TY  - THES
A1  - Ziege, Ricardo
T1  - Growth dynamics and mechanical properties of E. coli biofilms
T1  - Wachstumsdynamik und mechanische Eigenschaften von E. coli Biofilmen
N2  - Biofilms are complex living materials that form as bacteria get embedded in a matrix of self-produced protein and polysaccharide fibres. The formation of a network of extracellular biopolymer fibres contributes to the cohesion of the biofilm by promoting cell-cell attachment and by mediating biofilm-substrate interactions. This sessile mode of bacteria growth has been well studied by microbiologists to prevent the detrimental effects of biofilms in medical and industrial settings. Indeed, biofilms are associated with increased antibiotic resistance in bacterial infections, and they can also cause clogging of pipelines or promote bio-corrosion. However, biofilms also gained interest from biophysics due to their ability to form complex morphological patterns during growth. Recently, the emerging field of engineered living materials investigates biofilm mechanical properties at multiple length scales and leverages the tools of synthetic biology to tune the functions of their constitutive biopolymers.  
This doctoral thesis aims at clarifying how the morphogenesis of Escherichia coli (E. coli) biofilms is influenced by their growth dynamics and mechanical properties. To address this question, I used methods from cell mechanics and materials science. I first studied how biological activity in biofilms gives rise to non-uniform growth patterns. In a second study, I investigated how E. coli biofilm morphogenesis and its mechanical properties adapt to an environmental stimulus, namely the water content of their substrate. Finally, I estimated how the mechanical properties of E. coli biofilms are altered when the bacteria express different extracellular biopolymers.
On nutritive hydrogels, micron-sized E. coli cells can build centimetre-large biofilms. During this process, bacterial proliferation and matrix production introduce mechanical stresses in the biofilm, which release through the formation of macroscopic wrinkles and delaminated buckles. To relate these biological and mechanical phenomena, I used time-lapse fluorescence imaging to track cell and matrix surface densities through the early and late stages of E. coli biofilm growth. Colocalization of high cell and matrix densities at the periphery precede the onset of mechanical instabilities at this annular region. Early growth is detected at this outer annulus, which was analysed by adding fluorescent microspheres to the bacterial inoculum. But only when high rates of matrix production are present in the biofilm centre, does overall biofilm spreading initiate along the solid-air interface. By tracking larger fluorescent particles for a long time, I could distinguish several kinematic stages of E. coli biofilm expansion and observed a transition from non-linear to linear velocity profiles, which precedes the emergence of wrinkles at the biofilm periphery. Decomposing particle velocities to their radial and circumferential components revealed a last kinematic stage, where biofilm movement is mostly directed towards the radial delaminated buckles, which verticalize. The resulting compressive strains computed in these regions were observed to substantially deform the underlying agar substrates. The co-localization of higher cell and matrix densities towards an annular region and the succession of several kinematic stages are thus expected to promote the emergence of mechanical instabilities at the biofilm periphery. These experimental findings are predicted to advance future modelling approaches of biofilm morphogenesis. 
E. coli biofilm morphogenesis is further anticipated to depend on external stimuli from the environment. To clarify how the water could be used to tune biofilm material properties, we quantified E. coli biofilm growth, wrinkling dynamics and rigidity as a function of the water content of the nutritive substrates. Time-lapse microscopy and computational image analysis revealed that substrates with high water content promote biofilm spreading kinetics, while substrates with low water content promote biofilm wrinkling. The wrinkles observed on biofilm cross-sections appeared more bent on substrates with high water content, while they tended to be more vertical on substrates with low water content. Both wet and dry biomass, accumulated over 4 days of culture, were larger in biofilms cultured on substrates with high water content, despite extra porosity within the matrix layer. Finally, the micro-indentation analysis revealed that substrates with low water content supported the formation of stiffer biofilms. This study shows that E. coli biofilms respond to the water content of their substrate, which might be used for tuning their material properties in view of further applications.
Biofilm material properties further depend on the composition and structure of the matrix of extracellular proteins and polysaccharides. In particular, E. coli biofilms were suggested to present tissue-like elasticity due to a dense fibre network consisting of amyloid curli and phosphoethanolamine-modified cellulose. To understand the contribution of these components to the emergent mechanical properties of E. coli biofilms, we performed micro-indentation on biofilms grown from bacteria of several strains. Besides showing higher dry masses, larger spreading diameters and slightly reduced water contents, biofilms expressing both main matrix components also presented high rigidities in the range of several hundred kPa, similar to biofilms containing only curli fibres. In contrast, a lack of amyloid curli fibres provides much higher adhesive energies and more viscoelastic fluid-like material behaviour. Therefore, the combination of amyloid curli and phosphoethanolamine-modified cellulose fibres implies the formation of a composite material whereby the amyloid curli fibres provide rigidity to E. coli biofilms, whereas the phosphoethanolamine-modified cellulose rather acts as a glue. These findings motivate further studies involving purified versions of these protein and polysaccharide components to better understand how their interactions benefit biofilm functions. 
All three studies depict different aspects of biofilm morphogenesis, which are interrelated. The first work reveals the correlation between non-uniform biological activities and the emergence of mechanical instabilities in the biofilm. The second work acknowledges the adaptive nature of E. coli biofilm morphogenesis and its mechanical properties to an environmental stimulus, namely water. Finally, the last study reveals the complementary role of the individual matrix components in the formation of a stable biofilm material, which not only forms complex morphologies but also functions as a protective shield for the bacteria it contains. Our experimental findings on E. coli biofilm morphogenesis and their mechanical properties can have further implications for fundamental and applied biofilm research fields.
