TY  - THES
A1  - Albers, Philip
T1  - Funktionelle Charakterisierung des bakteriellen Typ-III Effektorproteins HopZ1a in Nicotiana benthamiana
T1  - Functional characterization of the bacterial type-III effector protein HopZ1a in Nicotiana benthamiana
N2  - Um das Immunsystem der Pflanze zu manipulieren translozieren gram-negative pathogene Bakterien Typ-III Effektorproteine (T3E) über ein Typ-III Sekretionssystem (T3SS) in die pflanzliche Wirtszelle. Dort lokalisieren T3Es in verschiedenen subzellulären Kompartimenten, wo sie Zielproteine modifizieren und so die Infektion begünstigen. HopZ1a, ein T3E des Pflanzenpathogens Pseudomonas syringae pv. syringae, ist eine Acetyltransferase und lokalisiert über ein Myristolierungsmotiv an der Plasmamembran der Wirtszelle. Obwohl gezeigt wurde, dass HopZ1a die frühe Signalweiterleitung an der Plasmamembran stört, wurde bisher kein mit der Plasmamembran assoziiertes Zielprotein für diesen T3E identifiziert. Um bisher unbekannte HopZ1a-Zieleproteine zu identifizieren wurde im Vorfeld dieser Arbeit eine Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung mit einer cDNA-Bibliothek aus Tabak durchgeführt, wobei ein nicht näher charakterisiertes Remorin als Interaktor gefunden wurde. 
Bei dem Remorin handelt es sich um einen Vertreter der Gruppe 4 der Remorin-Familie, weshalb es in NbREM4 umbenannt wurde. Durch den Einsatz verschiedener Interaktionsstudien konnte demonstriert werden, dass HopZ1a mit NbREM4 in Hefe, in vitro und in planta wechselwirkt. Es wurde ferner deutlich, dass HopZ1a auf spezifische Weise mit dem konservierten C-Terminus von NbREM4 interagiert, das Remorin jedoch in vitro nicht acetyliert. Analysen mittels BiFC haben zudem ergeben, dass NbREM4 in Homodimeren an der Plasmamembran lokalisiert, wo auch die Interaktion mit HopZ1a stattfindet. 
Eine funktionelle Charakterisierung von NbREM4 ergab, dass das Remorin eine spezifische Rolle im Immunsystem der Pflanze einnimmt. Die transiente Expression in N. benthamiana induziert die Expression von Abwehrgenen sowie einen veränderten Blattphänotyp. In A. thaliana wird HopZ1a über das Decoy ZED1 und das R-Protein ZAR1 erkannt, was zur Auslösung einer starken Hypersensitiven Antwort (HR von hypersensitive response) führt. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass ZAR1 in N. benthamiana konserviert ist, NbREM4 jedoch nicht in der ETI als Decoy fungiert. Mit Hilfe einer Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung mit NbZAR1 als Köder konnten zwei Proteine, die Catalase CAT1 und der Protonenpumpeninteraktor PPI1, als Interaktoren von NbZAR1 identifiziert werden, welche möglicherweise in der Regulation der HR eine Rolle spielen. 
Aus Voruntersuchungen war bekannt, dass NbREM4 mit weiteren, nicht näher charakterisierten Proteinen aus Tabak interagieren könnte. Eine phylogenetische Einordnung hat gezeigt, dass es sich um die bekannte Immun-Kinase PBS1 sowie zwei E3-Ubiquitin-Ligasen, NbSINA1 und NbSINAL3, handelt. PBS1 interagiert mit NbREM4 an der Plasmamembran und phosphoryliert das Remorin innerhalb des intrinsisch ungeordneten N-Terminus. Mittels Massenspektrometrie konnten die Serine an Position 64 und 65 innerhalb der Aminosäuresequenz von NbREM4 als PBS1-abhängige Phosphorylierungsstellen identifiziert wurden. 
NbSINA1 und NbSINAL3 besitzen in vitro Ubiquitinierungsaktivität, bilden Homo- und Heterodimere und interagieren ebenfalls mit dem N-terminalen Teil von NbREM4, wobei sie das Remorin in vitro nicht ubiquitinieren.
Aus den in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass der bakterielle T3E HopZ1a gezielt mit dem Tabak-Remorin NbREM4 an der Plasmamembran interagiert und über einen noch unbekannten Mechanismus mit dem Immunsystem der Pflanze interferiert, wobei NbREM4 möglicherweise eine Rolle als Adapter- oder Ankerprotein zukommt, über welches HopZ1a mit weiteren Immunkomponenten interagiert. NbREM4 ist Teil eines größeren Immunnetzwerkes, zu welchem die bekannte Immun-Kinase PBS1 und zwei E3-Ubiquitin-Ligasen gehören. Mit NbREM4 konnte damit erstmalig ein membranständiges Protein mit einer Funktion im Immunsystem der Pflanze als Zielprotein von HopZ1a identifiziert werden.
N2  - In order to manipulate the plant's immune system, gram-negative pathogenic bacteria inject type-III effector proteins (T3E) via a type III secretion system (T3SS) into the plant host cell. Inside the cell, T3Es localize to different subcellular compartments, where they modify target proteins and thereby promote the infection. HopZ1a, a T3E of the plant pathogen Pseudomonas syringae pv. syringae is an acetyltransferase and localizes to the plasma membrane. Although it has been shown that HopZ1a interferes with early signal transduction at the plasma membrane, no dedicated plasma membrane-associated target protein has been identified so far. 
To identify unknown HopZ1a target proteins, a yeast two-hybrid screening using a cDNA library from tobacco was performed in advance of this work. The screen identified a previously uncharacterized remorin-family protein as a putative interactor of HopZ1a. 
Using phylogenetic analyses, the remorin could be classified as a group 4 remorin family member and therefore was renamed NbREM4. By using different interaction studies, it has could be demonstrated that HopZ1a interacts with NbREM4 in yeast, in vitro, and in planta. It also became evident that HopZ1a specifically interacts with the conserved C-terminus of NbREM4 but does not acetylate it. BiFC analyses showed that NbREM4 localizes in homodimers at the plasma membrane, and NbREM4 interacts with HopZ1a in this subcellular compartment. 
From preliminary studies it was known that NbREM4 may interact with other uncharacterized proteins from tobacco. A phylogenetic analysis revealed the immune kinase NbPBS1 and two E3 ubiquitin ligases, NbSINA1 and NbSINAL3, as putative NbREM4 interacting proteins. Analysis showed that NbPBS1 interacts with NbREM4 at the plasma membrane and phosphorylates the Remorin within the intrinsically disordered N-terminus. By means of mass spectrometry, serines at position 64 and 65 within the amino acid sequence of NbREM4 were identified as PBS1-dependent phosphorylation sites. 

NbSINA1 and NbSINAL3 have in vitro ubiquitination activity and also interact with the N-terminal part of NbREM4, but do not ubiquitinate it.

It has already been shown that, in Arabidopsis thaliana, HopZ1a is recognized by the R protein ZAR1. In the presence of the effector, ZAR1 induces a strong hypersensitive response (HR) of the cell. In this study it could be confirmed that ZAR1 is conserved in Nicotiana benthamiana and is also responsible for the recognition of HopZ1a. In addition, a yeast two-hybrid screen revealed the catalase CAT1 and the proton pump interactor PPI1 as putative NbZAR1-interacting proteins, possibly contributing to the downstream activation of HR.

From the results obtained in this work, it can be deduced that the bacterial T3E HopZ1a specifically interacts with the Remorin NbREM4 at the plasma membrane and interferes with the immune system via a yet unknown mechanism. NbREM4 is part of a larger immune network that includes NbPBS1 and two E3 ligases. With NbREM4, the first membrane-associated target protein of HopZ1a could have been identified.
