TY - THES A1 - Bojahr, Juliane T1 - Aktivierung des humanen Süßgeschmacksrezeptors im zellbasierten Testsystem T1 - Human sweet taste receptor activation in cell based assay N2 - Zellbasierte heterologe Expressionssysteme bieten ein einfaches und schnelles Verfahren, um neue Süßstoffe oder Süßverstärker zu finden. Unter Verwendung eines solchen Testsystems, konnte ich in Zusammenarbeit mit der Symrise AG, Holzminden und dem Institut für Pflanzenbiochemie in Halle/Saale die vietnamesische Pflanze Mycetia balansae als Quelle eines neuen Süßstoffs identifizieren. Deren Hauptkomponenten, genannt Balansine, aktivieren spezifisch den humanen Süßrezeptor. Chimäre Rezeptoren zeigten, dass die amino-terminalen Domänen der Süßrezeptoruntereinheiten, welche ein Großteil der Liganden des Süßrezeptors binden, für dessen Aktivierung durch Balansin A nicht notwendig sind. Voraussetzung für die Anwendung zellbasierter Testsysteme zum Auffinden neuer Süßstoffe ist jedoch, dass süße Substanzen gesichert identifiziert werden, während nicht süße Substanzen zuverlässig keine Rezeptoraktivierung aufweisen. Während in HEK293 TAS1R2 TAS1R3To Galpha15i3-Zellen Süßrezeptoraktivierung gegenüber nicht süß schmeckenden Substanzen beobachtet wurde, konnte mit den HEK293PEAKrapid Galpha15-Zellen ein zuverlässiges Testsystem identifiziert, welches den Süßgeschmack der untersuchten Substanzen widerspiegelte. Es fanden sich keine Hinweise, dass akzessorische Proteine oder verwandte Rezeptoren des Süßrezeptors das unterschiedliche Verhalten der Zellen verursachen. Es konnte gezeigt werden, dass die Verwendung unterschiedlicher G-Proteine die Signalamplituden des Süßrezeptors beeinflusst, die Unterschiede zwischen den Zellsystemen jedoch nicht vollständig erklärt. Keine der untersuchten Galpha-Proteinchimären spiegelte die intrinsische Süße der Substanzen wider. Wenn auch nicht ursächlich für die Diskrepanz zwischen Süßrezeptoraktivierung in vitro und Süßgeschmack in vivo, so weisen die Ergebnisse dieser Arbeit auf eine Interaktion der Süßrezeptoruntereinheiten mit dem humanen Calcium-sensing Rezeptor hin. Vanillin und Ethylvanillin konnten als neue Agonisten des Calcium-sensing Rezeptors identifiziert werden. Wie die vorliegende Arbeit zeigt, können sich kleine Unterschiede im Zellhintergrund deutlich auf die Funktionsweise heterolog exprimierter Rezeptoren auswirken. Dies zeigt wie wichtig die Wahl der Zellen für solche Screeningsysteme ist. N2 - Screening for new sweeteners or sweet taste modulators by the use of heterologous expression systems is an easy and fast way without time- and cost-intensive sensory studies. Using such cell based expression systems we could show that the main components of the so far undescribed Vietnamese plant Mycetia balansae activate specifically the human sweet taste receptor TAS1R2-TAS1R3. Analysis of chimeric receptors revealed that the TAS1R2-TAS1R3 amino-terminal domain is not involved in the sweet taste receptor activation by balansin A, one of the main components of Mycetia balansae. The usage of such heterologous expression systems strongly depends on their predictive value, e.g. neither false-positives nor false-negatives shall occur when screening for new sweeteners. However, HEK293 TAS1R2 TAS1R3To Galpha15i3 cells showed sweet taste receptor activation for substances that were not perceived as sweet by a sensory panel. The analysis of further cell based systems revealed the HEK293PEAKrapid Galpha15 cell line as a reliable test system that reflected the sweet taste of the analyzed test compounds. These cell systems differ in their heterologously expressed G protein. Nevertheless, this does not explain the different responses of the cell systems. Although the G protein influences their signal amplitudes, none of the analyzed G protein chimeras showed an activation pattern that reflected the sweet taste of the test compounds. No indication was found that accessory proteins or related receptors like the calcium sensing receptor or the GPRC6A are responsible for the different behavior of these cell systems. First hints for an interaction of the human calcium sensing receptor and the sweet taste receptor subunits were observed. Vanillin and Ethylvanillin were identified as new calcium sensing receptor agonists. It appears as small differences in cellular background can strongly influence on the function of heterologously expressed receptors. KW - Süßrezeptor KW - Süßgeschmack KW - Süßstoff KW - Rezeptorscreening KW - sweet taste KW - sweet taste receptor KW - sweetener KW - taste receptor screening KW - HEK293 Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-93331 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Peter Michael T1 - Aktivitätsmessung auf nukleinsäuremodifizierten Oberflächen N2 - Im Bereich der medizinischen Diagnostik