N2  - Biofilme sind komplexe lebende Materialien, die sich bilden, wenn Bakterien in eine Matrix aus selbstproduzierten Protein- und Polysaccharidfasern eingebettet werden. Die Bildung eines Netzwerks aus extrazellulären Biopolymerfasern trägt zum Zusammenhalt des Biofilms bei, indem sie die Zell-Zell-Anhaftung fördert und die Wechselwirkungen zwischen Biofilm und Substrat vermittelt. Diese sessile Form des Bakterienwachstums wurde von Mikrobiologen eingehend untersucht, um die schädlichen Auswirkungen von Biofilmen in der Medizin und Industrie zu verhindern. Biofilme werden nämlich mit einer erhöhten Antibiotikaresistenz bei bakteriellen Infektionen in Verbindung gebracht, und sie können auch zur Verstopfung von Rohrleitungen führen oder Biokorrosion fördern. Biofilme sind jedoch auch für die Biophysik von Interesse, da sie während ihres Wachstums komplexe morphologische Muster bilden können. In jüngster Zeit werden auf dem aufstrebenden Gebiet der künstlich hergestellten lebenden Materialien die mechanischen Eigenschaften von Biofilmen auf verschiedenen Längenskalen untersucht und die Werkzeuge der synthetischen Biologie genutzt, um die Funktionen ihrer konstitutiven Biopolymere zu beeinflussen.  
In dieser Doktorarbeit soll geklärt werden, wie die Morphogenese von Escherichia coli (E. coli)-Biofilmen durch deren Wachstumsdynamik und mechanische Eigenschaften beeinflusst wird. Um dieser Frage nachzugehen, habe ich Methoden aus der Zellmechanik und der Materialwissenschaft verwendet. Zunächst habe ich untersucht, wie die biologische Aktivität in Biofilmen zu ungleichmäßigen Wachstumsmustern führt. In einer zweiten Studie untersuchte ich, wie sich die Morphogenese von E. coli-Biofilmen und ihre mechanischen Eigenschaften an einen Umweltstimulus, nämlich den Wassergehalt des Substrats, anpassen. Schließlich habe ich abgeschätzt, wie sich die mechanischen Eigenschaften von E. coli-Biofilmen verändern, wenn die Bakterien verschiedene extrazelluläre Biopolymere exprimieren.
Auf nährstoffhaltigen Hydrogelen können mikrometergroße E. coli-Zellen zentimetergroße Biofilme bilden. Während dieses Prozesses führen die bakterielle Vermehrung und die Matrixproduktion zu mechanischen Spannungen im Biofilm, die sich durch die Bildung von makroskopischen Falten und delaminierten Knicken entladen. Um diese biologischen und mechanischen Phänomene miteinander in Beziehung zu setzen, habe ich mit Hilfe von Zeitraffer-Fluoreszenzaufnahmen die Zell- und Matrixoberflächendichte in den frühen und späten Phasen des E. coli-Biofilmwachstums verfolgt. Die Kolokalisierung hoher Zell- und Matrixdichten an der Peripherie geht dem Auftreten mechanischer Instabilitäten in diesem ringförmigen Bereich voraus. An diesem äußeren Ring wird ein frühes Wachstum festgestellt, das durch Zugabe von fluoreszierenden Mikrokugeln zum bakteriellen Inokulum analysiert wurde. Aber nur wenn im Zentrum des Biofilms hohe Raten der Matrixproduktion vorhanden sind, beginnt die Ausbreitung des gesamten Biofilms entlang der Feststoff-Luft-Grenzfläche. Indem ich größere fluoreszierende Partikel über einen längeren Zeitraum verfolgte, konnte ich mehrere kinematische Stadien der E. coli-Biofilmexpansion unterscheiden und einen Übergang von nichtlinearen zu linearen Geschwindigkeitsprofilen beobachten, der dem Auftreten von Falten an der Biofilmperipherie vorausgeht. Die Zerlegung der Partikelgeschwindigkeiten in ihre radialen und umlaufenden Komponenten ergab ein letztes kinematisches Stadium, in dem die Bewegung des Biofilms hauptsächlich auf die radialen delaminierten Knicke gerichtet ist, die sich vertikalisieren. Die in diesen Regionen berechneten Druckspannungen verformen die darunter liegenden Agarsubstrate erheblich. Die gleichzeitige Ansammlung höherer Zell- und Matrixdichten in einer ringförmigen Region und die Abfolge mehrerer kinematischer Stadien dürften somit das Entstehen mechanischer Instabilitäten an der Biofilm-Peripherie fördern. Diese experimentellen Ergebnisse werden voraussichtlich zukünftige Modellierungsansätze der Biofilmmorphogenese voranbringen. 
Die Morphogenese des E. coli-Biofilms wird voraussichtlich auch von externen Stimuli aus der Umwelt abhängen. Um zu klären, wie das Wasser zur Einstellung der Materialeigenschaften von Biofilmen genutzt werden könnte, haben wir das Wachstum, die Faltenbildung und die Steifigkeit von E. coli-Biofilmen in Abhängigkeit vom Wassergehalt der Nährsubstrate quantifiziert. Zeitraffermikroskopie und computergestützte Bildanalyse zeigten, dass Substrate mit hohem Wassergehalt die Ausbreitungskinetik des Biofilms fördern, während Substrate mit niedrigem Wassergehalt die Faltenbildung des Biofilms begünstigen. Die auf Biofilm-Querschnitten beobachteten Falten erschienen auf Substraten mit hohem Wassergehalt stärker gebogen, während sie auf Substraten mit niedrigem Wassergehalt eher vertikal verliefen. Sowohl die feuchte als auch die trockene Biomasse, die während der 4-tägigen Kultur akkumuliert wurde, war in Biofilmen, die auf Substraten mit hohem Wassergehalt gezüchtet wurden, größer, trotz der zusätzlichen Porosität innerhalb der Matrixschicht. Schließlich ergab die Mikroindentationsanalyse, dass Substrate mit niedrigem Wassergehalt die Bildung von steiferen Biofilmen begünstigten. Diese Studie zeigt, dass E. coli-Biofilme auf den Wassergehalt ihres Substrats reagieren, was für die Abstimmung ihrer Materialeigenschaften im Hinblick auf weitere Anwendungen genutzt werden könnte.