KW  - Pseudomonas syringae
KW  - Remorin
KW  - HopZ1a
KW  - PBS1
KW  - pflanzliches Immunsystem
KW  - Pseudomonas syringae
KW  - Remorin
KW  - HopZ1a
KW  - PBS1
KW  - plant immune system
Y1  - 2018
ER  - 
TY  - THES
A1  - Aleksandrova, Krasimira
T1  - Understanding the link between obesity and colorectal cancer
BT  - the role of biomarkers of iflammation, immunity and metabolic dysfunction
Y1  - 2020
ER  - 
TY  - THES
A1  - Andres, Janin
T1  - Untersuchungen über Regulationsmechanismen der 11beta-Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ 1
T1  - Analysis of regulation of 11beta-Hydroxysteroid dehydrogenase type 1
N2  - Die 11beta-HSD1 reguliert intrazellulär die Cortisolkonzentration durch Regeneration von Cortison z.B. aus dem Blutkreislauf, zu Cortisol. Daher stellt diese ein wichtiges Element in der Glucocorticoid-vermittelten Genregulation dar. Die 11beta-HSD1 wird ubiquitär exprimiert, auf hohem Niveau besonders in Leber, Fettgewebe und glatten Muskelzellen. Insbesondere die Bedeutung der 11beta-HSD1 in Leber und Fettgewebe konnte mehrfach nachgewiesen werden. In der Leber führte eine erhöhte Aktivität aufgrund einer Überexpression in Mäusen zu einer verstärkten Gluconeogeneserate. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Expression und erhöhte Enzymaktivität der 11beta-HSD1 im subkutanen und viszeralen Fettgewebe assoziiert ist mit Fettleibigkeit, Insulinresistenz und Dyslipidämie. Über die Regulation ist jedoch noch wenig bekannt. Zur Untersuchung der Promotoraktivität wurde der Promotorbereich von -3034 bis +188, vor und nach dem Translations- und Transkriptionsstart, der 11beta-HSD1 kloniert. 8 Promotorfragmente wurden mittels Dual-Luciferase-Assay in humanen HepG2-Zellen sowie undifferenzierten und differenzierten murinen 3T3-L1-Zellen untersucht. Anschließend wurde mittels nicht-radioaktiven EMSA die Bindung des TATA-Binding Proteins (TBP) sowie von CCAAT/Enhancer-Binding-Proteinen (C/EBP) an ausgewählte Promotorregionen analysiert. Nach der Charakterisierung des Promotors wurden spezifische endogene und exogene Regulatoren untersucht. Fettsäuren modifizieren die Entstehung von Adipositas und Insulinresistenz. Ihre Wirkung wird u.a. PPARgamma-abhängig vermittelt und kann durch das Inkretin (Glucose-dependent insulinotropic Peptide) GIP modifiziert werden. So wurden die Effekte von unterschiedlichen Fettsäuren, vom PPARgamma Agonisten Rosiglitazon sowie dem Inkretin GIP auf die Expression und Enzymaktivität der 11beta-HSD1 untersucht. Dies wurde in-vitro-, tierexperimentell und in humanen in-vivo-Studien realisiert. Zuletzt wurden 2 Single Nucleotide Polymorphismen (SNP) im Promotorbereich der 11beta-HSD1 in der Zellkultur im Hinblick auf potentielle Funktionalität analysiert sowie die Assoziation mit Diabetes mellitus Typ 2 und Körpergewicht in der MeSyBePo-Kohorte bei rund 1.800 Personen untersucht. Die Luciferase-Assays zeigten basal eine zell-spezifische Regulation der 11beta-HSD1, wobei in allen 3 untersuchten Zelltypen die Bindung eines Repressors nachgewiesen werden konnte. Zudem konnte eine mögliche Bindung des TBPs sowie von C/EBP-Proteinen an verschiedene Positionen gezeigt werden. Die Transaktivierungsassays mit den C/EBP-Proteinen -alpha, -beta und -delta zeigten eben-falls eine zellspezifische Regulation des 11beta-HSD1-Promotors. Die Aktivität und Expression der 11beta-HSD1 wurde durch die hier untersuchten endogenen und exogenen Faktoren spezifisch modifiziert, was sowohl in-vitro als auch in-vivo in unterschiedlichen Modellsystemen dargestellt werden konnte. Die Charakterisierung der MeSyBePo-Kohorte ergab keine direkten Assoziationen zwischen Polymorphismus und klinischem Phänotyp, jedoch Tendenzen für eine erhöhtes Körper-gewicht und Typ 2 Diabetes mellitus in Abhängigkeit des Genotyps. Der Promotor der 11beta-HSD1 konnte aufgrund der Daten aus den Luciferaseassays sowie den Daten aus den EMSA-Analysen näher charakterisiert werden. Dieser zeigt eine variable und zell-spezifische Regulation. Ein wichtiger Regulator stellen insbesondere in den HepG2-Zellen die C/EBP-Proteine -alpha, -beta und -delta dar. Aus den in-vivo-Studien ergab sich eine Regulation der 11beta-HSD1 durch endogene, exogene und pharmakologische Substanzen, die durch die Zellkulturversuche bestätigt und näher charakterisiert werden konnten.
N2  - The enzyme 11beta-HSD1 regulates intracellular the cortisol concentration by regeneration of cortisone to cortisol. Hence, 11beta-HSD1 is an important factor in glucocorticoid-mediated gene expression. It is ubiquitously expressed, but high levels have been specifically described in liver, adipose tissue and smooth muscle cells. A pivotal role for 11beta-HSD1 has been demonstrated with respect to metabolism in liver and adipose tissue. Thus, a liver-specific overexpression results in an elevated gluconeogenesis and hepatic glucose output. Furthermore, a fat-specific overexpression was associated with obesity, insulin resistance and dyslipidemia. Despite these intriguing data, the regulation of the human 11beta-HSD1 gene is still in its infancies. 8 promoter fragments from -3034 to +188 of 11beta-HSD1-gene were cloned to analyze promoter activity. Dual-Luciferase-Assay was used in humane HepG2 cells and in undifferentiated and differentiated 3T3-L1 cells. Furthermore, the region close to the transcription start was studied with a non-radioactive EMSA for binding of TATA-binding protein (TBP) and CCAAT/enhancer-binding-protein (C/EBP). The role of the endogenous and exogenous regulators fatty acids, PPARgamma and the incretin (Glucose-dependent insulinotropic Peptide) GIP was investigated in-vitro and in-vivo. Finally, the functional consequences of 2 Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) within the promoter region were studied in cell culture and the MeSyBePo-cohorts for association with diabetes mellitus type 2 and body weight. The Luciferase-assay revealed a cell-specific regulation of 11beta-HSD1 and a repressor, which was active in all 3 cell models. Accordingly, a cell-specific regulation was observed in transactivation-assays with C/EBP-proteins -alpha, -beta and -delta. The 11beta-HSD1 enzyme expression and activity was specifically modified by the here investigated endogenous and exogenous factors, which was demonstrated in-vitro but also in-vivo in various experimental settings. The characterisation of the MeSyBePo-cohorte revealed no association between genotype and clinical phenotype, although a trend for an increased body weight and diabetes mellitus type 2 was detected. This work demonstrated a cell-specific regulation of the 11beta-HSD1 promoter. Furthermore, a binding site for TATA-binding proteins was detected in HepG2 and undifferentiated 3T3-L1 cells. A pivotal role in regulation of 11beta-HSD1 promoter activity was demonstrated for the C/EBP-proteins, especially in liver cells. The in-vivo-Studies revealed a regulation of enzyme expression and activity by endogenous, exogenous and pharmacological substances, which was confirmed and analyzed in more detail in cell culture experiments.
