaction-kinetic properties of the regulation mechanisms are analyzed. The obtained insights allow a new, more detailed view on the physiological role of potassium transporter proteins in the plant. KW - Kaliumion KW - Ionenkanal KW - Elektrophysiologie KW - Biophysik KW - Schmalwand KW - potassium ions KW - ion channel KW - electrophysiology KW - biophysics KW - Arabidopsis Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-7708 ER - TY - THES A1 - Stolzenburg, Antje T1 - Bittergeschmacksrezeptoren des peripheren und zentralen Nervensystems T1 - Bitter taste receptors of the peripheral and central nervous system N2 - Der Bittergeschmack warnt den Organismus vor potentiell verdorbener oder giftiger Nahrung und ist somit ein wichtiger Kontrollmechanismus. Die initiale Detektion der zahlreich vorkommenden Bitterstoffe erfolgt bei der Maus durch 35 Bitterrezeptoren (Tas2rs), die sich im Zungengewebe befinden. Die Geschmacksinformation wird anschließend von der Zunge über das periphere (PNS) ins zentrale Nervensystem (ZNS) geleitet, wo deren Verarbeitung stattfindet. Die Verarbeitung der Geschmacksinformation konnte bislang nicht gänzlich aufgeklärt werden. Neue Studien deuten auf eine Expression von Tas2rs auch im PNS und ZNS entlang der Geschmacksbahn hin. Über Vorkommen und Aufgaben dieser Rezeptoren bzw. Rezeptorzellen im Nervensystem ist bislang wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Tas2r-Expression in verschiedenen Mausmodellen untersucht, Tas2r-exprimierende Zellen identifiziert und deren Funktionen bei der Übertragung der Geschmacksinformationen analysiert. Im Zuge der Expressionsanalysen mittels qRT-PCR konnte die Expression von 25 der 35 bekannten Bittergeschmacksrezeptoren im zentralen Nervensystem der Maus nachgewiesen werden. Die Expressionsmuster im PNS sowie im ZNS lassen darüber hinaus Vermutungen zu Funktionen in verschiedenen Bereichen des Nervensystems zu. Basierend auf den Ergebnissen der Expressionsanalysen war es möglich, stark exprimierte Tas2rs mittels In-situ-Hybridisierung in verschiedenen Zelltypen zu visualisieren. Des Weiteren konnten immunhistochemische Färbungen unter Verwendung eines genetisch modifizierten Mausmodells die Ergebnisse der Expressionsanalysen bestätigen. Sie zeigten eine Expression von Tas2rs, am Beispiel des Tas2r131-Rezeptors, in cholinergen, dopaminergen, GABAergen, noradrenergen und glycinerg-angesteuerten Projektionsneuronen sowie in Interneuronen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen daher erstmals das Vorkommen von Tas2rs in verschiedenen neuronalen Zelltypen in weiten Teilen des ZNS. Dies lässt den Schluss zu, dass Tas2r-exprimierende Zellen potentiell multiple Funktionen innehaben. Anhand von Verhaltensexperimenten in genetisch modifizierten Mäusen wurde die mögliche Funktion von Tas2r131-exprimierenden Neuronen (Tas2r131-Neurone) bei der Geschmackswahrnehmung untersucht. Die Ergebnisse weisen auf eine Beteiligung von Tas2r131-Neuronen an der Signalweiterleitung bzw. -verarbeitung der Geschmacksinformation für eine Auswahl von Bittersubstanzen hin. Die Analysen zeigen darüber hinaus, dass Tas2r131-Neuronen nicht an der Geschmackswahrnehmung anderer Bitterstoffe sowie Geschmacksstimuli anderer Qualitäten (süß, umami, sauer, salzig), beteiligt sind. Eine spezifische „Tas2r131-Bittergeschmacksbahn“, die mit anderen potentiellen „Bitterbahnen“ teils unabhängige, teils überlappende Signalwege bzw. Verarbeitungsbereiche besitzt, bildet eine mögliche zelluläre Grundlage zur Unterscheidung von Bitterstoffen. Die im Rahmen dieser Arbeit entstandene Hypothese einer potentiellen Diskriminierung von Bitterstoffen soll daher in weiterführenden Studien durch die Etablierung eines Verhaltenstest mit Mäusen geprüft werden. N2 - Bitter taste warns the organism about potentially spoiled or toxic food and is thus an important control mechanism. The initial detection of numerous occurring bitter substances is done in mice by 35 bitter taste receptors (Tas2rs), located in tongue tissue. From the tongue the gustatory information is then passed via the peripheral (PNS) to the central nervous