spielen DNA-Chips eine immer wichtigere Rolle. Dabei werden Glas- oder Silikon-Oberflächen mit Tausenden von einzelsträngigen DNA-Fragmenten, sog. Sonden, bestückt, die mit den passenden DNA-Fragmenten in der zugefügten Patientenprobe verschmelzen. Die Auswertung solcher Messungen liefert die Diagnose für Krankheiten wie z.B. Krebs, Alzheimer oder für den Nachweis pathogener Erreger. Durch fortschreitende Miniaturisierung dieser Meßsysteme können bis zu 40.000 Genfragmente des Menschen in einer einzigen Messung analysiert werden. Neben den DNA-Fragmenten können Bio-Chips auch für andere biologische Komponenten wie Antikörper und Proteine eingesetzt werden, wobei bei letzteren neben der Bindung auch die Aktivität ein wichtiger Diagnoseparamter ist. Am Fraunhofer-Institut für medizinische Technik und am Lehrstuhl für Analytische Biochemie der Universität Potsdam wurden im Rahmen einer Doktorarbeit Methoden entwickelt, die es ermöglichen auf nukleinsäuremodifizierten Sensoroberflächen die Aktivität von Proteinen zu messen. Es wurden Nukleinsäuren auf Oberflächen optischer Sensoren verankert. Diese fungierten als Rezeptor für die Proteine sowie auch als Substrat für Restriktionsenzyme, die Nukleinsäuren schneiden und Polymerasen, die Nukleinsäuren synthetisieren und verlängern können. Seine Anwendung fand diese Messmethode in der Messung der Aktivität des Proteins Telomerase, das in 90% aller Tumore erhöhte Aktivität gegenüber gesunden Zellen aufweist. Die Vorteile dieses neuen Assays gegenüber älteren Methoden liegt im Verzicht auf radioaktiv-markierten Komponenten und einer deutlich verkürzten Analysezeit. Die Arbeit schliesst mit einem funktionsfähigen Nachweis der Telomeraseaktivität im Zellextrakt von gesunden und kranken Zellen. Der direkte Einfluß von Hemmstoffen auf die Aktivität konnte sichtbar gemacht werden, und steht daher bei der Entwicklung neuer Tumor-Diagnostika und Therapeutika zur Verfügung. N2 - In the field of medical diagnostic the importance of DNA chips is growing continuously. On silica surfaces hundreds of single stranded DNA fragments are immobilised which finally detect the complementary sequences in samples of patients by hybridisation. These methods enable the detection of serious diseases as cancer, Alzheimer's disease or infection by pathogens. Biomolecules as nucleic acids, antibodies and proteins can be used as receptors on the solid surfaces whereas in case of proteins not only the binding but also the activity are of high interest for medical diagnosis. In this thesis a biosensoric approach has been developed to determine the activity of nucleic-acid modifying enzymes. Optical sensors as, e.g., the grating coupler, were used to monitor the association and dissociation of unlabeled compounds on the sensor surface in real time, by virtue of evanescent-field. Furthermore sensors based on total internal reflection fluorescence measured the activity of restriction enzymes and polymerases. The general approach included the immobilisation of oligonucleotides which acted as the receptor for the enzymes as well as the substrate for the enzymatic reaction. Enzymes as EcoRI and Klenow were used to establish a model system to measure the activity of DNA-modifying enzymes on optical surfaces. As most nucleic acid detection systems use amplification steps such as polymerase chain reaction (PCR) to increase the amount of the probe the new optical systems facilitated the analysis of the enzymatic activity by measuring the DNA-synthesis or restriction directly. These systems were finally used to detect the activity of the telomerase, an enzymatic marker for the cancerous development of cells. In 90% of cancer cells the activity of telomerase is higher than in normal cells. Additionally the increase of the telomerase activity in cells induced by carcinogenic substances was detected. Furthermore no purification steps of the samples were required as all measurements were performed with crude cell extract. Also the effect of inhibitors of the telomerase could be shown in real time measurements underlining the potential of this assay for further developments of new cancer therapeutics. KW - Aktivitätsmessung KW - optische Biosensoren KW - Nukleinsäuren KW - Telomerase KW - Telomerase KW - TRAP-assay KW - fibre optic KW - G-quartettes KW - grating coupler KW - on-chip enzymatic assay Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0000797 ER - TY - THES A1 - Blenau, Wolfgang T1 - Aminerge Signaltransduktion bei Insekten T1 - Aminergic signal transduction in insects N2 - Biogene Amine sind kleine organische Verbindungen, die sowohl bei Wirbeltieren als auch bei Wirbellosen als Neurotransmitter, Neuromodulatoren und/oder Neurohormone wirken können. Sie bilden eine bedeutende Gruppe von Botenstoffen und entfalten ihre Wirkungen