KW  - Promotor
KW  - 11beta-HSD1
KW  - Fettleibigkeit
KW  - Diabetes
KW  - Regulation
KW  - Promoter
KW  - 11beta-HSD1
KW  - Obesity
KW  - Diabetes
KW  - Regulation
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-33033
ER  - 
TY  - THES
A1  - Andresen, Dennie
T1  - Entwicklung von Microarrays für die Multiparameteranalytik und Etablierung einer Multiplex-OnChip-PCR
T1  - Development of Microarrays for multiparameter analytics and the development of a multiplex OnChip-PCR
N2  - In der molekularen Diagnostik besteht ein Bedarf an schnellen und spezifischen Testsystemen, die entweder für die Labordiagnostik oder in Point of Care-Umgebungen eingesetzt werden können. Um dieses Ziel zu erreichen, stehen die Miniaturisierung und Parallelisierung im Mittelpunkt des Forschungsinteresses. Die führende Methode im Bereich der DNA-Analytik ist derzeit die Realtime-PCR. Dieser Technologie sind hinsichtlich der Multiplexfähigkeit technologischen Hürden gesetzt, da derzeit nur eine Analyse von maximal vier Parametern parallel in einem Versuchsansatz erfolgen kann. Microarrays stellen hingegen die benötigten Voraussetzungen zur Verfügung, um als Werkzeuge für die Multiparameteranalyse in verschiedensten Anwendungsbereichen zu dienen. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war es, Multiplex-PCRs und diagnostische Microarrays zu entwickeln, die für analytische Fragestellungen eine schnelle und zuverlässige Multiparameteranalytik ermöglichen, um die bisherigen Einschränkungen aktueller Nachweisverfahren zu vermeiden. Als Anwendungen wurden zum einen ein Nachweissystem für acht relevante Geflügelpathogene zur Überwachung in der Geflügelzucht, zum anderen ein Nachweissystem zur Identifikation potentiell allergener Lebensmittelinhaltstoffe entwickelt. Neben der Entwicklung geeigneter PCR und Multiplex-PCR-Verfahren sowie spezifischer Microarrays für die Detektion der gesuchten Zielsequenzen stand auch die weiterführende Integration von DNA-Amplifikation und Microarray-Technologie im Fokus dieser Arbeit. Die OnChip-Amplifikation stellt eine Möglichkeit dar, um DNA-Analytik und Detektion in einem Reaktionsschritt zu integrieren. Entsprechend wurden die in der Arbeit entwickelten PCR- und Multiplex-PCR-Verfahren zum Nachweis potentieller allergener Lebensmittelinhaltsstoffe für die OnChip-Amplifikation adaptiert und Reaktionsbedingungen getestet, die eine Multiparameteranalyse auf dem Chip ermöglichen. Die entwickelten OnChip-PCR-Verfahren zeigten eine hohe Spezifität sowohl in Single- als auch in der Multiplex-OnChip-PCR. Eine Sensitivität von 10 Kopien bzw. <10ppm konnte in Single-OnChip-PCRs für den Nachweis allergener Lebensmittelinhaltsstoffe gezeigt werden. In Multiplex-OnChip-PCRs konnten 10-100ppm allergene Verunreinigungen spezifisch in unterschiedlichen Lebensmitteln nachgewiesen werden. Ein weiterer Schritt in Richtung einer möglichen Verwendung im Point of Care-Bereich stellt der Einsatz eines isothermalen Amplifikationsverfahrens dar. Vorteil eines solchen Verfahrens ist die Möglichkeit, auf das ansonsten benötigte Thermocycling zu verzichten. Dies vereinfacht eine Integration der OnChip-Amplifikation in mobile Analysegeräte oder Lab on Chip-Systeme und qualifiziert das Verfahren für den Einsatz in Point of Care-Umgebungen. In dieser Arbeit wurde eine noch junge isothermale Amplifikationsmethode, die helikase-abhängige Amplifikation (HDA), hinsichtlich ihrer Eignung für die Integration auf einem Microarray getestet. Hierfür konnte die bislang erste OnChip-HDA für Einzel- und Duplex-Nachweise von Pathogenen entwickelt werden.
N2  - In molecular diagnostics there is a need for fast and specific assay systems that could be used in the clinics and in point of care settings alike. Therefore miniaturisation and parallelisation are in the main focus of current assay development researches. The current gold standard for DNA analytics is the realtime PCR. However, this technology has its restraints in context to multiplex analysis. With the currently available technology an efficient multiplexing is only possible for four different targets per analysed sample. Microarrays in contrast offer the needed multiplex capabilities and have advanced to capable tools used in multiple fields of application. One focus of this work was the integration of Multiplex PCR and microarray technology, developing a microarray capable of analysing multiple parameters in one given sample, circumventing the problems and restraints of the exsisting technologies. As an example microarray assays for two different application fields were developed. One microarray assay for the detection of pathogens in poultry and another microarray assay for the detection of potentially allergenic food ingredients. Single- and Multiplex OnChip-PCR assays for both applications were developed and tested. OnChip-PCRs developed in this work showed high specificity in Single- and Multiplex-OnChip amplifications. The sensitivity was in the range of 10 DNA copies or 10ppm respectively for Single-OnChip-PCR in experiments for the detection of allergenic food contaminations. In Multiplex-OnChip-PCR experiments 100 DNA copies or 100ppm of food contaminents could be detected in different food matrices. A further focus of this work was the adaption of the OnChip amplification for the use in Point of Care settings. Isothermal amplification is a promising approach having the advantage of avoiding the thermocycling needed in the PCR. This opens up certain opportunities for the development of smaller, more flexible mobile diagnostic analysis devices. In this work we have evaluated the helicase dependent amplification (HDA) in terms of usability in OnChip amplification. In this work it was shown for the first time that HDA could be used for the detection of different pathogens in an Duplex-OnChip-PCR, showing the potential of this technology for integration in Point of Care settings.
KW  - On Chip PCR
KW  - Microarray
KW  - HDA
KW  - Multiplex PCR
KW  - Multiparameter
KW  - On Chip PCR
KW  - Microarray
KW  - HDA
KW  - Multiplex PCR
KW  - multiparameter
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-39462
ER  - 
TY  - THES
A1  - Banning, Antje
T1  - Selenabhängige Glutathionperoxidasen als Mediatoren und Ziele der intrazellulären Redoxregulation : Identifizierung der GI-GPx als Ziel für Nrf2 und der PHGPx ...
T1  - Selenium-dependent glutathione peroxidases as mediators and targets of intracellular redox regulation
N2  - Das 1817 erstmals schriftlich erwähnte Selen galt lange Zeit nur als toxisch und sogar als procancerogen, bis es 1957 von Schwarz und Foltz als essentielles Spurenelement erkannt wurde, dessen biologische Funktionen in Säugern durch Selenoproteine vermittelt werden. Die Familie der Glutathionperoxidasen nimmt hierbei eine wichtige Stellung ein. Für diese sind konkrete Funktionen und die dazugehörigen molekularen Mechanismen, welche über die von ihnen katalysierte Hydroperoxidreduktion und damit verbundene antioxidative Kapazität hinausgehen, bislang nur unzureichend beschrieben worden.  Die Funktion der gastrointestinalen Glutathionperoxidase (GI-GPx) wird als Barriere gegen eine Hydroperoxidabsorption im Gastrointestinaltrakt definiert. Neuen Erkenntnissen zufolge wird die GI-GPx aber auch in verschiedenen Tumoren verstärkt exprimiert, was weitere, bis dato unbekannte, Funktionen dieses Enzymes wahrscheinlich macht. Um mögliche neue Funktionen der GI-GPx, vor allem während der Cancerogenese, abzuleiten, wurde hier die transkriptionale Regulation der GI-GPx detaillierter untersucht. Die Sequenzanalyse des humanen GI-GPx-Promotors ergab das Vorhandensein von zwei möglichen "antioxidant response elements" (ARE), bei welchen es sich um Erkennungssequenzen des Transkriptionsfaktors Nrf2 handelt. Die meisten der bekannten Nrf2-Zielgene gehören in die Gruppe der Phase-II-Enzyme und verfügen über antioxidative und/oder detoxifizierende Eigenschaften. Sowohl auf Promotorebene als auch auf mRNA- und Proteinebene konnte die Expression der GI-GPx durch typische, in der Nahrung enthaltene, Nrf2-Aktivatoren wie z.B. Sulforaphan oder Curcumin induziert werden. Eine direkte Beteiligung von Nrf2 wurde durch Cotransfektion von Nrf2 selbst bzw. von Keap1, das Nrf2 im Cytoplasma festhält, demonstriert. Somit konnte die GI-GPx eindeutig als Nrf2-Zielgen identifiziert werden. Ob sich die GI-GPx in die Gruppe der antiinflammatorischen und anticancerogenen Phase-II-Enzyme einordnen lässt, bleibt noch zu untersuchen.  Die Phospholipidhydroperoxid Glutathionperoxidase (PHGPx) nimmt aufgrund ihres breiten Substratspektrums, ihrer hohen Lipophilie und ihrer Fähigkeit, Thiole zu modifizieren, eine Sonderstellung innerhalb der Familie der Glutathionperoxidasen ein. Mit Hilfe eines PHGPx-überexprimierenden Zellmodells wurden deshalb Beeinflussungen des zellulären Redoxstatus und daraus resultierende Veränderungen in der Aktivität redoxsensitiver Transkriptionsfaktorsysteme und in der Expression atheroskleroserelevanter Adhäsionsmoleküle untersucht. Als Transkriptionsfaktoren wurden NF-kB und Nrf2 ausgewählt. Die Bindung von NF-kB an sein entsprechendes responsives Element in der DNA erfordert das Vorhandensein freier Thiole, wohingegen Nrf2 durch Thiolmodifikation von Keap1 freigesetzt wird und in den Kern transloziert. Eine erhöhte Aktivität der PHGPx resultierte in einer Erhöhung des Verhältnisses von GSH zu GSSG, andererseits aber in einer verminderten Markierbarkeit freier Proteinthiole. PHGPx-Überexpression reduzierte die IL-1-induzierte NF-kB-Aktivität, die sich in einer verminderten NF-kB-DNA-Bindefähigkeit und Transaktivierungsaktivität ausdrückte. Auch war die Proliferationsrate der Zellen vermindert. Die Expression des NF-kB-regulierten vaskulären Zelladhäsionsmoleküls, VCAM-1, war ebenfalls deutlich verringert. Umgekehrt war in PHGPx-überexprimierenden Zellen eine erhöhte Nrf2-Aktivität und Expression der Nrf2-abhängigen Hämoxygenase-1 zu verzeichnen. Letzte kann für die meisten der beobachteten Effekte verantwortlich gemacht werden. Die hier dargestellten Ergebnisse verdeutlichen, dass eine Modifizierung von Proteinthiolen als wichtige Determinante für die Regulation der Expression und Funktion von Glutathionperoxidasen angesehen werden kann. Entgegen früheren Vermutungen, welche oxidative Vorgänge generell mit pathologischen Veränderungen assoziierten, scheint ein moderater oxidativer Stress, bedingt durch eine transiente Thiolmodifikation, durchaus günstige Auswirkungen zu haben, da, wie hier dargelegt, verschiedene, miteinander interagierende, cytoprotektive Mechanismen ausgelöst werden. Hieran wird deutlich, dass sich "antioxidative Wirkung" oder "oxidativer Stress" keineswegs nur auf "gute" oder "schlechte" Vorgänge beschränken lassen, sondern im Zusammenhang mit den beeinflussten (patho)physiologischen Prozessen und dem Ausmaß der "Störung" des physiologischen Redoxgleichgewichtes betrachtet werden müssen.
