TY - THES A1 - Schäfer, Marjänn Helena T1 - Untersuchungen zur Evolution der 15-Lipoxygenase (ALOX15) bei Säugetieren und funktionelle Charakterisierung von Knock-in-Mäusen mit humanisierter Reaktionsspezifität der 15-Lipoxygenase-2 (Alox15b) T1 - Studies on the evolution of 15-lipoxygenase (ALOX15) in mammals and functional characterization of Knock-in mice with humanized reaction specificity of 15-lipoxygenase-2 (Alox15b) N2 - Arachidonsäurelipoxygenasen (ALOX-Isoformen) sind Lipid-peroxidierenden Enzyme, die bei der Zelldifferenzierung und bei der Pathogenese verschiedener Erkrankungen bedeutsam sind. Im menschlichen Genom gibt es sechs funktionelle ALOX-Gene, die als Einzelkopiegene vorliegen. Für jedes humane ALOX-Gen gibt es ein orthologes Mausgen. Obwohl sich die sechs humanen ALOX-Isoformen strukturell sehr ähnlich sind, unterscheiden sich ihre funktionellen Eigenschaften deutlich voneinander. In der vorliegenden Arbeit wurden vier unterschiedliche Fragestellungen zum Vorkommen, zur biologischen Rolle und zur Evolutionsabhängigkeit der enzymatischen Eigenschaften von Säugetier-ALOX-Isoformen untersucht: 1) Spitzhörnchen (Tupaiidae) sind evolutionär näher mit dem Menschen verwandt als Nagetiere und wurden deshalb als Alternativmodelle für die Untersuchung menschlicher Erkrankungen vorgeschlagen. In dieser Arbeit wurde erstmals der Arachidonsäurestoffwechsel von Spitzhörnchen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass im Genom von Tupaia belangeri vier unterschiedliche ALOX15-Gene vorkommen und die Enzyme sich hinsichtlich ihrer katalytischen Eigenschaften ähneln. Diese genomische Vielfalt, die weder beim Menschen noch bei Mäusen vorhanden ist, erschwert die funktionellen Untersuchungen zur biologischen Rolle des ALOX15-Weges. Damit scheint Tupaia belangeri kein geeigneteres Tiermodel für die Untersuchung des ALOX15-Weges des Menschen zu sein. 2) Entsprechend der Evolutionshypothese können Säugetier-ALOX15-Orthologe in Arachidonsäure-12-lipoxygenierende- und Arachidonsäure-15-lipoxygenierende Enzyme eingeteilt werden. Dabei exprimieren Säugetierspezies, die einen höheren Evolutionsgrad als Gibbons aufweisen, Arachidonsäure-15-lipoxygenierende ALOX15-Orthologe, während evolutionär weniger weit entwickelte Säugetiere Arachidonsäure-12 lipoxygenierende Enzyme besitzen. In dieser Arbeit wurden elf neue ALOX15-Orthologe als rekombinante Proteine exprimiert und funktionell charakterisiert. Die erhaltenen Ergebnisse fügen sich widerspruchsfrei in die Evolutionshypothese ein und verbreitern deren experimentelle Basis. Die experimentellen Daten bestätigen auch das Triadenkonzept. 3) Da humane und murine ALOX15B-Orthologe unterschiedliche funktionelle Eigenschaften aufweisen, können Ergebnisse aus murinen Krankheitsmodellen zur biologischen Rolle der ALOX15B nicht direkt auf den Menschen übertragen werden. Um die ALOX15B-Orthologen von Maus und Mensch funktionell einander anzugleichen, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Knock-in Mäuse durch die In vivo Mutagenese mittels CRISPR/Cas9-Technik hergestellt. Diese exprimieren eine humanisierte Mutante (Doppelmutation von Tyrosin603Asparaginsäure+Histidin604Valin) der murinen Alox15b. Diese Mäuse waren lebens- und fortpflanzungsfähig, zeigten aber geschlechtsspezifische Unterschiede zu ausgekreuzten Wildtyp-Kontrolltieren im Rahmen ihre Individualentwicklung. 4) In vorhergehenden Untersuchungen zur Rolle der ALOX15B in Rahmen der Entzündungsreaktion wurde eine antiinflammatorische Wirkung des Enzyms postuliert. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine Humanisierung der murinen Alox15b die Entzündungsreaktion in zwei verschiedenen murinen Entzündungsmodellen beeinflusst. Eine Humanisierung der murinen Alox15b führte zu einer verstärkten Ausbildung von Entzündungssymptomen im induzierten Dextran-Natrium-Sulfat-Kolitismodell. Im Gegensatz dazu bewirkte die Humanisierung der Alox15b eine Abschwächung der Entzündungssymptome im Freund‘schen Adjuvans Pfotenödemmodell. Diese Daten deuten darauf hin, dass sich die Rolle der ALOX15B in verschiedenen Entzündungsmodellen unterscheidet. N2 - Arachidonic acid lipoxygenases (ALOX-isoforms) are lipid peroxidizing enzymes that have been implicated in cell differentiation and in the pathogenesis of different diseases. In the human genome six different ALOX genes have been identified and all of them occur as single copy genes. For each human ALOX gene an ortholog exists in the mouse genome. Although human and mouse ALOX orthologs share a high degree of structural similarity ALOX15 and ALOX15B orthologs exhibit distinct functional characteristics. In the present study addressed four different questions on the occurrence, the biological role and enzyme evolution of mammalian ALOX15 and ALOX15B orthologs. 1) Tupaiidae are more closely related to humans than rodents and therefore these mammals have frequently been suggested as better animal models than mice for investigations into patho-physiological basis of human diseases. This work explored for the first time the arachidonic acid metabolism of a Tupaiidae representative (Tupaia belangeri) and found that this mammal carries four distinct ALOX15 genes in its genome. The enzymes encoded by these four genes share a high degree of functional similarity but the observed genomic multiplicity, which is neither present in mice nor in humans, makes studies into the biological role of ALOX15 orthologs more complex. Thus, Tupaia belangeri is not more suitable than mice for investigations into the biological role of mammalian ALOX15 orthologs since loss-of-function studies on one ALOX15 ortholog may easily be compensated by upregulation of an orthologous gene. 2) According to the Evolutionary Hypothesis mammalian ALOX15 orthologs can be subdivided into arachidonic acid 12-lipoxygenating and arachidonic acid 15-lipoxygenating enzymes. Mammalian species, which are ranked above gibbons express arachidonic acid 15 lipoxygenating ALOX15 orthologs. In contrast mammals ranked below gibbons express arachidonic acid 12-lipoxygenating enzymes. In this study the ALOX15 orthologs of eleven different mammals expressed as recombinant proteins and characterized their functional properties. The results of these experiments were consistent with the Evolutionary Hypothesis and put this theory on a broader experimental basis. Moreover, the obtained in vitro mutagenesis data indicate that the novel enzymes follow Triad Concept. 3) Since human and mouse ALOX15B orthologs exhibit different functional properties, conclusion drawn in mouse models of human diseases may be misleading. To make human and mouse ALOX15B orthologs more like each other were generated Alox15b knock-in mice, which express the humanized Tyr603Asp+His604Val double mutant of mouse Alox15b instead of the endogenous wildtype enzyme employing the CRISPR/Cas9 in vivo mutagenesis strategy. These Alox15b-KI mice are viable, reproduce normally but exhibit gender-specific differences to outbred wildtype control animals when the bodyweight kinetics during adolescence and early adulthood were followed. 