über die Bindung an eine bestimmte Klasse von Rezeptorproteinen, die als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bezeichnet werden. Bei Insekten gehören zur Substanzklasse der biogenen Amine die Botenstoffe Dopamin, Tyramin, Octopamin, Serotonin und Histamin. Neben vielen anderen Wirkung ist z.B. gezeigt worden, daß einige dieser biogenen Amine bei der Honigbiene (Apis mellifera) die Geschmacksempfindlichkeit für Zuckerwasser-Reize modulieren können. Ich habe verschiedene Aspekte der aminergen Signaltransduktion an den „Modellorganismen“ Honigbiene und Amerikanische Großschabe (Periplaneta americana) untersucht. Aus der Honigbiene, einem „Modellorganismus“ für das Studium von Lern- und Gedächtnisvorgängen, wurden zwei Dopamin-Rezeptoren, ein Tyramin-Rezeptor, ein Octopamin-Rezeptor und ein Serotonin-Rezeptor charakterisiert. Die Rezeptoren wurden in kultivierten Säugerzellen exprimiert, um ihre pharmakologischen und funktionellen Eigenschaften (Kopplung an intrazelluläre Botenstoffwege) zu analysieren. Weiterhin wurde mit Hilfe verschiedener Techniken (RT-PCR, Northern-Blotting, in situ-Hybridisierung) untersucht, wo und wann während der Entwicklung die entsprechenden Rezeptor-mRNAs im Gehirn der Honigbiene exprimiert werden. Als Modellobjekt zur Untersuchung der zellulären Wirkungen biogener Amine wurden die Speicheldrüsen der Amerikanischen Großschabe genutzt. An isolierten Speicheldrüsen läßt sich sowohl mit Dopamin als auch mit Serotonin Speichelproduktion auslösen, wobei Speichelarten unterschiedlicher Zusammensetzung gebildet werden. Dopamin induziert die Bildung eines völlig proteinfreien, wäßrigen Speichels. Serotonin bewirkt die Sekretion eines proteinhaltigen Speichels. Die Serotonin-induzierte Proteinsekretion wird durch eine Erhöhung der Konzentration des intrazellulären Botenstoffs cAMP vermittelt. Es wurden die pharmakologischen Eigenschaften der Dopamin-Rezeptoren der Schaben-Speicheldrüsen untersucht sowie mit der molekularen Charakterisierung putativer aminerger Rezeptoren der Schabe begonnen. Weiterhin habe ich das ebony-Gen der Schabe charakterisiert. Dieses Gen kodiert für ein Enzym, das wahrscheinlich bei der Schabe (wie bei anderen Insekten) an der Inaktivierung biogener Amine beteiligt ist und im Gehirn und in den Speicheldrüsen der Schabe exprimiert wird. N2 - Biogenic amines are small organic compounds that act as neurotransmitters, neuromodulators and/or neurohormones in vertebrates and in invertebrates. They form an important group of messenger substances and mediate their diverse effects by binding to membrane receptors that primarily belong to the large gene-family of G protein-coupled receptors. In insects, the group of biogenic amine messengers consists of five members: dopamine, tyramine, octopamine, serotonin, and histamine. Besides many other effects, some of these biogenic amines were shown, for example, to modulate gustatory sensitivity to sucrose stimuli in the honeybee (Apis mellifera). I have investigated various aspects of the aminergic signal transduction in the “model organisms” honeybee and American cockroach (Periplaneta americana). So far, I have characterized two dopamine receptors, a tyramine receptor, an octopamine receptor and a serotonin receptor of the honeybee, which is well-known for its learning and memory capacities. The receptors where expressed in cultivated mammalian cells in order to analyze their pharmacological and functional (i.e., second messenger coupling) properties. The spatiotemporal expression patterns of the respective receptor mRNA were investigated in the honeybee brain by using different techniques (RT PCR, Northern blotting, in situ-hybridization). The salivary glands of the American cockroach were used as a model object in order to investigate the cellular effects of biogenic amines. Both dopamine and serotonin trigger salivary secretion in isolated salivary glands. The quality of the secreted saliva is, however, different. Stimulation of the glands by serotonin results in the production of a protein-rich saliva, whereas stimulation by dopamine results in saliva that is protein-free. Serotonin-induced protein secretion is mediated by an increase in the intracellular concentration of cAMP. The pharmacological properties of dopamine receptors associated with cockroach salivary glands were investigated and the molecular characterization of putative aminergic receptors of the cockroach was initiated. Furthermore, I have characterized the ebony gene of the cockroach. This gene encodes an enzyme that is probably involved in the inactivation of biogenic amines in the cockroach (as in other insects). The ebony gene is expressed in the brain and in the salivary glands of the cockroach. KW - Neurotransmitter-Rezeptor KW - Dopamin KW - Tyramin KW - Octopamin KW - Serotonin KW - Insekten KW - Biene KW - Amerikanische Schabe KW - Biogene Amine KW - G-Protein-gekoppelte-Rezeptoren KW - biogenic amines KW - G protein-coupled receptors KW - honeybee KW - salivary gland Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-7568 ER - TY - THES A1 - Radon, Christin T1 - Analyse der Funktion der dualen Lokalisation der 3-Mercaptopyruvat Sulfurtransferase im Menschen Y1 - 2017 ER - TY - THES A1 - Himmel, Mirko T1 - Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen und der in vivo Phosphorylierung des Sarkomerproteins Myomesin T1 - Analysis of Protein-Protein Interactions and in vivo Phosphorylation of the Sarcomeric Protein Myomesin N2 - Für ein tiefergehendes Verständnis von Entwicklung und Funktion der quergestreiften Muskulatur ist eine Betrachtung der am Aufbau der Myofibrillen, den kontraktilen Organellen, beteiligten Proteine essentiell. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Myomesin, einem Protein der sarkomeren M-Bande. Zunächst wurde die cDNA des humanen Myomesins vollständig kloniert, sequenziert und nachfolgend die komplette Größe der aminoterminalen Kopfdomäne bestimmt. Es konnte gezeigt werden, daß Myomesin in vitro mit den Domänen 1 und 12 an Myosin bindet. Die muskelspezifische Isoform der Kreatinkinase bindet an die Domänen 7 und 8. Stimulations- und Inhibitionsexperimente belegen, daß Myomesin an Serin 618 in vivo durch die Proteinkinase A phosphoryliert wird und daß diese Phosphorylierung durch Aktivierung beta2-adrenerger Rezeptoren stimulierbar ist. In Muskelgewebeproben von Patienten, die an der Hypertrophen Kardiomyopathie, einer genetisch bedingten Herzmuskelkrankheit, erkrankt sind, konnte mit einem neu hergestellten phosphorylierungsabhängigen Antikörper eine Verminderung der Menge phosphorylierten Myomesins nachgewiesen werden. Mögliche Ursachen werden diskutiert. Myomesin bildet Dimere, wie durch hefegenetische und biochemische Experimente gezeigt werden konnte. Die Dimerisierung von Myomesin könnte eine zentrale Rolle für den Einbau der Myosinfilamente in die naszierende Myofibrille haben. Anhand der gewonnenen Daten wurde ein verbessertes Modell der zentralen M-Bande erstellt. N2 - A deep understanding of the development and function of the sarcomeric muscle depends on the careful study of proteins involved in the assembly of myofibrills, the contractile organelles in cross-striated muscle. This thesis deals with the sarcomeric M-band protein myomesin. First, the complete cDNA of human myomesin was cloned, sequenced, and subsequently the size of the aminoterminal head domain of myomesin was determined. Myomesin binds to myosin in vitro via domains 1 and 12. Musclespecific creatine kinase is binding to the domains 7 and 8 of myomesin. Stimulation and inhibition experiments revealed, that serin 618 in human myomesin is phosphorylated in vivo by protein kinase A and that this phosphorylation can be stimulated by activation of beta2-adrenergic receptors. In muscle tissue of patients showing symptoms of the hypertrophic cardiomyopathy, a cardiac disease caused by genetic defects, the amount of phosphorylated myomesin was lowered as detected by a phosphospecific antibody which was established new. Myomesin dimerizes as shown by yeast two hybrid and biochemical experiments. Myomesin dimerization could be a central point in myofibrillogenesis, when myosin filaments were incorporated in nascent myofibrills. Taking all the data together, an improved model of the central M-band was developed. KW - Proteine KW - Myofibrille KW - Sarkomer KW - Phosphorylierung KW - M-Bandenmodell KW - PKA KW - M-band model KW - PKA Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5153 ER - TY - THES A1 - Schwonbeck, Susanne T1 - Analyse von Single Nucleotide Polymorphisms an Glas-Oberflächen N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer SNP-Genotypisierungsmethode mit auf Mikroarrays immobilisierten PCR-Produkten. Für die Analyse wurde ein faseroptischer Affinitätssensor bzw. ein Durchfluss-Biochip-Scanner mit integrierter Fluoreszenzdetektion verwendet. An den immobilisierten Analyten (PCR-Produkten) wurde eine Fluoreszenzoligonukleotidsonde hybridisiert und anschließend die Dissoziation der Sonde im Fluss verfolgt. Die Diskriminierung von Wildtyp- und Mutanten-DNA erfolgte durch die kinetische Auswertung der Dissoziationskurven sowie durch die Analyse der Fluoreszenzintensität. Die Versuche am faseroptischen Affinitätssensor zeigten, dass DNA-DNA-Hybride sowohl von Oligonukleotiden als auch von PCR-Produkten ein typisches Dissoziationsverhalten aufweisen, wobei fehlgepaarte Hybride eine signifikant schnellere Dissoziation zeigen als perfekt passende Hybride. Dieser Geschwindigkeitsunterschied lässt sich durch den Vergleich der jeweiligen kinetischen Geschwindigkeitskonstanten kD