N2  - Selenium was discovered in 1817 by the Swedish chemist Berzelius and was for a long time considered as being toxic and even procarcinogenic. In 1957, however, Schwarz and Foltz realized that selenium is an essential trace element which elicits its biological functions in mammals as a structural component of selenoproteins among which the family of glutathione peroxidases plays a dominant role. Glutathione peroxidases reduce hydroperoxides to the corresponding alcohols and contribute to the antioxidative capacity of a cell. However, other functions of glutathione peroxidases and the according molecular mechanisms have hardly been described.>br> The gastrointestinal glutathione peroxidase (GI-GPx) is believed to build a barrier against the absorption of foodborne hydroperoxides. In addition, GI-GPx expression is increased in different tumors. This indicates further, still unknown, functions of this enzyme. In order to elucidate new possible functions of GI-GPx, especially during carcinogenesis, the transcriptional regulation of GI-GPx was analyzed in more detail. An analysis of the GI-GPx promoter sequence revealed the presence of two putative "antioxidant response elements" (ARE) which are recognition sites for the transcription factor Nrf2. Most of the known Nrf2 target genes either belong to the group of phase-II detoxification enzymes or possess antioxidative and/or detoxifying properties. On promoter level as well as on mRNA- and protein level the expression of GI-GPx was induced by typical Nrf2-activating compounds such as sulforaphane or curcumin that are contained in the diet. A direct involvement of Nrf2 was demonstrated by cotransfection of Nrf2 itself or by cotransfection of Keap1 which retains Nrf2 in the cytosol. Thus, the GI-GPx gene was unequivocally identified as a new target for Nrf2. Whether GI-GPx also belongs in the category of antiinflammatory and anticarcinogenic enzymes remains to be elucidated. The phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx) is exceptional among the glutathione peroxidases because of its broad range of substrates, its high lipophilicity, and its ability to modify protein thiols. With PHGPx-overexpressing cells, the influence of PHGPx on the cellular redox state and on resulting changes in the activity of redox-sensitive transcription factors and on the expression of proatherogenic adhesion molecules was analyzed. For this, the redox-sensitive transcription factors NF-kB and Nrf2 were chosen. NF-kB requires free thiols for being able to bind to its responsive element within the DNA, whereas Nrf2 is released from Keap1 and translocates to the nucleus upon a modification of protein thiols. PHGPx-overexpression resulted in an increase in the ratio of GSH to GSSG, in a reduced amount of intracellular protein thiols, and in a diminished proliferation rate. Furthermore, PHGPx-overexpressing cells displayed a reduced IL-1-dependent NF-kB activity as was assessed by a reduced NF-kB DNA-binding ability and activity of a NF-kB-driven reporter gene. In addition, the expression of the NF-kB-dependent vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) was also inhibited by overexpression of PHGPx. On the other hand, PHGPx-overexpressing cells displayed an increased activity of Nrf2 that was accompanied by an increased expression of the Nrf2-dependent heme oxygenase-1. Heme oxygenase-1 most likely is responsible for most of the aforementioned effects. The data presented here show that a modification of protein thiols can be regarded as an important determinant for the regulation and for the functions of glutathione peroxidases. In contrast to the previous assumption that oxidative processes are always linked to pathologic changes, a moderate oxidative stress seems to have beneficial effects, because it triggers different cytoprotective mechanisms. It can be concluded that the terms "antioxidative effect" or "oxidative stress" cannot simply be restricted to "good" or "bad" processes, but need to be seen in context with the modulated (patho)physiological processes and the degree of "disturbance" of the physiologic redox balance.
KW  - Selen
KW  - Transkriptionsfaktor
KW  - Selenoprotein
KW  - Glutathionperoxidase
KW  - GI-GPx
KW  - PHGPx
KW  - Redoxregulation
KW  - Nrf2
KW  - NF-kB
KW  - VCAM-1
KW  - selenium
KW  - selenoprotein
KW  - glutathione peroxidase
KW  - GI-GPx
KW  - PHGPx
KW  - redox regulation
KW  - transcription factor
KW  - NF-kB
KW  - Nrf2
KW  - VCAM-1
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-5436
ER  - 
TY  - THES
A1  - Barbirz, Stefanie
T1  - Konservierte Struktur bei genetischer Mosaizität : die Tailspike Proteine dreier Phagen der Familie Podviridae
T1  - Tailspike proteins of three Podoviridae : genetic mosaics with conserved hreedimensional structure
N2  - Die Tailspike Proteine (TSP) der Bakteriophagen P22, Sf6 und HK620 dienen der Erkennung von Kohlenhydratstrukturen auf ihren gram-negativen Wirtsbakterien und zeigen, von den ersten 110 Aminosäuren des N-Terminus abgesehen, keine Sequenzübereinstimmung. Mit Röntgenkristallstrukturanalyse konnte gezeigt werden, dass HK620TSP und Sf6TSP ebenfalls zu einer parallelen, rechtsgängigen beta-Helix falten, wie dies schon für P22TSP bekannt war. Die Kohlenhydratbindestelle ist bei Sf6TSP im Vergleich zu P22TSP zwischen die Untereinheiten verschoben.
N2  - The bacteriophages P22, Sf6 and HK620 need their tailspike proteins (TSP) for recognition of surface carbohydrates on their gram-negative host bacteria. Sequence identity is completely lacking in their C-terminal 500 to 600 amino acids. The three TSP have the same fold, an oligomeric parallel beta-helix, as shown by crystal structure analyses of HK620TSP and Sf6TSP. Compared with P22TSP, the carbohydrate binding site of Sf6TSP is located at the interface between two monomers and not on a single monomer.