Die Materialeigenschaften von Biofilmen hängen außerdem von der Zusammensetzung und Struktur der Matrix aus extrazellulären Proteinen und Polysacchariden ab. Insbesondere wurde vermutet, dass E. coli-Biofilme aufgrund eines dichten Fasernetzwerks aus Amyloid-Curli und Phosphoethanolamin-modifizierter Cellulose eine gewebeähnliche Elastizität aufweisen. Um den Beitrag dieser Komponenten zu den entstehenden mechanischen Eigenschaften von E. coli-Biofilmen zu verstehen, führten wir an Biofilmen, die aus Bakterien verschiedener Stämme gewachsen waren, Mikroeindrücke durch. Biofilme, die beide Hauptmatrixkomponenten enthalten, wiesen nicht nur eine höhere Trockenmasse, einen größeren Ausbreitungsdurchmesser und einen leicht verringerten Wassergehalt auf, sondern auch eine hohe Steifigkeit im Bereich von mehreren hundert kPa, ähnlich wie Biofilme, die nur Curli-Fasern enthalten. Das Fehlen von Amyloid-Curli-Fasern führt dagegen zu deutlich höheren Adhäsionsenergien und einem viskoelastischeren, flüssigkeitsähnlichen Materialverhalten. Die Kombination von Amyloid-Curli-Fasern und Phosphoethanolamin-modifizierten Cellulosefasern impliziert daher die Bildung eines Verbundmaterials, bei dem die Amyloid-Curli-Fasern den E. coli-Biofilmen Steifigkeit verleihen, während die Phosphoethanolamin-modifizierte Cellulose eher als Klebstoff wirkt. Diese Ergebnisse motivieren zu weiteren Studien mit gereinigten Versionen dieser Protein- und Polysaccharidkomponenten, um besser zu verstehen, wie ihre Interaktionen die Funktionen des Biofilms unterstützen. 
Alle drei Studien zeigen verschiedene Aspekte der Biofilm-Morphogenese, die miteinander verbunden sind. Die erste Arbeit zeigt den Zusammenhang zwischen ungleichmäßigen biologischen Aktivitäten und dem Auftreten mechanischer Instabilitäten im Biofilm auf. Die zweite Arbeit bestätigt die Anpassungsfähigkeit der Morphogenese des E. coli-Biofilms und seiner mechanischen Eigenschaften an einen Umweltreiz, nämlich Wasser. Die letzte Studie schließlich zeigt die komplementäre Rolle der einzelnen Matrixkomponenten bei der Bildung eines stabilen Biofilmmaterials, das nicht nur komplexe Morphologien bildet, sondern auch als Schutzschild für die darin enthaltenen Bakterien fungiert. Unsere experimentellen Erkenntnisse über die Morphogenese von E. coli-Biofilmen und ihre mechanischen Eigenschaften können weitere Auswirkungen auf grundlegende und angewandte Biofilm-Forschungsbereiche haben.
KW  - biofilm
KW  - E. coli
KW  - living materials
KW  - mechanobiology
KW  - E. coli
KW  - Biofilm
KW  - lebende Materialien
KW  - Mechanobiologie
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-559869
ER  - 
TY  - THES
A1  - Pellegrino, Antonio
T1  - miRNA profiling for diagnosis of chronic pain in polyneuropathy
T1  - miRNA profiling zur Diagnose von chronischem Schmerz in Polyneuropathie
N2  - This dissertation aimed to determine differential expressed miRNAs in the context of chronic pain in polyneuropathy. For this purpose, patients with chronic painful polyneuropathy were compared with age matched healthy patients. Taken together, all miRNA pre library preparation quality controls were successful and none of the samples was identified as an outlier or excluded for library preparation. Pre sequencing quality control showed that library preparation worked for all samples as well as that all samples were free of adapter dimers after BluePippin size selection and reached the minimum molarity for further processing. Thus, all samples were subjected to sequencing. The sequencing control parameters were in their optimal range and resulted in valid sequencing results with strong sample to sample correlation for all samples. The resulting FASTQ file of each miRNA library was analyzed and used to perform a differential expression analysis. The differentially expressed and filtered miRNAs were subjected to miRDB to perform a target prediction. Three of those four miRNAs were downregulated: hsa-miR-3135b, hsa-miR-584-5p and hsa-miR-12136, while one was upregulated: hsa-miR-550a-3p. miRNA target prediction showed that chronic pain in polyneuropathy might be the result of a combination of miRNA mediated high blood flow/pressure and neural activity dysregulations/disbalances. Thus, leading to the promising conclusion that these four miRNAs could serve as potential biomarkers for the diagnosis of chronic pain in polyneuropathy.