4) In previous studies an anti-inflammatory role of ALOX15B in the pathogenesis of inflammation has been suggested. Here we explored whether functional humanization of mouse Alox15b impacts the severity of inflammatory symptoms in two mouse inflammation models. In the dextran-sodium sulfate colitis model humanization of mouse Alox15b induced more severe inflammatory symptoms. In contrast, humanization of this enzyme protected mice in the Freund’s complete adjuvants induced paw edema model. Taken together, these data suggest that the patho-physiological roles of Alox15b may vary depending on the type of the animal inflammation model used. KW - Lipoxygenase KW - ALOX15B KW - Knock in Mäuse KW - enzymatische Reaktionsspezifität KW - Tupaia belangeri KW - DSS-Colitis KW - Pfotenödem Mausmodell KW - mammalian ALOX15 orthologs Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-620340 ER - TY - THES A1 - Sureshkumar, Priyavathi T1 - Erweiterung der zellbasierten Calcium-Imaging-Methode im eukaryotischen zellfreien Proteinsynthese-System für die transient-receptor-potential (TRP) - Ionenkanäle N2 - Die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode wird auch heute noch als gängige Methode verwendet, vor allem wegen der geringeren Kosten für das Wirkstoffscreening in der pharmazeutischen Forschung, wobei Ionenkanäle sowie einige der G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) die Mehrzahl der Wirkstoffziele ansprechen. Die zellfreie Synthese eukaryotischer Proteine hat nicht die Nachteile, die bei der Überexpression dieser ionenpermeablen Proteine in Zellen auftreten können, wie z. B. Zelltoxizität, geringere Proteinexpression und die Beseitigung der exprimierten Proteine aufgrund veränderter Domänen sowie die zeitaufwändige Pflege von Zelllinien. Die Synthese von Ionenkanälen in zellfreien Proteinsyntheseplattformen für das künftige Wirkstoffscreening ist noch in der Grundlagenforschung. Obwohl die Fluoreszenz-Calcium-Imaging-Methode in zellbasierten Assays weit verbreitet ist, wurde diese Methode bisher noch nicht in zellfreien Proteinexpressionssystemen verwendet. Insgesamt ist die neue Anwendung der Calcium-Imaging-Methode in eukaryontischen zellfreien Systemen eine Voraussetzung für die schnelle pharmakologische Analyse von Wirkstoffen. Das erste Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit bestand darin, die grundlegenden Prinzipien der Calcium-Imaging-Methode zur Untersuchung von Ionenkanälen in zellbasierten Systemen zu untersuchen. Hierfür wurden zwei Tumorzelllinien des Auges verwendet, und zwar benigne Pterygiumzellen und maligne Aderhautmelanom 92.1 Zellen. In diesen Studien wurde die Interaktion zwischen den nativ überexprimierten transient-receptor-potential-Ionenkanälen (TRPs) wie TRP Vanilliod 1 (TRPV1) (Capsaicinrezeptor) und TRP Melastatin 8 (TRPM8) (Mentholrezeptor) in diesen Tumorzellen nach Zugabe von verschiedenen Medikamenten und Hormonen untersucht. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, den Calcium-Mechanismus von GPCRs in den Zellen zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde Mas, ein GPCR und Angiotensin (1-7) -Hormonrezeptor, aus dem renin-angiotensin-aldosteron-system (RAAS) in der Human Embryonic Kidney-293 (HEK293) Zelllinie überexprimiert. In dieser Studie wurden insbesondere die Aktivierung klassischer GPCR-Signalwege wie Phospholipase C und Proteinkinase C durch Angiotensin-(1-7) über Mas und die Beteiligung von TRP-Kanälen nachgewiesen. Die zellbasierte-Calcium-Imaging-Methode für chemische Calcium-Indikatoren ließ sich aufgrund der Anwesenheit einer großen Menge cytosolischer Carboxylesterasen gut anwenden. Carboxylesterase ist das wichtigste Enzym in der Calcium Imaging Methode, das die Verarbeitung chemischen Calcium-Farbstoffe behandelt. Dieses Enzym fehlt jedoch in Mikrosomen, die als Basismembran für die Integration synthetisierter Ionenkanäle in eukaryontischen zellfreien Systemen verwendet werden. Das dritte Ziel dieser Forschungsarbeit war die Umsetzung der zellbasierten Calcium-Imaging Methode und der Calcium-Signalwege in zellfreie Systeme. Hier wurde die zellfrei synthetisierte Carboxylesterase in Mikrosomen von Spodoptera frugiperda (Sf21) als praktikables Calcium-Imaging-Werkzeug etabliert, um sowohl native ionenpermeable Proteine als auch zellfrei-synthetisierte Ionenkanäle zu untersuchen. Die Enzymaktivität der zellfrei-synthetisierten Carboxylesterase in Mikrosomen wurde durch Esterase-Assays und den Calcium-Fluoreszenzfarbstoff Fluo-5N Acetoxymethylester (Fluo-5N AM) Belastungstests nachgewiesen. Das Calcium-Imaging der nativ vorhandenen Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen/endoplasmatischen Retikulums (SERCA) und der Ryanodin-Rezeptoren (RyR) in den Mikrosomen sowie der zell-frei exprimierten TRP-Ionenkanäle wurden mit dem Fura-5N-AM- Fluoreszenzfarbstoff in mit Carboxylesterase vorsynthetisierten Mikrosomen nachgewiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Prinzip der zellbasierten Calcium-Imaging -Methode vielversprechend an das eukaryotische zellfreie Sf21-System angepasst werden konnte, um Ionenkanäle zu analysieren. Nach entsprechender Forschung könnte die etablierte Methode in Zukunft auch auf andere Membranproteine ausgeweitet werden. Dies umfasst die Untersuchung anderer zell-frei exprimierte GPCRs oder anderer Ionenkanäle wie Kalium-, Natrium- und Chlorid-Ionenkanäle. N2 - Fluorescence calcium imaging is still used today used as the common method, mainly due to its cheaper costs for drug screening in pharmaceutical research encompassing both ion channels, and part of G- Protein Coupled Receptors (GPCRs) in the major share of drug targets. Eukaryotic cell-free protein translation overcomes several drawbacks that might occur for overexpression of these ion-permeable proteins in the cells such as cell toxicity, poor protein expression, and deletion due to modified protein domain and time-consuming cell line maintenance. Expressing ion channels in the cell-free protein synthesis platform for future drug screening processes is still ongoing basic research and so far, no calcium imaging technique for cell-free expressed ion channels is available. Taken together, the novel application of the fluorescence calcium imaging method in eukaryotic cell-free systems is a prerequisite for rapid pharmacological drug investigations, which are not feasible using conventional call-based approaches. The aim of this thesis is to investigate the common calcium signaling pathways relevant to drug research via ion channels and GPCRs in cell-based systems. Thereby, the basic mechanism of the cell-based calcium imaging for chemical calcium indicators is studied and then translate its principle to the cell-free protein synthesis platforms. In order to study the cell-based calcium imaging and calcium pathways, two types of eye tumor cell-based models, namely benign pterygial tumor cells and malign uveal melanoma 92.1 cells were used. Specifically, the interplay between the natively expressed Transient Receptor Potential Channels (TRPs) like TRP-Vanilloid 1 (TRPV1) (Capsaicin receptor) and TRP-Melastatin 8 (TRPM8) (Menthol receptor) in these tumor cells was investigated by application of various drugs and hormones. The second aim of this thesis was to investigate the cell-based calcium mechanism of GPCRs. For this, overexpressed Mas, a GPCR and Angiotensin-(1-7) hormone receptor, from the Renin Angiotensin Aldosterone System (RAAS) in the Human Embryonic Kidney (HEK293) cells was used. Particularly, the activation of classical GPCR pathways like Phospholipase C and Proteinkinase C via Ang-(1-7) through Mas and the involvement of TRPs was proven in this study. The third aim of this thesis is to translate the