KW  - Bakteriophagen
KW  - Skleroproteine
KW  - Helix <beta->
KW  - Lipopolysaccharide
KW  - parallele beta-Helix
KW  - genetisches Mosaik
KW  - Tailspike
KW  - Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkung
KW  - parallel beta-helix
KW  - genetic mosaicism
KW  - tailspike
KW  - carbohydrate binding site
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-6885
ER  - 
TY  - THES
A1  - Batke, Monika
T1  - Metabolismus von alkylierten polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen : Einfluss der Struktur auf benzylische Hydroxylierung und Sulfonierung in vitro und Modulation des Metabolismus in vivo
T1  - Metabolism of alcylated polycyclic aromatic hydrocarbons : influence of the structure on benzylic hydroxylation and sulfonation in vitro and modulation of the metabolism in vivo
N2  - Die Toxizität und Kanzerogenität von rein aromatischen polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) ist seit Jahrzehnten bekannt und umfassend erforscht. Die alkylierten PAK (alkPAK) besitzen jedoch aufgrund ihrer Alkylgruppe eine weitere Möglichkeit zur Bioaktivierung und müssen daher gesondert betrachtet werden. Die Alkylgruppe wird zunächst hydroxyliert, anschließend zur Säure oxidiert oder direkt konjugiert. Entstehen hierbei instabile benzylische Sulfokonjugate, so können diese DNA-Addukte bilden und zu Mutationen führen. In Hinblick auf die Bioaktivierung von alkPAK galt es daher zu klären welchen Einfluss die Struktur auf die benzylische Hydroxylierung hat und welche humanen Formen der löslichen Sulfotransferasen besonders an der Umsetzung der alkPAK-Derivate beteiligt sind. Die Untersuchung der Albuminbindung von Schwefelsäureestern sowie ihre Aufnahme in Nierenzellen sollten Aufschluss hinsichtlich möglicher Transportvorgänge geben. Für die in-vivo-Situation wurde weiterhin die Modulation des Metabolismus ausgewählter benzylischer Alkohole durch verschiedene Nahrungsmittelbestandteile, Arzneimittel und Fremdstoffe an Ratten untersucht. Als Biomarker wurden benzylische Carbonsäuren im Urin und die entsprechenden Mercaptursäuren in Urin und Fäzes betrachtet. Zunächst wurde anhand von Inkubationen mit Rattenlebermikrosomen festgestellt, dass insbesondere größere Ringsystemen wie etwa alkylierte Benzo[a]pyrene im Gegensatz zu Methylpyrenen in wesentlich geringerem Umfang zum benzylischen Alkohol umgesetzt werden. Dies wurde auch in Untersuchungen mit humanen Lebermikrosomen bestätigt. Untersuchungen an einzelnen humanen Cytochromen P450 zeigten, dass insbesondere die durch PAK induzierbaren Formen hCYP1A1 und 1B1 hohe Umsatzraten aufwiesen. Die hepatisch exprimierten Formen hCYP1A2 und 3A4 waren jedoch auch zur Bildung der benzylischen Alkohole in der Lage. Für die anschließende Sulfonierung der benzylischen Alkohole wurden besonders hohe Aktivitäten mit den humanen Sulfotransferasen hSULT1A1, 1A2, 1C2 und 1E1 festgestellt. Aufgrund der Enzymexpression und der guten Durchblutung, die eine gute Substratversorgung ermöglicht, ist die Leber als Hauptort der benzylischen Hydroxylierung und Sulfonierung anzusehen. Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe zeigen jedoch, dass nach 1-Hydroxymethylpyren-Applikation bei Ratten die Niere die höchste Zahl an DNA-Addukten aufweist. Wegen der Fokussierung der Sulfonierung auf die Leber ist die systemische Verteilung der Schwefelsäureester die einzig plausible Erklärung. So wurde im Rahmen dieser Arbeit eine hochaffine Bindungsstelle für 2-Sulfoxymethylpyren an Albumin beschrieben und die Aufnahme von benzylischen Sulfaten durch die humanen organischen Anionentransporter hOAT1, 3 und 4 in Nierenzellen in vitro gezeigt. Für die in-vivo-Situation wurde der Einfluss von Ethanol, 4-Methylpyrazol, Pentachlorphenol, Quercetin und Disulfiram untersucht. Neben der durch die Detoxifizierung mittels Alkoholdehydrogenase und Aldehyddehydrogenase entstandenen benzylischen Carbonsäure kann als Biomarker die entsprechende Mercaptursäure herangezogen werden. Sie ist ein indirekter Nachweis für die reaktiven und toxischen benzylischen Sulfate der alkPAK. Für die beiden im Tierversuch eingesetzten benzylischen Alkohole (1-Hydroxymethylpyren und 1-Hydroxymethyl-8-methylpyren) konnte sie in Urin und Fäzes nachgewiesen werden. Es wurde jedoch ein deutlicher Unterschied in der gebildeten Menge sowie der Verteilung zwischen Urin und Fäzes für die beiden Mercaptursäuren festgestellt. Hierfür sind wahrscheinlich Unterschiede im Transport der benzylischen Schwefelsäureester sowie der Spezifität der an der Mercaptursäurebildung beteiligten Enzyme verantwortlich. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass der humane organische Anionentransporter hOAT1 1,8-Dimethylpyrenmercaptursäure nicht und der hOAT3 nur mit niedrigen Umsatzraten transportiert. Bei den Modulatoren zeigte die Gabe der kompetitiven Alkoholdehydrogenase-Hemmstoffe Ethanol und 4-Methylpyrazol die Bedeutung der Alkoholdehydrogenasen für die Entgiftung der benzylischen Alkohole: Die Oxidation zur entsprechenden Carbonsäure war reduziert und die Bildung der Mercaptursäure erhöht. Eine Hemmung der Toxifizierung vermittelt durch Sulfotransferase-Inhibitoren konnte nur für Pentachlorphenol beim Metabolismus des 1-Hydroxymethylpyrens beobachtet werden. Gleichzeitig erwies sich Pentachlorphenol als kompetitiver Alkoholdehydrogenase-Inhibitor, da eine signifikant geminderte Carbonsäureausscheidung zu beobachten war. Bei 1-Hydroxymethyl-8-methylpyren traten diese Effekte nicht auf. Die unterschiedlichen bzw. unterschiedlich starken Effekte der Modulatoren beim Metabolismus der verschiedenen benzylischen Alkohole bestätigen die Beobachtungen aus den in-vitro-Untersuchungen, dass unterschiedliche Enzym- und Transporteraffinitäten und –aktivitäten vorliegen.
N2  - The toxicity and carcinogenicity of purely aromatic polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) is known since decades and has been thoroughly investigated. Compared to the purely aromatic PAH the alcylated PAH (alcPAH) can additionally be biologically activated because of their alcyl group. The alcyl group is hydroxylated and subsequently oxidised to the corresponding acid or conjugated. If unstable benzylic sulfoconjugates arrise from this bioactivation DNA adducts may be formed and could induce mutations. Concering the bioactivation of alcPAH this work should help to get to know which influence the structure has on the benzylic hydroxylation and it should be clarified which forms of human soluble sulfotransferases catalyse the sulfonation of benzylic alcohols. Furthermore the albumin binding of sulfuric acid esters and the uptake into kidney cells by human organic anion transporters in vitro have been analysed to get inside into transport processes. For the in vivo situation the modulation of enzyme activities by food compounds, pharmaceuticals and xenobiotics is of interest. As biomarkers the respective benzylic carboxylic acid and mercapturic acid were measured in urine only and feces. By the use of incubations with rat liver microsomes it turned out that larger ring systems were benzylically hydroxylated to a remarkable less extent then alcyl pyrenes. This observation was also made for human liver microsomes. In vitro experiments addressing the activity of single human cytochromes P450 revealed that PAH inducable forms hCYP1A1 and 1B1 had highest hydroxylation rates, but also the hepatically expressed forms hCYP3A4 and CYP1A2 catalysed the benzylic hydroxylation. The subsequently following sulfonation of the benzylic alcohols was found to be catalysed with high formation rates by human sulfotransferase hSULT1A1, 1A2, 1C2 and 1E1. Due to the enzyme expression and the high blood circluation ensuring the substrate supply it can be assumed that liver is the main organ for benzylic hydroxylation and sulfonation. Nevertheless results from our group showed that after 1-hydroxy methyl pyrene exposure, rats had higher levels of DNA adducts in kidneys than in liver. Thus, it has to be assumed that the sulfuric acid esters are systemically distributed. In the course of this work a high affinity albumin binding site for 2-sulfoxy methyl pyrene was identified and the uptake of sulfuric acid esters mediated by human organic anion tranporter 1, 3 and 4 to kidneys cells in vitro was shown. For the further estimation of the in vivo bioactivation of alcPAH the modulation of enzyme activities by ethanol, 4-methylpyrazole, quercetin, pentachlorophenol and disulfiram was explored. The carboxylic acids formed via alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase were used as biomarkers as well as the respective mercapturic acids. The occurence of the mercapturic acids is an indirect proof for the reactive and toxic benzylic sulfo conjugates. In the urine and fecal samples of rats treated with either 1-hydroxymethyl pyrene or 1-hydroxymethyl 8-methyl pyrene the corresponding mercapturic acids of the sulfuric acid esters were found. Even though the absolute amount excreted and the distribution in urine and fecal samples were quite different. This observation may be explained by differences in transport of the sulfuric acid esters as well as by different specificities of the enzymes responsable for mercapturic acid formation. Additionally it was shown that the human organic anion transporter 1 does not transport 1,8-dimethyl pyrenyl mercapturic acid and the human organic anion transporter 3 only with very little turnover. Whereas 1-methyl pyrenyl mercapturic acid was well transported by both of these proteins. With regard to the modulation the concurrent application of ethanol or 4-methyl pyrazole to rats revealed the important role of alcohol dehydrogenase for the detoxification of benzylic alcohols: The oxidation leading to the corresponding carboxylic acid was remarkably reduced and the excretion of the mercapturic acid via urine and feces was enhanced. In order to observe an inhibition of sulfotransferases pentachlorophenol and quercetine were concurrently applied to rats. An inhibitory effect by the means of an reduced excretion of mercapturic acid was only observed for pentachlorophenol in animals treated with 1-hydroxymethyl pyrene. In addition it turned out, that pentachlorophenol was a potent competitive alcohol dehydrogenase inhibitor as the renal excretion of the corresponding carboxylic acid was remarkably reduced. For 1-hydroxymethyl 8-methyl pyrene this modulation was not observed. These differences in effects and strenght of effects may be ascribed to different enzymatic and transport affinities and activities which have already been observed in in vitro experiments.