quantitativ erfassen. Da die Kopplung des Analyten an der Chipoberfläche sowie die Hybridisierungs- und Dissoziationsparameter essentiell für die Methodenentwicklung war, wurden die Parameter für ein optimales Spotting und die Immobilisierung von PCR-Produkten ermittelt. Getestet wurden die affine Kopplung von biotinylierten PCR-Produkten an Streptavidin-, Avidin- und NeutrAvidin-Oberflächen sowie die kovalente Bindung von phosphorylierten Amplifikaten mit der EDC/Methylimidazol-Methode. Die besten Ergebnisse sowohl in Spotform und -homogenität als auch im Signal/Rausch-Verhältnis wurden an NeutrAvidin-Oberflächen erreicht. Für die Etablierung der Mikroarray-Genotypisierungsmethode durch kinetische Analyse nach einem Hybridisierungsexperiment wurden Sondenlänge, Puffersystem, Spotting-Konzentration des Analyten sowie Temperatur optimiert. Das Analysensystem erlaubte es, PCR-Produkte mit einer Konzentration von 250 ng/µl in einem HEPES-EDTA-NaCl-Puffer auf mit NeutrAvidin beschichtete Glasträger zu spotten. In den anschließenden Hybridisierungs- und Dissoziationsexperimenten bei 30 °C konnte die Diskriminierung von homocygoter Wildtyp- und homocygoter Mutanten- sowie heterocygoter DNA am Beispiel von Oligonukleotid-Hybriden erreicht werden. In einer Gruppe von 24 homocygoten Patienten wurde ein Polymorphismus im SULT1A1-Gen analysiert. Sowohl durch kinetische Auswertung als auch mit der Analyse der Fluoreszenzintensität wurde der Genotyp der Proben identifiziert. Die Ergebnisse wurden mit dem Referenzverfahren, der Restriktionschnittstellenanalyse (PCR-RFLP) validiert. Lediglich ein Genotyp wurde falsch bestimmt, die Genauigkeit lag bei 96%. In einer Gruppe von 44 Patienten wurde der Genotyp eines SNP in der Adiponectin-Promotor-Region untersucht. Nach Vergleich der Analysenergebnisse mit denen eines Referenzverfahrens konnten lediglich 14 der untersuchten Genotypen bestätigt werden. Ursache für die unzureichende Genauigkeit der Methode war vor allem das schlechte Signal/Rausch-Verhältnis. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das in dieser Arbeit entwickelte Analysesystem für die Genotypisierung von Einzelpunktmutationen geeignet ist, homocygote Patientenproben zuverlässig zu analysieren. Prinzipiell ist das auch bei heterocygoter DNA möglich. Da nach aktuellem Kenntnisstand eine SNP-Analysemethode an immobilisierten PCR-Produkten noch nicht veröffentlicht wurde, stellt das hier entwickelte Verfahren eine Alternative zu bisher bekannten Mikroarray-Verfahren dar. Als besonders vorteilhaft erweist sich der reverse Ansatz der Methode. Der hier vorgestellte Ansatz ist eine kostengünstigere und weniger hoch dimensionierte Lösung für Fragestellungen beispielsweise in der Ernährungswissenschaft, bei denen meist eine mittlere Anzahl Patienten auf nur einige wenige SNPs zu untersuchen ist. Wenn es gelingt, durch die Weiterentwicklung der Hardware bzw. weiterer Optimierung, eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses und damit die Diskriminierung von heterocygoter DNA zu erreichen, kann diese Methode zukünftig bei der Analyse von mittelgroßen Patientengruppen alternativ zu anderen Genotypisierungsmethoden verwendet werden. N2 - The aim of this thesis was the development of a SNP genotyping method involving PCR products immobilised on microarrays. For the analysis a fibre optic affinity biosensor and a flow-through biochip scanner were used. Fluorescent probes were hybridized with the immobilised PCR products. In order to start the dissociation process the surface was rinsed with buffer and the fluorescence intensity was measured. Two different cases were studied: First, the full-matched DNA hybrid (wildtyp single strand with complementary wildtype single strand), second the mis-matched hybrid (wildtype single strand and mutant single strand). After determinating the reaction rates (kD) as kinetic parameter the kD values of both cases were compared. The experiments showed a significant difference in the kD value of the full- and the mis-match hybrids. Therefore, mutant and wildtype DNA were discriminated by kinetic analysis of the dissociation process and analysis of the fluorescence intensity. To set up the complete analysis process the reaction parameters like coupling of the PCR products had to be optimised. Both affininty coupled (streptavidin, neutravidin, avidin - biotin) and covalent methods (EDC/methylimidazol) were carried out. Best results in spot homogeinity and spot appearance were obtained with coupling of biotinylated PCR products on neutravidin coated chip surfaces. Additionally, the length of the probe, the spotting concentration, the spotting buffer and the reaction temperature were optimised. In the optimised analysis PCR products (250 µg/µl) were spotted onto neutravidin coated surfaces. The hybridisation