Since TRPV1 seems to be one of the major contributors of nociception and is associated with neuropathic pain, the influence of PKA phosphorylated ARMS on the sensitivity of TRPV1 as well as the part of AKAP79 during PKA phosphorylation of ARMS was characterized. Therefore, possible PKA-sites in the sequence of ARMS were identified. This revealed five canonical PKA-sites: S882, T903, S1251/52, S1439/40 and S1526/27. The single PKA-site mutants of ARMS revealed that PKA-mediated ARMS phosphorylation seems not to influence the interaction rate of TRPV1/ARMS. While phosphorylation of ARMST903 does not increase the interaction rate with TRPV1, ARMSS1526/27 is probably not phosphorylated and leads to an increased interaction rate. The calcium flux measurements indicated that the higher the interaction rate of TRPV1/ARMS, the lower the EC50 for capsaicin of TRPV1, independent of the PKA phosphorylation status of ARMS. In addition, the western blot analysis confirmed the previously observed TRPV1/ARMS interaction. More importantly, AKAP79 seems to be involved in the TRPV1/ARMS/PKA signaling complex. To overcome the problem of ARMS-mediated TRPV1 sensitization by interaction, ARMS was silenced by shRNA. ARMS silencing resulted in a restored TRPV1 desensitization without affecting the TRPV1 expression and therefore could be used as new topical therapeutic analgesic alternative to stop ARMS mediated TRPV1 sensitization.
N2  - Ziel dieser Dissertation war es, differentiell exprimierte miRNAs im Kontext von chronischen Schmerzen bei Polyneuropathie zu bestimmen. Zu diesem Zweck wurden Patienten mit chronisch schmerzhafter Polyneuropathie und altersgleiche gesunde Patienten verglichen. Insgesamt waren alle Qualitätskontrollen zur Erstellung der miRNA-Bibliothek erfolgreich und keine der Proben wurde als Ausreißer identifiziert oder ausgeschlossen. Die Qualitätskontrolle vor der Sequenzierung zeigte, dass die Bibliothekserstellung für alle Proben funktionierte, sowie dass alle Proben frei von Adapterdimeren waren und die Mindestmolalität erreichten, woraufhin alle Proben sequenziert wurden. Die Kontrollparameter für die Sequenzierung lagen im optimalen Bereich und führten bei allen Proben zu gültigen Sequenzierungsergebnissen mit einer starken Korrelation zwischen den Proben. Die resultierende FASTQ-Datei jeder miRNA-Bibliothek wurde analysiert und für eine differenzielle Expressionsanalyse verwendet. Die differenziell exprimierten und gefilterten miRNAs wurden mittels miRDB analysiert, um eine Zielvorhersage zu erhalten. Drei dieser vier miRNAs wurden herunterreguliert: hsa-miR-3135b, hsa-miR-584-5p und hsa-miR-12136, während eine hochreguliert wurde: hsa-miR-550a-3p. Die miRNA-Zielvorhersage zeigte, dass chronische Schmerzen bei Polyneuropathie das Ergebnis von miRNA induziertem hohen Blutdruck und neuralen Aktivitätsdysregulationen sein könnten. Daraus ergibt sich die Schlussfolgerung, dass diese vier miRNAs als potenzielle Biomarker für die Diagnose von chronischen Schmerzen bei Polyneuropathie dienen könnten.

Da TRPV1 mit Nozizeption und neuropathischen Schmerzen in Verbindung gebracht wird, wurde der Einfluss von PKA-phosphoryliertem ARMS auf die Sensitivität von TRPV1 sowie die Rolle von AKAP79 während der PKA-Phosphorylierung von ARMS untersucht. Dazu wurden mögliche PKA-Stellen in der Sequenz von ARMS identifiziert. Dies ergab fünf kanonische PKA-Stellen: S882, T903, S1251/52, S1439/40 und S1526/27. Die einzelnen ARMS-Mutanten zeigten, dass die PKA-vermittelte ARMS-Phosphorylierung die Interaktion von TRPV1/ARMS nicht zu beeinflussen scheint. Während die Phosphorylierung von ARMST903 die Interaktionsrate mit TRPV1 nicht erhöht, wird ARMSS1526/27 vermutlich nicht phosphoryliert und führt zu einer erhöhten Interaktionsrate. Zusätzlich zeigten Kalziumflussmessungen, dass der EC50 für Capsaicin von TRPV1 umso niedriger ist, je höher die Interaktionsrate von TRPV1/ARMS ist, unabhängig vom PKA-Phosphorylierungsstatus von ARMS. Darüber hinaus bestätigte die Western-Blot-Analyse, dass AKAP79 an dem TRPV1/ARMS/PKA-Signalkomplex beteiligt zu sein scheint. Letztlich sorgte die Stilllegung von ARMS mittels shRNA zu einer wiederhergestellten TRPV1-Desensibilisierung, ohne die TRPV1-Expression zu beeinträchtigen, und könnte als neue topische therapeutische Analgetika-Alternative verwendet werden.