KW  - alkylierte polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe
KW  - benzylischer Alkohol
KW  - benzylisches Sulfat
KW  - 1-Hydroxymethylpyren
KW  - Mercaptursäure
KW  - alcylated polycyclic aromatic hydrocarbons
KW  - benzylic alcohol
KW  - benzylic sulfate
KW  - 1-hydroxy methyl pyrene
KW  - mercapturic acid
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-26939
ER  - 
TY  - THES
A1  - Baufeld, Ralf
T1  - GIS-gestützte Prognose der Biotopentwicklung auf Grundlage von Biotoptypen- und Vegetationserhebungen auf geplanten Rückdeichungsflächen an der Mittleren Elbe in Sachsen-Anhalt
T1  - GIS supported forecast of biotope development based on investigations of biotopes and vegetation on planned areas for setting back dykes at the Middle Elbe in Saxony-Anhalt
N2  - Durch die anthropogene Nutzung sind viele Auen in Mitteleuropa verändert worden, wobei insbesondere die Retentionsflächen stark verringert wurden. Während Auen seit längerem im Fokus der wissenschaftlichen Bearbeitung stehen, gibt es bisher große Wissensdefizite in der Frage der Auenreaktivierungen. Zum einen sind derartige Projekte bisher kaum verwirklicht und zum anderen ist ein langfristiges Monitoring notwendig, um die Anpassung von Biozönosen an die veränderten Standortbedingungen beobachten zu können. Um die Folgen derartiger Eingriffe zu analysieren, bieten sich computergestützte Modellierungen der Landschaftsentwicklung an, wie sie in der vorliegenden Arbeit verwirklicht wurden. Ziel der Arbeit war, mit Hilfe eines Geografischen Informationssystems (GIS) das Entwicklungspotenzial der Landschaft bei verschiedenen Rückdeichungsvarianten auf der Ebene der Biotoptypen darzustellen. Dabei ging es nicht um die Erstellung eines allgemein gültigen Auenmodells sondern um die Erarbeitung eines Modells für einen konkreten Anwendungsfall. Der erarbeitete Ansatz sollte zudem für die landschaftsplanerische Praxis geeignet sein. Als Beispielgebiete wurden Flächen an der Mittleren Elbe bei Rogätz und Sandau, beide im nördlichen Teil von Sachsen-Anhalt, ausgewählt. Die vorliegende Arbeit gliedert sich in zwei Teile. Im ersten Teil werden Erhebungen und Auswertungen als Grundlage der Modellentwicklung dargestellt. Dazu wurden die Biotoptypen der Beispielgebiete flächendeckend erhoben und mit punktuellen Vegetationserhebungen ergänzt. Aus dem Forschungsprojekt "Rückgewinnung von Retentionsflächen und Altauenreaktivierung an der Mittleren Elbe in Sachsen-Anhalt" des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) standen standortökologische Daten der Hydrologie und Bodenkunde zur Verfügung. Ziel der Auswertung war, Schlüsselfaktoren für Hydrologie und Bodenbedingungen innerhalb der rezenten Aue zu identifizieren, die zur Ausprägung bestimmter Biotoptypen führen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein Modell für Biotoptypenpotenziale auf den geplanten Rück&ndash;deichungsflächen entwickelt. Das Modell bearbeitet die Datenbank der verwendeten GIS-Dateien, die auf Daten zum Bestand beruht und um solche der Prognose der Standortökologie (Hydrologie und Boden) im Rückdeichungsfalle aus dem BMBF-Projekt erweitert wurde. Weitere Voraussetzung für die Modellierung war die Erarbeitung von Leitbildern, in denen unterschiedliche Nutzungsszenarios für die Landschaft nach Deichrückverlegung hypothetisch festgelegt wurden. Insbesondere die Nutzungsintensität wurde variiert, von einer Variante intensiver land- und forstwirtschaftlicher Nutzung über sogenannte integrierte Entwicklungsziele aus dem BMBF-Projekt bis hin zu einer Variante der Naturschutznutzung. Zusätzlich wurde eine zukünftige Potentielle Natürliche Vegetation modelliert. Eine Überprüfung des Modell fand für den Raum der rezenten Aue in der intensiven Nutzungsvariante statt, die der gegenwärtigen Nutzung am nächsten kommt. Werden Informationen des Bestandsbiotoptyps als Korrekturgröße in das Modell einbezogen, konnte für viele Biotoptypen eine Trefferquote von über 90 % erreicht werden. Bei flächenmäßig weniger bedeutenden Bio&ndash;toptypen lag dieser Wert aufgrund der schmaleren Datenbasis zwischen 20 und 40 %. Als Ergebnis liegt für unterschiedliche Deichvarianten und Leitbilder in den Beispielgebieten die Landschaftsentwicklung als Biotoppotenzial vor. Als eine vereinfachte Regionalisierung der punktuellen Vegetationsdaten wurde im Modell geprüft, inwieweit die modellierten Biotopflächen der Charakteristik der pflanzensoziologischen Aufnahmen aus der rezenten Aue entsprechen. In dem Falle wurde die Pflanzengesellschaft der jeweiligen ökologisch im Rahmen der Untersuchung einheitlichen Flächeneinheit zugeordnet. Anteilig lässt sich damit die Biotopprognosefläche pflanzensoziologisch konkretisieren. Die vorliegende Arbeit gehört zu den bisher wenigen Arbeiten, die sich mit den Folgen von Auenreaktivierung auf die Entwicklung der Landschaft auseinandersetzen. Sie zeigt eine Möglichkeit auf, Prognosemodelle für Biotoptypen und Vegetation anhand begrenzter Felduntersuchungen zu entwerfen. Derartige Modelle können zum Verständnis von Eingriffen in den Naturhaushalt, wie sie die Deichrückverlegungen darstellen, beitragen und eine Folgenabschätzung unterstützen.
N2  - Most of the floodplains in Central Europe are highly altered by man. In particular, recent inundation areas have been dramatically reduced. Before the Elbe-flood-disaster of the year 2002 there had already been considerations about combining flood-protection and restoration of floodplains. While research has focused on floodplains for a considerable time, knowledge on the reactivation of floodplains is still significantly lacking. Until now, only a few projects have been realized, and there has not been enough long-term moni&ndash;toring of the adaption of habitats to changing conditions. Computerized models of landscape development, as utilized in the presented work, can help to address these questions. The aim of the study was to show the potential development of the landscape on the scale of biotopes under different scenarios of floodplain expansion by application of a geographic information system (GIS). It was not intended to create a general floodplain-model. The model aimed at a specific applied case and should also be applicable for questions of landscape planning. Two areas near the villages of Sandau and Rogätz at the Middle Elbe River in the north of the German federal state of Saxony-Anhalt were selected. The presented work is divided into two parts. The first describes the sampling and evaluation of data as a basis for modeling. For this, the biotopes were mapped in total in the two study areas. Additionally, vegetation data were collected from selected sites mainly in the grassland and forest-biotopes. Hydrological and soil condition data were available through the project "Rückgewinnung von Retentionsflächen und Altauenreaktivierung an der Mittleren Elbe in Sachsen-Anhalt" of the German Ministry of Education and Science (BMBF). This part of the study aimed to identify the ecological key factors in the recent floodplain that lead to the development of the different biotopes. In the second part of the presented work a model for the potential biotopes on the expanded floodplain after setting back the dikes was developed. The model alters the GIS database and adds a potential biotope. First this database must be expanded to integrate the hydrological and soil data of the BMBF-project for the expanded floodplain. Different hypo&ndash;thetical land use scenarios were assumed and applied to the model. The three different variants of land use adapted from the BMBF-project were intensive land use, land use under conditions of nature-conservation an integration of both extremes. In the case of intensive land &ndash;use arable fields were modeled in areas which are flooded on average only every ten years or less. As a fourth scenario the potential natural vegetation was modeled. An evaluation of the model was made for the recent floodplain under intensive land use conditions, which are close to the current land use. By correcting the models results with information of the current biotope composition, many biotopes could be predicted correctly with 90 % accuracy. For biotopes which are rare in the study area the prediction rate lay between 20 and 40 %. The result of the second part of the presented work was the modeling of the potential biotopes for the different land use scenarios and the different variants of setting back the dikes. Integrated in the model was a module of a simplified regionalization of the vegetation data. It was tested whether the characteristics of the processed unit of the GIS-database fit the results of the vegetation sampling of the first part of the study. Where this was the case, the whole unit was characterized as a phytosociologic vegetation-unit. Thus, for part of the modeling area the biotope-potentials could be expanded with information on the actual vegetation. The present work is one of the few studies so far dealing with the consequences for the landscape of reactivating floodplains which are separated from rivers by dikes. It shows the possibility to use models to predict changes in biotopes and vegetation based on limited field data. Such models can help to understand the altering of nature caused by such impacts and to estimate the possible consequences.