and dissociation processes were carried out at 30°C. A HEPES-EDTA-NaCl buffer was used for spotting, diluting of the fluorescent probe and rinsing the microarray surface. A fluorescent probe was used with 13 nucleotides in length. The mis- or full-matching base indicating the polymorphism was located in the center position of the probe. The analysis system was tested with the genomic DNA of a group of 24 homocygote individuals with a SNP in the SULT1A1 gene region. The hybridisation and dissociation processes were carried out and the reaction rates were determinated. Subsequently after the analysis in the flow-through biochip scanner the fluorescence intensity of the spots were measured. The results showed very good comparability with results of a PCR-RFLP analysis (one false genotype). Additionally, a group of 44 heterocygote DNA samples with one SNP in the adiponectin promotor region were also genotyped. Compared to a reference method only 14 genotypes were correctly determined. This was mostly due to a low signal-noise-ratio and needs to be further investigated. Besides the problem in analysing heterocygote DNA samples the developed analysis system is very useful for genotyping SNP in homocygote DNA samples. The successful analysis of heterocygote sample is principally possible and with further investigations/optimisation, a better analysis should be possible. The most important advantage of the developed method is the reverse approach of binding PCR products at the surface instead of oligonucleotides. This allows the parallel genotyping of several individuals. Other advantages include low costs and medium sized dimensions in terms of throughput. KW - Einzelbasenaustausch KW - SNP KW - Mikrochip KW - DNA-Chip KW - SULT1A1 KW - Adiponectin KW - kinetische Analyse KW - Dissoziation KW - Durchfluß-Biochip-Scanner KW - Fließsystem KW - single nucleotide polymorphisms KW - SNP KW - microarray KW - DNA KW - kinetic analysis KW - dissociation KW - SULT1A1 KW - flow-through biochip scanner Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-0001853 ER - TY - THES A1 - Neuber, Corinna T1 - Analytik zur Biotransformation des Sphingosin 1-phosphat-abbauproduktes (2E)-Hexadecenal Y1 - 2017 ER - TY - THES A1 - Maier, Natalia T1 - Aufbau eines Testsystems zum Nachweis von Ethylglucuronid (EtG) in Haaren Y1 - 2016 ER - TY - THES A1 - Geisendörfer, Birte T1 - Autologer Ansatz zur Entwicklung von 2D- und 3D-Kokultivierungsmethoden für die Bestimmung des sensibilisierenden Potenzials von Xenobiotika N2 - Die allergische Kontaktdermatitis ist eine immunologisch bedingte Hauterkrankung mit insbesondere in den westlichen Industrienationen hoher und weiter ansteigender Prävalenz. Es handelt sich hierbei um eine Hypersensitivitätsreaktion vom Typ IV, die sich nach Allergenkontakt durch Juckreiz, Rötung, Bläschenbildung und Abschälung der Haut äußert. Zahlreiche Xenobiotika besitzen das Potenzial, Kontaktallergien auszulösen, darunter Konservierungsstoffe, Medikamente, Duftstoffe und Chemikalien. Die wirksamste Maßnahme zur Eindämmung der Erkrankung ist die Expositionsprophylaxe, also die Vermeidung des Kontakts mit den entsprechenden Substanzen. Dies wiederum setzt die Kenntnis des jeweiligen sensibilisierenden Potenzials einer Substanz voraus, dessen Bestimmung aus diesem Grund eine hohe toxikologische Relevanz besitzt. Zu diesem Zweck existieren von der OECD veröffentlichte Testleitlinien, welche auf entsprechend validierten Testmethoden basieren. Goldstandard bei der Prüfung auf hautsensibilisierendes Potenzial war über lange Zeit der murine Lokale Lymphknotentest. Seit der 7. Änderung der EU-Kosmetikrichtlinie, welche Tierversuche für Kosmetika und deren Inhaltsstoffe untersagt, wurden vermehrt Alternativmethoden in die OECD-Testleitlinien implementiert.. Die bestehenden in vitro Methoden sind jedoch alleinstehend nur begrenzt aussagekräftig, da sie lediglich singuläre Mechanismen bei der Entstehung einer Kontaktallergie abbilden. Die Entwicklung von Testmethoden, welche mehrere dieser Schlüsselereignisse berücksichtigen, erscheint daher richtungsweisend. Einen vielversprechenden Ansatz liefert hierbei der Loose-fit coculture-based sensitisation assay (LCSA), welcher eine Kokultur aus primären Keratinozyten und PBMC darstellt. Bei der Kokultivierung von Immunzellen mit anderen Zelltypen stellt sich allerdings die Frage, inwiefern die Nutzung von Zellen derselben Spender*innen (autologe Kokultur) bzw. verschiedener Spender*innen (allogene Kokultur) einen Einfluss nimmt. Zu diesem Zweck wurden im Rahmen dieser Arbeit Hautzellen spenderspezifisch aus gezupften Haarfollikeln isoliert und der LCSA mit den generierten HFDK in autologen und allogenen Ansätzen verglichen. Zusätzlich wurde auch ein Vergleich zwischen der Nutzung von HFDK und NHK, welche aus humaner