cell-based calcium imaging principle to cell-free systems. Cell-based calcium imaging for chemical calcium indicators could be performed with all ease due to the presence of a large amount of cytosolic carboxylesterase, the crucial enzyme which handles the chemical calcium dyes. But this enzyme is absent in microsomes. Microsomes are used as a backbone membrane to integrate the synthesized ion channels in a eukaryotic cell-free system. Cell-free synthesized carboxylesterase in Spodoptera frugiperda (Sf21) microsomes is established as a viable calcium imaging tool to study both natively present ion permeable proteins and cell-free synthesized ion channels. The enzyme activity of the carboxylesterase in microsomes was confirmed by esterase assays and fluorescent calcium dye Fluo-5N Acetoxymethylester (Fluo-5N AM) loading assays. Fluorescent calcium imaging of natively present SERCA (Sarco Endoplasmic Reticulum Calcium ATPase) and ryanodine channels in the microsomes and cell-free expressed TRPV1 channel was demonstrated using Fluo-5N AM fluorescent dye in carboxylesterase pre-synthesized microsomes. With adequate research in future, the established method could be promisingly extended to study other cell-free expressed GPCRs or other ion channels like potassium, sodium, and chloride ion channels. KW - zellfreie Proteinsynthese KW - Calcium-Imaging KW - transient-receptor-potential-Ionenkanäle KW - calcium imaging KW - transient receptor potential ion channels KW - cell-free protein synthesis Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-619872 ER - TY - THES A1 - Geisendörfer, Birte T1 - Autologer Ansatz zur Entwicklung von 2D- und 3D-Kokultivierungsmethoden für die Bestimmung des sensibilisierenden Potenzials von Xenobiotika N2 - Die allergische Kontaktdermatitis ist eine immunologisch bedingte Hauterkrankung mit insbesondere in den westlichen Industrienationen hoher und weiter ansteigender Prävalenz. Es handelt sich hierbei um eine Hypersensitivitätsreaktion vom Typ IV, die sich nach Allergenkontakt durch Juckreiz, Rötung, Bläschenbildung und Abschälung der Haut äußert. Zahlreiche Xenobiotika besitzen das Potenzial, Kontaktallergien auszulösen, darunter Konservierungsstoffe, Medikamente, Duftstoffe und Chemikalien. Die wirksamste Maßnahme zur Eindämmung der Erkrankung ist die Expositionsprophylaxe, also die Vermeidung des Kontakts mit den entsprechenden Substanzen. Dies wiederum setzt die Kenntnis des jeweiligen sensibilisierenden Potenzials einer Substanz voraus, dessen Bestimmung aus diesem Grund eine hohe toxikologische Relevanz besitzt. Zu diesem Zweck existieren von der OECD veröffentlichte Testleitlinien, welche auf entsprechend validierten Testmethoden basieren. Goldstandard bei der Prüfung auf hautsensibilisierendes Potenzial war über lange Zeit der murine Lokale Lymphknotentest. Seit der 7. Änderung der EU-Kosmetikrichtlinie, welche Tierversuche für Kosmetika und deren Inhaltsstoffe untersagt, wurden vermehrt Alternativmethoden in die OECD-Testleitlinien implementiert.. Die bestehenden in vitro Methoden sind jedoch alleinstehend nur begrenzt aussagekräftig, da sie lediglich singuläre Mechanismen bei der Entstehung einer Kontaktallergie abbilden. Die Entwicklung von Testmethoden, welche mehrere dieser Schlüsselereignisse berücksichtigen, erscheint daher richtungsweisend. Einen vielversprechenden Ansatz liefert hierbei der Loose-fit coculture-based sensitisation assay (LCSA), welcher eine Kokultur aus primären Keratinozyten und PBMC darstellt. Bei der Kokultivierung von Immunzellen mit anderen Zelltypen stellt sich allerdings die Frage, inwiefern die Nutzung von Zellen derselben Spender*innen (autologe Kokultur) bzw. verschiedener Spender*innen (allogene Kokultur) einen Einfluss nimmt. Zu diesem Zweck wurden im Rahmen dieser Arbeit Hautzellen spenderspezifisch aus gezupften Haarfollikeln isoliert und der LCSA mit den generierten HFDK in autologen und allogenen Ansätzen verglichen. Zusätzlich wurde auch ein Vergleich zwischen der Nutzung von HFDK und NHK, welche aus humaner Vorhaut isoliert wurden, im LCSA durchgeführt. Dabei ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen autologen und allogenen Kokulturen bzw. zwischen der Verwendung von HFDK und NHK. Die Verwendung allogener Zellen aus anonymem Spendermaterial sowie die Nutzung von Keratinozyten aus unterschiedlichen Quellen scheint im Rahmen des LCSA problemlos möglich. Einige der getesteten Kontaktallergene, darunter DNCB und NiCl2, erwiesen sich im LCSA jedoch als problematisch und konnten nicht zufriedenstellend als sensibilisierend detektiert werden. Daher wurde eine Optimierung der Kokultur durch Verwendung ex vivo differenzierter Langerhans Zellen (MoLC) angestrebt, welche ein besseres Modell primärer epidermaler Langerhans Zellen darstellen als die dendritischen Zellen aus dem LCSA. Zusätzlich wurden weitere, den Erfolg der Kokultur beeinflussende Faktoren, wie die Art und Zusammensetzung des Mediums und die Kokultivierungsdauer, untersucht und angepasst. Das schlussendlich etablierte Kokultivierungsprotokoll führte zu einer maßgeblich verstärkten Expression von CD207 (Langerin) auf den MoLC, was auf eine wirkungsvolle Interaktion zwischen Haut- und Immunzellen in der Kokultur hindeutete. Des Weiteren konnten DNCB und NiCl2 im Gegensatz zum LCSA durch Verwendung des kostimulatorischen Moleküls CD86 sowie des Reifungsmarkers CD83 als Ausleseparameter eindeutig als Kontaktallergene identifiziert werden. Die Untersuchungen zur Kokultur von MoLC und HFDK wurden jeweils vergleichend in autologen und allogenen Ansätzen durchgeführt. Ähnlich wie beim LCSA kam es aber auch hier zu keinen signifikanten Unterschieden, weder hinsichtlich der Expression von Charakterisierungs- und Aktivierungsmarkern auf MoLC noch hinsichtlich der Zytokinsekretion in den Zellkulturüberstand. Die Hinweise aus zahlreichen Studien im Mausmodell, dass Zellen des angeborenen Immunsystems zur Erkennung von und Aktivierung durch allogene Zellen bzw. Gewebe in der Lage sind, bestätigten sich im Rahmen dieser Arbeit dementsprechend nicht. Aus diesem Grund wurden abschließend CD4+ T-Lymphozyten, die Effektorzellen des adaptiven Immunsystems, in die Kokultur aus MoLC und autologen bzw. allogenen HFDK integriert. Überraschenderweise traten auch hier keine verstärkten Aktivierungen in allogener Kokultur im Vergleich zur autologen Kokultur auf. Die Nutzung autologer Primärzellen scheint im Rahmen der hier getesteten Methoden nicht notwendig zu sein, was die Validierung von Kokulturen und deren Implementierung in die OECD-Testleitlinien erleichtern dürfte. Zuletzt wurde eine Kokultivierung primärer Haut- und Immunzellen auch im 3D-Vollhautmodell durchgeführt, wobei autologe MoLC in die Epidermisäquivalente entsprechender Modelle integriert werden sollten. Obwohl die erstellten Hautmodelle unter Verwendung autologer Haarfollikel-generierter Keratinozyten und Fibroblasten eine zufriedenstellende Differenzierung und Stratifizierung aufwiesen, gestaltete sich die Inkorporation der MoLC als problematisch und konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht erreicht werden. KW - Kontaktallergie KW - Langerhans Zellen KW - Alternativmethoden KW - Kokultur KW - Hautmodell Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Tanner, Norman T1 - Methoden zur routinemäßigen Untersuchung von Bienenprodukten mittels Fourier-transformierter