KW  - Modellierung
KW  - Geoinformationssystem
KW  - Vegetation
KW  - Biotoptypen
KW  - Deichrückverlegung
KW  - Auenreaktivierung
KW  - biotopes
KW  - setting back dykes
KW  - restoration of floodplains
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-2523
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TY  - THES
A1  - Baumgart, Natalie
T1  - Faltungseigenschaften des extrazellulären Proteins Internalin J und seine Cysteinleiter
T1  - Folding of the extracellular protein Internalin J and the cysteine ladder
N2  - Internalin J (InlJ) gehört zu der Klasse der bakteriellen, cysteinhaltigen (leucine-rich repeat) LRR Proteine. Bei den Internalinen handelt es sich um meist invasions-assoziierte Proteine der Listerien. Die LRR-Domäne von InlJ ist aus 15 regelmäßig wiederkehrenden, stark konservierten Sequenzeinheiten (repeats, 21 Aminosäuren) aufgebaut. Ein interessantes Detail dieses Internalins ist das stark konservierte Cystein innerhalb der repeats. Daraus ergibt sich eine ungewöhnliche Anordnung von 12 Cysteinen in einem Stapel. Die Häufigkeit von Cysteinen in InlJ ist für ein extrazelluläres Protein von L. monocytogenes außergewöhnlich, und die Frage nach ihrer Funktion daher umso brennender. Im Vergleich zum ubiquitären Vorkommen der sogenannten repeat-Proteine in der Natur sind Studien zu ihrer Stabilität und Faltung nicht äquivalent vertreten. Die zentrale Eigenschaft der repeat-Proteine ist ihr modularer Aufbau, der durch einfache Topologie gekennzeichnet ist und auf kurzreichenden Wechselwirkungen basiert. Diese Topologie macht repeat-Proteine zu idealen Modellproteinen, um die stabilitätsrelevanten Wechselwirkungen zu separieren und zuzuordnen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Faltung und Entfaltung von InlJ umfassend charakterisiert und die Relevanz der Cysteine näher beleuchtet. Die spektroskopische Charakterisierung von InlJ zeigte, dass dessen Faltungszustand durch zwei Tryptophane im N- und C-Terminus fluoreszenzspektroskopisch gut zugänglich ist. Die thermodynamische Stabilität wurde mittels fluoreszenz-detektierten, Guanidiniumchlorid-induzierten Gleichgewichtsexperimenten bestimmt. Um die kinetischen Eigenschaften von InlJ zu erfassen, wurden die Faltungs- sowie die Entfaltungsreaktion spektroskopisch untersucht. Die Identifizierung der produktiven Faltungsreaktion war lediglich durch die Anwendung des reversen Doppelsprungexperiments möglich. Die Auswertung erfolgte nach dem Zweizustandsmodell, wonach die Faltung dem „Alles-oder-Nichts“ Prinzip folgt. Die Gültigkeit dieser Annahme wurde durch die kinetische Charakterisierung bestätigt. Es wurde sowohl in den Gleichgewichtsexperimenten als auch in den kinetisch erhaltenen Daten eine hohe freie Stabilisierungsenthalpie festgestellt. Die hohe Stabilität von InlJ geht mit hoher Kooperativität einher. Die kinetischen Daten zeigen zudem, dass die hohe Kooperativität hauptsächlich der Faltungsreaktion entstammt. Der Tanford-Wert von 0.93 impliziert, dass die Oberflächenänderung während der Faltung bereits zum größten Teil erfolgt ist, bevor der Übergangszustand ausgebildet wurde. Direkte strukturelle Informationen über den Übergangszustand wurden mit Hilfe von Mutationsstudien erhalten. Zu diesem Zweck wurden 12 der 14 Cysteine gegen ein Alanin ausgetauscht. Die repeats 1 bis 11 von InlJ beinhalten jeweils ein Cystein, deren Anordnung eine Leiter ergibt. Deren Substitutionen haben einen vergleichbar destabilisierenden Effekt auf InlJ von durchschnittlich 4.8 kJ/mol. Die Verlangsamung der Faltung deutet daraufhin, dass die Interaktionen der repeats 5 bis 11 im Übergangszustand bereits voll ausgebildet sind. Demnach liegt bei InlJ ein zentraler Faltungsnukleus vor. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurde eine hohe Stabilität und ein stark-kooperatives Verhalten für das extrazelluläre Protein InlJ beobachtet. Diese Erkenntnisse könnten wichtige Beiträge zur Entwicklung artifizieller repeat-Proteine leisten, deren Verwendung sich stetig ausweitet.
N2  - Internalin J (InlJ) is a member of the family of bacterial cysteine-containing leucine-rich repeat (LRR) proteins. Internalins are invasion-associated surface proteins of Listeria monocytogenes. The LRR domain of InlJ consists of 15 repeating units, which are arranged in tandem. The consensus sequence consists of 21 residues. Interestingly, a leucine residue which is highly conserved among the Internalins is replaced by cysteine. This results in a continuous cysteine ladder of 12 repeats. This frequency of cysteines is remarkable for an extracellular protein of L. monocytogenes. Stability and folding of repeat proteins are not equivalently studied considering their ubiquitous distribution in nature. Their modular structure results in simple topology and is dominated by short-range interactions. These characteristic features of repeat proteins facilitate the separation and identification of stabilizing interactions, making repeat proteins to ideal model systems for folding studies. In this work the folding and unfolding of InlJ has been extensively characterized, shedding light on the relevance of the cysteines. Two tryptophans located in the N- and C-terminus allowed monitoring the folding state of the entire protein via fluorescence. Thermodynamic stability was therefore derived by guanidinium chloride induced equilibrium experiments. Furthermore, the chemically induced unfolding and folding reactions were characterized with respect to their kinetics. Interrupted refolding experiments were essential for tracking the productive folding reaction of InlJ. Analysis of the kinetic and equilibrium data leads to the conclusion that the results are compatible with a two-state model. The study presented here reveals high stability of the protein InlJ in conjunction with high cooperativity. Kinetic data disclosed the origin of high cooperativity in the folding reaction; with a Tanford value of about 0.93. This high value implicates that the major change of the accessible surface area occurs before the transition state is formed. Mutational studies provided more detailed structural information about the transition state. 12 of 14 cysteine residues were mutated to alanine for this purpose. The cysteines in repeats 1 to 11 stack over each other and form a ladder of reduced cysteines. The substitution of one of these cysteines has an average destabilizing effect of 4.8 kJ/mol. The deceleration of the folding reaction by the substitution shows that repeats 5 to 11 are already fully structured in the transition state, pointing to a central nucleus in the folding of the LRR-protein InlJ. The extracellular protein InlJ reveals extreme stability and high cooperativity. The insights into the folding of this LRR motif could facilitate the design of further artificial repeat proteins.