KW  - miRNA
KW  - miRNA
KW  - chronic pain
KW  - chronischer Schmerz
KW  - polyneuropathy
KW  - Polyneuropathie
KW  - TRPV1
KW  - TRPV1
KW  - ARMS
KW  - ARMS
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-583858
ER  - 
TY  - THES
A1  - Folikumah, Makafui Yao
T1  - Stimuli-promoted in situ formation of hydrogels with thiol/thioester containing peptide precursors
T1  - Stimuli-induzierte In-Situ-Bildung von Hydrogelen durch Peptid-Prekursor mit Thiol/Thioestergruppen
N2  - Hydrogels are potential synthetic ECM-like substitutes since they provide functional and structural similarities compared to soft tissues. They can be prepared by crosslinking of macromolecules or by polymerizing suitable precursors. The crosslinks are not necessarily covalent bonds, but could also be formed by physical interactions such as π-π interactions, hydrophobic interactions, or H-bonding. On demand in situ forming hydrogels have garnered increased interest especially for biomedical applications over preformed gels due to the relative ease of in vivo delivery and filling of cavities. The thiol-Michael addition reaction provides a straightforward and robust strategy for in situ gel formation with its fast reaction kinetics and ability to proceed under physiological conditions. The incorporation of a trigger function into a crosslinking system becomes even more interesting since gelling can be controlled with stimulus of choice. The use of small molar mass crosslinker precursors with active groups orthogonal to thiol-Michael reaction type electrophile provides the opportunity to implement an on-demand in situ crosslinking without compromising the fast reaction kinetics.
It was postulated that short peptide sequences due to the broad range structural-function relations available with the different constituent amino acids, can be exploited for the realisation of stimuli-promoted in situ covalent crosslinking and gelation applications. The advantages of this system over conventional polymer-polymer hydrogel systems are the ability tune and predict material property at the molecular level.
The main aim of this work was to develop a simplified and biologically-friendly stimuli-promoted in situ crosslinking and hydrogelation system using peptide mimetics as latent crosslinkers. The approach aims at using a single thiodepsipeptide sequence to achieve separate pH- and enzyme-promoted gelation systems with little modification to the thiodepsipeptide sequence. The realization of this aim required the completion of three milestones. 
In the first place, after deciding on the thiol-Michael reaction as an effective in situ crosslinking strategy, a thiodepsipeptide, Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-NEtSH (TDP) with expected propensity towards pH-dependent thiol-thioester exchange (TTE) activation, was proposed as a suitable crosslinker precursor for pH-promoted gelation system. Prior to the synthesis of the proposed peptide-mimetic, knowledge of the thiol-Michael reactivity of the would-be activated thiol moiety SH-Leu, which is internally embedded in the thiodepsipeptide was required. In line with pKa requirements for a successful TTE, the reactivity of a more acidic thiol, SH-Phe was also investigated to aid the selection of the best thiol to be incorporated in the thioester bearing peptide based crosslinker precursor. Using ‘pseudo’ 2D-NMR investigations, it was found that only reactions involving SH-Leu yielded the expected thiol-Michael product, an observation that was attributed to the steric hindrance of the bulkier nature of SH-Phe. The fast reaction rates and complete acrylate/maleimide conversion obtained with SH-Leu at pH 7.2 and higher aided the direct elimination of SH-Phe as a potential thiol for the synthesis of the peptide mimetic. 
Based on the initial studies, for the pH-promoted gelation system, the proposed Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-NEtSH was kept unmodified. The subtle difference in pKa values between SH-Leu (thioester thiol) and the terminal cysteamine thiol from theoretical conditions should be enough to effect a ‘pseudo’ intramolecular TTE. In polar protic solvents and under basic aqueous conditions, TDP successfully undergoes a ‘pseudo’ intramolecular TTE reaction to yield an α,ω-dithiol tripeptide, HSLeu-Leu-Gly-NEtSH. The pH dependence of thiolate ion generation by the cysteamine thiol aided the incorporation of the needed stimulus (pH) for the overall success of TTE (activation step) – thiol-Michael addition (crosslinking) strategy. 
Secondly, with potential biomedical applications in focus, the susceptibility of TDP, like other thioesters, to intermolecular TTE reaction was probed with a group of thiols of varying thiol pKa values, since biological milieu characteristically contain peptide/protein thiols. L-cysteine, which is a biologically relevant thiol, and a small molecular weight thiol, methylthioglycolate both with relatively similar thiol pKa, values, led to an increase concentration of the dithiol crosslinker when reacted with TDP. In the presence of acidic thiols (p-NTP and 4MBA), a decrease in the dithiol concentration was observed, an observation that can be attributed to the inability of the TTE tetrahedral intermediate to dissociate into exchange products and is in line with pKa requirements for successful TTE reaction. These results additionally makes TDP more attractive and the potentially the first crosslinker precursor for applications in biologically relevant media. 
Finally, the ability of TDP to promote pH-sensitive in situ gel formation was probed with maleimide functionalized 4-arm polyethylene glycol polymers in tris-buffered media of varying pHs. When a 1:1 thiol: maleimide molar ratio was used, TDP-PEG4MAL hydrogels formed within 3, 12 and 24 hours at pH values of 8.5, 8.0 and 7.5 respectively. However, gelation times of 3, 5 and 30 mins were observed for the same pH trend when the thiol: maleimide molar was increased to 2:1. 
A direct correlation of thiol content with G’ of the gels at each pH could also be drawn by comparing gels with thiol: maleimide ratios of 1:1 to those with 2:1 thiol: maleimide mole ratios. This is supported by the fact that the storage modulus (G') is linearly dependent on the crosslinking density of the polymer. The values of initial G′ for all gels ranged between (200 – 5000 Pa), which falls in the range of elasticities of certain tissue microenvironments for example brain tissue 200 – 1000 Pa and adipose tissue (2500 – 3500 Pa). 
Knowledge so far gained from the study on the ability to design and tune the exchange reaction of thioester containing peptide mimetic will give those working in the field further insight into the development of new sequences tailored towards specific applications. 