Infrarotspektroskopie Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Wetzel, Alexandra T1 - Epigenetische Regulation des Epstein-Barr Virus-induzierten Gens 3 (EBI3) und dessen Bedeutung bei Colitis ulcerosa N2 - Epigenetische Mechanismen spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von Colitis ulcerosa (CU). Ihr Einfluss auf das beobachtete Ungleichgewicht zwischen pro- und anti-inflammatorischen Cytokinen ist hingegen weitgehend unerforscht. Einige der wichtigsten immunmodulatorischen Cytokine sind die Mitglieder der heterodimeren Interleukin- (IL-) 12-Familie, die durch das Kombinieren einer der drei α-Ketten (IL-12p35, IL-27p28, IL-23p19) mit den ß-Untereinheiten IL-12p40 oder EBI3 (Epstein-Barr Virus-induziertes Gen 3) charakterisiert sind. IL-35 (IL-12p35/EBI3) spielt eine bedeutende anti-inflammatorische Rolle bei verschiedenen Erkrankungen, wohingegen seine Level bei chronischen Entzündungen erniedrigt sind. Eine mögliche Ursache könnte eine transkriptionelle Stilllegung über epigenetische Modifikationen sein. Tatsächlich konnte durch die Stimulation mit dem DNA-Methyltransferase-Inhibitor (DNMTi) Decitabin (DAC; Dacogen®) eine Induktion von EBI3 in humanen Epithelzellen aus gesundem Colon (HCEC) erreicht werden, die als Modell für ein lokales Entzündungsgeschehen dienten. Diese Regulation über DNA-Methylierung konnte in weiteren humanen Zellen unterschiedlichen Ursprungs sowie durch Stimulation von HCEC-Zellen mit zwei weiteren DNMTi, dem Cytosin-Analogon Azacytidin (AZA; Vidaza®) und dem natürlich vorkommenden, epigenetisch wirksamen Polyphenol Epigallocatechingallat (EGCG), verifiziert werden. Die kombinierte Inkubation mit Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα) resultierte jeweils in einer über-additiven Induktion von EBI3. Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass TNFα trotz Beeinflussung der epigenetischen DNMT- und Ten-eleven Translocation- (TET-) Enzyme keinen Einfluss auf die globalen Methylierungs- oder Hydroxymethylierungslevel hatte, jedoch eine genspezifische DNA-Hypomethylierung im EBI3-Promotor induzierte. Durch Nutzung verschiedener Inhibitoren konnte darüber hinaus nachgewiesen werden, dass der beobachtete synergistische Effekt der gemeinsamen DAC und TNFα-Stimulation hauptsächlich über NFκB (Nuclear factor “kappa-light-chain-enhancer” of activated B-cells) vermittelt wird. Ein Teil verläuft dabei über p38 MAPK (mitogen-activated protein kinases), während die JNK- (c-Jun N-terminale Kinasen-) und ERK- (extracellular-signal-regulated kinases) Signalwege keine Rolle spielen. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem gezeigt, dass die DNA-Hypomethylierung während eines entzündlichen Zustandes auch in einer erhöhten EBI3-Proteinexpression resultiert. Die Höhe der immunologisch detektierten Banden wies auf eine Dimerbildung sowohl im Zelllysat als auch im Überstand hin. Humane Colonepithelzellen sind demnach in der Lage, Cytokine zu bilden und zu sezernieren, was die Bedeutung von Nicht-Immunzellen bei der lokalen Immunantwort unterstreicht. Mittels Genexpressionsanalysen wurden IL-12p35 und IL-23p19 als mögliche Bindungspartner identifiziert. Aufgrund kreuzreaktiver Antikörper ist ein direkter Nachweis der EBI3-Dimere derzeit nicht möglich. Die stattdessen genutzte Kombination verschiedener Methoden dient als geeigneter Ersatz für die problematischen Antikörper-basierten Analysen wie Immunpräzipitation oder ELISA. Durch molekularbiologische, immunologische und massenspektrometrische Methoden konnte IL-35 identifiziert werden, während IL-39 (IL-23p19/EBI3) nicht detektiert wurde. Dies ist in Einklang mit den Erkenntnissen mehrerer Forschungsgruppen, die eine Bildung des nativen humanen Dimers aus IL-23p19 und EBI3 bezweifeln. Des Weiteren wurde die biologische Aktivität des behandlungsinduzierten IL 35-Proteins durch einen Funktionsassay nachgewiesen. Neben einer DNMTi-bedingten transkriptionellen Aktivierung konnte eine Regulation von EBI3 über Histonacetylierungen gezeigt werden. Der EBI3-induzierende Effekt des Histondeacetylasen-Inhibitors (HDACi) Trichostatin A (TSA) wurde durch SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid (Vorinostat; Zolinza®)) verifiziert. Ähnlich zu der Stimulation mit den hypomethylierenden Substanzen wurde ein synergistischer Effekt bei paralleler Inkubation mit TNFα beobachtet, der in einer gesteigerten Bildung des EBI3-Proteins resultierte. Um die Befunde in einem komplexeren in vivo-Modell zu untersuchen, wurde eine chronische Colitis in Ebi3-defizienten Mäusen und dem dazugehörigen Wildtypstamm C57BL/6 durch zyklische Applikation von Natriumdextransulfat (Dextran sodium sulfate (DSS)) induziert. Der Vergleich klinischer Parameter wie Mortalitätsrate und Körper- sowie Milzgewicht wies bei Abwesenheit von Ebi3 signifikant stärkere colitische Symptome auf. Dies bestätigte die zentrale Rolle von Ebi3 in der Colitisentwicklung und deutete auf eine bevorzugte Bildung des anti-inflammatorisch wirkenden IL-35 statt des pro-inflammatorischen IL-39 in den Wildtyptieren hin. Durch zusätzliche therapeutische Behandlung der C57BL/6-Mäuse nach der DSS-Gabe konnte die in der Literatur beschriebene positive Wirkung von SAHA auf die Colitismanifestation bestätigt werden. Im Gegensatz dazu war der HDACi in den Ebi3-defizienten Tieren nicht in der Lage, die colitischen Parameter zu verbessern beziehungsweise verschlimmerte den Krankheitsphänotyp. Expressionsanalysen von Up- und Downstream-Target-Genen lieferten weitere Hinweise darauf, dass bei Anwesenheit von Ebi3 IL-35 statt IL-39 gebildet wird, was in Einklang mit den in vitro-Untersuchungen steht. Die vorliegende Arbeit konnte durch den Vergleich der C57BL/6-Mäuse mit den Ebi3-defizienten Tieren neue Erkenntnisse über die Wirkungsweise von SAHA erbringen. Histonacetylierende Bedingungen verbessern colitische Symptome über einen Mechanismus, der die epigenetische Induktion von Ebi3 mit nachfolgender IL-35-Bildung involviert. Durch Kooperation der epigenetischen Mechanismen Hypomethylierung und Histonacetylierung wurde der stärkste Effekt auf die EBI3-Induktion bewirkt. Insgesamt konnte in der vorliegenden Arbeit durch in vitro- und in vivo-Analysen die epigenetische und NFκB-vermittelte Induktion von EBI3 über DNA-Demethylierung und Histonacetylierung mit nachfolgender IL-35-Bildung und –Sezernierung nachgewiesen werden. Da IL-35 in der Lage ist, colitische Symptome zu mildern, stellt die epigenetische Reaktivierbarkeit von EBI3 durch DNMTi und HDACi eine vielversprechende Alternative für die derzeit genutzten, oft nicht oder nur kurzfristig wirksamen Therapien bei der Behandlung einer CU dar. Einer übermäßigen Immunantwort während schubweiser entzündlicher Phasen könnte entgegengewirkt und Komplikationen wie die Bildung Colitis-assoziierter Karzinome verhindert werden. N2 - Aberrant epigenetic alterations are becoming increasingly relevant in the development of multiple diseases. Epigenetic mechanisms also play a crucial role in the pathogenesis of ulcerative colitis (CU). In contrast, their influence on the observed imbalance between pro- and anti-inflammatory cytokines is largely unexplored. Several of the most important immunomodulatory cytokines are the members of the heterodimeric interleukin- (IL-) 12 family, which are characterized by combining one of the three α-chains (IL-12p35, IL-27p28, IL-23p19) with the ß-subunits IL-12p40 or EBI3 (Epstein-Barr virus induced gene 