system (CNS), where it is processed. The processing of taste information couldn’t yet be clarified entirely. Recent studies point to an expression of Tas2rs also in the PNS and CNS along the taste transmission pathway. However, little is known concerning occurrence and functions of Tas2rs or Tas2r-expressing cells in the nervous system. In this work the Tas2r expression was examined in different mouse models, Tas2r-expressing cells were identified and their functions in transmission of taste information analyzed. Expression analyses using qRT-PCR showed an expression of 25 of the 35 known murine bitter taste receptors in the central nervous system. The expression patterns in the PNS and CNS suggests functions in different areas of the nervous system. Based on the results of the expression analysis it was possible to visualize highly expressed Tas2rs by in-situ-hybridization in various cell types. Furthermore, immunohistochemical staining using a genetically modified mouse model confirmed the results of the expression analysis. They showed an expression of Tas2rs, on the example of the Tas2r131 receptor, in the cholinergic, dopaminergic, GABAergic, noradrenergic and glycinerg-driven projection neurons and interneurons. The results of the present work show for the first time the presence of Tas2rs in different neuronal cell types in many parts of the CNS. This leads to the conclusion that Tas2r-expressing cells hold potentially multiple functions. Based on behavioral experiments in genetically modified mice, the possible taste function of Tas2r131-expressing neurons (Tas2r131 neurons) was studied. The results showed the involvement of Tas2r131 neurons in signal transduction and processing of gustatory information for a selection of bitter substances. Besides, the analyses show that Tas2r131 neurons aren’t involved in taste perception for another selection of bitter substances and taste stimuli of other qualities (sweet, umami, sour, salty). A specific "Tas2r131-bitter-pathway" which forms partly independent and partly overlapping signaling pathways or processing areas with other potential "bitter-pathways", provides a cellular basis for the distinction of specific bitter compounds. The resulting hypothesis of a potential discrimination of bitter substances should therefore be examined in further studies by establishing a behavioral test with mice. KW - Geschmack KW - Bittergeschmack KW - Bittergeschmacksrezeptoren KW - Tas2r KW - Verhaltensstudien KW - zentrales Nervensystem KW - peripheres Nervensystem KW - Neurone KW - Maus KW - taste KW - bitter taste KW - bitter taste receptors KW - Tas2rs KW - peripheral nervous system KW - central nervous system KW - neuron KW - behavioral experiments KW - expression analysis KW - mouse Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-92397 ER - TY - THES A1 - Demin, Paul T1 - Blaulicht-aktivierbares Proteinexpressionssystem in Saccharomyces cerevisiae T1 - Blue light-inducible protein expression system in Saccharomyces cerevisiae N2 - Synthetische Transkriptionsfaktoren bestehen wie natürliche Transkriptionsfaktoren aus einer DNA-Bindedomäne, die sich spezifisch an die Bindestellensequenz vor dem Ziel-Gen anlagert, und einer Aktivierungsdomäne, die die Transkriptionsmaschinerie rekrutiert, sodass das Zielgen exprimiert wird. Der Unterschied zu den natürlichen Transkriptionsfaktoren ist, sowohl dass die DNA-Bindedomäne als auch die Aktivierungsdomäne wirtsfremd sein können und dadurch künstliche Stoffwechselwege im Wirt, größtenteils chemisch, induziert werden können. Optogenetische synthetische Transkriptionsfaktoren, die hier entwickelt wurden, gehen einen Schritt weiter. Dabei ist die DNA-Bindedomäne nicht mehr an die Aktivierungsdomäne, sondern mit dem Blaulicht-Photorezeptor CRY2 gekoppelt. Die Aktivierungsdomäne wurde mit dem Interaktionspartner CIB1 fusioniert. Unter Blaulichtbestrahlung dimerisieren CRY2 und CIB1 und damit einhergehend die beiden Domänen, sodass ein funktionsfähiger Transkriptionsfaktor entsteht. Dieses System wurde in die Saccharomyces cerevisiae genomisch integriert. Verifiziert wurde