Vorhaut isoliert wurden, im LCSA durchgeführt. Dabei ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen autologen und allogenen Kokulturen bzw. zwischen der Verwendung von HFDK und NHK. Die Verwendung allogener Zellen aus anonymem Spendermaterial sowie die Nutzung von Keratinozyten aus unterschiedlichen Quellen scheint im Rahmen des LCSA problemlos möglich. Einige der getesteten Kontaktallergene, darunter DNCB und NiCl2, erwiesen sich im LCSA jedoch als problematisch und konnten nicht zufriedenstellend als sensibilisierend detektiert werden. Daher wurde eine Optimierung der Kokultur durch Verwendung ex vivo differenzierter Langerhans Zellen (MoLC) angestrebt, welche ein besseres Modell primärer epidermaler Langerhans Zellen darstellen als die dendritischen Zellen aus dem LCSA. Zusätzlich wurden weitere, den Erfolg der Kokultur beeinflussende Faktoren, wie die Art und Zusammensetzung des Mediums und die Kokultivierungsdauer, untersucht und angepasst. Das schlussendlich etablierte Kokultivierungsprotokoll führte zu einer maßgeblich verstärkten Expression von CD207 (Langerin) auf den MoLC, was auf eine wirkungsvolle Interaktion zwischen Haut- und Immunzellen in der Kokultur hindeutete. Des Weiteren konnten DNCB und NiCl2 im Gegensatz zum LCSA durch Verwendung des kostimulatorischen Moleküls CD86 sowie des Reifungsmarkers CD83 als Ausleseparameter eindeutig als Kontaktallergene identifiziert werden. Die Untersuchungen zur Kokultur von MoLC und HFDK wurden jeweils vergleichend in autologen und allogenen Ansätzen durchgeführt. Ähnlich wie beim LCSA kam es aber auch hier zu keinen signifikanten Unterschieden, weder hinsichtlich der Expression von Charakterisierungs- und Aktivierungsmarkern auf MoLC noch hinsichtlich der Zytokinsekretion in den Zellkulturüberstand. Die Hinweise aus zahlreichen Studien im Mausmodell, dass Zellen des angeborenen Immunsystems zur Erkennung von und Aktivierung durch allogene Zellen bzw. Gewebe in der Lage sind, bestätigten sich im Rahmen dieser Arbeit dementsprechend nicht. Aus diesem Grund wurden abschließend CD4+ T-Lymphozyten, die Effektorzellen des adaptiven Immunsystems, in die Kokultur aus MoLC und autologen bzw. allogenen HFDK integriert. Überraschenderweise traten auch hier keine verstärkten Aktivierungen in allogener Kokultur im Vergleich zur autologen Kokultur auf. Die Nutzung autologer Primärzellen scheint im Rahmen der hier getesteten Methoden nicht notwendig zu sein, was die Validierung von Kokulturen und deren Implementierung in die OECD-Testleitlinien erleichtern dürfte. Zuletzt wurde eine Kokultivierung primärer Haut- und Immunzellen auch im 3D-Vollhautmodell durchgeführt, wobei autologe MoLC in die Epidermisäquivalente entsprechender Modelle integriert werden sollten. Obwohl die erstellten Hautmodelle unter Verwendung autologer Haarfollikel-generierter Keratinozyten und Fibroblasten eine zufriedenstellende Differenzierung und Stratifizierung aufwiesen, gestaltete sich die Inkorporation der MoLC als problematisch und konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht erreicht werden. KW - Kontaktallergie KW - Langerhans Zellen KW - Alternativmethoden KW - Kokultur KW - Hautmodell Y1 - 2022 ER - TY - THES A1 - Borschewski, Aljona T1 - Bedeutung der Interaktion von Calcineurin und SORLA für die Regulation des Na⁺,K⁺,2Cl⁻-Kotransporters (NKCC2) in der Niere T1 - Importance of the interaction between calcineurin and SORLA for the regulation of the renal Na⁺-K⁺-2Cl⁻−cotransporter (NKCC2) N2 - Der Na⁺-K⁺-2Cl⁻-Kotransporter (NKCC2) wird im distalen Nephron der Niere exprimiert. Seine Verteilung umfasst die Epithelien der medullären und kortikalen Teile der dicken aufsteigenden Henle-Schleife (Thick ascending limb, TAL) und die Macula densa. Resorptiver NaCl-Transport über den NKCC2 dient dem renalen Konzentrierungsmechanismus und reguliert systemisch auch Volumenstatus und Blutdruck. Die Aktivität des NKCC2 ist mit der Phosphorylierung seiner N-terminalen Aminosäurereste Serin 126 und Threonin 96/101 verbunden. Vermittelt wird diese durch die homologen Kinasen SPAK (SPS-related proline/alanine-rich kinase) und OSR1 (Oxidative stress responsive kinase 1), die hierzu ihrerseits phosphoryliert werden müssen. Der regulatorische Kontext dieser Kinasen ist mittlerweile gut charakterisiert. Über Mechanismen und Produkte, die den NKCC2 deaktivieren, war hingegen weniger bekannt. Ziel der Arbeit war daher zu untersuchen, welche Wege zur Deaktivierung des Transporters führen. Der intrazelluläre Sortierungsrezeptor SORLA (Sorting-protein-related receptor with A-type repeats) war zuvor in seiner Bedeutung für das Nephron charakterisiert worden. Ein SORLA-defizientes Mausmodell weist unter anderem eine stark verringerte NKCC2-Phosphorylierung auf. Unter osmotischem Stress können SORLA-defiziente Mäuse ihren Urin