3). IL-35 (IL-12p35/EBI3) plays a significant anti-inflammatory role in various diseases, while its levels are decreased in chronic inflammation. One possible reason could be transcriptional silencing via epigenetic modifications. Indeed, stimulation with the DNA methyltransferase inhibitor (DNMTi) decitabine (DAC; Dacogen®) resulted in reactivation of EBI3 in Human Colon Epithelial Cells (HCEC) generated from healthy tissue, which served as a model for a local inflammatory process. This regulation via DNA methylation could be verified in other human cells of different origin as well as by stimulating HCEC cells with two additional DNMTi, the cytosine analog azacytidine (AZA; Vidaza®) and the naturally occurring, epigenetically active polyphenol epigallocatechin gallate (EGCG). Combined incubation with tumor necrosis factor α (TNFα) resulted in synergistic induction of EBI3. Further studies showed that TNFα had no effect on global methylation or hydroxymethylation levels despite its influence on epigenetic DNMT and ten-eleven translocation (TET) enzymes, but induced gene-specific DNA hypomethylation in the EBI3 promoter. Moreover, by using several inhibitors, it has been demonstrated that the synergistic effect of DAC and TNFα stimulation is mediated mainly via NFκB (nuclear factor "kappa-light-chain-enhancer" of activated B-cells). Part of this occurs via p38 MAPK (mitogen-activated protein kinases), while the JNK (c-Jun N-terminal kinases) and ERK (extracellular-signal-regulated kinases) signaling pathways are not involved. In the present work, it was also shown that DNA hypomethylation during an inflammatory condition also results in increased EBI3 protein expression. The level of immunologically detected bands indicated dimer formation in both cell lysate and supernatant. Human epithelial cells are therefore capable of producing and secreting cytokines, underlining the importance of non-immune cells in the local immune response. Gene expression analyses identified IL-12p35 and IL-23p19 as possible binding partners. Due to cross-reactive antibodies, direct detection of EBI3 dimers is currently not possible. The combination of different methods used instead serves as a suitable alternative to the problematic antibody-based analyses such as immunoprecipitation or ELISA. Molecular biology, immunology, and mass spectrometry methods identified IL-35, whereas IL-39 (IL-23p19/EBI3) was not detected. This is in agreement with the findings of several research groups that doubt formation of the native human dimer. Furthermore, the biological activity of treatment-induced IL-35 protein was detected by a functional assay. In addition to DNMTi-induced reactivation, regulation of EBI3 via histone acetylation was demonstrated. The EBI3-inducing effect of the histone deacetylase inhibitor (HDACi) trichostatin A (TSA) was verified by SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid (Vorinostat; Zolinza®)). Similar to stimulation with the hypomethylating agents, a synergistic effect was observed with parallel incubation with TNFα, resulting in increased EBI3 protein formation. To investigate the effects in a more complex in vivo model, chronic colitis was induced in Ebi3-deficient mice and the corresponding wild-type strain C57BL/6 by cyclic application of dextran sodium sulfate (DSS). Comparison of clinical parameters such as mortality rate and body as well as spleen weight showed significantly more severe colitic symptoms in the absence of Ebi3. This confirmed the central role of Ebi3 in colitis development and indicated preferential formation of the anti-inflammatory IL-35 rather than the pro-inflammatory IL-39 in wild-type animals. Additional therapeutic treatment of C57BL/6 mice after DSS administration confirmed the beneficial effect of SAHA on colitis manifestation reported in the literature. In contrast, HDACi in the Ebi3-deficient animals was not able to improve colitic parameters and even appeared to exacerbate the disease phenotype. Expression analyses of up- and downstream target genes provided further evidence that IL-35 rather than IL-39 is produced in the presence of Ebi3, consistent with the in vitro studies. Thus, comparison of the C57BL/6 mice with the Ebi3-deficient animals could provide insights into the mode of action of SAHA. Histone acetylating conditions ameliorate colitic symptoms via a mechanism involving epigenetic induction of Ebi3 followed by IL-35 formation. Based on the cooperation of epigenetic mechanisms and the drastic EBI3 induction shown by parallel hypomethylating and histone acetylating conditions, combined treatment with low-dose DNMTi and HDACi represents a therapeutic option for CU. In summary, the present work demonstrated epigenetic and NFκB-mediated reactivation of EBI3 via DNA demethylation and histone acetylation with subsequent IL-35 formation and secretion by in vitro and in vivo analyses. Since IL-35 is able to alleviate colitic symptoms, the epigenetic inducibility of EBI3 by DNMTi and HDACi represents a promising alternative for the currently used therapies in the treatment of CU, which are often not successful or only short-term effective. An excessive immune response during relapsing inflammatory phases could be counteracted and complications such as the formation of colitis-associated carcinomas prevented. KW - Epigenetik KW - Epstein-Barr Virus-induziertes Gen 3 KW - Colitis ulcerosa Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Steppert, Isabel T1 - Entwicklung einer nichtinvasiven Diagnostikmethode zum Nachweis von Infektionserregern T1 - Development of a non-invasive diagnostic method for the identification of infectious pathogens N2 - Die aktuelle COVID-19-Pandemie zeigt deutlich, wie sich Infektionskrankheiten weltweit verbreiten können. Neben Viruserkrankungen breiten sich auch multiresistente bakterielle Erreger weltweit aus. Dementsprechend besteht ein hoher Bedarf, durch frühzeitige Erkennung Erkrankte zu finden und Infektionswege zu unterbrechen. Herkömmliche kulturelle Verfahren benötigen minimalinvasive bzw. invasive Proben und dauern für Screeningmaßnahmen zu lange. Deshalb werden schnelle, nichtinvasive Verfahren benötigt. Im klassischen Griechenland verließen sich die Ärzte unter anderem auf ihren Geruchssinn, um Infektionen und andere Krankheiten zu differenzieren. Diese charakteristischen Gerüche sind flüchtige organische Substanzen (VOC), die im Rahmen des Metabolismus eines Organismus entstehen. Tiere, die einen besseren Geruchssinn haben, werden trainiert, bestimmte Krankheitserreger am Geruch zu unterscheiden. Allerdings ist der Einsatz von Tieren im klinischen Alltag nicht praktikabel. Es bietet sich an, auf technischem Weg diese VOCs zu analysieren. Ein technisches Verfahren, diese VOCs zu unterscheiden, ist die Ionenmobilitätsspektrometrie gekoppelt mit einer multikapillaren Gaschromatographiesäule (MCC-IMS). Hier zeigte sich, dass es sich bei dem Verfahren um eine schnelle, sensitive und verlässliche Methode handelt. Es ist bekannt, dass verschiedene Bakterien aufgrund des Metabolismus unterschiedliche VOCs und damit eigene spezifische Gerüche produzieren. Im ersten Schritt dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die verschiedenen Bakterien in-vitro nach einer kurzen Inkubationszeitzeit von 90 Minuten anhand der VOCs differenziert werden können. Hier konnte analog zur Diagnose in biochemischen Testreihen eine hierarchische