das konstruierte System mit Hilfe des Reporters yEGFP, welcher durchflusszytometrisch detektiert werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass die yEGFP Expression variabel gestaltet werden kann, indem unterschiedlich lange Blaulichtimpulse ausgesendet wurden, die DNA-Bindedomäne, die Aktivierungsdomäne oder die Anzahl der Bindestellen, an dem sich die DNA-Bindedomäne anlagert, verändert wurden. Um das System für industrielle Anwendungen attraktiv zu gestalten, wurde das System vom Deepwell-Maßstab auf Photobioreaktor-Maßstab hochskaliert. Außerdem erwies sich das Blaulichtsystem sowohl im Laborstamm YPH500 als auch im industriell oft verwendeten Hefestamm CEN.PK als funktional. Des Weiteren konnte ein industrierelevante Protein ebenso mit Hilfe des verifizierten Systems exprimiert werden. Schlussendlich konnte in dieser Arbeit das etablierte Blaulicht-System erfolgreich mit einem Rotlichtsystem kombiniert werden, was zuvor noch nicht beschrieben wurde. N2 - Like natural transcription factors, synthetic transcription factors consist of a DNA-binding domain that attaches specifically to the binding site sequence in front of the target gene, and an activation domain that recruits the transcription machinery so that the target gene is expressed. The difference to natural transcription factors is that both the DNA binding domain and the activation domain can be host foreign and artificial metabolic pathways, mostly chemically, can be induced in the host. In this work, new optogenetic synthetic transcription factors were developed so that chemical induction becomes obsolete. The DNA binding domain is no longer linked to the activation domain but to the blue light photoreceptor CRY2. The activation domain was fused to the interaction partner CIB1. Upon blue light irradiation, CRY2 and CIB1 dimerize and thus the two domains, resulting in a functional transcription factor. Six different prokaryotic DNA-binding domains and a total of two different activation domains, viral and fungal, were recombined with CRY2 and CIB1, respectively, and genomically integrated into the eukaryotic cell factory Saccharomyces cerevisiae. Since the blue light dimerization is based on the chromophore FAD, which the yeast can synthesize itself, only the blue light had to be switched on for the induction. The constructed system was verified with the help of the reporter yEGFP, which could be detected by flow cytometry. It could be shown that the yEGFP expression could be made variable by emitting blue light pulses of different lengths, changing the DNA binding domain, the activation domain or the copy number of binding sites at which the DNA binding domain attaches. To make the system attractive for industrial applications, the system was scaled up from deepwell scale to photobioreactor scale. In addition, the blue light system proved to be functional both in the laboratory strain YPH500 and in the yeast strain CEN.PK, which is often used industrially. Furthermore, the industrially relevant protein VP1 could also be expressed using the verified system. Due to its great flexibility, the blue light system established here was christened/named FLIRT (Flexible Blue Light Induced Transcription). Finally, in this work, the established flirt system could be successfully combined with a red light system, which has not been described before. KW - Synthetische Biologie KW - Hefe KW - Saccharomyces cerevisiae KW - Blaulicht KW - Transkriptionsfaktoren KW - Bioreaktor KW - bioreactor KW - blue light KW - budding yeast KW - Saccharomyces cerevisiae KW - synthetic biology KW - transcription factors Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-559696 ER - TY - GEN A1 - Maaß, Stefanie T1 - Blick in die Zukunft BT - wie werden sich Pflanzengemeinschaften in Brandenburg verändern? T2 - Vielfalt in der Uckermark : Forschungsprojekte 2015 - 2018 Y1 - 2019 SP - 24 EP - 25 PB - oerding print GmbH CY - Braunschweig ER - TY - THES A1 - Urban, Alexander T1 - Charakterisierung der Funktion der Rhodanese YnjE für die Molybdänkofaktor Biosynthese in Escherichia coli T1 - Characterization of