weniger effizient konzentrieren. Meine Resultate zeigen mit hochauflösender Technik, dass SORLA apikal im TAL lokalisiert ist und dass mit NKCC2 eine anteilige Kolokalisation besteht. Unter SORLA Defizienz war die für die NKCC2 Aktivität maßgebliche SPAK/OSR1-Phosphorylierung gegenüber dem Wildtyp nicht verändert. Jedoch war die ebenfalls im TAL exprimierte Phosphatase Calcineurin Aβ (CnAβ) per Western blot um das zweifache gesteigert. Parallel hierzu wurde immunhistochemisch die Kolokalisation von verstärktem CnAβ-Signal und NKCC2 bestätigt. Beide Befunde geben zusammen den Hinweis auf einen Bezug zwischen der reduzierten NKCC2-Phosphorylierung und der gesteigerten Präsenz von CnAβ bei SORLA Defizienz. Die parallel induzierte Überexpression von SORLA in HEK-Zellen zeigte entsprechend eine Halbierung der CnAβ Proteinmenge. SORLA steuert demzufolge sowohl die Abundanz als auch die zelluläre Verteilung der Phosphatase. Weiterhin ließ sich die Interaktion zwischen CnAβ und SORLA (intrazelluläre Domäne) mittels Co-Immunpräzipitation bzw. GST-pulldown assay nachweisen. Auch die Interaktion zwischen CnAβ und NKCC2 wurde auf diesem Weg belegt. Da allerdings weder SORLA noch NKCC2 ein spezifisches Bindungsmuster für CnAβ aufweisen, sind vermutlich intermediäre Adapterproteine bei ihrer Bindung involviert. Die pharmakologische Inhibition von CnAβ mittels Cyclosporin A (CsA; 1 h) führte bei SORLA Defizienz zur Normalisierung der NKCC2-Phosphorylierung. Entsprechend führte in vitro die Gabe von CsA bei TAL Zellen zu einer 7-fach gesteigerten NKCC2-Phosphorylierung. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Phosphatase CnAβ über ihre Assoziation mit NKCC2 diesen im adluminalen Zellkompartiment deaktivieren kann. Gesteuert wird dieser Vorgang durch die Eigenschaft von SORLA, CnAβ apikal zu reduzieren und damit die adluminale Phosphorylierung und Aktivität von NKCC2 zu unterstützen. Da Calcineurin-Inhibitoren derzeit die Grundlage der immunsupprimierenden Therapie darstellen, haben die Ergebnisse eine klinische Relevanz. Angesichts der Co-Expression von SORLA und CnAβ in verschiedenen anderen Organen können die Ergebnisse auch über die Niere hinaus Bedeutung erlangen. N2 - The Na⁺-K⁺-2Cl⁻-cotransporter (NKCC2) of the thick ascending limb (TAL) is critical for renal salt handling. Activity of the cotransporter is facilitated by its phosphorylation at conserved N-terminal threonine and serine residues provided by homologous SPAK (SPS-related proline/alanine-rich kinase) and OSR1 (oxidative stress responsive kinase 1) kinases. The identification of factors which modulate the phosphorylation and hence, the activity of NKCC2 has received recent interest. SORLA (sorting-protein-related receptor with A-type repeats) is co-expressed with NKCC2 in TAL epithelium. Genetically engineered mice lacking SORLA show near-complete absence of NKCC2 phosphorylation at the SPAK/OSR1-dependent phosphoacceptors, indicating that SORLA acts as a mediator between these reaction partners, possibly by a cellular trafficking step involving additional molecules. The present study addresses molecular pathways modulating NKCC2 activity by phosphorylation or dephosphorylation reactions with a special focus on SORLA. Comparative evaluation of SORLA-deficient and wild-type mouse kidneys revealed similar levels of phosphorylated, catalytically active SPAK and OSR1 kinases, whereas abundance of the phosphatase calcineurin Aβ (CnAβ) was increased by approximately two-fold in the renal medulla of SORLA-deficient mice likely reflecting changes in TAL. In line with this, confocal microscopy revealed accumulation of CnAβ in the apical compartment of TAL in SORLA-deficient kidneys. In contrast, overexpression of SORLA in HEK cells resulted in approximately two-fold decreased CnAβ levels suggesting that SORLA modulates both the cellular abundance and distribution of the phosphatase. This data was further corroborated by co-immunoprecipitation and GST pull down assays which showed an interaction between the cytoplasmic tail of SORLA and CnAβ. Acute administration of the calcineurin inhibitor, cyclosporin A (CsA), for 1 h rapidly normalized NKCC2 phosphorylation in SORLA-deficient mice which demonstrates that the decrease in phospho-NKCC2 was functionally related with CnAβ. In sum, our data elucidate the role of calcineurin in the regulation of NKCC2 and establish SORLA as an endogenous regulator of the phosphatase. KW - Salztransport KW - Niere KW - Henlesche Schleife KW - Calcineurin KW - Phosphatase KW - SORLA KW - Calcineurin-Inhibitoren KW - Transporteraktivierung KW - Phosphorylierung KW - kidney KW - phosphorylation KW - thick ascending limb KW - epithelial salt transport KW - calcineurin inhibitors KW - cell signaling Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-89205 ER -