Klassifikation der Bakterien erfolgen. Im Gegensatz zu Bakterien haben Viren keinen eigenen Stoffwechsel. Ob virusinfizierte Zellen andere VOCs als nicht-infizierte Zellen freisetzen, wurde an Zellkulturen überprüft. Hier konnte gezeigt werden, dass sich die Fingerprints der VOCs in Zellkulturen infizierter Zellen mit Respiratorischen Synzytial-Viren (RSV) von nicht-infizierten Zellen unterscheiden. Virusinfektionen im intakten Organismus unterscheiden sich von den Zellkulturen dadurch, dass hier neben Veränderungen im Zellstoffwechsel auch durch Abwehrmechanismen VOCs freigesetzt werden können. Zur Überprüfung, inwiefern sich Infektionen im intakten Organismus ebenfalls anhand VOCs unterscheiden lassen, wurde bei Patienten mit und ohne Nachweis einer Influenza A Infektion als auch bei Patienten mit Verdacht auf SARS-CoV-2 (Schweres-akutes-Atemwegssyndrom-Coronavirus Typ 2) Infektion die Atemluft untersucht. Sowohl Influenza-infizierte als auch SARS-CoV-2 infizierte Patienten konnten untereinander und von nicht-infizierten Patienten mittels MCC-IMS Analyse der Atemluft unterschieden werden. Zusammenfassend erbringt die MCC-IMS ermutigende Resultate in der schnellen nichtinvasiven Erkennung von Infektionen sowohl in vitro als auch in vivo. N2 - The current COVID-19 pandemic demonstrates the worldwide spread of infectious diseases. Besides virus infections there is also a worldwide dissemination of multiresistant bacterial strains. Therefore, there is an urgent need for rapid non-invasive screening methods. There is an unmet need to cut infection chains by early detection of infected subjects. Conventional cultural methods require minimally invasive or invasive samples and are not feasible for mass screening due to a long analysis time. In classical Greece, physicians also used their olfactory senses to differentiate infections from other diseases. These characteristic odors are volatile organic compounds (VOC) produced by the metabolism of an organism. Animals with a much better olfactory sense have been trained to detect different germs by their odors. However, the use of sniffing animals is not practicable in clinical settings. A technical detection of VOCs is therefore desirable. One technical approach for the differentiation of VOCs is ion mobility spectrometry coupled with a multicapillary gas chromatography (MCC-IMS). It could be shown that this method is a rapid, sensitive, and reliable method. It is known that various bacteria produce VOCs by their metabolism and therefore different specific smells. By the MCC-IMS method, different bacterial species could be distinguished based on the VOCs after an incubation time as short as 90 minutes in vitro. Comparable to biochemical series of tests a decision tree for the classification of bacteria could be implemented. In contrast to bacteria viruses have no own metabolism and thus are dependent on the host metabolism. Cell cultures were used to determine whether virus-infected cells release other VOCs than non-infected cells. It could be shown here that cell cultures infected with respiratory syncytial virus (RSV) differ from non-infected cell cultures in VOC profiles. Unlike in cell cultures, in the intact organism changes in VOC profiles are not only dependent on cell metabolism alterations but also in defense mechanisms. To investigate infection induced VOC changes in intact organisms, nasal breath of patients with and without influenza A infection as well as of patients with suspected SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2) infection were analyzed. It was proven that a breath analysis using a MCC-IMS is able to distinguish infected patients from non-infected as well as SARS-CoV-2 from influenza A infections. In summary, MCC-IMS delivers encouraging results in the rapid, non-invasive detection of infections in vitro as well as in vivo. KW - volatile organische Substanzen (VOCs) KW - Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS) KW - nichtinvasive Diagnostik KW - bakterielle Infektionen KW - virale Infektionen KW - volatile organic compounds (VOCs) KW - ion mobility spectrometry (IMS) KW - non-invasive Diagnostics KW - bacterial infections KW - viral infections Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-575441 ER - TY - THES A1 - Demin, Paul T1 - Blaulicht-aktivierbares Proteinexpressionssystem in Saccharomyces cerevisiae T1 - Blue light-inducible protein expression system in Saccharomyces cerevisiae N2 - Synthetische Transkriptionsfaktoren bestehen wie natürliche Transkriptionsfaktoren aus einer DNA-Bindedomäne, die sich spezifisch an die Bindestellensequenz vor dem Ziel-Gen anlagert, und einer Aktivierungsdomäne, die die Transkriptionsmaschinerie rekrutiert, sodass das Zielgen exprimiert wird. Der Unterschied zu den natürlichen Transkriptionsfaktoren ist, sowohl dass die DNA-Bindedomäne als auch die Aktivierungsdomäne wirtsfremd sein können und dadurch künstliche Stoffwechselwege im Wirt, größtenteils chemisch, induziert werden können. Optogenetische synthetische Transkriptionsfaktoren, die hier entwickelt wurden, gehen einen Schritt weiter. Dabei ist die DNA-Bindedomäne nicht mehr an die Aktivierungsdomäne, sondern mit dem Blaulicht-Photorezeptor CRY2 gekoppelt. Die Aktivierungsdomäne wurde mit dem Interaktionspartner CIB1 fusioniert. Unter Blaulichtbestrahlung dimerisieren CRY2 und CIB1 und damit einhergehend die beiden Domänen, sodass ein funktionsfähiger Transkriptionsfaktor entsteht. Dieses System wurde in die Saccharomyces cerevisiae genomisch integriert. Verifiziert wurde das konstruierte System mit Hilfe des Reporters yEGFP, welcher durchflusszytometrisch detektiert werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass die yEGFP Expression variabel gestaltet werden kann, indem unterschiedlich lange Blaulichtimpulse ausgesendet wurden, die DNA-Bindedomäne, die Aktivierungsdomäne oder die Anzahl der Bindestellen, an dem sich die DNA-Bindedomäne anlagert, verändert wurden. Um das System für industrielle Anwendungen attraktiv zu gestalten, wurde das System vom Deepwell-Maßstab auf Photobioreaktor-Maßstab hochskaliert. Außerdem erwies sich das Blaulichtsystem sowohl im Laborstamm YPH500 als auch im industriell oft verwendeten Hefestamm CEN.PK als funktional. Des Weiteren konnte ein industrierelevante Protein ebenso mit Hilfe des verifizierten Systems exprimiert werden. Schlussendlich konnte in dieser Arbeit das etablierte Blaulicht-System erfolgreich mit einem Rotlichtsystem kombiniert werden, was zuvor noch nicht beschrieben wurde. N2 - Like natural transcription factors, synthetic transcription factors consist of a DNA-binding domain that attaches specifically to the binding site sequence in front of the target gene, and an activation domain that recruits the transcription machinery so that the target gene is expressed. The difference to natural transcription factors is that both the DNA binding domain and the activation domain can be host foreign and artificial metabolic pathways, mostly chemically, can be induced in the host. In this work, new optogenetic synthetic transcription factors were developed so that chemical induction becomes obsolete. The DNA binding domain is no longer linked to the activation domain but to the blue light photoreceptor CRY2. The activation domain was fused to the interaction partner CIB1. Upon blue light irradiation, CRY2 and CIB1 dimerize and thus the two domains, resulting