KW  - Internalin J
KW  - leucinreiches repeat-Protein
KW  - Proteinfaltung
KW  - Zweizustandsmodell
KW  - thermodynamische Stabilität
KW  - Internalin J
KW  - leucine-rich repeat protein
KW  - protein folding
KW  - two-state model
KW  - thermodynamic stability
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-69603
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TY  - THES
A1  - Becker, Marion
T1  - Bedeutung eines hydrophoben Seitenkettenstapels für Stabilität, Faltung und Struktur des P22 Tailspikeproteins
T1  - Importance of a hydrophobic side chain stack for stability, folding and structure of the P22 tailspike protein
N2  - Das homotrimere Tailspikeadhäsin des Bakteriophagen P22 ist ein etabliertes Modellsystem, dessen Faltung, Assemblierung und Stabilität in vivo und in vitro umfassend charakterisiert ist. Das zentrale Strukturmotiv des Proteins ist eine parallele beta-Helix mit 13 Windungen, die von einer N‑terminalen Kapsidbindedomäne und einer C‑terminalen Trimerisierungsdomäne flankiert wird. Jede Windung beinhaltet drei kurze beta-Stränge, die durch turns und loops unterschiedlicher Länge verbunden sind. Durch den sich strukturell wiederholenden, spulenförmigen Aufbau formen beta-Stränge benachbarter Windungen elongierte beta-Faltblätter. Das Lumen der beta-Helix beinhaltet größtenteils hydrophobe Seitenketten, welche linear und sehr regelmäßig entlang der Längsachse gestapelt sind. Eine hoch repetitive Struktur, ausgedehnte beta-Faltblätter und die regelmäßige Anordnung von ähnlichen oder identischen Seitenketten entlang der beta-Faltblattachse sind ebenfalls typische Kennzeichen von Amyloidfibrillen, die bei Proteinfaltungskrankheiten wie Alzheimer, der Creutzfeld-Jakob-Krankheit, Chorea Huntington und Typ-II-Diabetes gebildet werden. Es wird vermutet, dass die hohe Stabilität des Tailspikeproteins und auch die der Amyloidfibrille durch Seitenkettenstapelung, einem geordneten Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen und den rigiden, oligomeren Verbund bedingt ist. Um den Einfluss der Seitenkettenstapelung auf die Stabilität, Faltung und Struktur des P22 Tailspikeproteins zu untersuchen, wurden sieben Valine in einem im Lumen der beta-Helix begrabenen Seitenkettenstapel gegen das kleinere und weniger hydrophobe Alanin und das voluminösere Leucin substituiert. Der Einfluss der Mutationen wurde anhand zweier Tailspikevarianten, dem trimeren, N‑terminal verkürzten TSPdeltaN‑Konstrukt und der monomeren, isolierten beta-Helix Domäne analysiert. Generell wurde in den Experimenten deutlich, dass Mutationen zu Alanin stärkere Effekte auslösen als Mutationen zu Leucin. Die dichte und hydrophobe Packung im Kern der beta-Helix bildet somit die Basis für Stabilität und Faltung des Proteins. Anhand hoch aufgelöster Kristallstrukturen jeweils zweier Alanin‑ und Leucin‑Mutanten konnte verdeutlicht werden, dass das Strukturmotiv der parallelen beta-Helix stark formbar ist und mutationsbedingte Änderungen des Seitenkettenvolumens durch kleine und lokale Verschiebung der Haupt‑ und Seitenketten ausgeglichen werden, sodass mögliche Kavitäten gefüllt und sterische Spannung abgebaut werden können. Viele Mutanten zeigten in vivo und in vitro einen temperatursensitiven Faltungsphänotyp (temperature sensitive for folding, tsf), d.h. bei Temperaturerhöhung waren die Ausbeuten des N‑terminal verkürzten Trimers im Vergleich zum Wildtyp deutlich verringert. Weiterführende Experimente zeigten, dass der tsf‑Phänotyp durch die Beeinflussung unterschiedlicher Stadien des Reifungsprozesses oder auch durch die Verminderung der kinetischen Stabilität des nativen Trimers ausgelöst wurde. Durch Untersuchungen am vollständigen und am N‑terminal verkürzten Wildtypprotein wurde gezeigt, dass die Entfaltungsreaktion des Tailspiketrimers komplex ist. Die Verläufe der Kinetiken folgen zwar einem apparenten Zweizustandsverhalten, jedoch sind bei Darstellung der Entfaltungsäste im Chevronplot die Abhängigkeiten der Geschwindigkeitskonstanten vom Denaturierungsmittel nicht linear, sondern in unterschiedliche Richtungen gewölbt. Dieses Verhalten könnte durch ein hoch energetisches Entfaltungsintermediat, einen breiten Übergangsbereich oder parallele Entfaltungswege hervorgerufen sein. Mit Hilfe der monomeren, isolierten beta-Helix Domäne, bei der die N‑terminale Capsidbindedomäne und die C‑terminale Trimerisierungsdomäne deletiert sind und welche als unabhängige Faltungseinheit fungiert, wurde gezeigt, dass alle Mutanten im Harnstoff‑induzierten Gleichgewicht analog zum Wildtypprotein einem Zweizustandsverhalten mit vergleichbaren Kooperativitäten folgen. Die konformationellen Stabilitäten von in der beta-Helix zentral gelegenen Alanin‑ und Leucin‑Mutanten sind stark vermindert, während Mutationen in äußeren Bereichen der Domäne keinen Einfluss auf die Stabilität der beta-Helix haben. Bei Verlängerung der Inkubationszeiten der Gleichgewichtsexperimente konnte die langsame Bildung von Aggregaten im Übergangsbereich der destabilisierten Mutanten detektiert werden. Die in der Arbeit erlangten Erkenntnisse lassen vermuten, dass die isolierte beta-Helix einem für die Reifung des Tailspikeproteins entscheidenden thermolabilen Faltungsintermediat auf Monomerebene sehr ähnlich ist. Im Intermediat ist ein zentraler Kern, der die Windungen 4 bis 7 und die „Rückenflosse“ beinhaltet, stabilitätsbestimmend. Dieser Kern könnte als Faltungsnukleus dienen, an den sich sequenziell weitere Helixwindungen anlagern und im Zuge der „Monomerreifung“ kompaktieren.
N2  - The homotrimeric tailspike adhesin of bacteriophage P22 is a widely used model system for studying different aspects of multi-domain protein folding, assembly and stability, both in vivo and in vitro. The central domain of the tailspike protein is a 13-turn right-handed parallel beta-helix, flanked by an N-terminal capsid-binding domain and a C-terminal trimerization domain. In the beta-helix motif the polypeptide backbone winds up to form a right-handed helix, with each coil consisting of three short beta-strands connected by turns and loops of varying lengths. Due to this repetitive and solenoidal structure, beta-strands of adjacent coils participate in building up three elongated beta-sheets. The internal lumen of the beta-helix is tightly packed and contains mostly hydrophobic side-chains, which are stacked along the helical axis in a linear and very regular manner. A highly repetitive structure, elongated beta-sheets and stacking of similar or identical side chains along the beta-sheet axis are also typical characteristics of amyloid fibrils, which are associated with protein folding diseases such as Alzheimer’s disease, Creutzfeldt-Jacob disease, Huntington’s disease and type II diabetes. It is assumed that the high stability of both, the tailspike protein and amyloid fibrils, is determined by side chain stacking, a well‑ordered network of H-bonds and the rigid, oligomeric state. To systematically investigate the influence of side chain stacking for stability, folding and structure of the P22 tailspike protein, a hydrophobic stack located in the lumen of the beta-helix domain was subjected to site-directed mutagenesis. Each of seven valine residues, distributed over the whole length of the beta-helix domain, was substituted by the smaller and less hydrophobic alanine and the bulkier leucine. The influence of these substitutions was investigated with the help of two tailspike protein constructs, namely the N-terminally shortened TSPdeltaN construct and the isolated, monomeric BHX construct. In general, almost all experiments showed that alanine mutations cause a stronger effect than leucine mutations, which demonstrates that the tight and hydrophobic packing in the lumen of the beta-helix domain is the basis for stability and folding of the tailspike protein. High-resolution crystal structures of two alanine and two leucine mutants revealed that the parallel beta-helix motif shows considerable plasticity. Small and local adjustments of side chains and the polypeptide backbone compensate for changes induced by the mutations, herewith potential cavities are filled and steric strain is released. Compared to the wild type, many mutations lead to a temperature sensitive for folding (tsf) phenotype in vivo and in vitro, i.e. mutations reduce folding yields of TSPdeltaN at high temperatures, but had little effect at low temperatures. Our experiments have elucidated that the tsf phenotype was caused either by an impact on different stages of the maturation process or by a reduction of the kinetic stability of the native trimer. Using TSPdeltaN and the complete wild type protein, it was shown that the tailspike trimer unfolds in a complex manner. Although unfolding kinetics exhibit a two-state behaviour, analysis of the apparent rate constants of unfolding in a Chevron plot revealed their non-linear denaturant-dependence. Typically, the natural logarithm of the apparent rate constants depend linearly on the denaturant concentration. However, in case of TSPdeltaN and the complete wild type protein, unfolding branches of the Chevron plot are curved. Such a behaviour could arise from a high energy intermediate on the unfolding pathway, a broad activation barrier or parallel unfolding pathways. The monomeric BHX construct lacks both the N-terminal and C-terminal domain. It folds into a conformation very similar to that of the -helix domain in the tailspike trimer and acts as an independent folding unit. Unfolding and refolding equilibrium transitions of mutant and wild type BHX constructs are reversible and follow a two-state behaviour with comparable cooperativities. However, conformational stabilities of alanine and leucine mutations located in the central part of the beta-helix domain are highly reduced, whereas mutations at the ends of the domain show a wild type-like stability. Furthermore, these destabilizing mutations tend to form aggregates around the transition midpoint when equilibrium experiments were incubated for longer time periods. Taken together, the results suggest that the structure of the isolated beta-helix seems to be similar to an essential, monomeric intermediate during tailspike folding. In this intermediate, a central core including coils 4 to 7 and the dorsal fin determines the stability of the whole folding unit. This core may act as a nucleus on which beta-helix coils can associate in a sequential manner and compact during maturation of the monomer.
KW  - P22 Tailspikeprotein
KW  - Seitenkettenstapel
KW  - beta-Solenoidproteine
KW  - Proteinfaltung
KW  - thermodynamische Stabilität
KW  - P22 tailspike protein
KW  - side chain stacking
KW  - beta-solenoid proteins
KW  - protein folding
KW  - thermodynamic stability
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus-42674
ER  -