the Rhodanese YnjE regarding Molybdenum Cofaktor Biosynthesis in E. coli N2 - Die ubiquitär verbreitete Molybdänkofaktorbiosynthese ist in Escherichia coli (E. coli) bisher am umfassendsten untersucht. Bislang war jedoch nicht bekannt, welche physiologische Schwefelquelle im zweiten Schritt dieses Syntheseweges zur Bildung der charakteristischen Dithiolengruppe genutzt wird. Erste Untersuchungen deuteten auf eine der Cysteindesulfurasen E. colis hin, welche in Verbindung mit einem rhodaneseähnlichen Protein den Schwefel in Form eines Persulfids übertragen. Ähnliche Mechanismen wurden bereits in der humanen Moco-Biosynthese und der Thiaminbiosynthese identifiziert. In dieser Arbeit wurde das E. coli Protein YnjE näher charakterisiert. Es handelt sich bei YnjE um ein rhodaneseähnliches Protein aus drei Rhodanesedomänen. Durch Proteinkristallisation und anschliessender Röntgenstrukturanalyse wurde die Tertiärstruktur des YnjE-Proteins analysiert. Die hergestellten Kristalle konnten zur Gewinnung von Strukturdaten vermessen und eine Proteinkristallstruktur für YnjE berechnet werden. Desweiteren besitzt YnjE ein N-terminales Typ I Sekretionssystem abhängiges Sipnalpeptid. Durch Lokalisieungsexperimente wurde die Bedeutung des Signalpeptids für das YnjE-Protein untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass endogenes YnjE sowohl im peri- als auch im cytoplasmatischen Raum lokalisiert ist. Auf Grund von vorhergehenden Studien, wurde eine Funktion des YnjE-Proteins innerhalb der Molybdänkofaktorbiosynthese in der Schwefelübertragung auf das Protein MoaD in E. coli vermutet und deshalb in dieser Arbeit näher untersucht. Es wurde eine Interaktion des YnjE-Proteins mit dem MoeB-Protein, welches für die Thiocarboxylierung des MoaD-Proteins essentiell ist, durch Tandem-Affinitätsreinigung und Antikörper-basierte Affinitätsreinigung nachgewiesen und ein signifikanter positiver Einfluss YnjEs auf die Bildung von Molybdopterin, einer Vorstufe des Molybdänkofaktors, bestätigt. Dabei wurde sowohl der Sulfurierungsgrad des MoaD-Proteins in YnjE und Cysteindesulfurase-knock-out Mutanten untersucht, als auch die Bildung von Molybdopterin in einem in vitro Ansatz in Abhängigkeit von steigenden YnjE-Konzentrationen analysiert. Im Ergebnis kann man daraus schließen, dass der Mechanismus der Schwefelübertragung ähnlich der Thiaminbiosynthese, über eine der drei Cysteindesulfurasen CsdA, SufS oder IscS geschieht, welche Schwefel in Form eines Persulfids auf YnjE übertragen können. Thiosulfat und Mercaptopyruvat, die Substrate für die beiden Familien der rhodaneseähnlichen Proteine, Thiosulfat-Sulfurtransferasen und Mercaptopyruvat-Sulfurtransferasen, dienen nicht als Substrate für eine Persulfurierung YnjEs. Durch eine Austauschmutante des Cysteinrestes der aktiven Schleife von YnjE konnte nicht bestätigt werden, dass dieser Aminosäurerest und damit die Bildung eines YnjE-gebundenen Persulfids für die positive Beeinflussung der MPT-Synthese essentiell ist. Vielmehr kann durch diese Arbeit von einer Vermittlung der Interaktionen zwischen MoeB, IscS und der MPT-Synthase durch YnjE ausgegangen werden wobei die Cysteindesulfurase IscS den Schwefel für die Thiocarboxylierung des MoaD-Proteins liefert. N2 - The rhodanese-like protein YnjE was characterized in this study. After protein christallization the stucture of the YnjE protein was analyzed. Subzellular localization experiments revealed, that the YnjE protein is present both in cytoplasm and periplasm. Interaction studies and in vitro synthesis of Molybdopterin revealed an influence of YnjE on Molybdenum Cofactor Biosynthesis.A sulfur transfer from L-Cystein to YnjE by a Cystein desulfurase was not responsible for the the effects on Molybdenum Cofaktor Biosynthesis, since a YnjE cysteine 385 to alanine mutant showed the same effect on Molybdenum Cofaktor Biosynthesis. KW - Molybdänkofaktor KW - Rhodanese KW - YnjE KW - Sulfurtransferase KW - Escherichia coli KW - Molybdenum Cofaktor KW - Rhodanese KW - YnjE KW - sulfur transferase KW - Escherichia coli Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-29018 ER -