in a functional transcription factor. Six different prokaryotic DNA-binding domains and a total of two different activation domains, viral and fungal, were recombined with CRY2 and CIB1, respectively, and genomically integrated into the eukaryotic cell factory Saccharomyces cerevisiae. Since the blue light dimerization is based on the chromophore FAD, which the yeast can synthesize itself, only the blue light had to be switched on for the induction. The constructed system was verified with the help of the reporter yEGFP, which could be detected by flow cytometry. It could be shown that the yEGFP expression could be made variable by emitting blue light pulses of different lengths, changing the DNA binding domain, the activation domain or the copy number of binding sites at which the DNA binding domain attaches. To make the system attractive for industrial applications, the system was scaled up from deepwell scale to photobioreactor scale. In addition, the blue light system proved to be functional both in the laboratory strain YPH500 and in the yeast strain CEN.PK, which is often used industrially. Furthermore, the industrially relevant protein VP1 could also be expressed using the verified system. Due to its great flexibility, the blue light system established here was christened/named FLIRT (Flexible Blue Light Induced Transcription). Finally, in this work, the established flirt system could be successfully combined with a red light system, which has not been described before. KW - Synthetische Biologie KW - Hefe KW - Saccharomyces cerevisiae KW - Blaulicht KW - Transkriptionsfaktoren KW - Bioreaktor KW - bioreactor KW - blue light KW - budding yeast KW - Saccharomyces cerevisiae KW - synthetic biology KW - transcription factors Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-559696 ER - TY - THES A1 - Pitzen, Valentin T1 - Weitergeführte funktionelle Charakterisierung des centrosomalen Proteins Cep192 und Untersuchung der Topologie des Centrosoms in Dictyostelium Amöben T1 - Functional Characterization of the Centrosomal Protein Cep192 and Investigation of the Topology of the Centrosome in Dictyostelium amoeba N2 - Das Centrosom von Dictyostelium ist acentriolär aufgebaut, misst ca. 500 nm und besteht aus einer dreischichten Core-Struktur mit umgebender Corona, an der Mikrotubuli nukleieren. In dieser Arbeit wurden das centrosomale Protein Cep192 und mögliche Interaktionspartner am Centrosom eingehend untersucht. Die einleitende Lokalisationsuntersuchung von Cep192 ergab, dass es während der gesamten Mitose an den Spindelpolen lokalisiert und im Vergleich zu den anderen Strukturproteinen der Core-Struktur am stärksten exprimiert ist. Die dauerhafte Lokalisation an den Spindelpolen während der Mitose wird für Proteine angenommen, die in den beiden identisch aufgebauten äußeren Core-Schichten lokalisieren, die das mitotische Centrosom formen. Ein Knockdown von Cep192 führte zur Ausbildung von überzähligen Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOC) sowie zu einer leicht erhöhten Ploidie. Deshalb wird eine Destabilisierung des Centrosoms durch die verminderte Cep192-Expression angenommen. An Cep192 wurden zwei kleine Tags, der SpotH6- und BioH6-Tag, etabliert, die mit kleinen fluoreszierenden Nachweiskonjugaten markiert werden konnten. Mit den so getagten Proteinen konnte die hochauflösende Expansion Microscopy für das Centrosom optimiert werden und die Core-Struktur erstmals proteinspezifisch in der Fluoreszenzmikroskopie dargestellt werden. Cep192 lokalisiert dabei in den äußeren Core-Schichten. Die kombinierte Markierung von Cep192 und den centrosomalen Proteinen CP39 und CP91 in der Expansion Microscopy erlaubte die Darstellung des dreischichtigen Aufbaus der centrosomalen Core-Struktur, wobei CP39 und CP91 zwischen Cep192 in der inneren Core-Schicht lokalisieren. Auch die Corona wurde in der Expansion Microscopy untersucht: Das Corona-Protein CDK5RAP2 lokalisiert in räumlicher Nähe zu Cep192 in der inneren Corona. Ein Vergleich der Corona-Proteine CDK5RAP2, CP148 und CP224 in der Expansion Microscopy ergab unterscheidbare Sublokalisationen der Proteine innerhalb der Corona und relativ zur Core-Struktur. In Biotinylierungsassays mit den centrosomalen Core-Proteinen CP39 und CP91 sowie des Corona-Proteins CDK5RAP2 konnte Cep192 als möglicher Interaktionspartner identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die wichtige Funktion des Proteins Cep192 im Dictyostelium-Centrosom und ermöglichen durch die Kombination aus Biotinylierungsassays und Expansion Microscopy der untersuchten Proteine ein verbessertes Verständnis der Topologie des Centrosoms. N2 - The Dictyostelium centrosome contains no centrioles and has a diameter of approx. 500 nm. It consists of a three layered core structure and a surrounding corona, which nucleates microtubules. This work focusses on the centrosomal protein Cep192 and potential interactors at the centrosome. Localization studies showed, that Cep192 is a permanent resident at the spindle poles during mitosis and that, compared to other centrosomal core proteins, Cep192 is expressed at the highest level. The permanent residence at the spindle poles throughout mitosis is assumed for proteins which localize to the outer core layers, which form the mitotic centrosome. A knockdown of Cep192 resulted in supernumerary microtubule organizing centers (MTOC) and a slightly higher ploidy. Due to the phenotype, a destabilization of the centrosome caused by the reduced Cep192 expression is assumed. Cep192 was fused to the newly established short tags BioH6 and SpotH6, which are recognized by small fluorescently labelled probes. The tagged proteins were used for superresolution expansion microscopy. Superresolution expansion microscopy was optimized for the centrosome and allowed the protein specific resolving of the core structure for the first time. Cep192 localizes to the outer core layers. Combination of tagged proteins nicely mirrored all three core layers. CP39 and CP91 localize inbetween Cep192 in the inner core layer. Corona proteins were included in the expansion microscopy: the corona protein CDK5RAP2 comes into close proximity of Cep192 and localizes to the inner corona. A comparison with CP148 and CP224, two other corona proteins, revealed a distinct localization of the proteins within the corona and relatively to the core structure. Applied biotinylase assays with the core proteins CP39 and CP91, as well with the corona protein CDK5RAP2 revealed Cep192 as a possible interaction partner of all three proteins. The results of this work show the important function of Cep192 at the Dictyostelium centrosome and through the biotinylase assay and expansion microscopy data shed a light on the refined Dictyostelium centrosome topology. KW - Centrosom KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - expansion microscopy KW - Cep192 KW - CDK5RAP2 KW - fluorescence microscopy KW - Cep192 KW - CDK5RAP2 Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-548891 ER - TY - THES A1 - Zinke, Jann Felix T1 - Herstellung von Gießharzpräparaten für den Einsatz im Biologieunterricht T1 - Production of casting resin preparations to use in biology classes N2 - Das Ziel des hier beschriebenen Masterprojekts war es, eine Methode zu etablieren, mit der Insekten in Gießharz eingeschlossen werden können, damit sie dauerhaft konserviert für mikroskopische Untersuchungen