TTE substrate design using peptide mimetic as presented in this work has revealed interesting new insights considering the state-of-the-art. Using the results obtained as reference, the strategy provides a possibility to extend the concept to the controlled delivery of active molecules needed for other robust and high yielding crosslinking reactions for biomedical applications. Application for this sequentially coupled functional system could be seen e.g. in the treatment of inflamed tissues associated with urinary tract like bladder infections for which pH levels above 7 were reported. By the inclusion of cell adhesion peptide motifs, the hydrogel network formed at this pH could act as a new support layer for the healing of damage epithelium as shown in interfacial gel formation experiments using TDP and PEG4MAL droplets.
The versatility of the thiodepsipeptide sequence, Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-(TDPo) was extended for the design and synthesis of a MMP-sensitive 4-arm PEG-TDPo conjugate. The purported cleavage of TDPo at the Gly-SLeu bond yields active thiol units for subsequent reaction of orthogonal Michael acceptor moieties. One of the advantages of stimuli-promoted in situ crosslinking systems using short peptides should be the ease of design of required peptide molecules due to the predictability of peptide functions their sequence structure. Consequently the functionalisation of a 4-arm PEG core with the collagenase active TDPo sequence yielded an MMP-sensitive 4-arm thiodepsipeptide-PEG conjugate (PEG4TDPo) substrate. 
Cleavage studies using thiol flourometric assay in the presence of MMPs -2 and -9 confirmed the susceptibility of PEG4TDPo towards these enzymes. The resulting time-dependent increase in fluorescence intensity in the presence of thiol assay signifies the successful cleavage of TDPo at the Gly-SLeu bond as expected. It was observed that the cleavage studies with thiol flourometric assay introduces a sigmoid non-Michaelis-Menten type kinetic profile, hence making it difficult to accurately determine the enzyme cycling parameters, kcat and KM .  
Gelation studies with PEG4MAL at 10 % wt. concentrations revealed faster gelation with MMP-2 than MMP-9 with 28 and 40 min gelation times respectively. Possible contributions by hydrolytic cleavage of PEG4TDPo has resulted in the gelation of PEG4MAL blank samples but only after 60 minutes of reaction. From theoretical considerations, the simultaneous gelation reaction would be expected to more negatively impact the enzymatic than hydrolytic cleavage. The exact contributions from hydrolytic cleavage of PEG4TDPo would however require additional studies. 
In summary this new and simplified in situ crosslinking system using peptide-based crosslinker precursors with tuneable properties exhibited in situ crosslinking gelation kinetics on similar levels with already active dithiols reported. The advantageous on-demand functionality associated with its pH-sensitivity and physiological compatibility makes it a strong candidate worth further research as biomedical applications in general and on-demand material synthesis is concerned. 
Results from MMP-promoted gelation system unveils a simple but unexplored approach for in situ synthesis of covalently crosslinked soft materials, that could lead to the development of an alternative pathway in addressing cancer metastasis by making use of MMP overexpression as a trigger. This goal has so far not being reach with MMP inhibitors despite the extensive work this regard.
N2  - Hydrogele sind synthetische, potenziell ECM-ähnliche Substituenten, die funktionelle und strukturelle Ähnlichkeiten mit Weichteilgeweben aufweisen. Sie können durch Vernetzung von Makromolekülen oder durch Polymerisation geeigneter Precursoren hergestellt werden. Die Vernetzungen müssen nicht unbedingt aus kovalenten Bindungen bestehen, sondern können auch durch physikalische Wechselwirkungen wie π-π-Wechselwirkungen, hydrophoben Wechselwirkungen oder Wasserstoff-Brückenbindungen entstehen. In-situ-Hydrogele, die on-demand gebildet werden, haben vor allem für biomedizinische Anwendungen gegenüber vorgefertigten Gelen zunehmend an Interesse gewonnen, da sie relativ einfach in-vivo eingebracht und somit Fehlstellen gefüllt werden können. Die Thiol-Michael-Additionsreaktion bietet mit ihrer schnellen Reaktionskinetik und ihrer Fähigkeit, unter physiologischen Bedingungen abzulaufen, eine unkomplizierte und robuste Strategie für die in-situ-Gelbildung. Der Einbau einer Triggerfunktion in ein Vernetzungssystem ist besonders interessant, da die Gelierung durch einen gewählten Stimulus gesteuert werden kann. Die Verwendung eines Precursors mit geringer Molmasse und aktiven Gruppen, die orthogonal zu den Elektrophilen des Thiol-Michael-Reaktionstyps sind, bietet die Möglichkeit, eine bedarfsgesteuerte in-situ-Vernetzung zu realisieren, ohne die schnelle Reaktionskinetik zu beeinträchtigen.
Es wurde postuliert, dass kurze Peptidsequenzen aufgrund der weitreichenden Struktur-Funktions-Beziehungen, die mit den verschiedenen konstituierenden Aminosäuren zur Verfügung stehen, für die Realisierung von Stimulus-ausgelösten, in-situ kovalenten Vernetzungs- und Gelierungsanwendungen genutzt werden können. Die Vorteile dieses Systems gegenüber herkömmlichen Polymer-Polymer-Hydrogelsystemen liegen in der Möglichkeit, die Materialeigenschaften auf molekularer Ebene zu justieren und vorherzusagen.

Das Hauptziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines vereinfachten und biologisch-geeigneten, stimulierungsgeförderten in-situ-Vernetzungs- und Hydrogelierungssystems unter Verwendung von Peptidmimetika als latente Vernetzer. Der Ansatz zielt darauf ab, eine einzige Thiodepsipeptidsequenz zu verwenden, um getrennte pH- und enzymausgelöste Gelierungssysteme mit geringen Modifikationen der Thiodepsipeptidsequenz zu erreichen. Zur Verwirklichung dieses Ziels, mussten drei Meilensteine erreicht werden. 