im Biologieunterricht zur Verfügung stehen. Die Masterarbeit enthält eine ausführliche Anleitung zur Herstellung von Gießharzpräparaten mit darin eingebetteten Insekten. Sie soll als Handreichung vor allem für Biologie-Lehrkräfte dienen, um selbstständig hochwertige Lehrpräparate für ihren Unterricht herstellen zu können. Aufgrund der Komplexität des Themas werden Naturschutzbestimmungen und die Beschaffung der Insekten genauso beleuchtet wie deren anschließende Präparation, die Konstruktion einer eigenen Gießform, die Einbettung der Insekten in Gießharz und die Nachbehandlung des Gießlings. Wichtige Einflussfaktoren, die die Qualität der Präparate entscheidend beeinflussen und mögliche Fehlerquellen, werden ausführlich erläutert. Mittels dieser detaillierten Eingießanleitung können mit relativ einfachen und kostengünstigen Mitteln faszinierende Studienobjekte für einen anschaulichen Biologieunterricht entstehen. N2 - This master thesis aims at the establishment of a method in order to embed insects into cast resin, so that the insects are permanently preserved and available for microscopic studies in biology classes. This master thesis contains a detailed guide to produce cast resin preparations with embedded insects. It is primarily intended to serve as a guide to enable teachers in order to independently create high-quality teaching materials for their classes. Due to the complexity of the topic, environmental protection regulations and the procurement of insects are examined as well as their subsequent preparations, the construction of own casting moulds, the embedding of the insects into the casting resin and the post-treatment of the casting. Important factors which have a decisive influence on quality of the preparations and possible sources of error are particularly described. These detailed casting instructions open new possibilities for teachers to create fascinating teaching objects for vivid biology classes using relatively simple and inexpensive means. KW - Gießharz KW - Gießharzpräparate KW - Biologieunterricht KW - Herstellung KW - Präparate KW - Insekten KW - casting resin KW - preparation KW - insects KW - biology classes KW - production Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-615028 ER - TY - THES A1 - Ramm, Timo T1 - Entwicklung von Multiplex-Methoden zur Antikörper-Charakterisierung und Validierung N2 - Antikörper werden in verschiedensten Bereichen, sowohl zu therapeutischen als auch zu diagnostischen und forschungsorientierten Zwecken verwendet. Vor der Verwendung des Antikörpers bedarf es der Charakterisierung seiner Eigenschaften, in Bezug auf sein Epitop und sein Bindeverhalten gegenüber dem Paratop. Gleichzeitig muss, in Abhängigkeit des Einsatzes, der Antikörper, für den gewünschten Gebrauch, validiert werden. Zu diesem Zweck wurden in der vorliegenden Arbeit Bead-basierte, multiplexe Testsysteme entworfen, ausgetestet und etabliert mit dem Ziel, eine einfache Screeningmethode zu entwickeln, um eine hohe Anzahl an Proben beziehungsweise Analyten gleichzeitig bestimmen zu können. Dafür wurden drei verschiedene Herangehensweisen etabliert. So wurden ein phospho-PKA-Substrat Antikörper, welcher phosphorylierte Bindemotive der PKA der Form RRxpS erkennt, gleichzeitig mit einer Reihe an Peptide getestet, welche Punktmutationen im Vergleich zur Konsensussequenz enthielten, um den Einfluss einzelner Aminosäuren auf die Bindung des Antikörpers zu untersuchen. Es konnte im Multiplex gezeigt werden, dass die Unterschiede im Antikörperbindungsverhalten in Abhängigkeit der Aminosäure an verschiedenen P-Positionen detektierbar waren. Mit dem Bead-basierten Multiplexansatz konnten, durch Messungen von Konzentrationsreihen des Antikörpers, Bindungskinetiken aufgenommen und diese mit bereits etablierten Methoden verglichen werden. Des Weiteren wurden verschiedene Antikörper, welche essenzielle Bestandteile von Bead-basierten Testsystemen darstellten, validiert. Es wurden dabei verschiedene Antikörper, welche spezifisch THC und CBD erkennen ausgetestet und anschließend ein kompetitiver Assay zur Detektion von THC und CBD in humanem Serum etabliert, und die Nachweisgrenzen bestimmt. Ferner sollten Pferdeseren von Tieren, welche am Sommerekzem leiden, auf ihren IgE-Gehalt hin bestimmt werden. Dafür wurden relevante Proteine rekombinant hergestellt und durch Immobilisierung an Beads im Multiplex mit Serum inkubiert. Die spezifische Bindung des IgE an die Allergen sollte damit messbar gemacht werden können. Für die Gesamtvalidierung des Testsystems wurden zuvor sämtliche Einzelschritte einzeln validiert, um im Anschluss im multiplexen Screening zu vermessen. Die Nutzung von Bead-basierten Multiplexmessungen als eine Plattformtechnologie erleichtert die Charakterisierung von Antikörpern sowie ihre Validierung für verschiedene Testsysteme. N2 - Antibodies are widely used in different fields, which include therapeutic as well as diagnostic and research applications Before the antibody can be used, its properties must be characterized with regard to its epitope and its binding behavior to the paratope. At the same time, depending on the application, the antibody must be validated for its desired use. For this purpose, bead-based multiplex assay systems were designed, tested, and established with the aim of developing a simple screening method to simultaneously measure a high number of samples or analytes. Thus, a phospho-PKA-substrate antibody, which recognizes phosphorylated binding motifs of PKA with the RRxpS motif, was tested. A series of peptides containing point mutations as compared to consensus sequences were used to investigate the influence of individual amino acids on the binding of the antibody. In a multiplex approach it was shown that the differences in the antibody binding behavior were detectable at different P-positions depending on the amino acid. Furthermore, it was possible to measure binding kinetics by the bead-based multiplex approach using dilution series of the antibody, and to compare these with already established methods. In addition to that, different antibodies, which were applied as essential components of bead-based biosensor systems, were validated. On the one hand, different antibodies specifically recognizing THC and CBD were tested and subsequently a competitive assay for the detection of THC and CBD in human serum was established. The detection limits could be determined. On the other hand, the IgG level in horse sera from animals suffering from sweet itch were determined. For this purpose, relevant proteins were recombinantly expressed, immobilized on beads and incubated with serum in a multiplex approach. The specific binding of IgE to the allergen was measurable. For the overall validation of the test system, all individual steps were partially validated beforehand to allow for a measurement in the multiplex screening system. Thus, using the advantages of bead-based multiplex measurements, a platform for the characterization of antibodies as well as their validation in different test systems was demonstrated. KW - Antikörper KW - Multiplex KW - THC KW - Proteinkinase A KW - Sommerekzem KW - CBD KW - Bead KW - Antikörpercharakterisierung KW - Antikörpervalidierung KW - antibody KW - antibody characterization KW - antibody validation KW - THC KW - CBD KW - Proteinkinase A KW - summer eczema Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-561531 ER -