Nach der Wahl der Thiol-Michael-Reaktion als in-situ-Vernetzungsstrategie, musste ein Thiodepsipeptid, Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-NEtSH (TDP) mit einer zu erwartenden Neigung zu einer pH-abhängigen Thiol-Thioester-Austausch-Aktivierung (TTE), als geeignetem Vernetzer-Precursor für das pH-unterstützte Gelierungssystem designt werden. Vor der Synthese dieses Peptid-Mimetikums war die Untersuchung der Thiol-Michael-Reaktivität der potenziell aktivierten Thiolkomponente SH-Leu erforderlich, die intern in das Thiodepsipeptid eingebettet ist. In Übereinstimmung mit den pKa-Anforderungen für eine erfolgreiche TTE wurde auch die Reaktivität eines saureren Thiols, SH-Phe, untersucht, um die Auswahl des besten Thiols zu ermöglichen, das in den Thioester-tragenden Peptid-basierten Vernetzer-Precursor eingebaut werden sollte. Pseudo-2D-NMR-Untersuchungen zeigten, dass nur Reaktionen mit SH-Leu das erwartete Thiol-Michael-Produkt ergaben, eine Beobachtung, die auf die sterische Hinderung durch die sperrige Natur von SH-Phe zurückzuführen ist. Wegen der schnellen Reaktionsgeschwindigkeiten und der vollständigen Acrylat/Maleimid-Umwandlung, die mit SH-Leu bei einem pH-Wert von 7,2 und höher erzielt wurde, kam SH-Phe als potenzielles Thiol für die Synthese des Peptidmimetikums nicht mehr infrage. 
Auf der Grundlage der ersten Studien wurde für das pH-basierte Gelierungssystem das vorgeschlagene Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-NEtSH unverändert beibehalten. Der geringe Unterschied in den pKa-Werten zwischen SH-Leu (Thioesterthiol) und dem terminalen Cysteaminthiol sollte ausreichen, um eine "pseudo"-intramolekulare TTE zu bewirken. In polaren protischen Lösungsmitteln und unter basischen wässrigen Bedingungen verläuft die "pseudo"-intramolekulare TTE-Reaktion bei TDP erfolgreich, bei der ein α,ω-Dithiol-Tripeptid, HSLeu-Leu-Gly-NEtSH, entsteht. Die pH-Abhängigkeit der Thiolat-Ionen-Generierung durch das Cysteamin-Thiol trug dazu bei, den notwendigen Stimulus (pH) für den Gesamterfolg der TTE (Aktivierungsschritt) - Thiol-Michael-Addition (Vernetzung) Strategie einzubauen. 
Zweitens wurde mit Blick auf potenzielle biomedizinische Anwendungen die Empfindlichkeit von TDP, wie auch anderer Thioester, für die intermolekulare TTE-Reaktion mit einer Gruppe von Thiolen mit unterschiedlichen Thiol-pKa-Werten untersucht, da biologische Milieus typischerweise Peptid-/Proteinthiole enthalten. L-Cystein, ein biologisch relevantes Thiol, und ein Thiol mit geringem Molekulargewicht, Methylthioglykolat, die beide relativ ähnliche Thiol-pKa-Werte besitzen, führten bei der Reaktion mit TDP zu einer erhöhten Konzentration des Dithiol-Vernetzers. In Gegenwart von sauren Thiolen (p-NTP und 4MBA) wurde eine Abnahme der Dithiolkonzentration beobachtet, eine Beobachtung, die auf die Unfähigkeit des tetraedrischen TTE-Zwischenprodukts in Austauschprodukte zu dissoziieren zurückgeführt werden kann und mit den pKa-Anforderungen für eine erfolgreiche TTE-Reaktion in Einklang steht. Diese Ergebnisse machen TDP noch attraktiver und zum potenziell ersten Vernetzer-Precursor für Anwendungen in biologisch relevanten Medien. 
Schließlich wurde die Fähigkeit von TDP, die pH-empfindliche in-situ-Gelbildung zu fördern, mit Maleimid-funktionalisierten 4-armigen Polyethylenglykolpolymeren in tris-gepufferten Medien mit unterschiedlichen pH-Werten untersucht. Bei einem Molverhältnis von 1:1 Thiol zu Maleimid bildeten sich TDP-PEG4MAL-Hydrogele innerhalb von 3, 12 und 24 Stunden bei pH-Werten von 8,5, 8,0 bzw. 7,5. Bei einer Erhöhung des Molverhältnisses von Thiol zu Maleimid auf 2:1 wurden jedoch Gelierzeiten von 3, 5 und 30 Minuten für denselben pH-Trend beobachtet. 
Ein direkter Zusammenhang zwischen dem Thiolgehalt und G' der Gele bei jedem pH-Wert konnte auch durch den Vergleich von Gelen mit einem Thiol/Maleimid-Molverhältnis von 1:1 mit solchen mit einem Thiol/Maleimid-Molverhältnis von 2:1 hergestellt werden. Dies wird durch die Tatsache unterstützt, dass der Speichermodulus (G') linear von der Vernetzungsdichte des Polymers abhängig ist. Die Werte des anfänglichen G′ für alle Gele lagen bei 200 - 5000 Pa, was in den Bereich der Elastizitäten bestimmter Gewebe-Mikroumgebungen fällt, z. B. Gehirngewebe (200 - 1000 Pa) und Fettgewebe (2500 - 3500 Pa). 
Die bisher aus der Studie gewonnenen Erkenntnisse über die Möglichkeit, die Austauschreaktion von Thioester-haltigen Peptidmimetika zu entwerfen und abzustimmen, geben weitere Einblicke in die Entwicklung neuer, auf spezifische Anwendungen zugeschnittener Sequenzen. 
Das Design von TTE-Substraten unter Verwendung von Peptidmimetika, wie es in dieser Arbeit vorgestellt wurde, hat interessante neue Erkenntnisse im Hinblick auf den Stand der Technik gebracht. Mit den erzielten Ergebnissen als Basis bietet die Strategie die Möglichkeit, das Konzept auf die kontrollierte Freisetzung aktiver Moleküle zu erweitern, die für andere robuste Vernetzungsreaktionen mit hohem Umsatz für biomedizinische Anwendungen benötigt werden. Dieses sequentiell gekoppelte funktionelle System könnte z. B. bei der Behandlung von entzündetem Gewebe im Zusammenhang mit Harnwegsinfektionen wie Blasenentzündungen eingesetzt werden, für die pH-Werte über 7 berichtet wurden. Durch die Einbeziehung von Zelladhäsionspeptidmotiven könnte das bei diesem pH-Wert gebildete Hydrogelnetz als neue Stützschicht für die Heilung von geschädigtem Epithel fungieren, wie in Experimenten zur Bildung von Grenzflächengelen mit TDP- und PEG4MAL-Tropfen gezeigt wurde.
Die Vielseitigkeit der Thiodepsipeptidsequenz Ac-Pro-Leu-Gly-SLeu-Leu-Gly-(TDPo) wurde um Design und die Synthese eines MMP-empfindlichen 4-armigen PEG-TDPo-Konjugats erweitert. Die beabsichtigte Spaltung von TDPo an der Gly-SLeu-Bindung liefert aktive Thiol-Einheiten für die anschließende Reaktion orthogonaler Michael-Akzeptor-Einheiten. Einer der Vorteile stimulierungsgestützter in-situ-Vernetzungssysteme unter Verwendung kurzer Peptide dürfte darin liegen, dass sich die erforderlichen Peptidmoleküle aufgrund der Vorhersagbarkeit der Peptidfunktionen und ihrer Sequenzstruktur leicht entwerfen lassen. Die Funktionalisierung eines vierarmigen PEG-Kerns mit der kollagenaseaktiven TDPo-Sequenz führte zu einem MMP-empfindlichen vierarmigen Thiodepsipeptid-PEG-Konjugat (PEG4TDPo). 
Spaltungs-Studien unter Verwendung eines thiolfluorimetrischen Assays in Gegenwart der MMPs -2 und -9 bestätigten die Spaltbarkeit von PEG4TDPo durch diese Enzyme. Der daraus resultierende zeitabhängige Anstieg der Fluoreszenzintensität in Anwesenheit des Thiol-Assays deutet auf die erfolgreiche Spaltung von TDPo an der Gly-SLeu-Bindung hin. Es wurde festgestellt, dass die Spaltungsstudien mit dem thiol-fluorimetrischen Assay ein sigmoides, nicht-Michaelis-Menten-artiges kinetisches Profil ergeben, was eine genaue Bestimmung der Enzymzyklusparameter, kcat und KM, erschwert.  
Gelierungsstudien mit PEG4MAL in einer Konzentration von 10 Gew.-% ergaben eine schnellere Gelierung mit MMP-2 als mit MMP-9 mit Gelierungszeiten von 28 bzw. 40 Minuten. Eventuelle Beiträge durch hydrolytische Spaltung von PEG4TDPo an der Gelierung wurden an PEG4MAL-Blindproben untersucht und führten erst nach 60 Minuten Reaktionszeit zu einer Gelierung. Aus theoretischen Überlegungen heraus wäre zu erwarten, dass sich die gleichzeitige Gelierungsreaktion negativer auf die enzymatische als auf die hydrolytische Spaltung auswirkt. Genaues zum Beitrag der hydrolytischen Spaltung von PEG4TDPo bedürfte jedoch weiterer Untersuchungen. 
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses neue in-situ-Vernetzungssystem, bei dem Peptid-basierte Vernetzungs-Precursor mit einstellbaren Eigenschaften verwendet werden, eine in-situ-Vernetzungs-Gelierungskinetik auf ähnlichem Niveau wie bei bereits berichteten aktiven Dithiole aufweist. Die vorteilhafte On-Demand-Funktionalität in Verbindung mit ihrer pH-Sensitivität und physiologischen Verträglichkeit macht sie zu einem interessanten Kandidaten für weitere Forschungen im Bereich biomedizinischer Anwendungen im Allgemeinen und der On-Demand-Materialsynthese. 
Die Ergebnisse des MMP-geförderten Gelierungssystems weisen einen einfachen, aber unerforschten Ansatz für die in-situ-Synthese kovalent vernetzter weicher Materialien, der zur Entwicklung eines alternativen Weges zur Bekämpfung der Krebsmetastasierung führen könnte, indem er die MMP-Überexpression als Auslöser nutzt. Mit MMP-Inhibitoren wurde dieses Ziel trotz umfangreicher Arbeiten in dieser Hinsicht bisher nicht erreicht.
KW  - hydrogels
KW  - stimuli
KW  - peptide
KW  - thioester
KW  - crosslinker
KW  - Hydrogele
KW  - Vernetzer
KW  - Peptid
KW  - Thioester
KW  - Stimuli
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:517-opus4-569713
ER  -